專利名稱：水通道蛋白拮抗劑的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一類水通道蛋白的拮抗劑及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
水是細胞維持正常的形態(tài)和功能必須的組成成份。存在滲透壓梯度情況下，細胞的水轉(zhuǎn)運主要以水通道蛋白(AQPs，aquaporins)介導的形式進行?，F(xiàn)在已經(jīng)在哺乳動物中相繼發(fā)現(xiàn)了11中水通道的亞型。研究表明，水通道蛋白表達異常及基因突變與機體的某些生理變化有密切的關系(Verkman AS；Mitra A K.Am J Physiol Renal Physiol，2000，278(1)F13-28。King L S；Yasui M；Agre P.Mol Med Today，2000，6(2)，60-5.)，造成的疾病有腎源性糖尿病、眼內(nèi)壓力的調(diào)節(jié)、充血性心力衰竭和聽力損壞等。基于此，對水通道拮抗劑的研究有重要意義。
1，3，4-噻二唑類化合物具有廣譜生物活性，如對腫瘤、白血病的作用等Oleson等報道2-胺基-1，3，4-噻二唑類化合物(N4728)對S91黑素瘤、8110神經(jīng)膠質(zhì)過濾、6C3HED淋巴肉瘤具有抑制作用(Oleson J J；Sloboda A；Troy W P；Halliday S L；Landes M J；Angier R B；Semb J；Cyr K；Williams J H.J Am Chem Soc.1955，77，6713.)；Zee-Cheng等報道對白血病P-388具有較高的抑制作用(Zee-Cheng；R K J；Cheng C C.J Med Chem.1979，22，28.)；Miyamoto K等報道對Lewis肺癌瘤株的小鼠經(jīng)灌胃給藥后，顯著延長其生命(MiyamotoK；Koshiura R；Moru M；Yokoi H；Mori C；Hasegawa T；Takatori K；Chem Pharm Bull.1985，33，5126～5129)；Chimirri A等報道對白血病P-388、L1210及M5076腹水惡性毒瘤具有抑制作用(Chimirri A；Grasso S；Monforte P；Fenech G；Zappala M；Monforte A M.Eur J MedChem.1989，24，131～135)。但未見1，3，4-噻二唑母體結(jié)構(gòu)的化合物具有水通道蛋白拮抗劑作用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是找到一種新的水通道蛋白的拮抗劑。
本發(fā)明通過對水通道蛋白進行基于結(jié)構(gòu)的藥物設計，合成了全新結(jié)構(gòu)的有機化合物，利用高通量紅細胞模型、轉(zhuǎn)染細胞模型等對設計合成的化合物進行水通道蛋白拮抗活性測試，發(fā)現(xiàn)如下通式I的化合物對水通道蛋白具有拮抗作用
式I式I中，R1獨立選自氫，SO2NH2，C1～C4直鏈或支鏈烷基；R2獨立選自苯基、一個或一個以上鹵素取代苯基；X為O或S；式I中，所述鹵素優(yōu)選為氯、氟；鹵素取代的數(shù)量優(yōu)選為1-2；優(yōu)選的式I化合物中，R1是C2～C4烷基，R2是氯代苯基；最優(yōu)選地，R1為乙基或正丁基，R2為間氯代苯基，X為O。
式I化合物還包括其水合物。
式I化合物可以與酸形成各種可藥用的鹽，如鹽酸鹽等。
將式I化合物或其水合物、鹽與藥物可接受的輔劑，如載體、賦形劑等組合，可以制備抗腫瘤、腎原性糖尿病、眼內(nèi)壓力的調(diào)節(jié)、充血性心力衰竭和改善聽力損壞等的藥物。
式I化合物的合成路線是先將酸(R1COOH)與氨基硫脲反應，得到中間產(chǎn)物5-R1-2-氨基-1，3，4-噻二唑，然后再與R2-異氰酸酯或R2-異硫氰酸酯等反應，得到相應的產(chǎn)物本發(fā)明采用水通道紅細胞模型、水通道轉(zhuǎn)染細胞模型對受試化合物水通道蛋白拮抗活性進行了測試。其中水通道紅細胞模型是一種可以定量、高通量、簡便的方法，目前已經(jīng)在水通道研究中廣泛使用。水通道轉(zhuǎn)染細胞模型可測試受試化合物對單個細胞水通道活性的作用，此方法可定量、準確度高、重現(xiàn)性好、不易受其他物質(zhì)干擾。
經(jīng)上述生物學實驗證實，本發(fā)明的化合物對水通道蛋白具有很好的拮抗作用。


圖1是本發(fā)明化合物對紅細胞滲透作用的實驗結(jié)果，圖中，橫坐標代表受試化合物的濃度(LogM)；縱坐標代表對紅細胞光密度改變的抑制程度(％)；圖2是本發(fā)明化合物對水通道基因轉(zhuǎn)染細胞模型的水轉(zhuǎn)運的影響實驗結(jié)果，圖中，橫坐標代表低滲透刺激細胞后熒光記錄時間(Sec)；縱坐標代表單位面積熒光強度相對值。
具體實施例方式為了更清楚地說明本發(fā)明而列舉以下實施例，但其對本發(fā)明的范圍無任何限制。
在以下實施例中，合成所用的原料均為市售的產(chǎn)品；所采用的實驗操作方法和操作步驟，除詳述之處，其余是依本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員熟知的。
實施例1 N1-(5-正丁基-1，3，4-噻二唑-2-基)-N3-間氯代苯基脲A.中間體5-正丁基-2-氨基-1，3，4-噻二唑的合成將0.05mol的正戊酸和0.07mol的氨基硫脲分別裝入100mL的三口瓶里，室溫攪拌下滴入11mL濃硫酸，然后加熱8h，溫度保持在80～90℃，冷卻至室溫，將反應液慢慢倒入冰水中，并用40％的氫氧化鈉溶液中和至pH＝8～9，放置過夜，抽濾，用水洗滌固體粗產(chǎn)品2～3次，用水或稀的乙醇溶液重結(jié)晶得純品，收率為70％，m.p.219-220℃。
B.N1-(5-正丁基-1，3，4-噻二唑-2-基)-N3-間氯代苯基脲的合成將2mmol的5-正丁基-2-氨基-1，3，4-噻二唑溶于10mL無水乙腈中，室溫下緩慢滴加2mmol間-氯代苯基異氰酸酯的2mL無水乙腈溶液，加畢，回流至反應完全(TLC跟蹤反應進程)。冷卻，析出大量的白色固體，過濾，收集固體，用乙醇重結(jié)晶得純品，收率為96％，m.p.182-183℃。
C13H15N4OSCl，AnalC，50.24；H，4.79；N，17.84。CalC，50.27；H，4.82；N，18.03。
1HNMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.91(t，3H，CH3)，1.37(m，2H，CH2)，1.67(m，2H，CH2)，2.92(t，2H，CH2)，7.07～7.73(m，4H，C6H4)，9.29(s，1H，NH)，10.94(bs，1H，NH)。
實施例2-24的化合物可基本上按照實施例1的描述制備。




實施例25 N1-(5-正丁基-1，3，4-噻二唑-2-基)-N3-3，4-二氯代苯基硫脲將2mmol的5-正丁基-2-氨基-1，3，4-噻二唑溶于10mL無水乙腈中，室溫下緩慢滴加2mmol3，4-二氯代苯基異硫氰酸酯的2mL無水乙腈溶液，加畢，回流至反應完全(TLC跟蹤反應進程)。冷卻，析出大量的白色固體，將析出的固體物過濾，再用乙酸乙酯/石油醚進行柱層析得純品，收率為70％，m.p.＞260℃。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ0.89(t，3H，CH3)，1.34(m，2H，CH2)，1.65(m，2H，CH2)，2.84(t，2H，CH2)，7.42～7.69(m，3H，C6H3)，10.05(s，1H，NH)，13.78(bs，1H，NH)。
實施例26-39的化合物可基本上按照實施例25的描述制備。



實施例40 N1-(5-磺酰胺基-1，3，4-噻二唑-2-基)-N3-鄰氯代苯基脲A.中間體2-胺基-5-磺酰胺基-1，3，4-噻二唑的合成將5.0g乙酰唑胺溶于60ml乙醇中，加入6ml 12N的鹽酸溶液，加熱回流約6小時(TLC跟綜反應進程)。減壓去掉乙醇，析出固體。將固體物在冰水浴中滴加1N氫氧化鈉溶液至pH為8。抽濾得粗品，用水重結(jié)晶得純品。m.p＝219～220℃，產(chǎn)率為75％。
B.N1-(5-磺酰胺基-1，3，4-噻二唑-2-基)-N3-鄰氯代苯基脲將0.36g(2mmol)的2-胺基-5-磺酰胺基-1，3，4-噻二唑1溶于12ml乙腈中，慢慢滴加2mmol鄰氯代苯基異氰酸酯，加熱回流至反應完全(TLC跟綜反應進程)。放置冷卻，析出大量的白色固體。將析出的固體物過濾，再用乙醇重結(jié)晶得純品，m.p＞260℃，產(chǎn)率為95％。
1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ7.13～7.41(m，4H，C6H4)，8.33(s，2H，NH)，9.42(s，1H，NH)，11.63(s，1H，NH)。
實施例41-43的化合物可基本上按照實施例40的描述制備。


篩選水通道拮抗劑的生物學實驗在以下實驗中，代號“XJ-3-A”代表化合物N1-(5-乙基-1，3，4-噻二唑-2-基)-N3-間氯代苯基脲；代號“XJ-6-A”代表化合物N1-(5-正丁基-1，3，4-噻二唑-2-基)-N3-間氯代苯基脲實驗一對紅細胞篩選模型的水通道蛋白拮抗作用觀察(一)實驗方法紅細胞模型取大鼠新鮮血液，分離得到紅細胞，采用高滲溶液處理，使紅細胞皺縮。然后將細胞懸液加入到96孔板中，(該96孔板在加入紅細胞之前已加入待篩化合物的溶液，其中DMSO的濃度低于0.1％)，孵育10分鐘。然后加入等體積的低滲溶液，使細胞內(nèi)外產(chǎn)生100毫滲的滲透梯度。在此過程中，動態(tài)觀察細胞懸液在492nm處OD值。加入低滲前后的OD值變化反映細胞體積的變化，從而評價待篩化合物對水通道水轉(zhuǎn)運功能的影響。
(二)操作步驟1、取紅細胞100微升，加入到盛有5毫升高滲溶液的試管中，采用紅細胞計數(shù)板計數(shù)，再次逐量遞加溶液稀釋；2、室溫放置10分鐘，使得紅細胞皺縮；3、在96孔板上加入各種濃度(對數(shù)梯度濃度)的受試藥物溶液，以濃度為0.2μM的氯化汞溶液為陽性對照。
4、向盛有藥物溶液的孔中加入20微升紅細胞，與藥物繼續(xù)室溫孵育10分鐘。
5、調(diào)節(jié)分光光度儀器的設置，觀察細胞懸液在492nm處OD值。測定時間為10分鐘，測定時間間歇為0.1秒；
6、測試自動加入低滲溶液前后OD的動態(tài)變化值。
(三)實驗結(jié)果在紅細胞模型中，XJ-6-A對紅細胞水轉(zhuǎn)運的IC50約為5×10-8M，結(jié)果見圖1。
實驗二對轉(zhuǎn)染細胞篩選模型的水通道蛋白拮抗作用觀察(一)實驗方法1、大鼠水通道基因克隆到pEGFP質(zhì)粒中，酶切并測序鑒定重組質(zhì)粒pEGFP-AQP1；7、將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細胞中，采用G418篩選得到穩(wěn)定表達GFP-AQP1蛋白的陽性細胞；8、將陽性細胞接種到Confocal小皿中，給予待篩化合物(終濃度為0.1μM和1μM的XJ-6-A和XJ-3-A)的溶液(其中DMSO的濃度低于0.1％)，孵育30分鐘；2、采用加入蒸餾水的方法外產(chǎn)生細胞內(nèi)外滲透梯度；3、在激光共聚焦顯微鏡下，每隔30秒，觀察記錄細胞在給予低滲處理前后細胞表面單位面積內(nèi)綠色熒光強度的動態(tài)變化；細胞單位面積內(nèi)的熒光強度相對減弱可以揭示細胞腫脹，從而可以評價化合物對水轉(zhuǎn)運的影響。
(二)實驗結(jié)果XJ-6-A在0.1μM和1μM劑量下能明顯地抑制轉(zhuǎn)染細胞在低滲溶液中體積的增加，XJ-3-A在1μM劑量下能明顯地抑制轉(zhuǎn)染細胞在低滲溶液中體積的增加，結(jié)果見圖2。
(三)實驗結(jié)論受試化合物對于轉(zhuǎn)染細胞和紅細胞中的水通道介導的滲透性水轉(zhuǎn)運具有確定的抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種水通道蛋白拮抗劑，為通式I化合物 式I式中的R1獨立選自氫、SO2NH2、C1～C4直鏈或支鏈烷基；R2獨立選自苯基、一個或一個以上鹵素取代苯基；X為O或S；式I化合物包括其水合物及藥物可接受的鹽。
2.權(quán)利要求1的水通道蛋白拮抗劑，式I中，所述鹵素優(yōu)選為氯、氟；鹵素取代的數(shù)量優(yōu)選為1-2。
3.權(quán)利要求1或2的水通道蛋白拮抗劑，式I中，R1是C2～C4烷基。
4.權(quán)利要求3的水通道蛋白拮抗劑，式I中，R2是氯代苯基。
5.權(quán)利要求3的水通道蛋白拮抗劑，式I中，R1為乙基或正丁基。
6.權(quán)利要求5的水通道蛋白拮抗劑，式I中，R2為間氯代苯基，X為O。
7.式I化合物的制備方法先將酸(R1COOH)與氨基硫脲反應，得到中間產(chǎn)物5-R1-2-氨基-1，3，4-噻二唑，然后再與R2-異氰酸酯或R2-異硫氰酸酯反應，得到相應的式I化合物。
8.用式I化合物制備水通道蛋白拮抗劑的用途。
9.用式I化合物制備防治水通道蛋白異常所引起疾病的藥物的用途。
10.權(quán)利要求9所述用途，其中水通道蛋白異常所引起疾病包括腫瘤、腎原性糖尿病、眼內(nèi)壓力的調(diào)節(jié)、充血性心力衰竭和聽力損壞。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了式I結(jié)構(gòu)的水通道蛋白的拮抗劑，其中R1獨立選自氫、SO
文檔編號A61P3/00GK1746164SQ20041000952
公開日2006年3月15日 申請日期2004年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月8日
發(fā)明者來魯華, 劉瑩, 鄒霞娟, 劉振明, 李學軍, 高軍衛(wèi) 申請人:北京大學