專利名稱：一種治療智能減退、癡呆的中藥組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物，特別涉及用于治療智能減退、癡呆的中藥組合物，同時涉及該組合物的制備方法。
背景技術(shù)：
老年期癡呆的發(fā)病過程不單純是腦的局部病變和腦功能獨(dú)立受損，而是全身性老化和病變的局部表現(xiàn)，常用的抗癡呆藥物雖然有對癥治療的效果，但是對癡呆的預(yù)防和改善預(yù)后的效果不佳。
中醫(yī)認(rèn)為癡呆之發(fā)病，除因先天稟賦或熱病傷神者外，凡于老年后逐漸發(fā)病者，均與腎、心、脾之患有關(guān)。腎為先天之，為元陰元陽之所在。藏精主骨生髓，腦為髓海，腎精充則髓海充盈；心藏神而主血脈，《靈樞雅容》心者，五臟六腑之大主也，精神之所舍也。《靈樞·本神》“心藏脈，脈藏神”，無形之神淡有形之精血所載，血脈通利，陰陽配合則精，神相得為安，所以《靈樞·神》說“心藏脈，脈舍神”；脾主運(yùn)化，為后天之本，氣血生化之源，統(tǒng)攝血液，運(yùn)化水濕。若腎精不足，元陰元陽虧損，則不能生髓充腦，腦失所養(yǎng)，神明失健；心氣虛則血脈不得通暢，腎精虛則水火不相既濟(jì)，以致神不守舍，神明無主；脾虛則失健運(yùn)，后天失養(yǎng)，精血化生無源，水谷精微停聚化為痰濁，蒙蔽清竅而神明不精?？傊?，癡呆一癥，其病在臟以心，脾、腎為主，病機(jī)為精血不足，氣滯而血脈不暢，痰濁蒙蔽所致。以虛為本，虛中扶實(shí)。對本病的治療應(yīng)針對上述病機(jī)而設(shè)。
醫(yī)藥對癡呆的治療在理論上側(cè)重整體調(diào)整，在臨床方藥的設(shè)計上重視生活質(zhì)量的改善。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于公開一種新的治療智能減退、癡呆的中藥組合物；本發(fā)明的另一個目的在于公開制備一種新的治療智能減退、癡呆的中藥組合物的方法。
本發(fā)明藥物組合物的原料藥組成及配比如下(按重量份)
紅參50-200重量份 鹿茸30-80重量份人參皂甙15-50重量份何首烏150-500重量份黃精100-500重量份 丹參100-500重量份山楂100-500重量份 大黃10-50重量份。
所述大黃優(yōu)選酒制大黃；人參皂甙優(yōu)選人參莖葉皂甙；鹿茸優(yōu)選凍干鮮鹿茸。
本發(fā)明中藥組合物的制備方法為a.取紅參，凍干鮮鹿茸，大黃，分別粉碎，過80-130目，備用；b.取人參莖葉皂甙粉，備用；c.取何首烏、山楂、黃精、丹參切片混合煎煮1-3次；每次加水4-8倍量，煎煮1-3小時；合并煎液濾過，在60℃溫度下濃縮至相對密度為1.20-1.35的浸膏，與a，b之粉劑混合、干燥、粉碎、過篩；以70-80％乙醇制粒；于60-90℃溫度下干燥；經(jīng)過常規(guī)工序直接或間接加入藥學(xué)上可接受的賦型劑制成臨床可接受的劑型，如片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸等。
本發(fā)明組合物標(biāo)本兼顧，通補(bǔ)并施；達(dá)到補(bǔ)而不滯，通而不峻。集補(bǔ)陰陽，和氣血、調(diào)臟腑，通經(jīng)脈諸功效于一爐，對治療智能減退、癡呆病有很好的效果；且無毒副作用。
以下實(shí)驗(yàn)例所用健神益智片為本發(fā)明組合物片劑；藥理實(shí)驗(yàn)是從整體給藥的促智行為效應(yīng)，代謝調(diào)節(jié)作用，老化相關(guān)酶及異常代謝產(chǎn)物的調(diào)控；到與老年期癡呆相關(guān)的神經(jīng)生長因子受體功能的分子生物學(xué)方面的變化進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)設(shè)計，從多方面證明健神益智片的臨床效果藥理學(xué)基礎(chǔ)。
實(shí)驗(yàn)例1健神益智片對果蠅壽命的影響果蠅是研究衰老的常用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，具有生存期短、繁殖快、管理簡便以及有與人類相似的生長、發(fā)育、繁殖和衰老階段等優(yōu)點(diǎn)，而適用于抗衰老藥物篩選研究。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的健神益智片，由于方中人參為君藥，為觀察組方后之效應(yīng)，故以人參為對照品，陽性對照藥為維參鋅，系衛(wèi)生部批準(zhǔn)之西藥三類98衛(wèi)藥準(zhǔn)字X-45號。加入培養(yǎng)基中，以對比觀察不同藥物，不同劑時量對果蠅壽命的影響。
材料和方法本實(shí)驗(yàn)采用天津醫(yī)學(xué)院老年醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供的美國野生型果蠅作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?1)，培養(yǎng)基的成分含量比為每100g基礎(chǔ)培養(yǎng)基含玉米10g，紅糖13.5g，干酵母1g，瓊脂1.5g，苯甲酸0.15g，溶于自來水，天然PH值。成蟲培養(yǎng)在25±0.5℃，相對濕度65％的暗室培養(yǎng)箱中。實(shí)驗(yàn)開始后，每日統(tǒng)計一次果蠅死亡數(shù)目，每4天更換一次培養(yǎng)基，直至成蟲全部死亡為止，以壽命表法統(tǒng)計，組間以方差檢驗(yàn)壽命長短是否有顯著性差異。
藥品配制健神益智片及維參鋅粉(維參鋅由人參、花粉、維生素E及硫酸鋅組成為衛(wèi)生部批準(zhǔn)之新抗老化劑。1988衛(wèi)藥準(zhǔn)字X-45號)各取1g、2g藥品分別加入99g、98g、培養(yǎng)基中，加熱混合攪拌，令最終濃度為1％、2％兩個濃度梯度。人參果皂甙，純品含量80％，稱12.5mg，溶解后加入100g培養(yǎng)基中，令最終濃度0.01g％。人參浸膏，含量23％，稱6g溶于12ml乙醇中，取1ml加入100g培養(yǎng)基中(加熱除乙醇)，令最終含量為0.115％。
實(shí)驗(yàn)分組取果蠅(處女蠅)800只，乙醚麻醉后隨機(jī)分組，共分7組，每組100只，其中雌雄各半，分裝于14個培養(yǎng)基中，每管50只，雌雄分裝。
A組陰性對照組B組維參鋅1％C組維參鋅2％D組健神益智片低劑量組1％E組健神益智片高劑量組2％F組人參果皂甙0.01％對照組G組人參浸膏0.115％對照組各組果蠅在分組培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每日記錄死亡果蠅數(shù)，直至果蠅全部死亡為止。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用壽命表法進(jìn)行果蠅壽命統(tǒng)計，組間差異應(yīng)用方差分析(3)結(jié)果表明健神益智片在雄性果蠅組只有高劑量組有效(Z＝5.17 P＜0.01；2％組Z＝4.20 P＜0.01)。見表1及表2。
表1健神益智片對雄性果蠅壽命的影響
Z0.01＝2.33Z0.05＝1.64(按壽命表法統(tǒng)計)表2健神益智片對雌性果蠅壽命的影響
Z0.99＝2.33 Z0.95＝1.64實(shí)驗(yàn)例2健神益智片對單胺氧化酶、過氧化脂持、超氧化物歧酶的影響及抗幅射作用過氧化脂質(zhì)、超氧化物歧酶是測定體內(nèi)自由基清除能力的重要生化藥理指標(biāo)。單胺氧化酶(Monoamino Oxidase MAO)是一類廣泛存在于生物體不同組織中的胺基氧化酶，它具有催化不同類型的單胺氧化脫氨的作用。有人發(fā)現(xiàn)人腦、血小板中單胺氧化酶(MAO、EC、1、4、1、3)的活性，隨著年齡的增長而明顯增高，從而影響腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的功能。特別是七十年代以來，由于發(fā)現(xiàn)衰老過程，老年性癡呆疾及帕金森氏病與單胺氧化酶B(MAO-B)的活性有密切關(guān)系，因此人們一直尋求應(yīng)用適當(dāng)?shù)膯伟费趸敢种苿?MAOI)來選擇性的抑制MAO-B，以治療老年性癡呆和帕金森氏病。
過氧化脂質(zhì)(LPO)是脂類化合物中或游離的不飽合脂肪酸受自由基作用生成的過氧化物。隨著增齡和在某些病理情況下，例如老年期癡呆、幅射損傷、紫外線照射和衰老等情況下自由基增高時引起過氧化脂質(zhì)的增高，尤其腦內(nèi)LPO的增加與老年期癡呆患者腦內(nèi)老年斑形成有關(guān)(2)，同時與超氧化物歧化酶(SOD)活性降低有關(guān)，SOD是消除自由基的主要酶類之一，從而減少過氧化脂質(zhì)的積蓄。因此測定血清或組織中的LPO和SOD可以了解自由基的代謝情況。
為驗(yàn)證健神益智片的抗自由基的作用，及進(jìn)一步探討其抗老年癡呆的作用，我們應(yīng)用正常大鼠，老年大鼠和60Co照射小鼠，造成了自由基模型，測定MAO、LPO、SOD水平。
材料與方法正常動物Wistar大白鼠體重160±10g，老齡鼠為10個月齡，青年鼠為2個月齡。
健神益智片高劑量組2g/kg，低劑量組1g/kg及陽性對照藥維參鋅2g/kg體重，給藥35天后放血處死。
抗幅射實(shí)驗(yàn)，ICR純系小鼠，體重25-30g，以配對設(shè)計分組，設(shè)正常，放射對照，健神益智片低、高劑量組(低劑量1g/kg，高劑量2g/kg)及陽性對照組維參鋅(2g/kg)給藥7天后，一次性60Co 450拉德照射，照射后給藥3天處死動物。取血、腦、肝作MAO-B、LPO、SOD測定。
一、MAO-B的測定取組織稱重→加10倍體積的予冷的PH7.4，0.2M，PB緩沖液研磨成勻漿1000×g離心10分→除沉淀取上清液4℃下17000g離心30分→取沉淀用0.3ml 0.2M緩沖液懸浮即得粗酶。在帶有磨口蓋的試管中加入0.3ml 80mM芐胺，2.4ml、0.2M PH7.4 PB再加入0.3ml粗酶→37℃保溫振蕩3小時→加60％PCA 0.3ml終止反應(yīng)，再加環(huán)己烷3ml振蕩→8000轉(zhuǎn)/離心→取上清液測242nm波長光密度值。
二、LPO的測定鼠肝及腦分別作10％組織勻漿取0.1ml→加8.1％SDS<p>
表1調(diào)度器系統(tǒng)硬件配置具體實(shí)施時，調(diào)度器的兩個調(diào)度機(jī)分別用一根網(wǎng)線聯(lián)入集群服務(wù)器外端的共享介質(zhì)集線器，同時用一根網(wǎng)線聯(lián)入內(nèi)部的交換機(jī)。機(jī)器啟動后，對Linux Virtual Server進(jìn)行相應(yīng)配置，并啟動所述的雙機(jī)容錯調(diào)度軟件，即可開始正常工作。
表4健神益智片對老年大鼠腦LPO的影響
表5健神益智片對老年組大鼠肝LPO的影響
表6健神益智片對青年大鼠肝LPO的影響
表7健神益智片對ICR純系小鼠經(jīng)60Co照射后肝臟LPO的變化
表8灌服健神益智片后ICR小鼠經(jīng)60Co照射后血清SOD的變化
結(jié)果與討論上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，健神益智片具有明顯的抑制單胺氧化酶B的作用及減少過氧化脂質(zhì)的功能，其作用機(jī)理有待近一步研究。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果又表明健神益智片在人工自由基增多的條件下能使LPO降低，這可能是保護(hù)SOD活性的結(jié)果，在抗自由基作用，可以解釋一部分健神益智片的作用機(jī)理。
實(shí)驗(yàn)例3健神益智片對正常小鼠智能(記憶—條件反射)的影響第一次試驗(yàn)材料與方法動物昆明種小白鼠(白求恩醫(yī)大動物實(shí)驗(yàn)室提供)體重18-22g儀器DS-Z條件反射電控儀藥物健神益智片低劑量組1g/kg高劑量組2g/kg陽性對照藥人參莖葉皂甙60mg/kg取昆明種小白鼠50只，雌雄各半，體重為18-22g。
首先用DS-Z條件反射電控制儀小鼠，從而進(jìn)行選擇，對于一些劣鼠淘汰，選好的鼠進(jìn)行分組，每組10只小鼠，共4組以蒸餾水為空白對照，以人參莖葉皂甙為陽性對照組。10％健神益智片灌胃0.5ml/day為高劑量組。以5％健神益智片灌胃0.5ml/day，為低劑量組。連續(xù)給藥7天，第8天給藥1小時后用DS-Z條件反射電控儀重復(fù)記憶。
表1健神益智片對小鼠記憶條件反射的促進(jìn)作用
健神益智片低劑量組X2＝2.7P＞0.05高劑量組X2＝11.37 P＜0.01人參皂甙組0.5％X2＝8.35 P＜0.01人參皂甙對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用已有廣泛而肯定的研究結(jié)論，尤其是條件反射形成過程有調(diào)節(jié)作用(1)。本項(xiàng)記憶實(shí)驗(yàn)原理是以形成條件反射為神經(jīng)活動之生理學(xué)基礎(chǔ)，因此人參皂甙可以做為衡量本實(shí)驗(yàn)是否成功可靠的陽性對照。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，健神益智片及人參皂甙均可加強(qiáng)條件反射的形成。
實(shí)驗(yàn)例3健神益智片對老齡鼠記憶—條件反射的作用(第二次實(shí)驗(yàn))材料與方法動物DBA/2純系老年小白鼠(大連市醫(yī)藥科學(xué)研究所動物室提供)體重30±2g 月齡18月藥物健神益智片 陽性對照藥人參皂甙(莖葉)儀器Y型反射箱，底部為柵板，柵條間距為12mm實(shí)驗(yàn)時將小鼠放入箱內(nèi)，通電后學(xué)會主動逃避反應(yīng)，燈光信號表示安全區(qū)(不通電)，安全區(qū)的方位以無規(guī)則次序變化，小鼠的正常反應(yīng)是迅即跳回安全區(qū)。
方法取老年小白鼠(18月齡)，體重30±2g，50只雌雄各半，進(jìn)行預(yù)選，淘汰離散度太大的小鼠，留下40只，分5組，每組8只。
第I組人參莖葉皂60mg/kg；第II組健神益智片高劑量2.4g/kg；第III組健神益智片中劑量1.6g/kg；IV組健神益智片低劑量0.8g/kg；第V組生理鹽水對照組每日胃內(nèi)給藥一次，連續(xù)給藥八天，并于最后一天給藥后1小時，測重復(fù)記憶力。記錄10次電擊動物的正確數(shù)，共8次，累計數(shù)(80次)記錄進(jìn)行比較。
結(jié)果見下表健神益智片對老年鼠重復(fù)記憶的影響；訓(xùn)練后(訓(xùn)練前)
健神益智片和人參皂甙則均有促進(jìn)老年鼠條件反射—記憶的作用。
實(shí)驗(yàn)例4健神益智片對記憶障礙小鼠學(xué)習(xí)記憶環(huán)節(jié)的作用(第三次實(shí)驗(yàn))實(shí)驗(yàn)材料動物昆明種小白鼠，體重20±2g各半，由白求恩醫(yī)科大學(xué)動物室提供。
藥品及試劑健神益智片0.38/片，由大連市保健品科研生產(chǎn)聯(lián)合體提供。陽性對照藥維參鋅膠囊，由長春制藥廠生產(chǎn)。東莨菪堿，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供。環(huán)己酰亞胺為sigma公司產(chǎn)品。
方法與結(jié)果一、對東莨菪堿造成小鼠記憶獲得障礙的影響(跳臺法)取小鼠60只，隨機(jī)分為六組，如表1所示劑量灌胃給藥，每日1次，正常對照組及模型組每日給予等體積蒸餾水，藥稱15天，末次給藥后20min除正常對照組外，其余五組均腹腔注射東莨菪堿5mg/kg，10min后進(jìn)行小鼠跳臺訓(xùn)練，適應(yīng)3min，訓(xùn)練5min，24小時后重測，記錄各鼠錯誤反應(yīng)次次數(shù)，結(jié)果見表1。
表1健神益智片對東莨菪堿(0.005g/kg)小鼠記憶障礙模型的作用(第一次實(shí)驗(yàn))
***P＜0.001 **p＜0.01 *p＜0.05(與模型組比較)表2健神益智片對東莨菪堿(0.005g/kg)小鼠記憶障礙模型的作用(重復(fù)實(shí)驗(yàn))
二、對環(huán)己酰亞胺造成小鼠記憶鞏固障礙的影響(跳臺法)取小鼠60只，分組及給藥方法同前，與末次給藥30min后，各鼠均進(jìn)行跳臺訓(xùn)練，訓(xùn)練后立即注射環(huán)己酰亞胺120mg/kg，24h后進(jìn)行測驗(yàn)，結(jié)果見表3。
表3健神益智片對環(huán)己酰亞胺(0.12g/kg)造成小鼠記憶鞏固障礙的影響(第一批實(shí)驗(yàn))
***P＜0.001 **p＜0.01 *p＜0.05(與模型組比較)表4健神益智片對環(huán)己酰亞胺(0.12g/kg)所造成記憶鞏固的影響(第二批實(shí)驗(yàn))
上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，健神益智片各劑量組對東莨菪堿造成小鼠記憶獲得障礙及環(huán)己酰胺造成小鼠記憶鞏固障礙，均有不同程度的改善作用，說明健神益智片能夠提高小鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
實(shí)驗(yàn)例5健神益智片對化學(xué)性學(xué)習(xí)記憶障礙的保護(hù)作用本實(shí)驗(yàn)用樟柳堿導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，用跳臺和暗回避法觀察小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，觀察了健神益智片對這種化學(xué)性記憶障礙的保護(hù)作用。
動物昆明種小鼠18-22克，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，隨機(jī)分為五組，每組10只。
藥物健神益智片由廣東省南海市羅村鎮(zhèn)華衛(wèi)藥業(yè)有限公司提供，分為1g/kg 2g/kg 4g/kg三組每天灌胃一次，連續(xù)一周。
尼地平由山東新華制藥廠提供，1mg/kg(用土溫80數(shù)滴研磨蒸餾水混懸)灌胃一次。
樟柳堿為昆明制藥廠生產(chǎn)，用蒸餾水溶解，5mg/kg腹腔注射，學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)前15分給藥。
方法給藥第八天進(jìn)行學(xué)習(xí)試驗(yàn)，次日進(jìn)行記憶試驗(yàn)，分別記示錄潛伏期和錯誤次數(shù)作為評價學(xué)習(xí)記憶功能的指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果1.跳臺實(shí)驗(yàn)
*P＜0.05與對照組比較 **P＜0.01與對照組比較以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見在跳臺實(shí)驗(yàn)中健神益智片1g/kg 2g/kg組記憶成績潛伏期和錯誤次數(shù)與對照組比較均有明顯改善，最適劑量為1-2g/kg。
2.水迷宮學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)動物昆明種小鼠18-22克，隨機(jī)分為五組每組15只藥物健神益智片分1，2，4g/kg三組及對照，腦復(fù)康0.5mg/kg，每天灌胃一次方法裝置包括水迷宮及自動記錄儀兩部分，迷宮線路終點(diǎn)沒有梯子供動物爬出水面，水溫控制在25℃左右。實(shí)驗(yàn)分階段進(jìn)行第一階段，用一擋板在A處(第一轉(zhuǎn)彎處)擋死，使動物在開始訓(xùn)練，此階段約需訓(xùn)練2次，待對照組動物有80％以上通過后即轉(zhuǎn)入第二階段，訓(xùn)練加長路程，從B(第二轉(zhuǎn)彎處)開始，此階段也需訓(xùn)練2次，對照組動物可有80％以上達(dá)到終點(diǎn)。
給藥第八天進(jìn)行水迷宮學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)，于每天學(xué)習(xí)前繼續(xù)給藥。第一次訓(xùn)練前需將小鼠放在梯子附近使其自行爬上三次，以后每次訓(xùn)練前，均將小鼠放在梯子附近使其自行爬上一次。每只小鼠每天訓(xùn)練一次，每次時間限定在3min，記小鼠到達(dá)終點(diǎn)的時間及進(jìn)入盲端的次數(shù)(即錯誤數(shù))。
健神益智片對水迷宮學(xué)習(xí)的影響
*P＜0.05 **P＜0.05與對照組相比水迷宮學(xué)習(xí)實(shí)驗(yàn)中1g/kg組可隨訓(xùn)練次數(shù)的增加，在第2-4天明顯減少水迷宮學(xué)習(xí)所需時間；2g/kg 4g/kg組訓(xùn)練初期能明顯提高學(xué)習(xí)成績。
健神益智片對小鼠自主活動的影響動物昆明種小鼠18-22克，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心藥物由廣東省南海市羅村鎮(zhèn)華衛(wèi)藥業(yè)有限公司提供劑量4g/kg將藥物濃度用水配成200mg/ml，口服按0.2ml/10g體重2g/kg用4g/kg濃度的藥液稀一倍1g/kg用2g/kg濃度的藥液稀一倍儀器XZ-4型小鼠自主活動計數(shù)器，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制方法將動物平均分為四組每組12只，各組分灌胃(每批各2只)對照灌同容量的水，1小時后四組并行測定自主活動，每洞2只，記錄10分鐘動物活動擋光次數(shù)，并統(tǒng)計處理。
結(jié)果
健神益智片鎮(zhèn)痛作用觀察動物、藥物及劑量同自主活動實(shí)驗(yàn)儀器TF-光熱測痛儀中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所制方法動物灌胃1小時后，用TF-光熱測痛儀測定動物耐痛效果，記錄小鼠甩尾潛伏時間，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
結(jié)果
通過以上兩種實(shí)驗(yàn)說明健神益智片對中樞神經(jīng)無興奮或抑制作用，亦無鎮(zhèn)痛作用，在跳臺試驗(yàn)中，由于藥物對中樞的抑制或提高痛，可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，出現(xiàn)假陽性，現(xiàn)結(jié)果可排除兩方面的非特異性干擾。
實(shí)驗(yàn)例6健神益智片對骨髓細(xì)胞及蛋白質(zhì)代謝的影響生命在其個體發(fā)育、生長乃至衰老過程中都與DNA復(fù)制的質(zhì)與量的改變有關(guān)，在衰老過程中不但有DNA復(fù)制的錯誤，而且還有速度的快慢變化。抗衰老藥物應(yīng)能使DNA復(fù)制得到調(diào)節(jié)，使DNA復(fù)制的速率得以改善。
本實(shí)驗(yàn)選骨髓細(xì)胞為靶細(xì)胞(1)(2)，因?yàn)楣撬杓?xì)胞是DNA復(fù)制最活躍的細(xì)胞之一，對藥物的反應(yīng)較為敏感，我們采且放射性前體摻入法可直接反映出骨髓內(nèi)DNA、RNA與蛋白質(zhì)的更新率。本文觀查不同狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)動物，即在正常動物及用60Co照射后，骨髓細(xì)胞受抑制狀態(tài)下的動物中藥物的調(diào)節(jié)作用。
材料與方法動物用昆明種小鼠觀察健神益智片對正常小鼠骨髓細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)的影響。雌雄各半，體重在25-30g隨機(jī)分組。60Co照射模型用ICR純系小鼠，雌雄各半，體重為22-25g，按體重配對分組。60Co照射小鼠，照射劑量為450拉德。分為陽性對照(維參鋅2g/kg及4g/kg)；治療組健神益智片1g/kg及(低)2g/kg(高)給藥途徑及療程灌胃15天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
3H標(biāo)記物；1、3H-TdR摻入DNA，放射強(qiáng)度23Ci/mM由北京原子能所提供。84年3月標(biāo)記；2、23Ci/mMUR摻入RNA，放射強(qiáng)度23Ci/mM由北京原子能所提供。84年3月標(biāo)記；3、3H-亮氨酸摻入蛋白質(zhì)。放射強(qiáng)度25.33Ci/mM由北京原子能所提供。84年3月標(biāo)記實(shí)驗(yàn)方法小鼠拉頸處死后，立即在無菌條件下取雙股骨髓，用Eagle氏液沖洗骨髓腔后再過4號針頭以除去較大的血凝塊之后配成X×107/ml的細(xì)胞液濃度，備用。每個給藥組分別做DNA、RNA和蛋白摻入，分別取0.8mlEagle培養(yǎng)液，加入0.1ml骨髓細(xì)胞和0.1ml標(biāo)記物，培養(yǎng)液總體積為1ml混勻后置37℃溫箱中培育4小時后置49型玻璃纖維濾膜上抽濾，經(jīng)2.5ml生理鹽水，5％三氯醋酸及無水乙醇抽洗膜片后，置70℃干燥1小時，置閃爍瓶內(nèi)，加入二甲苯閃爍液(PPO 25g，POPOP 0.5g，二甲苯1000ml)5ml，經(jīng)暗適應(yīng)后測定cpm值，之后計算X×106細(xì)胞液中的微克分子濃度。
表I健神益智片對正常小鼠骨髓細(xì)胞核酸及蛋白質(zhì)代謝的影響
ΔP＜0.05 ΔΔP＜0.01表II60Co照射(450拉德)后健神智片對小鼠骨髓細(xì)胞核酸及蛋白質(zhì)代謝的影響
ΔP＜0.05 ΔΔP＜0.01測定核酸與蛋白質(zhì)代謝的方法很多，但放射性同位素前體摻入法是近年來發(fā)展較快的一門技術(shù)。采且骨髓胞為靶細(xì)胞應(yīng)用放射性同位素?fù)饺氲姆椒ㄒ埠芏?。例如體內(nèi)給藥，體外摻入法；體內(nèi)給藥，體內(nèi)摻入法等等。本文采用體內(nèi)給藥，體外同位素?fù)饺氲姆椒?。這種方法可以藥物在體內(nèi)的綜合作用下，觀察各種抗衰老藥物對骨髓細(xì)胞的影響，又能在體外控制同位素的用量。操作簡便，可以不經(jīng)提取直接測定，這也可以避免由于標(biāo)記物在體內(nèi)的吸收不均勻和代謝的個體差異。通過不同狀態(tài)的動物對不同抗衰老藥物的研究，證明了本實(shí)驗(yàn)方法的可靠性和特異性。尤其可以看到動物在病理狀態(tài)下，如用放射菌素D或60Co照射后抗衰老藥的調(diào)節(jié)作用。同時我們也看到健神益智片在60Co照射后骨髓細(xì)胞受到一致的情況下呈現(xiàn)出對骨髓細(xì)胞DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成的促進(jìn)作用。
實(shí)驗(yàn)例7健神益智片對老齡DBA/2小鼠腦細(xì)胞膜神經(jīng)生長因子受體(R-NGF)的影響腦細(xì)胞的生存及維持正常機(jī)能，與神經(jīng)生長因子(NGF)的正常作用密切相關(guān)(1)，首先要有足夠的NGF以旁分泌的形式作用于腦細(xì)胞；其次是神經(jīng)細(xì)胞膜中的NGF受體的功能及數(shù)目要正常。已知在腦衰老或神經(jīng)細(xì)胞退化性癡呆狀態(tài)，腦細(xì)胞NGF受體可有變化。本項(xiàng)研究試圖觀察在整體給藥(健神益智片)的情況下，對腦細(xì)胞膜NGF受體的影響，以探討健神益智片益智作用的機(jī)理。
材料與方法材料1.1動物，DBA/2小鼠，18月齡，40只，體重X±SD＝30.08±3g。
1.2低溫超速度離心機(jī)，日立。SGR20BB，55P-72。
1.3紫外分光光度計，島津UV-26501.4γ-計數(shù)器、瑞典、LKB、1275MINI-GAMMA。
1.5恒溫冷室。
1.6 49型玻璃纖維瀘膜，上海紅光造紙廠。
1.7 Eppdooff試管1.8125I-NGF，中國原子能總公司北方同位素公司標(biāo)記，放射強(qiáng)度為75ci/mM。
1.9 NGF，由中國康復(fù)中心基礎(chǔ)研究所提取，純度為電泳純。附合sigma標(biāo)準(zhǔn)。
1.10 folin酚試劑1.12標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白(BSA)1.13手術(shù)器械2.1給藥及膜蛋白制備將DBA/2小鼠隨機(jī)分為4組I對照組；I健神益智片2g/kg；III健神益智片4g/kg；IV人參莖葉皂甙100mg/kg。以蒸餾水配成混懸液，每天一次連續(xù)灌胃15天(對照組灌蒸餾水)。處死小鼠，取全腦立即放入液氮中保存。在4℃冷室內(nèi)操作。實(shí)驗(yàn)時取液氮冰凍之鼠腦加10倍體積的PBS緩沖液勻漿，1000×g離心率兩次(各10`)，棄沉渣；再以7700×g離心一次，10`，棄沉渣；上清以100000×g離心一次，60`，棄上清。將沉淀顆粒懸浮在適量PBS緩沖液中，分裝小管，-80℃冰箱貯存，取少量，以Lowry氏法測定蛋白含量。
3、受體結(jié)合試驗(yàn)125I-NGF共取10個點(diǎn)自0.010nM～1.20nM，非標(biāo)記NGF用1000倍競爭，小鼠腦細(xì)胞膜蛋白每管加入量為2mg，總反應(yīng)體積為200μl，每管體積以PBG-BSA補(bǔ)齊。在4℃冷室內(nèi)操作，加樣完畢搖勻，置37℃水浴30`后立即入冰水中止反應(yīng)，經(jīng)49型玻璃纖維濾膜收集細(xì)胞膜，以6ml PBG液沖洗三次，將膜片置γ-定標(biāo)儀計數(shù)，在抽濾前測定125I-NGF總計數(shù)(F值)。每組均為復(fù)管。測定后取均值，按下列公式轉(zhuǎn)換為f＝Pmol/mg膜蛋白。
=12.2×106×61.5%×75×2]]>=4.883×10-9nM/mg]]>η＝γ計數(shù)器效率＝61.5％以上f×實(shí)測cpm值即為每管受體結(jié)合蛋白。
結(jié)果各組總結(jié)合有飽和現(xiàn)象，用Scalchard作圖曲線分析，顯示腦細(xì)胞膜NGF受體具有雙受體特征，即低容量高親和力受體和高容低親和力受體，各組規(guī)律相同。健神益智片及人參皂甙對兩型受體均有提高其特異性受體結(jié)合率(SD/F)之作用，健神益智片并呈現(xiàn)量效關(guān)系(2g組提高率為12.84倍和11.33倍，4g組為17.22和21.53)；同時可以降低KD值，即提高親和常數(shù)Ka。(表1)以上結(jié)果表明，健神益智片可以提高老年DBA/2小鼠腦細(xì)胞膜R-NGF與NGF的結(jié)合率和親和力，這一現(xiàn)象有助于NGF的生理作用，也提示健神益智片可以在受體水平調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，以達(dá)到其促智防癡呆作用。
表1健神益智片對老齡DBA/2小鼠腦細(xì)胞膜漿蛋白中NGF受體的影響
I低容量高親和力受體；II高容量低親和力受體( )給藥組SD/F與正常對照組之比值實(shí)驗(yàn)例8健神益智片對小鼠腦缺血性記憶障礙的影響臨床觀察發(fā)現(xiàn)，健神益智片具有補(bǔ)益氣血，增髓添精，活血通滯，健腦益智功效。臨床用于中老年記憶及智能減退，老年性癡呆有較好療效。對腦缺血，腦血栓及腦梗塞患者的記憶力減退和智力下降亦有一定療效。為給本品的臨床應(yīng)用進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，本研究采用小鼠腦血管性學(xué)習(xí)記憶障礙模型觀察了健神益智片對小鼠腦缺血性記憶障礙的影響。
1.實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)動物昆明種健康雄性小鼠，體重22-28g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
1.2藥品健神益智片(批號961101)由咸陽步長藥業(yè)有限公司提供。
人參；皂甙 由大連醫(yī)藥科學(xué)研究所秦麗雅博士惠贈。
1.3儀器小鼠被動回避反應(yīng)箱跳臺為13×13×17cm3裝置，箱內(nèi)底板設(shè)有可通交流電(36V)的銅柵，其內(nèi)一角放置一直徑為4cm高4.5cm的本質(zhì)圓臺，為小鼠逃避電擊的安全區(qū)。
JJC-2型 生理實(shí)驗(yàn)多用儀上海國泰電訊器材廠出品MF-47 電流表 杭洲解放儀表電機(jī)廠出品BLBA W 921-4030 計時器(日本產(chǎn))MT-28 電子體溫計(日本產(chǎn))2.實(shí)驗(yàn)方法2.1實(shí)驗(yàn)動物分組昆明種雄性小鼠隨機(jī)分為五組偽手術(shù)組n＝10缺血模型組 n＝12人參皂甙組 n＝12(60mg/kg，ig)健神益智1組 n＝12(1g/kg，ig)健神益智2組 n＝11(3g/kg，ig)2.2腦缺血再灌注模型制備小鼠稱重，戊巴比妥鈉麻醉(50mg/kg，i.P.)。仰位固定，頸部正中剪開皮膚，分離兩側(cè)頸總動脈，游離迷走神經(jīng)。以無損傷微型動脈夾夾閉雙側(cè)頸總動脈20min，然后放開動脈夾，再灌注20min，再次夾閉20min后解除阻斷。第一次夾閉頸總動脈時，于距尾尖1cm處剪斷尾尖放血0.3ml。在整個缺血過程中以電子體溫計監(jiān)測體溫，小鼠體溫需在36℃以上為合格模型?？p合皮膚，精心飼養(yǎng)，術(shù)中注意無菌操作，偽手術(shù)組不阻斷頸總動脈，不放血，其它操作同它組。
2.3跳臺實(shí)驗(yàn)小鼠術(shù)前4d及術(shù)后6d給藥組分別給予相應(yīng)藥物。偽手術(shù)組及缺血模型組給予等容量生理鹽水(0.1ml/10g體重)。術(shù)后6d小鼠自由活動均恢復(fù)常態(tài)進(jìn)行跳臺試驗(yàn)。先將小鼠置于箱內(nèi)，自由活動2min以熟習(xí)環(huán)境，然后通電(36v)，小鼠受電擊后即可跳上平臺回避。記錄5min內(nèi)跳下臺的次數(shù)(錯誤次數(shù))及在臺下受電擊的時間總和，以上述指標(biāo)作為訓(xùn)練成績。24h后重復(fù)試驗(yàn)，以其錯誤次數(shù)和受電擊時間總和作為記憶試驗(yàn)成績。
2.4數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過計算機(jī)POMS-04軟件處理，數(shù)據(jù)X±SE表示，各組與缺血模型組比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果表明缺血模型組電擊時間和較偽手術(shù)組明顯增加(P＜0.01)，其錯誤次數(shù)也明顯多于偽手術(shù)組(p＜0.01)，表明小鼠因腦缺血造成記憶障礙模型可靠。人參皂甙組電擊時間總和與缺血對照組有明顯差異(p＜0.05)，錯誤次數(shù)則無明顯差異。健神益智片小劑量組電擊時間總和明顯小于缺血組(P＜0.05)，提示有增強(qiáng)記憶作用。本品大劑量可使電擊時間總和遠(yuǎn)小于缺血組(P＜0.01)，錯誤次數(shù)也明顯減少(P＜0.01)，結(jié)果提示，健神益智片對缺血性記憶障礙有一定的改善作用。結(jié)果見附表。
附表健神益智片對小鼠腦缺血性記憶障礙的影響(X±SE)觀察指標(biāo) 訓(xùn)練成績組別 電擊時間總和(sec)錯誤次數(shù)偽手術(shù)組(n＝10)7.90±0.83** 1.90±0.23*缺血模型組(n＝12) 27.49±4.55 2.66±0.18人參皂甙組(n＝12) 15.55±2.64* 2.33±0.18Δ健神1組(n＝12) 19.66±3.35Δ2.16±0.20Δ健神2組(n＝11) 24.09±3.52Δ2.45±0.24Δ與缺血對照組比較ΔP＞0.05 *P＜0.05 **P＜0.01
下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果。
實(shí)施例1片劑紅參100g 凍干鮮鹿茸50g人參(莖葉)皂甙25g何首烏250g黃精250g 丹參250g山楂250g 大黃(酒制)25g制備方法1.取紅參，鹿茸，大黃，分別粉碎，過100目，備用。
2.取人參莖葉皂甙粉，按其含量折合到處方量，備用。
3.取何首烏、山楂、黃精、丹參切片混合煎煮2次。第一次加水6倍量，煎煮2小時；第二次加水4倍量煎煮2小時，合并兩次煎液濾過，在60℃溫度下濃縮至相對密度為1.30-1.31的浸膏，與1，2之粉劑混合、干燥、粉碎、過篩。以75％乙醇制粒。于70-80℃溫度下干燥。按0.5％比例加入硬脂酸鎂，混勻，壓片，包糖衣即得健神益智片1000片。
4.方中各藥材，除人參莖葉皂甙為遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)外，均為藥典品。
4.1紅參規(guī)格40支，人參皂甙含量＞5％，TLC點(diǎn)完整。
4.2鹿茸三叉梅花鹿茸，采用藥典陳氏法鑒別。按霍玉書專利方法(中國專利申請?zhí)?3121547；公開號1104095)進(jìn)行冷凍干燥后，控溫研磨成為100目以上的細(xì)粉入藥。
4.3其他藥材應(yīng)按藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，合格者方可入藥。
功能與主治補(bǔ)益氣血，增髓添精，活血通滯，健腦益智，用于智能減退及老年期癡呆。
實(shí)施例2膠囊劑紅參80g 凍干鮮鹿茸40g人參(莖葉)皂甙20g何首烏180g黃精150g 丹參150g山楂150g 大黃(酒制)18g制備方法a.取紅參，鹿茸，大黃，分別粉碎，過100目，備用。
b.取人參莖葉皂甙粉，按其含量折合到處方量，備用。
c.取何首烏、山楂、黃精、丹參切片混合煎煮2次。第一次加水6倍量，煎煮2小時；第二次加水4倍量煎煮2小時，合并兩次煎液濾過，在60℃溫度下濃縮至相對密度為1.30-1.31的浸膏，與a，b步驟之粉劑混合、干燥、粉碎、過篩。以75％乙醇制粒。于70-80℃溫度下干燥。經(jīng)常規(guī)制得膠囊劑1000粒。功能與主治補(bǔ)益氣血，增髓添精，活血通滯，健腦益智，用于智能減退及老年期癡呆。
實(shí)施例3顆粒劑紅參150g 凍干鮮鹿茸70g人參(莖葉)皂甙35g何首烏350g黃精400g 丹參350g山楂400g 大黃(酒制)35g制備方法a.取紅參，鹿茸，大黃，分別粉碎，過100目，備用。
b.取人參莖葉皂甙粉，按其含量折合到處方量，備用。
c.取何首烏、山楂、黃精、丹參切片混合煎煮2次。第一次加水6倍量，煎煮2小時；第二次加水4倍量煎煮2小時，合并兩次煎液濾過，在60℃溫度下濃縮至相對密度為1.30-1.31的浸膏，與a，b步驟之粉劑混合、干燥、粉碎、過篩。以75％乙醇制粒。于70-80℃溫度下干燥。經(jīng)常規(guī)制得顆粒劑。功能與主治補(bǔ)益氣血，增髓添精，活血通滯，健腦益智，用于智能減退及老年期癡呆。
權(quán)利要求
1.一種治療治療智能減退、癡呆的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物主要是由下述原料藥制成的紅 參50-200重量份 鹿 茸30-80重量份人參皂甙15-50重量份何首烏150-400重量份 黃 精100-400重量份 丹 參100-400重量份山 楂100-400重量份 大 黃10-50重量份。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物主要是由下述原料藥制成的紅 參100重量份 鹿 茸50重量份人參皂甙25重量份何首烏250重量份 黃 精250重量份 丹 參250重量份山 楂250重量份 大 黃25重量份。
3.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物主要是由下述原料藥制成的紅 參80重量份 鹿 茸40重量份 人參皂甙20重量份何首烏180重量份 黃 精150重量份 丹 參150重量份山 楂150重量份 大 黃18重量份。
4.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物主要是由下述原料藥制成的紅 參150重量份 鹿 茸70重量份人參皂甙35重量份何首烏350重量份 黃 精400重量份 丹 參350重量份山 楂400重量份 大 黃35重量份。
5.如權(quán)利要求1-4所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物原料藥中所述大黃優(yōu)選酒制大黃；人參皂甙優(yōu)選人參莖葉皂甙；鹿茸優(yōu)選凍干鮮鹿茸。
6.如權(quán)利要求5所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于該方法包括以下步驟a.取紅參，鹿茸，大黃，分別粉碎，過80-130目，備用；b.取人參莖葉皂甙粉，備用；c.取何首烏、山楂、黃精、丹參切片混合煎煮1-3次；每次加水4-8倍量，煎煮1-3小時；合并煎液濾過，在60℃溫度下濃縮至相對密度為1.20-1.35的浸膏，與a，b之粉劑混合、干燥、粉碎、過篩；以70-80％乙醇制粒；于60-90℃溫度下干燥；經(jīng)過常規(guī)工序直接或間接加入藥學(xué)上可接受的賦型劑制成片劑、膠囊、顆粒劑、滴丸中的任一種。
7.如權(quán)利要求6所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于片劑方法包括以下步驟a.取紅參，鹿茸，大黃，分別粉碎，過100目，備用；b.取人參莖葉皂甙粉，按其含量折合到處方量，備用；c.取何首烏、山楂、黃精、丹參切片混合煎煮2次；第一次加水6倍量，煎煮2小時；第二次加水4倍量煎煮2小時，合并兩次煎液濾過，在60℃溫度下濃縮至相對密度為1.30-1.31的浸膏，與a，b步驟之粉劑混合、干燥、粉碎、過篩；以75％乙醇制粒；于70-80℃溫度下干燥；按0.5％比例加入硬脂酸鎂，混勻，壓片，包糖衣即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療智能減退、癡呆的中藥組合物及其制備方法。該組合物主要由紅參、凍干鮮鹿茸、人參皂甙、何首烏、黃精、丹參、山楂、大黃組成。該中藥組合物制備中，對不同原料藥分別采用制粉、煎煮方法，使得有效成分的充分溶出，并避免貴重藥材浪費(fèi)；最后并經(jīng)過科學(xué)的工序直接或間接加入藥學(xué)上可接受的賦型劑制成臨床可接受的劑型，包括片劑膠囊、滴丸、顆粒劑；本發(fā)明組合物對治療智能減退、癡呆病有很好的效果，且無毒副作用。
文檔編號A61K9/48GK1621078SQ20031011379
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者霍玉書 申請人:霍玉書