專(zhuān)利名稱(chēng)：一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及骨缺損、骨不連修復(fù)所需的替代物及構(gòu)建骨組織工程的材料，具體講是異種骨基質(zhì)材料。
背景技術(shù)：
作為骨缺損修復(fù)及骨組織工程的基質(zhì)材料可分為以下幾種天然骨及其衍生物；人工合成材料；各種材料組成的復(fù)合物等。其中，天然骨及衍生物(經(jīng)各種方法處理的骨)具有接近自體骨的網(wǎng)狀孔隙系統(tǒng)，組成和結(jié)構(gòu)符合生理要求，并具有良好的細(xì)胞相容性，有利于種子細(xì)胞的生長(zhǎng)，故在骨組織工程方面得到了比較廣泛的應(yīng)用。按其來(lái)源又分為同種異體骨和異種骨。相比之下，異種骨相對(duì)來(lái)源豐富、價(jià)格低廉。不過(guò)，兩者都存在免疫原性問(wèn)題。目前，一般是通過(guò)凍干、高溫煅燒、γ射線(xiàn)照射和脫鈣等方法降低其抗原性，如煅燒骨、脫蛋白骨等無(wú)機(jī)骨或完全去除骨礦成分的脫鈣骨、骨基質(zhì)明膠等有機(jī)成分材料。然而，其中的無(wú)機(jī)骨不含有機(jī)成分，因而疏松易碎，不具備基本力學(xué)強(qiáng)度；后者缺乏骨礦，因而質(zhì)地柔軟，不具備基本力學(xué)剛度。這些不足均限制了它們?cè)诠墙M織工程中的應(yīng)用[劉建中，王臻，胡蘊(yùn)玉等《異體骨關(guān)節(jié)移植修復(fù)肢體大段骨缺損的術(shù)后并發(fā)癥》 中華外科雜志，2000，38(5)332～335]。而人工合成材料，存在成本高，性能不穩(wěn)定，力學(xué)強(qiáng)度低，骨誘導(dǎo)活性弱，成骨能力差等問(wèn)題。即使是在成分和結(jié)構(gòu)上與天然骨基質(zhì)具有高度仿生性的材料也難于同骨組織的天然結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)及生物學(xué)特性相比較。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是克服現(xiàn)有的各種異種骨的缺點(diǎn)，提供一種既消除了抗原，又具有很好的力學(xué)強(qiáng)度和剛度，還利于細(xì)胞粘附、增殖的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備所述異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料的方法。
實(shí)現(xiàn)第一個(gè)目的的一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料，它是經(jīng)過(guò)理化處理的豬骨；區(qū)別于現(xiàn)有異種骨基質(zhì)材料的特征是，本發(fā)明的材料還是去脫了細(xì)胞以及抗原的豬骨。
進(jìn)一步講本發(fā)明的材料是經(jīng)過(guò)理化處理、并去脫了細(xì)胞以及抗原的豬的肋骨或四肢骨。
實(shí)現(xiàn)第二個(gè)目的的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料的制備方法是取新鮮豬骨，先對(duì)其進(jìn)行常規(guī)的理化處理，包括去除軟組織和骨髓，沖洗，在蒸餾水中浸泡等，關(guān)鍵的是該制備方法還至少有以下步驟①把理化處理后的豬骨放入H2O2中反應(yīng)，以破壞細(xì)胞和間質(zhì)蛋白；②再放入蒸餾水中浸泡、清洗；③放入甲醇-氯仿溶液中脫脂；④放入無(wú)水乙醇中除去多余的氯仿；⑤放入成分包括NaOH、Triton-X100和蛋白水解酶的溶液中反應(yīng)，以脫去細(xì)胞和間質(zhì)蛋白；⑥放入無(wú)水乙醇中除盡殘留的氯仿；⑦把該骨晾干、封裝后用60Co照射滅菌。其中，所述的蛋白水解酶為Dispase酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶；所述的新鮮豬骨主要指豬的肋骨或四肢骨。
進(jìn)一步講步驟①所用H2O2的濃度為30％，反應(yīng)時(shí)間為12小時(shí)左右(以完全破壞掉細(xì)胞和間質(zhì)蛋白為準(zhǔn))。步驟③中的甲醇、氯仿比例約為1∶1～1∶4，脫脂時(shí)間為12～24小時(shí)(以能完全脫脂為準(zhǔn))。步驟⑤的溶液中NaOH含量為0.1～1.0N；Triton-X100含量為1％～5％；蛋白水解酶的含量為2％～8％；反應(yīng)時(shí)間為18～42小時(shí)(以能完全脫去細(xì)胞為準(zhǔn))；顯然，為保持酶的活性，反應(yīng)溫度應(yīng)在37℃左右。60Co的照射劑量為25～30kGy。
豬的體型大小與人較接近，骨組織也相似，而且豬與人在遺傳背景上比牛、羊等動(dòng)物更接近。所以，采用豬骨這種異種骨更適合于作為骨組織工程及骨缺損修復(fù)的材料。與現(xiàn)有的去除抗原的方法不同，本發(fā)明是用脫去細(xì)胞的方法來(lái)去除存在于細(xì)胞及組織中的抗原的——因?yàn)?，存在于?xì)胞和細(xì)胞外的非膠原性異種蛋白具有抗原性，而且主要存在于細(xì)胞上，脫去了細(xì)胞和間質(zhì)蛋白，就自然去除了細(xì)胞和抗原。本發(fā)明步驟簡(jiǎn)單、易于操作，材料和藥品的來(lái)源豐富。與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1、采用脫細(xì)胞方法制備的異種骨基質(zhì)材料，由于經(jīng)酶解及Triton-X100聯(lián)合作用，無(wú)細(xì)胞及碎片殘留，非膠原蛋白去除徹底，因此抗原性極低，對(duì)植入受體的全身及局部免疫無(wú)明顯影響。
2、采用對(duì)豬骨脫細(xì)胞的方法制備的骨基質(zhì)材料，具有天然骨組織的網(wǎng)孔和孔隙率，有適合種子細(xì)胞和血管長(zhǎng)入；有利于種子細(xì)胞黏附、增殖、分化和表型表達(dá)的三維空間結(jié)構(gòu)。并且在組織相容性、生物降解性和造價(jià)方面明顯優(yōu)于人工合成材料。
3、所述材料具有很好的力學(xué)強(qiáng)度和剛度；具有良好的骨傳導(dǎo)性和一定的骨誘導(dǎo)性?？梢宰鳛楣侨睋p的填充材料，也可以構(gòu)建組織工程骨，修復(fù)骨缺損。
4、所述材料用60Co照射滅菌，可以有效殺滅病毒及細(xì)菌，消除生物制品臨床應(yīng)用的后顧之憂(yōu)。當(dāng)然，達(dá)到這同一目的其他可靠的滅菌方法也是可行的。
在“具體實(shí)施方式
”中將進(jìn)一步披露所述材料被制成塊狀或粉末狀。相比較而言，豬肋骨較適合制成塊狀的，其四肢骨較適合制成粉末狀的。其中塊狀的脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料具有與新鮮骨組織近似的生物力學(xué)強(qiáng)度、剛度和相同的小梁結(jié)構(gòu)，尤其適合四肢骨缺損的修復(fù)；粉末狀的脫細(xì)胞骨基質(zhì)復(fù)合粘連劑及信息分子(如rh-BMP，VEGF等)后，作為可注射型材料修復(fù)骨缺損、骨不連，其特點(diǎn)是對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷小。
以下僅以“具體實(shí)施方式
”中的塊狀材料的部分實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)1用塊狀的脫細(xì)胞異種骨基質(zhì)材料，修復(fù)兔橈骨1.0cm缺損20例。8周時(shí)，見(jiàn)新骨形成；16周時(shí)，X線(xiàn)及組織學(xué)均見(jiàn)骨性愈合，新生血管長(zhǎng)入。
實(shí)驗(yàn)2用塊狀的脫細(xì)胞異種骨基質(zhì)材料，復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2修復(fù)兔橈骨1.0cm骨缺損、骨不連各15例。4周時(shí)見(jiàn)新骨形成，血流量、成骨量較實(shí)驗(yàn)1顯著增多。8周見(jiàn)骨性愈合。
實(shí)驗(yàn)3分別用塊狀的脫細(xì)胞異種骨基質(zhì)材料與兔自體骨植入。植入后1～6周，5次檢測(cè)外周血、局部組織中免疫細(xì)胞變化、淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)及母細(xì)胞轉(zhuǎn)化等。兩者比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，局部組織學(xué)觀(guān)察見(jiàn)有骨誘導(dǎo)作用。
上述實(shí)驗(yàn)還進(jìn)一步表明用本法所制作脫細(xì)胞異種骨基質(zhì)材料復(fù)合重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2修復(fù)兔橈骨骨缺損較傳統(tǒng)材料明顯縮短愈合時(shí)間，效果顯著，無(wú)免疫排斥反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料的制備方法取體重為70～100Kg的豬的新鮮肋骨，去除軟組織和骨髓，根據(jù)需要、制成塊狀(為前面介紹的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，本例的大小為1cm3左右)。用自來(lái)水沖洗干凈，時(shí)間不少于30分；再用蒸餾水浸泡45分鐘。取出晾干后，在室溫條件下，在濃度為30％的H2O2中反應(yīng)12小時(shí)，以破壞細(xì)胞和間質(zhì)蛋白。蒸餾水浸泡40分鐘。取出晾干后，于室溫條件下，在濃度為1∶1的甲醇氯仿液中脫脂24小時(shí)。再用無(wú)水乙醇溶解、除去多余的氯仿，時(shí)間為24小時(shí)。取出晾干后，在37℃±1.5℃的條件下，在含有0.8N的NaOH、2％的Triton-X100、5％的DisDase酶的溶液中反應(yīng)20小時(shí)，以脫去細(xì)胞。然后，再用無(wú)水乙醇溶解并徹底清除殘余的氯仿，時(shí)間為48小時(shí)，第24小時(shí)后更換該乙醇一次。取出徹底晾干。制品封裝后，用60Co照射滅菌，照射劑量為25kGy。至此，一種塊狀的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料已制備完成，備用。
實(shí)施例2一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料的制備方法取體重為70～100Kg的豬的新鮮肋骨，去除軟組織和骨髓，根據(jù)需要、制成塊狀(為前面介紹的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，本例的大小為1cm3左右)。用自來(lái)水沖洗干凈，時(shí)間不少于30分；再用蒸餾水浸泡50分鐘。取出晾干后，在室溫條件下，在濃度為30％的H2O2中反應(yīng)12小時(shí)，以破壞細(xì)胞和間質(zhì)蛋白。蒸餾水浸泡35分鐘。取出晾干后，于室溫條件下，在濃度為1∶2的甲醇氯仿液中脫脂18小時(shí)。再用無(wú)水乙醇溶解、除去多余的氯仿，時(shí)間32小時(shí)。取出晾干后，在37℃±1.5℃的條件下，在含有0.2N的NaOH、1.5％的Triton-X100、2.5％的胃蛋白酶的溶液中反應(yīng)36小時(shí)，以脫去細(xì)胞。然后，再用無(wú)水乙醇溶解并徹底清除殘余的氯仿，時(shí)間為48小時(shí)，第24小時(shí)后更換該乙醇一次。取出徹底晾干。制品封裝后，用60Co照射滅菌，照射劑量為30kGy。至此，一種塊狀的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架材料已制備完成，備用。
實(shí)施例3一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料的制備方法取體重為70～100Kg的豬的新鮮肋骨，去除軟組織和骨髓，根據(jù)需要、制成塊狀(為前面介紹的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，本例的大小為1cm3左右)。用自來(lái)水沖洗干凈，時(shí)間不少于30分；再用蒸餾水浸泡60分鐘。取出晾干后，在室溫條件下，在濃度為30％的H2O2中反應(yīng)12小時(shí)，以破壞細(xì)胞和間質(zhì)蛋白。蒸餾水浸泡30分鐘。取出晾干后，于室溫條件下，在濃度為1∶4的甲醇氯仿液中脫脂12小時(shí)。再用無(wú)水乙醇溶解、除去多余的氯仿，時(shí)間48小時(shí)。取出晾干后，在37℃±1.5℃的條件下，在含有1.0N的NaOH、4.5％的Triton-X100、8％的胰蛋白酶的溶液中反應(yīng)18小時(shí)，以脫去細(xì)胞。然后，再用無(wú)水乙醇溶解并徹底清除殘余的氯仿，時(shí)間為48小時(shí)，第24小時(shí)后更換該乙醇一次。取出徹底晾干。制品封裝后，用60Co照射滅菌，照射劑量為25kGy。至此，一種塊狀的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架材料已制備完成，備用。
實(shí)施例4；一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架材料的制備方法取體重為70～100Kg的豬的新鮮四肢骨，去除軟組織和骨髓，制成5mm×5mm×5mm左右的塊狀。用自來(lái)水沖洗干凈，時(shí)間不少于30分；再用蒸餾水浸泡60分鐘。取出晾干后，在室溫條件下，在濃度為30％的H2O2中反應(yīng)12小時(shí)，以破壞細(xì)胞和間質(zhì)蛋白。蒸餾水浸泡40分鐘。取出晾干后，于室溫條件下，在濃度為1∶2的甲醇氯仿液中脫脂20小時(shí)。再用無(wú)水乙醇溶解、除去多余的氯仿，時(shí)間36小時(shí)。取出晾干后，在37℃±1.5℃的條件下，在含有0.4N的NaOH、2％的Triton-X100、4％的Dispase酶的溶液中反應(yīng)38小時(shí)，以脫去細(xì)胞。然后，再用無(wú)水乙醇溶解并徹底清除殘余的氯仿，時(shí)間為48小時(shí)，第24小時(shí)后更換該乙醇一次。取出徹底晾干后，碾成其顆粒大小在0.2～1mm3的粉末狀。制品封裝后60Co照射滅菌，照射劑量為30kGy。至此，一種粉末狀的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架材料已制備完成，備用。
實(shí)施例5一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架材料的制備方法取體重為70～100Kg的豬的新鮮四肢骨，去除軟組織和骨髓，制成5mm×5mm×5mm左右的塊狀。用自來(lái)水沖洗干凈，時(shí)間不少于30分；再用蒸餾水浸泡50分鐘。取出晾干后，在室溫條件下，在濃度為30％的H2O2中反應(yīng)12小時(shí)，以破壞細(xì)胞和間質(zhì)蛋白。蒸餾水浸泡50分鐘。取出晾干后，于室溫條件下，在濃度為1∶1的甲醇氯仿液中脫脂28小時(shí)。再用無(wú)水乙醇溶解、除去多余的氯仿，時(shí)間32小時(shí)。取出晾干后，在37℃±1.5℃的條件下，在含有0.6N的NaOH、3％的Triton-X100、5％的胃蛋白酶的溶液中反應(yīng)32小時(shí)，以脫去細(xì)胞。然后，再用無(wú)水乙醇溶解并徹底清除殘余的氯仿，時(shí)間為48小時(shí)，第24小時(shí)后更換該乙醇一次。取出徹底晾干后，碾成其顆粒大小在0.2～1mm3的粉末狀。制品封裝后60Co照射滅菌，照射劑量為25kGy。至此，一種粉末狀的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架材料已制備完成，備用。
實(shí)施例6一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架材料的制備方法取體重為70～100Kg的豬的新鮮四肢骨，去除軟組織和骨髓，制成5mm×5mm×5mm左右的塊狀。用自來(lái)水沖洗干凈，時(shí)間不少于30分；再用蒸餾水浸泡60分鐘。取出晾干后，在室溫條件下，在濃度為30％的H2O2中反應(yīng)12小時(shí)，以破壞細(xì)胞和間質(zhì)蛋白。蒸餾水浸泡30分鐘。取出晾干后，于室溫條件下，在濃度為1∶3的甲醇氯仿液中脫脂18小時(shí)。再用無(wú)水乙醇溶解、除去多余的氯仿，時(shí)間48小時(shí)。取出晾干后，在37℃±1.5℃的條件下，在含有0.8N的NaOH、5％的Triton-X100、6％的胰蛋白酶的溶液中反應(yīng)20小時(shí)，以脫去細(xì)胞。然后，再用無(wú)水乙醇溶解并徹底清除殘余的氯仿，時(shí)間為48小時(shí)，第24小時(shí)后更換該乙醇一次。取出徹底晾干后，碾成其顆粒大小在0.2～1mm3的粉末狀。制品封裝后60Co照射滅菌，照射劑量為30kGy。至此，一種粉末狀的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)支架材料已制備完成，備用。
從上述制備方法的實(shí)施例中不難看出，本發(fā)明中關(guān)于產(chǎn)品——“異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料”的發(fā)明內(nèi)容也同時(shí)披露了出來(lái)，故不再另舉出該材料本身的實(shí)施例了。
除豬骨外，同樣可以用其他動(dòng)物骨，如牛骨、羊骨等異種骨、依照本發(fā)明所述的方法制備出脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料，以供臨床應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料，它是經(jīng)過(guò)理化處理的豬骨，其特征在于，該材料是脫去了細(xì)胞以及抗原的豬骨。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料，其特征在于，該材料是經(jīng)過(guò)理化處理、并脫去了細(xì)胞以及抗原的豬的肋骨或四肢骨。
3.一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料的制備方法，取新鮮豬骨，先對(duì)其進(jìn)行常規(guī)的理化處理，包括去除軟組織和骨髓，沖洗，在蒸餾水中浸泡，其特征在于，該制備方法還至少有以下步驟①把理化處理后的豬骨放入H2O2中反應(yīng)，以破壞細(xì)胞和間質(zhì)蛋白，②再放入蒸餾水中浸泡、清洗；③放入甲醇-氯仿溶液中脫脂；④放入無(wú)水乙醇中除去多余的氯仿；⑤放入含有NaOH、Triton-X100和蛋白水解酶的溶液中反應(yīng)，以脫去細(xì)胞和間質(zhì)蛋白；⑥放入無(wú)水乙醇中除盡殘留的氯仿；⑦把該骨晾干、封裝后用60Co照射滅菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料的制備方法，其特征在于，所述的新鮮豬骨是豬的肋骨或四肢骨。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料的制備方法，其特征在于，H2O2的濃度為30％；甲醇、氯仿比例為1∶1～1∶4；NaOH含量為0.1～1.0N，Triton-X100含量為1％～5％，蛋白水解酶的含量為2％～8％；60Co的照射劑量為25～30kGy。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料的制備方法，其特征在于，所述的蛋白水解酶為Dispase酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶。
全文摘要
一種異種脫細(xì)胞骨基質(zhì)材料及其制備方法。其方法將豬的肋骨或四肢骨經(jīng)過(guò)理化處理、并經(jīng)過(guò)優(yōu)選的幾種蛋白水解酶之一聯(lián)合Triton－X100作用后脫去細(xì)胞及組織中的異種蛋白。該材料保留了骨組織的天然網(wǎng)孔及小梁結(jié)構(gòu)；近似天然骨的成分及生物力學(xué)強(qiáng)度。具有抗原性極低，植入后對(duì)受體的全身及局部免疫無(wú)明顯影響。相容性及骨傳導(dǎo)性好，來(lái)源豐富，制作簡(jiǎn)便，價(jià)廉。既可以作為骨缺損的充填材料，又可以復(fù)合細(xì)胞因子，種植種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨，應(yīng)用于臨床骨缺損的修復(fù)。
文檔編號(hào)A61L27/00GK1552467SQ20031011087
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月5日
發(fā)明者孫新君, 王正國(guó), 朱佩方 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所, 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科