專利名稱：一種消癌平注射制劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于中藥制藥技術領域，涉及一種治療癌癥的藥物制劑及其制備方法，具體地說是一種消癌平注射制劑及其制備方法。
背景技術：
通關藤為蘿摩科植物，其地方名有烏骨藤、下奶藤及大骨藤等，產于云南和貴州南部，藥用藤、葉、莖含甾體苦味酯甙、多糖類、生物堿等，味苦，微寒。藥理研究表明通關藤具有平喘、降壓及抑菌等作用，能干擾癌細胞核糖核酸及DNA的合成，阻止癌細胞分裂、繁殖。以通關藤為原料制備而成的中藥消癌平制劑，具有保肝、利水和恢復放、化療后血象的作用，并能促進食欲，消除疼痛，使病灶穩(wěn)定或縮小，經十多年的臨床驗證，對多種惡性腫瘤均有良好療效，尤其對肺癌、食管癌、胃癌、白血病、宮頸癌等疾病的治療更為適宜，對心、肝、腎及造血系統(tǒng)均無明顯毒副作用，是一種很有前途的抗癌中藥。目前，中藥消癌平制劑有片劑、口服液及注射液。消癌平注射液采用水提醇沉法工藝制備，用水加熱提取后醇沉除雜，醇沉工藝在純化除雜的同時，除掉了其中的多糖成份，而中國專利CN1076859A報道通關藤多糖為抗癌的有效成份。
中國發(fā)明專利CN1372971A在制備通關藤注射液時先采用乙醇回流提取得總苷，再對藥渣水提醇沉得多糖的工藝，有效組分含量不高，純化、除雜效果不理想，使用大量的乙醇，成本較高，后續(xù)回收乙醇工作也較煩瑣。
大孔樹脂是一類有機高聚物吸附劑，是一種非凝膠型、注有致孔劑、不含交換基團、有含空隙結構的“純聚合物”。其平均孔徑在30～100A，具有比表面積大，吸附容量大，選擇性好，再生處理方便，工藝簡單，生產成本較低等特點，特別適合于從水溶液中分離化合物，在多種中草藥有效成分的提取、純化中已取得了成功，但是尚未見應用大孔樹脂對通關藤進行分離、純化的報道。
中藥質量控制是中藥現代化、國際化的關鍵。中藥制劑有效成分的含量控制方法主要有薄層掃描法、分光光度法、高效液相色譜法(HPLC)和氣相色譜法。目前藥廠應用較為普遍的是分光光度法和HPLC，分光光度法由于成本低，應用更為普遍，但是分光光度法由于自身的缺陷，不能夠檢測出總含量中各具體成分的含量比例，其應用受到越來越多的限制。相比之下，HPLC作為一種正在普及的檢測技術，在中藥制藥行業(yè)的應用已逐漸成為主流手段，越來越多的廠家在中藥制劑質量評價中應用HPLC分析方法。
目前，消癌平注射液的質量控制仍采用部頒標準中的分光光度法，以綠原酸折算其總酚酸的含量。若采用HPLC對其進行有效成分的含量測定可以更好的控制藥品的內在質量。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于以首次從通關藤中分離鑒定出的單體化合物東莨菪內酯為質控指標，提供一種穩(wěn)定性好、療效顯著、制備工藝更合理的消癌平注射制劑，包括注射液和凍干粉針劑。應用該方法制得的消癌平注射制劑對S180荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用優(yōu)于現有的消癌平注射劑。本發(fā)明還公開了消癌平注射制劑的制備方法。
本發(fā)明內容通過以下技術方案實現1將通關藤用10～12倍量水煎煮2～3次，每次60～120min，合并煎液濾過，濃縮，高速離心，上清液備用；2取高速離心后的上清液，上已預先處理好的大孔吸附樹脂柱，先以去離子水洗至無糖，再以20～80％乙醇洗至無苷類止，分別收集水洗脫液和醇洗脫液；3大孔樹脂柱的水洗脫液濃縮，加入乙醇，使含醇量達60～90％，充分攪拌后靜置，濾過，沉淀加50～100倍量蒸餾水溶解，過中空纖維柱超濾(截留分子量6000～100000)、濃縮，得提取液A。
4大孔樹脂柱的醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮得提取液B。
5合并提取液A和B，加入適量助溶劑，攪勻、冷藏、濾過，再補充適量注射用水，攪勻，過濾、分裝、滅菌、包裝即得本發(fā)明的消癌平注射液。
6合并提取液A和B，攪勻、冷藏、濾過，加入凍干賦形劑，調PH 6.5～7，濾過，濾液加0.1％活性炭煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋即得本發(fā)明的消癌平注射制劑的凍干粉針劑。
用于純化有效部位的大孔吸附樹脂，可以是非極性、弱極性或者極性大孔吸附樹脂，優(yōu)選弱極性大孔吸附樹脂，包括AB-8和D101樹脂。凍干賦形劑可以是制劑學上可接受的任意常用的凍干賦形劑。優(yōu)選凍干賦形劑為甘露醇、乳糖、蔗糖、或葡萄糖中的一種或兩種的復合賦形劑。
本發(fā)明的一種消癌平注射制劑制備工藝，在采用大孔樹脂純化通關藤中的總苷的同時，保留了通關藤中的多糖類有效部位，優(yōu)于傳統(tǒng)方法的水提醇沉工藝，因為多糖絕大部分在水提醇沉工藝中丟失；本發(fā)明的制備工藝，采用大孔樹脂吸附技術，提高了制劑中總苷類有效部位的含量，優(yōu)于中國發(fā)明專利CN1372971A的乙醇回流法制備工藝。應用HPLC對首次從通關藤中分離鑒定出的單體化合物東莨菪內酯進行含量測定，使本發(fā)明的一種消癌平注射制劑的內在質量得到很好的控制。本發(fā)明的一種消癌平注射制劑穩(wěn)定性好、質量高、療效顯著，臨床上可用于惡性腫瘤的治療。實驗表明，應用本發(fā)明方法制得的消癌平注射制劑對S180荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用優(yōu)于現有的消癌平注射劑。
東莨菪內酯有鎮(zhèn)痛，抗炎等藥理作用，其抗菌消炎作用和水楊酸鈉作用相似。以東莨菪內酯為指標，建立HPLC法測定其在消癌平注射制劑中的含量，有助于控制消癌平注射制劑的內在質量。
下面是通關藤中新成分東莨菪內酯的發(fā)現、分離與鑒定實驗。
1 實驗儀器與材料日本島津LC-10AT高效液相色譜儀；日本島津SPD-6A紫外檢測器；島津IR-400紅外分光光度計；MAT212型質譜儀；FT90Q型核磁共振儀；青島海洋化工廠產柱層析、薄層層析用硅膠GF254；實驗所用試劑均為色譜純。
2 實驗方法與結果2.1 東莨菪內酯的發(fā)現及提取、分離取通關藤5kg適度粉碎后，用95％乙醇溫浸提取，提取液減壓回收乙醇至浸膏，將浸膏與水適量混懸，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分別回收溶劑，得到各萃取部位。其中氯仿萃取物干法拌樣，濕法裝柱，經硅膠H柱層析，以石油醚-氯仿(1∶0～1∶1)梯度洗脫，得到化合物I。
2.2 東莨菪內酯的鑒定以上實驗獲得的化合物I結晶，經紫外、紅外、質譜、氫譜、碳譜鑒定分析確定X物質為東莨菪內酯。其結構式為 化合物I為淺黃色針晶，mp.209℃～210.5℃。具強烈藍色熒光，異羥肟酸鐵反應紅色。，UVλMeOHmax253.3，300，348。IR(KBr)cm-13335，1690，1600，1510，1425，1300，1255，1130，1015，910，850，810，730。EI-MSm/z192(M+*，87)，177(100)，164(38)，149(62)，121(27)，107(4)，69(47)。1HNMR(CDCl3)δppm3.96(3H，s，6-OCH3)，6.27(1H，d，J＝9.4Hz，3-H)，7.60(1H，d，J＝9.4Hz，4-H)，6.92(1H，s，5-H)，6.85(1H，s，8-H)。13CNMR(CDCl3)δppm161.5(C-2)，113.4(C-3)，143.3(C-4)，111.5(C-4a)，107.5(C-5)，144.0(C-6)，149.7(C-7)，103.2(C-8)，150.3(C-8a)。EI-MS給出分子量為192，結合DEPT譜確定分子式為C10H8O4。1HNMR顯示有一個甲氧基質子信號δ3.96(3H，s)，δ6.27(1H，d，J＝9.4Hz)與δ7.60(1H，d，J＝9.4Hz)有鄰位偶合關系，為香豆素特征；δ6.92(1H，s)與δ6.85(1H，s)兩者無明顯偶合關系，說明為苯環(huán)對位H，提示該香豆素的6，7位有取代，根據分子式可知6，7位應為甲氧基及羥基取代。由EI-MS可知，化合物I的M-CH3峰(m/e177)為基峰，并有很強的M-CH3-CO離子(m/e149)，已知由于醌式結構的形成使得C6-甲氧基容易失去甲基，故6位為甲氧基取代，而7位為羥基取代。以上數據與已知化合物東莨菪內酯UV、IR、MS、1HNMR、13CNMR標準圖譜核對均一致，故鑒定化合物I為東莨菪內酯。此化合物為首次從該植物中分離得到。
實驗消癌平注射制劑中東莨菪內酯含量的測定1 實驗儀器與材料日本島津LC-10AT高效液相色譜儀；日本島津SPD-6A紫外檢測器；東莨菪內酯對照品，中國生物制品檢定所；消癌平注射劑及凍干粉針劑，廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供。甲醇為色譜純，Fisher公司；水為超純水，其余均為分析純。
2 方法與結果2.1 色譜條件色譜柱Waters C18反相色譜柱(3.5×15cm，5μm)；流動相甲醇-0.5％冰醋酸水(38∶62)，流速0.9ml/min，柱溫25℃，檢測波長343nm；東莨菪內酯對照品保留時間為12min；定量方法外標法。
2.2 含量測定方法2.2.1 對照品溶液制備 精密稱定東莨菪內酯對照品，加氯仿制成每1ml含60μg的溶液，作為對照品溶液。
2.2.2 供試品溶液制備 取消癌平凍干粉適量以水溶解，將消癌平凍干粉水溶液及消癌平注射液用乙酸乙酯提取3次，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，定容至10ml量瓶中，搖勻。用0.45μm微孔濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。每1ml溶液相當于生藥通關藤0.5g。
2.2.3 標準曲線的制作精密吸取東莨菪內酯對照品溶液0.5，1，2，3，4ml，分別置10ml量瓶中，加氯仿稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取各對照品溶液10μl，依次注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標，東莨菪內酯進樣量(μg)為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y＝3.421×103X+17.174，r＝0.9999(n＝5)。結果表明東莨菪內酯在0.15～1.24μg范圍內線性關系良好。
2.2.4 精密度試驗 精密吸取供試品溶液10μl，連續(xù)進樣5次，RSD為0.82％。
2.2.5 回收率實驗 精密稱取已知東莨菪內酯含量的消癌平注射劑，精確加入東莨菪內酯對照品，按樣品溶液的制備方法操作，測定其含量，并計算回收率，東莨菪內酯的平均回收率為98.63％，RSD為0.97％。
2.3樣品測定 吸取供試品溶液10μl，進樣，根據標準曲線計算含量，結果見表1。
表1 樣品中東莨菪內酯含量的測定結果測定批數樣品1 2 3 4 5 X消癌平注射劑(μg·ml-1) 41.543.940.841.140.7 41.6消癌平凍干粉針劑(μg·mg-1) 2.3 2.5 2.0 2.2 2.02.2下面通過本發(fā)明的一種注射用消癌平注射劑和現有消癌平注射劑對S180荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用的比較實驗，對本發(fā)明作進一步說明。
1 實驗材料與儀器消癌平注射劑A，廣東天之驕藥物開發(fā)有限公司實驗室提供；消癌平注射劑B，通化神源藥業(yè)有限公司生產；昆明種小鼠50只，由第一軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，體重20±2g，雌雄各半；實驗瘤株S180(肉瘤)由第一軍醫(yī)大學細胞實驗室提供。
2.實驗方法與結果小鼠50只隨機分5組對照組(生理鹽水組)、消癌平注射劑A組(0.02ml/kg、0.04ml/kg)、消癌平注射劑B組(0.02ml/kg、0.04ml/kg)、5-FU組(50mg/kg)。于接種后次日連續(xù)ip給藥7d，末次給藥后1h，處死動物，取腫瘤組織，計算抑瘤率。腫瘤體積＝長徑×短徑×短徑/2；抑瘤率＝(對照組瘤體積-用藥組瘤體積)/對照組瘤體積×100％。實驗結果見表1。
表1 消癌平對S180荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用組別 劑量瘤體積(mm3)抑制率(％)對照組 - 8.6±3.1-0.02ml/kg 4.1±2.352.3消癌平注射劑A組0.04ml/kg 2.2±2.074.40.02ml/kg 5.5±2.736.0消癌平注射劑B組0.04ml/kg 2.8±2.367.45-FU組 50mg/kg 2.0±1.976.具體實施方式
實施例一規(guī)格1000瓶(凍干粉針劑)1 將通關藤1000g用12倍量水煎煮2次，第一次120min，第二次90min，合并煎液濾過，濃縮，高速離心，上清液備用；2 取高速離心后的上清液，上已預先處理好的AB-8大孔吸附樹脂柱，先以去離子水洗至無糖，再以20％乙醇洗至無苷類止，分別收集水洗脫液和醇洗脫液；3 大孔樹脂柱的水洗脫液濃縮，加入乙醇，使含醇量達80％，充分攪拌后靜置，濾過，沉淀加50倍量蒸餾水溶解，過中空纖維柱超濾(截留分子量6000～100000)、濃縮，得提取液A。
4 大孔樹脂柱的醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮得提取液B。
5 合并提取液A和B，攪勻、冷藏、濾過，加注射用甘露醇20g、加注射用乳糖20g，調PH 6.5～7，濾液加0.1％活性炭煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，得溶液，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋即得(東莨菪內酯含量為2.4μg·mg-1)。
實施例二規(guī)格100瓶(凍干粉針劑)1 將通關藤100g用10倍量水煎煮3次，第一次120min，第二次90min，第三次60min，合并煎液濾過，濃縮，高速離心，上清液備用；2 取高速離心后的上清液，上已預先處理好的D101大孔吸附樹脂柱，先以去離子水洗至無糖，再以80％乙醇洗至無苷類止，分別收集水洗脫液和醇洗脫液；3 大孔樹脂柱的水洗脫液濃縮，加入乙醇，使含醇量達60％，充分攪拌后靜置，濾過，沉淀加100倍量蒸餾水溶解，過中空纖維柱超濾(截留分子量6000～100000)、濃縮，得提取液A。
4 大孔樹脂柱的醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮得提取液B。
5 合并提取液A和B，攪勻、冷藏、濾過，加注射用甘露醇30g，調PH 6.5～7，濾液加0.1％活性炭煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，得溶液，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋即得。(東莨菪內酯含量為2.7μg·mg-1)。
實施例三規(guī)格500ml1 將通關藤500g用10倍量水煎煮3次，第一次90min，第二次90min，第三次60min，合并煎液濾過，濃縮，高速離心，上清液備用；2 取高速離心后的上清液，上已預先處理好的DA大孔吸附樹脂柱，先以去離子水洗至無糖，再以40％乙醇洗至無苷類止，分別收集水洗脫液和醇洗脫液；3 大孔樹脂柱的水洗脫液濃縮，加入乙醇，使含醇量達90％，充分攪拌后靜置，濾過，沉淀加50倍量蒸餾水溶解，過中空纖維柱超濾(截留分子量6000～100000)、濃縮，得提取液A。
4 大孔樹脂柱的醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮得提取液B。
5 合并提取液A和B，加入吐溫80 5ml，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水至500ml，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，即得(東莨菪內酯含量為45μg·ml-1)。
實施例四規(guī)格1000ml
1 將通關藤1000g用12倍量水煎煮2次，第一次120min，第二次60min，合并煎液濾過，濃縮，高速離心，上清液備用；2 取高速離心后的上清液，上已預先處理好的DA大孔吸附樹脂柱，先以去離子水洗至無糖，再以50％乙醇洗至無苷類止，分別收集水洗脫液和醇洗脫液；3 大孔樹脂柱的水洗脫液濃縮，加入乙醇，使含醇量達70％，充分攪拌后靜置，濾過，沉淀加80倍量蒸餾水溶解，過中空纖維柱超濾(截留分子量6000～100000)、濃縮，得提取液A。
4 大孔樹脂柱的醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮得提取液B。
5 合并提取液A和B，加入吐溫80 10ml，攪勻、冷藏、濾過，加注射用水至1000ml，過濾，分裝，115℃滅菌30分鐘，包裝，即得(東莨菪內酯含量為42μg·ml-1)。
權利要求
1一種消癌平注射制劑，其特征在于它是由從通關藤中提取的多糖有效部位和總苷類有效部位組成的，以東莨菪內酯為質控指標。
2根據權利要求1所述的總苷類有效部位，其特征在于它是通過提取通關藤的有效組分后，上大孔吸附樹脂柱，用乙醇溶液洗脫，純化制得的。
3根據權利要求1所述的一種消癌平注射制劑包括注射液和凍干粉針劑。其中注射液中東莨菪內酯含量不少于40μg·ml-1，凍干粉針劑中東莨菪內酯含量不少于2μg·mg-1。
4根據權利要求1所述的一種消癌平注射制劑中的通關藤多糖，其特征為分子量為6000～100000。
5根據權利要求2所述用于純化有效部位的大孔吸附樹脂，其特征在于它可以是非極性、弱極性或者極性大孔吸附樹脂，優(yōu)選弱極性大孔吸附樹脂，包括AB-8和D101。
6根據權利要求2所述用大孔吸附樹脂柱純化，以乙醇溶液洗脫，其特征在于所用乙醇的濃度為20-80％。
7根據權利要求3所述的凍干粉針劑，其中的凍干賦形劑可以是制劑學上可接受的任意常用的凍干賦形劑。
8根據權利要求3所述的凍干粉針劑，其中的凍干賦形劑也可以是甘露醇、乳糖、蔗糖、或葡萄糖中的一種或兩種的復合賦形劑。
9一種消癌平注射液的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)通關藤粉碎后，用10～12倍量水煎煮2～3次，每次60～120min，合并煎液濾過，濃縮，高速離心，上清液備用；(2)高速離心后的上清液，上已預先處理好的大孔吸附樹脂柱，先以去離子水洗至無糖，再以20～80％乙醇洗至無苷類止，分別收集水洗脫液和醇洗脫液；(3)大孔樹脂柱的水洗液濃縮，加入乙醇，使含醇量達60～90％，充分攪拌后靜置，濾過，沉淀加50～100倍量蒸餾水溶解，過中空纖維柱超濾(截留分子量6000～100000)、濃縮，得提取液A。(4)大孔樹脂柱的醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮得提取液B。(5)合并提取液A和B，加入適量助溶劑，攪勻、冷藏、濾過，再補充適量注射用水，攪勻，過濾、分裝、滅菌、包裝即得本發(fā)明的消癌平注射液。
10一種消癌平凍干粉針劑的制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)通關藤粉碎后，用10～12倍量水煎煮2～3次，每次60～120min，合并煎液濾過，濃縮，高速離心，上清液備用；(2)高速離心后的上清液，上已預先處理好的大孔吸附樹脂柱，先以去離子水洗至無糖，再以20～80％乙醇洗至無苷類止，分別收集水洗脫液和醇洗脫液；(3)大孔樹脂柱的水洗液濃縮，加入乙醇，使含醇量達60～90％，充分攪拌后靜置，濾過，沉淀加50～100倍量蒸餾水溶解，過中空纖維柱超濾(截留分子量6000～100000)、濃縮，得提取液A。(4)大孔樹脂柱的醇洗脫液，回收乙醇后，濃縮得提取液B。(5)合并提取液A和B，攪勻、冷藏、濾過，加入凍干賦形劑，調PH 6.5～7，濾過，濾液加0.1％活性炭煮沸15min，稍冷，過濾至澄明，滅菌后分裝，冷凍干燥，壓蓋即得本發(fā)明的消癌平注射制劑的凍干粉針劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種消癌平注射制劑，其特征在于通過提取通關藤的有效組分后，上大孔吸附樹脂柱純化，分別收集大孔樹脂水洗脫部位和醇洗脫部位，得到多糖部位和總苷部位。本發(fā)明應用首次從通關藤中分離鑒定出的單體化合物東莨菪內酯為質控指標，使本發(fā)明的一種消癌平注射制劑的內在質量得到很好的控制。本發(fā)明的一種消癌平注射制劑穩(wěn)定性好、質量高、療效顯著，臨床上可用于惡性腫瘤的治療。
文檔編號A61K31/715GK1546055SQ200310121000
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月14日 優(yōu)先權日2003年12月14日
發(fā)明者張正生 申請人:張正生