專利名稱：用于腸胃外給藥的異環(huán)磷酰胺組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于腸胃外給藥的異環(huán)磷酰胺組合物。具體地，本發(fā)明涉及用于腸胃外給藥的穩(wěn)定的、澄清的、含水異環(huán)磷酰胺組合物，其具有降低的毒性。更具體地，本發(fā)明涉及除了含有異環(huán)磷酰胺之外還含有2-羥丙基-β-環(huán)糊精(下文稱為“HPBCD”)的異環(huán)磷酰胺組合物。
背景技術(shù)：
在治療惡性疾病中使用的兩組主要的藥物是烷化劑和抗代謝物。異環(huán)磷酰胺是廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物之一，其屬于烷化劑。
異環(huán)磷酰胺的化學(xué)名為3-(2-氯乙基)-2-[(2-氯乙基)氨基]-四氫-2H-1，3，2-氧氮雜酰胺(oxazaphosphorin)-2-氧化物，表示為式 異環(huán)磷酰胺是白色結(jié)晶的吸濕性粉末，具有40℃的低熔點。該粉末具有約100mg/ml的水溶性。
異環(huán)磷酰胺被用于治療多種實體瘤和Burkitt淋巴瘤，所述實體瘤包括子宮頸瘤、子宮內(nèi)膜瘤、肺瘤、卵巢瘤、睪丸瘤、胸腺瘤和肉瘤。
使用異環(huán)磷酰胺的治療伴有嚴重的副作用，所述副作用例如出血性膀胱炎、骨髓抑制、心臟心律失常、CNS障礙、腎毒性、血液學(xué)和胃腸反應(yīng)。據(jù)報道，小鼠靜脈內(nèi)給藥的LD50為338mg/kg體重。與泌尿系統(tǒng)保護劑(uroprotective agent)巰乙磺酸鈉(mesna)聯(lián)合降低了出血性膀胱炎的發(fā)生率。因此，巰乙磺酸鈉通常以異環(huán)磷酰胺劑量的20％在零時(異環(huán)磷酰胺給藥時)、和之后的4小時和8小時靜脈給藥。
異環(huán)磷酰胺可以以含有小于4％w/v的異環(huán)磷酰胺的稀釋液通過注射或輸注靜脈給藥。異環(huán)磷酰胺非常易于水解，因而，通常需要即時給藥這樣的溶液。因此，市售的主要是干燥的形式，其以無菌包裝的干粉末形式供應(yīng)，在給藥前溶于水中用于注射。然而，異環(huán)磷酰胺的低熔點和吸濕性使得粉末需要在正確控制的溫度和濕度下小心地裝填以獲得無菌產(chǎn)品。而且，干粉末長時間的貯藏也導(dǎo)致板結(jié)(sintering)和變黃，其依次導(dǎo)致溶解速率的降低而增加了重構(gòu)需要的時間。
為了克服與熱敏性和易水解性有關(guān)的難題，已嘗試了凍干藥物。然而，凍干的過程相當(dāng)費時且需要特定的設(shè)備。在凍干粉末的重構(gòu)過程中發(fā)生的人員暴露于強細胞毒性的異環(huán)磷酰胺是不受歡迎的。
因此，已嘗試制備可用于腸胃外給藥的澄清的液體異環(huán)磷酰胺組合物，其將在一段時期內(nèi)穩(wěn)定。
US4952575公開了含有96％至100％的乙醇的異環(huán)磷酰胺的乙醇溶液。盡管異環(huán)磷酰胺的降解已顯示出為最小，但是這樣高濃度溶劑的使用導(dǎo)致其它的問題，如揮發(fā)性、制備過程中的操作性、給藥時與血液的混溶性。由于該醇是藥理學(xué)活性的，其可影響給予了異環(huán)磷酰胺的醇溶液的患者。
有兩個專利使用了多元醇制備了氧氮雜酰胺類化合物的穩(wěn)定的液體組合物，即US4879286公開了這樣的發(fā)明其中環(huán)磷酰胺被制備成易于稀釋的溶液。該發(fā)明使用有機多元醇即丙二醇和聚乙二醇及他們的混合物作為溶劑，也可含有0至50％的水。所述水可以被10％至30％的乙醇部分地代替。
WO0202125公開了含有異環(huán)磷酰胺、溶劑和任選地常規(guī)藥用載體和賦形劑的腸胃外給藥的液體藥物組合物。根據(jù)該發(fā)明，溶劑含有35-75％的低級醇和25-65％的多元醇。當(dāng)?shù)图壌既軇┩ǔ橐掖紩r，多元醇溶劑為丙二醇、丙三醇和/或聚乙二醇。
在專利US4879286和WO0202125中，更大量多元醇和醇的腸胃外給藥導(dǎo)致了其它的問題，例如注射時的疼痛和刺激、溶血、耳毒性、心血管作用、CNS作用和癲癇發(fā)作。其在患有腎衰的患者中也可導(dǎo)致容積滲摩爾濃度過高(hyperosmolarity)和乳酸中毒。
WO9918073公開了穩(wěn)定的、使用氯化鈉作為穩(wěn)定劑的即用型異環(huán)磷酰胺的水溶液。該發(fā)明還公開了含有尿素、氯化鈉和磷酸二氫鈉的10-500mg/ml的異環(huán)磷酰胺組合物。據(jù)說該發(fā)明的組合物是穩(wěn)定的，但是沒有提及所述組合物的安全性和毒性。在制劑中，高濃度的尿素可導(dǎo)致并發(fā)癥，比如注射部位的溶血、刺激、靜脈炎&血栓形成，和患有肝臟和腎功能衰竭的患者中提高的血氨和尿濃度。
WO03/051297A2公開了在可藥用緩沖劑中含有40-400mM(10-100mg/ml)的異環(huán)磷酰胺的即用型異環(huán)磷酰胺的含水組合物。該專利建議優(yōu)選使用選自Na2HPO4&NaH2PO4和K2HPO4&KH2PO4的緩沖劑。尚沒有關(guān)于該專利中公開的異環(huán)磷酰胺組合物的毒性的報道。
因此，仍需要穩(wěn)定的、濃縮的異環(huán)磷酰胺溶液，以便于在給藥過程中進行處理。另外，仍需要能表現(xiàn)出比當(dāng)前可獲得的組合物更低毒性的異環(huán)磷酰胺組合物。
因而，本發(fā)明的主要目的是提供可用于腸胃外給予人類或其它哺乳動物的穩(wěn)定的、澄清的具有降低的毒性的含水異環(huán)磷酰胺組合物。
本發(fā)明的另一個目的是提供制備該組合物的方法。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供用于腸胃外給藥的穩(wěn)定的、澄清的具有降低的毒性的含水異環(huán)磷酰胺組合物，其含有組合物中最多1100mg/ml的異環(huán)磷酰胺和2-羥丙基-β-環(huán)糊精。
本發(fā)明還提供制備用于腸胃外給藥的具有降低的毒性的異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其包括以下步驟i使異環(huán)磷酰胺、2-羥丙基-β-環(huán)糊精和水密切接觸；ii對步驟(i)結(jié)束時所獲得的組合物進行滅菌。
在本發(fā)明的方法中，在使異環(huán)磷酰胺、2-羥丙基-β-環(huán)糊精和水密切接觸時可加入需要量的可藥用添加劑。
密切接觸可通過各種方法如攪拌、混合、超聲處理、加熱、均質(zhì)化實施。優(yōu)選在無菌條件下和在惰性氣體氣氛中于低于40℃下實施。
本發(fā)明還提供加入一種或多種可藥用緩沖劑、張力劑(tonicityagent)、防腐劑、螯合劑、抗氧化劑、抗結(jié)晶劑。
本發(fā)明還涉及進行組合物滅菌，優(yōu)選通過無菌的0.2μm滅菌分級過濾器滅菌，并將滅菌的組合物在無菌操作下轉(zhuǎn)移到滅菌的容器中，然后用惰性氣體清除容器頂部的空氣并密封容器，所述惰性氣體如氮氣。
表發(fā)明實施方案的詳述在本發(fā)明描述的組合物中，異環(huán)磷酰胺含量最多1100mg/ml，優(yōu)選為1mg/ml至200mg/ml，更優(yōu)選為10mg/ml至100mg/ml，最優(yōu)選40mg/ml至50mg/ml。在本發(fā)明描述的組合物中，異環(huán)磷酰胺含量的其它優(yōu)選的范圍為200mg/ml至500mg/ml和500mg/ml至1000mg/ml。
在濃縮的異環(huán)磷酰胺組合物中，異環(huán)磷酰胺含量為200mg/ml至1100mg/ml，優(yōu)選200mg/ml至1000mg/ml，更優(yōu)選為500mg/ml和1000mg/ml。
2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HPBCD)是β-環(huán)糊精的部分取代的聚(羥丙基)醚。所述羥丙基為隨機地在環(huán)糊精的羥基上取代的，取代量被報道為取代的平均程度或每個環(huán)糊精上羥丙基的數(shù)量?；蛘呷〈勘粓蟮罏槟柸〈?MS)或環(huán)糊精的環(huán)上每葡糖酐單元取代的平均數(shù)量。摩爾取代對客體分子與HPBCD的結(jié)合可能具有作用。在低取代度下，結(jié)合與未修飾的β環(huán)糊精的結(jié)合類似。由于空間位阻(stearic hindrance)，增加摩爾取代可導(dǎo)致結(jié)合變?nèi)?。具有摩爾取代?.05至約2的HPBCD在本發(fā)明中是有用的。具有摩爾取代為0.3至約1.5的HPBCD是優(yōu)選的，具有摩爾取代為0.5至約1.2的HPBCD是更優(yōu)選的。
在組合物中，HPBCD可以以異環(huán)磷酰胺與HPBCD的摩爾比率為100∶0.1至1∶300存在，優(yōu)選100∶0.25至1∶100，更優(yōu)選100∶1至1∶20。其它優(yōu)選的異環(huán)磷酰胺與HPBCD的摩爾比率為100∶3.3至1∶2.5。
在制備濃縮的異環(huán)磷酰胺組合物時，HPBCD的需要量依異環(huán)磷酰胺的濃度而變化。最初它隨著異環(huán)磷酰胺的濃度而增加。但是在異環(huán)磷酰胺濃度較高時，由于體積的限制，HPBCD和水的含量受到限制。因此，異環(huán)磷酰胺與HPBCD的比率應(yīng)當(dāng)進行正確的選擇。
本發(fā)明的組合物的pH可以為3.0-9.0。本發(fā)明優(yōu)選的pH為5.0-8.0。
本發(fā)明的組合物還可包括用于pH穩(wěn)定化目的的可藥用添加劑、防腐劑、等滲調(diào)節(jié)劑、抗氧化穩(wěn)定劑、螯合劑、抗結(jié)晶劑和其它適宜的添加劑。某些可藥用添加劑可存在于含水溶液中，異環(huán)磷酰胺與HPBCD將被加入到該含水溶液中，和/或某些可藥用添加劑可以在補足最終組合物的體積之前，以水溶液的形式另行被加入。
本發(fā)明的組合物可能需要適宜的緩沖劑以調(diào)整或穩(wěn)定pH。用于本發(fā)明的組合物的適宜的緩沖劑包括，但不限于含有任何通常使用的化合物或化合物的混合物的磷酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑、甘氨酸緩沖劑、組氨酸緩沖劑，所述化合物例如磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鹽酸組氨酸、氫氧化鈉、磷酸、檸檬酸鈉、檸檬酸、甘氨酸、檸檬酸鉀、鹽酸和氫氧化鉀。優(yōu)選的緩沖劑是磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的混合物。
在其他可藥用的添加劑中，用于本發(fā)明組合物的適宜的張力劑選自化合物例如甘油、氯化鈉、麥芽糖、甘露糖醇、葡萄糖及它們的混合物。
類似地，用于本發(fā)明組合物的適宜防腐劑包括但不限于甲基羥基苯甲酸、丙基羥基苯甲酸、苯酚、芐醇和苯甲酸鈉。
本發(fā)明的組合物可含有適宜的螯合劑，所述螯合劑例如乙二胺四乙酸(EDTA)&其鹽和去鐵胺甲烷磺酸(Desferoximine methanesulfonate)(Desferal)。
本發(fā)明的組合物也可以含有適宜的抗氧化劑，所述抗氧化劑例如抗壞血酸、亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite)、偏亞硫酸氫鈉、丁基化羥基苯甲醚和丁基化羥基甲苯。
本發(fā)明的組合物還可以含有物質(zhì)例如甘油作為抗結(jié)晶劑。
所述含有異環(huán)磷酰胺和HPBCD的含水溶液通過下述方法密切接觸，所述方法例如攪拌、混合、超聲、加熱、均質(zhì)化。腸胃外劑型所需要的可藥用添加劑例如緩沖劑、張力劑、防腐劑、螯合劑、抗氧化劑、抗結(jié)晶劑可存在于含水的溶液中，所述溶液中加入了異環(huán)磷酰胺和HPBCD。或者，他們可以在定容體積前以水溶液的形式分別加入。在制備濃縮的異環(huán)磷酰胺組合物中，為了摻入更大量的異環(huán)磷酰胺，將HPBCD溶于最少量水中，異環(huán)磷酰胺通過密切攪拌溶解。如果需要，可藥用添加劑可以以自身加入或以溶液形式加入到異環(huán)磷酰胺-HPBCD溶液中。最后，剩余量的水被加入補足到需要的體積，接著混合得到均質(zhì)化溶液，然后進行滅菌所得到的組合物。如果需要的話，可以在滅菌前通過切向流過濾系統(tǒng)(TFF)使該組合物變?yōu)榉菬嵩葱缘摹?br> 所述組合物通常通過滅菌分級過濾器進行滅菌。優(yōu)選地，可使用0.2μm的滅菌分級過濾器。
本發(fā)明的滅菌組合物可在無菌操作下裝入滅菌容器如小瓶、安瓿、玻璃容器，給容器的頂部充入惰性氣體如氮氣清除空氣并密封填充容器。
不受理論的約束，我們相信異環(huán)磷酰胺、HPBCD和水的三組分系統(tǒng)是穩(wěn)定的含水組合物。目前已經(jīng)從不同方面例如溶解性、絡(luò)合性和膠囊化性經(jīng)過不同的溫度和時間段研究了該系統(tǒng)。其他添加劑對該系統(tǒng)穩(wěn)定性的另外的作用也在研究之中。
眾所周知，用異環(huán)磷酰胺的治療伴有嚴重的副作用，例如出血性膀胱炎，為了抵消該副作用，巰乙磺酸鈉通常與異環(huán)磷酰胺注射劑一起給藥。然而，還存在其它的副作用，例如骨髓抑制、心臟心律失常、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)障礙、腎毒性、血液病學(xué)和胃腸道反應(yīng)，目前市售的異環(huán)磷酰胺組合物不能解決這些副作用。
本發(fā)明的組合物的毒性采用對照市售的常規(guī)劑型(Holoxan)評估。當(dāng)采用瑞士albino小鼠研究時，本發(fā)明的組合物顯示出較小的毒副作用，例如驚厥、骨髓抑制、肝毒性。發(fā)現(xiàn)與常規(guī)市售的產(chǎn)品相比，采用本發(fā)明的組合物處理的動物的死亡率顯著降低。所研究的組合物L(fēng)D50值在實施例中描述。
不受理論的約束，我們認為在水溶液中異環(huán)磷酰胺全部或其部分與HPBCD腔絡(luò)合。在系統(tǒng)給藥時，藥物從腔中釋放進入血流。游離的藥物和藥物-HPBCD絡(luò)合物處于平衡，游離的異環(huán)磷酰胺的代謝轉(zhuǎn)移了平衡，導(dǎo)致游離藥物的釋放。血液中的以絡(luò)合形式存在的異環(huán)磷酰胺和最佳水平的游離藥物可阻止異環(huán)磷酰胺與健康組織和器官的相互作用，從而防止了不想要的副作用。
在本發(fā)明中，異環(huán)磷酰胺和HPBCD可以形成協(xié)同組合物，獲得在存在或不存在巰乙磺酸鈉時降低的毒性，其是通過在小鼠中的LD50值和在大鼠中的出血性膀胱炎研究表明的。具有降低的毒性的本發(fā)明的異環(huán)磷酰胺組合物在治療多種實體瘤和治療Burkitts淋巴瘤中是有效的，所述實體瘤包括那些子宮頸瘤、子宮內(nèi)膜瘤、肺瘤、卵巢瘤、睪丸瘤和胸腺瘤以及肉瘤。
異環(huán)磷酰胺在水中的溶解度為約100mg/ml。本發(fā)明的方法使獲得含有異環(huán)磷酰胺濃度大于100mg/ml的組合物成為可能。含有100mg/ml至1100mg/ml的濃縮溶液提供了另外的優(yōu)點，所述優(yōu)點例如安全性，該安全性是由于減少了處理，從而臨床醫(yī)師在給藥過程中暴露于細胞毒性異環(huán)磷酰胺的機會更少并增加了無菌的保險系數(shù)。
實施例本發(fā)明將通過實施例進行闡述。實施例僅僅是用于闡述，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在這些實施例中使用的異環(huán)磷酰胺符合美國藥典規(guī)定的腸胃外級別。使用的2-羥丙基-β-環(huán)糊精(HPBCD)是由Wacker Chemie制備的，每葡糖苷單元上羥基丙基的摩爾取代為0.5至1.2。使用的設(shè)備是常規(guī)性能的；整個過程是在受控環(huán)境的區(qū)域內(nèi)進行的。在這些實施例中，使用的水是符合“注射用水”規(guī)定的腸胃外級別。在這些實施例中，使用的所有其它的添加劑是腸胃外級別的。
實施例I在水中含有20％HPBCD的異環(huán)磷酰胺50mg/ml組合物的制備下述的組合物是通過下面給出的步驟制備的i異環(huán)磷酰胺 10gm.
iHPBCD40gm.
ii水 適量至200ml.
將所稱重量的HPBCD溶于150ml水中。加入所稱重量的異環(huán)磷酰胺，并混合3小時。用水將體積補足200ml并混合。通過0.2μ過濾器過濾獲得的溶液，并在無菌操作下裝入無菌的玻璃瓶中。在無菌條件下用滅菌的TeflonTM包衣的橡膠蓋封閉玻璃瓶，并使用flipoff封鉛密封。
通過高壓液相色譜(High Pressure LiquidChromatography，HPLC)方法分析在該實施例中獲得的組合物中異環(huán)磷酰胺的含量，發(fā)現(xiàn)含有51.73mg/ml的異環(huán)磷酰胺。該組合物具有的pH為6.5。
實施例II實施例I的組合物的穩(wěn)定性實施例I獲得的組合物用于2-8℃下的長期穩(wěn)定性研究。24個月結(jié)束時的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)顯示在表1中。
表1實施例I的組合物的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
上述數(shù)據(jù)表明了異環(huán)磷酰胺的含量的微小降低，顯示出良好的穩(wěn)定性。
實施例III實施例I的組合物的毒性研究實施例I中獲得的組合物在小鼠中進行急性毒性研究試驗詳述如下使用的動物任意性別的瑞士albino小鼠動物的體重范圍20-22gm.
組數(shù)10每組動物數(shù)10環(huán)境適應(yīng)性在測試條件下在受控溫度和濕度下一周測試物質(zhì)異環(huán)磷酰胺注射劑物質(zhì)(Identity)實施例I的組合物描述澄清無色溶液給藥途徑靜脈給藥對比物質(zhì)HoloxanTM(重構(gòu))物質(zhì)異環(huán)磷酰胺注射液U.S.P.
批號G220生產(chǎn)日期2001年10月有效期2003年9月描述干燥粉末，可與水重構(gòu)用于注射強度與水重構(gòu)時40mg/ml生產(chǎn)商德國Remedies Limited給藥途徑靜脈給藥兩種藥物溶液都用5％的葡萄糖注射液適量稀釋，靜脈內(nèi)給藥。異環(huán)磷酰胺以400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg和800mg/kg體重的劑量給予10組不同的動物，每組包括10只動物。
動物被持續(xù)觀察14天，在第7天末記錄死亡率。LD50劑量，即導(dǎo)致50％的動物死亡的劑量在表2中列出。
表2實施例I的組合物和HoloxanTM的LD50劑量
上述數(shù)據(jù)清楚地表明實施例I的組合物比常規(guī)制劑的毒性小。
實施例IV在磷酸緩沖液中的含有10％HPBCD的異環(huán)磷酰胺組合物的制備通過下面給出的步驟制備下述組合物i異環(huán)磷酰胺 10giiHPBCD 20giii磷酸氫二鈉 0.1giv磷酸二氫鈉 0.06gv水 適量至200ml將所稱重量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶于160ml水中。將所稱重量的HPBCD加入該緩沖液中并在攪拌下慢慢溶解。將所稱重量的異環(huán)磷酰胺在攪拌下逐漸加入緩沖的HPBCD溶液中，并混合3小時。用水將體積補足200ml并混合。通過0.2μ過濾器過濾獲得的溶液，并在無菌操作下裝入無菌的玻璃瓶中。用氮氣清除瓶子頂部的空氣，在無菌條件下用滅菌的TeflonTM包衣的橡膠蓋封閉玻璃瓶，并使用flip off封鉛密封。
通過高壓液相色譜方法(HPLC)分析在該實施例中獲得的組合物的異環(huán)磷酰胺的含量，發(fā)現(xiàn)含有50.23mg/ml的異環(huán)磷酰胺。該組合物具有的pH為7.2。
對比實施例V在緩沖液中的異環(huán)磷酰胺50mg/ml組合物的制備為了通過毒性研究確定HPBCD降低毒性的性質(zhì)，通過下述過程制備在緩沖液中含有異環(huán)磷酰胺的對比組合物i異環(huán)磷酰胺 10g
ii磷酸氫二鈉 0.1giii磷酸二氫鈉0.06giv水 適量至200ml將所稱重量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉溶于180ml水中。將所稱重量的異環(huán)磷酰胺在攪拌下逐漸加入到緩沖液中并混合3小時。用水將體積補足200ml并混合。通過0.2μ過濾器過濾獲得的溶液，并在無菌操作下裝入無菌的玻璃瓶中。用氮氣清除瓶子頂部的空氣，在無菌條件下用滅菌的TeflonTM包衣的橡膠蓋封閉玻璃瓶，并使用filp off封鉛密封。
通過高壓液相色譜方法(HPLC)分析在該實施例中獲得的組合物中異環(huán)磷酰胺的含量，發(fā)現(xiàn)含有50.1mg/ml的異環(huán)磷酰胺。該組合物具有的pH為6.5。
實施例VI實施例IV和V的急性毒性研究試驗詳述如下使用的動物任意性別的瑞士albino小鼠動物的體重范圍20-22gm.
組數(shù)25每組動物數(shù)8環(huán)境適應(yīng)性在測試條件下在受控的溫度和濕度下一周測試物質(zhì)異環(huán)磷酰胺注射劑物質(zhì)實施例IV的組合物描述澄清無色溶液給藥途徑靜脈給藥對比物質(zhì)1.異環(huán)磷酰胺注射液物質(zhì)實施例V的組合物描述澄清無色溶液給藥途徑靜脈給藥對比物質(zhì)2HoloxanTM(重構(gòu))(HoloxanTM的詳述在實施例III中顯示)
泌尿系統(tǒng)保護物質(zhì)UromitexanTM物質(zhì)巰乙磺酸鈉注射液批號G168生產(chǎn)日期2001年10月有效期2004年9月描述澄清&無色溶液，用于靜脈注射強度100mg/ml生產(chǎn)商德國Remedies Limited.
給藥途徑靜脈給藥實施例IV和V中獲得的組合物都用于小鼠的急性毒性研究。常規(guī)制劑HoloxanTM根據(jù)生產(chǎn)商的建議重構(gòu)，并用作對照。選擇用于研究的異環(huán)磷酰胺的劑量為400mg/kg、500mg/kg、600mg/kg、700mg/kg、和800mg/kg體重。實施例IV、實施例V和HoloxanTM的組合物的異環(huán)磷酰胺溶液都用5％的葡萄糖注射液本身適量稀釋，并且也用20％的異環(huán)磷酰胺劑量的巰乙磺酸鈉適量稀釋，靜脈內(nèi)給藥，給予25組不同的動物，每組包括8只動物。
動物被持續(xù)觀察14天，在第7天末記錄死亡率。實施例IV、實施例V和HoloxanTM的組合物的LD50值顯示在表3中。
表3實施例IV、實施例5和HOLOVXANTM的組合物的LD50值
上述數(shù)據(jù)清楚的表明實施例IV的組合物在存在或不存在巰乙磺酸鈉時比常規(guī)制劑和緩沖液中的異環(huán)磷酰胺的的毒性低。
實施例VII實施例IV的組合物的重復(fù)劑量毒性研究實施例IV中獲得的組合物和常規(guī)制劑HoloxanTM用于小鼠重復(fù)劑量毒性研究以評估異環(huán)磷酰胺組合物對血液學(xué)和生物化學(xué)參數(shù)的作用。
試驗詳述如下使用的動物任意性別的瑞士albino小鼠動物的體重范圍20-22gm組數(shù)7每組動物數(shù)10環(huán)境適應(yīng)性在測試條件下在受控溫度和濕度下一周測試物質(zhì)實施例IV的組合物對照物質(zhì)HoloxanTM(重構(gòu))泌尿系統(tǒng)保護物質(zhì)UromitexanTM(HoloxanTM和UromitexanTM的詳述已經(jīng)在實施例VI中給出)給所述動物以80mg/kg、100mg/kg和120mg/kg的每日劑量靜脈注射異環(huán)磷酰胺和巰乙磺酸鈉(異環(huán)磷酰胺劑量的20％)7天。未處理組作為對照組使用。在14天研究期間觀察動物的死亡率、血液學(xué)和生物化學(xué)改變。用實施例IV的組合物和HoloxanTM處理之前和之后進行總WBC計數(shù)。數(shù)值顯示在表4中。
表4用實施例IV的組合物和HoloxanTM處理的動物的總WBC計數(shù)
用實施例IV和HoloxanTM處理的動物表現(xiàn)出總WBC計數(shù)的減少。然而，與實施例IV的組合物相比，用HoloxanTM處理的動物顯示出嚴重的白血球減少。這表明實施例IV的組合物具有較小的毒性。
為了研究實施例IV的組合物和HoloxanTM對腎功能的效果，分析處理的和未處理的對照組的血清谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(SGOT)水平。處理組和未處理對照組的SGOT水平顯示在表5中。
表5用實施例IV的組合物、HoloxanTM處理的動物和未處理對照組的平均SGOT水平。
按照上述數(shù)據(jù)，用實施例IV處理的動物中SGOT水平的上升略微高于對照組，然而，在用HoloxanTM處理的動物中SGOT值的增長非常顯著。這表明降低了實施例IV的組合物的肝毒性。
實施例VIII組合物IV的出血性膀胱炎研究實施例IV中獲得的組合物和常規(guī)制劑HoloxanTM一起用于大鼠出血性膀胱炎研究以評價它們的膀胱毒性(BLADDERTOXICITY)試驗詳述如下使用的動物任意性別的Wistar大鼠動物的體重范圍100-150gm組數(shù)9每組動物數(shù)2環(huán)境適應(yīng)性在測試條件下在受控溫度和濕度下一周測試物質(zhì)實施例IV的組合物對照物質(zhì)HoloxanTM(重構(gòu))泌尿系統(tǒng)保護物質(zhì)UromitexanTM(HoloxanTM和UromitexanTM的詳述已經(jīng)在實施例VI中給出)研究設(shè)計將動物分成9組，每組包括兩只動物。異環(huán)磷酰胺單獨和與巰乙磺酸鈉一起經(jīng)過靜脈途徑以400mg/kg和500mg/kg體重的劑量給藥。用葡萄糖注射劑處理的組作為對照使用。
動物在注射24小時后處死。收集所有動物的膀胱，并用10％福爾馬林溶液固定48小時。制備器官的組織病理學(xué)切片，并經(jīng)過顯微鏡檢查。
觀察表6描述了異環(huán)磷酰胺的兩種制劑對出血性膀胱炎的評價結(jié)果表6出血性膀胱炎的評分
N正常1+輕度出血性膀胱炎2+中度出血性膀胱炎，伴有或不伴有上皮細胞異型3+重度出血性膀胱炎，伴有或不伴有上皮細胞異型結(jié)果Holoxan中度至重度出血性膀胱炎Holoxan和巰乙磺酸鈉輕度至中度出血性膀胱炎實施例IV輕度至中度出血性膀胱炎實施例IV和巰乙磺酸鈉沒有出血性膀胱炎結(jié)論上述結(jié)果最終證實實施例IV的組合物比常規(guī)的制劑HoloxanTM具有更低的膀胱毒性。
實施例IX實施例IV的組合物的穩(wěn)定性研究在實施例IV中獲得的組合物用于2-8℃的穩(wěn)定性研究。在第6和第12個月末，通過HPLC方法分析樣品。數(shù)據(jù)顯示在表7中。
表7實施例IV的組合物的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
上述數(shù)據(jù)顯示在2℃-8℃下異環(huán)磷酰胺含量的不明顯降低，表明超過12個月時期的良好穩(wěn)定性。
包括不同濃度的異環(huán)磷酰胺和HPBCD的本發(fā)明的其他組合物顯示在表8中表8本發(fā)明的其它組合物
根據(jù)下列的步驟制備表8列出的組合物。
實施例X將異環(huán)磷酰胺(10g)和HPBCD(40g)、磷酸氫二鈉(0.1g)和磷酸氫鈉(0.06g)置入量瓶中。慢慢加入注射用水并間歇性混合得到200ml澄清均一的溶液。通過無菌的0.2μm過濾器過濾獲得的溶液，并在無菌操作下裝入無菌的10ml玻璃瓶中。用氮氣清除瓶子頂部的空氣，在無菌條件下用滅菌的TeflonTM包衣的橡膠蓋封閉玻璃瓶，并使用flip off封鉛密封。
實施例XI將異環(huán)磷酰胺(10g)和HPBCD(80g)、磷酸氫二鈉(0.1g溶于10ml水中)和磷酸氫鈉(0.06g溶于10ml水中)置入量瓶中。慢慢加入注射用水并間歇性混合得到200ml澄清均一的溶液。通過無菌的0.2μm過濾器過濾獲得的溶液，并在無菌操作下裝入滅菌的10ml玻璃瓶中。用氮氣清除瓶子頂部的空氣，在無菌條件下用滅菌的TeflonTM包衣的橡膠蓋封閉玻璃瓶，并使用flip off封鉛密封。
實施例XII將HPBCD(20g)溶于40ml水中。將異環(huán)磷酰胺(10g)逐漸加入到濃縮的HPBCD溶液中，以中等速度攪拌混合物1小時。然后用水稀釋澄清溶液至200ml。通過0.2μm過濾器過濾獲得的溶液，并在無菌操作下裝入無菌的10ml玻璃瓶中。用氮氣清除瓶子頂部的空氣，在無菌條件下用滅菌的TeflonTM包衣的橡膠蓋封閉玻璃瓶，并使用flip off封鉛密封。
實施例XIII按照實施例IV的制備過程使用表8中提到的成分的含量制備組合物。
實施例XIV將HPBCD(40g)溶于80ml水中。將異環(huán)磷酰胺(100g)逐漸加入到濃縮的HPBCD溶液中，攪拌溶解。用水補足體積至200ml并混合。通過0.2μm過濾器過濾獲得的溶液，并在無菌操作下裝入無菌的10ml玻璃瓶中。用氮氣清除瓶子頂部的空氣，在無菌條件下用滅菌的TeflonTM包衣的橡膠蓋封閉玻璃瓶，并使用flip off封鉛密封。通過HPLC分析該實施例的組合物的異環(huán)磷酰胺含量，發(fā)現(xiàn)含有500.3mg/ml的異環(huán)磷酰胺。
實施例XV按照實施例XIV的制備過程使用表8中提到的成分的含量制備組合物。通過HPLC分析該實施例的組合物的異環(huán)磷酰胺含量，發(fā)現(xiàn)含有500.28mg/ml的異環(huán)磷酰胺。
實施例XVI將異環(huán)磷酰胺(200g)和HPBCD(10g)置入量瓶中。慢慢加入注射用水并間歇性混合得到200ml澄清均一的溶液。通過無菌0.2μm過濾器過濾獲得的溶液，并在無菌操作下裝入無菌的10ml玻璃瓶中。用氮氣清除瓶子頂部的空氣，在無菌條件下用滅菌的TeflonTM包衣的橡膠蓋封閉玻璃瓶，并使用flip off封鉛密封。通過HPLC分析該實施例的組合物中的異環(huán)磷酰胺含量，發(fā)現(xiàn)含有1025.5mg/ml的異環(huán)磷酰胺。
權(quán)利要求
1.用于腸胃外給藥的具有降低的毒性的、穩(wěn)定的、澄清的含水異環(huán)磷酰胺組合物，包括所述組合物中最多1100mg/ml的異環(huán)磷酰胺和2-羥丙基-β-環(huán)糊精。
2.如權(quán)利要求1所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中在2-羥丙基-β-環(huán)糊精中羥丙基的摩爾取代為0.05-2。
3.如權(quán)利要求1或2中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中在2-羥丙基-β-環(huán)糊精中羥丙基的摩爾取代為0.3-1.5。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中在2-羥丙基-β-環(huán)糊精中羥丙基的摩爾取代為0.5-1.2。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中異環(huán)磷酰胺與2-羥丙基-β-環(huán)糊精的摩爾比為100∶0.1-1∶300。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中異環(huán)磷酰胺與2-羥丙基-β-環(huán)糊精的摩爾比為100∶0.25-1∶100。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中異環(huán)磷酰胺與2-羥丙基-β-環(huán)糊精的摩爾比為100∶1-1∶20。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中異環(huán)磷酰胺與2-羥丙基-β-環(huán)糊精的摩爾比為100∶3.3-1∶2.5。
9.如權(quán)利要求1所述的異環(huán)磷酰胺組合物，還含有可藥用添加劑，其選自緩沖劑、張力劑、防腐劑、螯合劑、抗氧化劑、抗結(jié)晶劑。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為1-200mg/ml。
11.如權(quán)利要求1-10中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為1-100mg/ml。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為40-50mg/ml。
13.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為200-500mg/ml。
14.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為500-1000mg/ml。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中組合物的pH為3.0-9.0。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中組合物的pH為5.0-8.0。
17.如權(quán)利要求9所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中緩沖劑選自磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸、鹽酸組氨酸、氫氧化鈉、鹽酸及其混合物。
18.如權(quán)利要求17所述的異環(huán)磷酰胺組合物，其中緩沖劑為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的混合物。
19.制備權(quán)利要求1-18中任一項所述的異環(huán)磷酰胺組合物的方法，包括步驟i使異環(huán)磷酰胺、2-羥丙基-β-環(huán)糊精和水密切接觸；ii對步驟(i)結(jié)束時獲得的組合物進行滅菌。
20.如權(quán)利要求19所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，還包括在使異環(huán)磷酰胺、2-羥丙基-β-環(huán)糊精和水密切接觸時加入需要量的可藥用添加劑。
21.如權(quán)利要求19-20中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中組合物通過無菌的0.2μm的滅菌級過濾器滅菌。
22.如權(quán)利要求19-21中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，還包括如下步驟將無菌組合物在無菌操作下轉(zhuǎn)移到無菌容器中，用惰性氣體清除容器上方的空氣并密封容器。
23.如權(quán)利要求19-22中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中在2-羥丙基-β-環(huán)糊精中羥丙基的摩爾取代為0.05-2。
24.如權(quán)利要求19-23中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中在2-羥丙基-β-環(huán)糊精中羥丙基的摩爾取代為0.3-1.5。
25.如權(quán)利要求19-24中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中在2-羥丙基-β-環(huán)糊精中羥丙基的摩爾取代為0.5-1.2。
26.如權(quán)利要求19-25中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中異環(huán)磷酰胺與2-羥丙基-β-環(huán)糊精的摩爾比為100∶0.1-1∶300。
27.如權(quán)利要求19-26中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中異環(huán)磷酰胺與2-羥丙基-β-環(huán)糊精的摩爾比為100∶0.25-1∶100。
28.如權(quán)利要求19-27中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中異環(huán)磷酰胺與2-羥丙基-β-環(huán)糊精的摩爾比為100∶1-1∶20。
29.如權(quán)利要求19-28中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中異環(huán)磷酰胺與2-羥丙基-β-環(huán)糊精的摩爾比為100∶3.3-1∶2.5。
30.如權(quán)利要求20所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中所述的可藥用添加劑選自緩沖劑、張力劑、防腐劑、螯合劑、抗氧化劑、抗結(jié)晶劑。
31.如權(quán)利要求19-30中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為1-200mg/ml。
32.如權(quán)利要求19-31中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為10-100mg/ml。
33.如權(quán)利要求19-32中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為40-50mg/ml。
34.如權(quán)利要求19-30中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為200-500mg/ml。
35.如權(quán)利要求19-30中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中組合物中異環(huán)磷酰胺的含量為500-1000mg/ml。
36.如權(quán)利要求19-35中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中組合物的pH為3.0-9.0。
37.如權(quán)利要求19-36中任一項所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中組合物的pH為5.0-8.0。
38.如權(quán)利要求30所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中緩沖劑選自磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、鹽酸組氨酸、氫氧化鈉及其混合物。
39.如權(quán)利要求38所述的制備異環(huán)磷酰胺組合物的方法，其中所述的緩沖劑為磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉的混合物。
40.如權(quán)利要求1所述的用于腸胃外給藥的具有降低的毒性的、穩(wěn)定的、澄清的含水異環(huán)磷酰胺組合物，其中每毫升的組合物含有異環(huán)磷酰胺50mg，2-羥丙基-β-環(huán)糊精100mg，磷酸二氫鈉0.3mg，和磷酸氫二鈉0.5mg。
41.如權(quán)利要求1所述的用于腸胃外給藥的具有降低的毒性的、穩(wěn)定的、澄清的含水異環(huán)磷酰胺組合物，其中每毫升的組合物含有異環(huán)磷酰胺500mg，和2-羥丙基-β-環(huán)糊精400mg。
42.如權(quán)利要求1所述的用于腸胃外給藥的具有降低的毒性的、穩(wěn)定的、澄清的含水異環(huán)磷酰胺組合物，其中每毫升的組合物含有異環(huán)磷酰胺1000mg，和2-羥丙基-β-環(huán)糊精50mg。
43.如在本文中和實施例中描述的異環(huán)磷酰胺組合物及其制備方法。
全文摘要
本發(fā)明提供含水的異環(huán)磷酰胺組合物及其制備方法，其中該組合物與泌尿系統(tǒng)保護劑巰乙磺酸鈉同時使用時具有降低的毒性。異環(huán)磷酰胺的含水組合物可制備成高達1100mg/ml的濃度。
文檔編號A61K31/33GK1744904SQ200380109416
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月2日
發(fā)明者G·V·達塔里, S·A·帕伊, S·H·里范卡, K·S·普拉維恩 申請人:印度血清及疫苗有限公司