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囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白抑制劑及其用途的制作方法

文檔序號:1041626閱讀:1317來源:國知局
專利名稱:囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白抑制劑及其用途的制作方法
背景技術(shù)
囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白(CFTR)為表達(dá)在哺乳動物氣道、腸、胰腺及睪丸上皮細(xì)胞的cAMP活化氯通道。CFTR是負(fù)責(zé)cAMP介導(dǎo)的Cl-分泌的氯通道。諸如β-腎上腺激動劑的激素、或諸如霍亂毒素的毒素可導(dǎo)致cAMP的增加、cAMP依賴蛋白激酶的活化以及所述CFTR Cl-通道的磷酸化,其可引起該通道的開放。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加也能活化不同的頂端(apical)膜通道。由蛋白激酶C引起的磷酸化能引起頂端膜中的Cl-通道開放或關(guān)閉。CFTR主要位于上皮中,這為Cl-離子跨頂端膜運(yùn)動提供了途徑和關(guān)鍵位點(diǎn)(key point)并以此來調(diào)節(jié)跨上皮的鹽和水的轉(zhuǎn)運(yùn)比例。CFTR氯通道功能與較廣泛的疾病有關(guān),包括囊性纖維化(CF)以及男性不育癥的一些類型、多發(fā)性囊性腎病以及分泌性腹瀉。
這種遺傳性致死性疾病囊性纖維化(CF)由CFTR的突變引起。人類囊性纖維化(CF)患者以及CF小鼠模型中的觀察表明CFTR在腸和胰腺液體轉(zhuǎn)運(yùn)中以及男性生殖中具有重要功能(Grubb et al.,1999,Physiol.Rev.79S193-S214;Wong,P.Y.,1997,Mol.Hum.Reprod.4107-110)。然而CFTR缺失可產(chǎn)生氣道疾病是CF中主要的發(fā)病和死亡原因,其機(jī)制仍不清楚(Pilewski et al.,1999,Physiol.Rev.79S215-S255)。了解CF中氣道性疾病的主要困難包括CF小鼠模型的不適當(dāng)(其顯現(xiàn)極少和沒有氣道疾病)、CF大動物模型的缺乏以及人CF氣道的可用性限制(其還沒有被慢性感染和被炎癥所損傷)。尚未使用高親和性、CFTR選擇性抑制劑來研究CF中的氣道性疾病的發(fā)病機(jī)制或在大動物模型中產(chǎn)生CF表型。
高親和性CFTR抑制劑在分泌性腹瀉和囊性腎病的治療以及在抑制男性生殖中也具有臨床作用?;衔锒桨?2-羧酸鹽(DPC)和5-硝基-2-(3-苯丙基氨基)苯甲酸酯(NPPB)在高濃度下可抑制CFTR,但其抑制活性沒有特異性(Cabantchik et al.,1992,Am.J.Physiol.262C803-C827;McDonough et al.,1994,Neurone 13623-634;Schultz et al.,1999,Physiol.Rev.79S109-S144)。用于電生理和其它細(xì)胞水平研究的最好的CFTR抑制劑優(yōu)降糖(glibenclamide)使用濃度為>100μM(Sheppard et al.,1992,J.Gen.Physiol.100573-591;Hongre et al,1994,Pflugers Arch.426284-287)。然而在此濃度優(yōu)降糖也抑制其它Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)劑(transporter)和K+通道(Edwards et al.,1993,Br.J.Pharmacol.1101280-1281;Rabe et al.,1995,Pflugers Arch.429659-662;Yamazaki et al.,1997,Circ.Res.81101-109)。其它離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的有效小分子抑制劑是公知的,但還沒有出現(xiàn)適合分泌性疾病治療的具有特異性CFTR抑制能力的小分子。
因此,需要CTFR抑制劑化合物及使用此化合物來開發(fā)用于CF研究和治療的動物模型以及分泌性病癥的治療和控制。本發(fā)明滿足了這些需求以及其它方面的要求并克服了背景技術(shù)中存在的缺陷。
發(fā)明概述本發(fā)明提供抑制囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白(CFTR)的組合物、藥物制劑及方法,其可用于CFRT介導(dǎo)疾病和病癥的研究和治療。本發(fā)明的組合物藥物制劑可包括一種或多種噻唑烷酮化合物或衍生物以及可另外含有一種或多種藥物可接受載體、賦形劑和/或佐劑。本發(fā)明的方法包括,在某些實(shí)施方案中,給予患有CFTR介導(dǎo)疾病或病癥的患者有效劑量的噻唑烷酮化合物或衍生物。在其它的實(shí)施方案中,本發(fā)明提供抑制CFTR的方法,其包括利用有效劑量的噻唑烷酮化合物或衍生物接觸個(gè)體細(xì)胞。本發(fā)明的特點(diǎn)還在于CFTR介導(dǎo)疾病的非人動物模型,該模型通過給予非人動物足以抑制CFTR的噻唑烷酮化合物或衍生物來產(chǎn)生。
從以下的詳細(xì)描述中可顯而易見本發(fā)明的這些和其它的目的和優(yōu)點(diǎn)。
附圖的簡要說明參考以下附圖可更加全面的理解本發(fā)明,該附圖僅是為了說明的目的。


圖1A所示為用于鑒定CFTR抑制劑的篩選技術(shù)流程圖。通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的上皮細(xì)胞中的多潛能激動劑可最大地刺激CFTR,該上皮細(xì)胞共表達(dá)人CFTR和具有Cl-/I-敏感熒光的黃色熒光蛋白(YFP)。在加入試驗(yàn)化合物后,通過加入含I-溶液可誘導(dǎo)I-流入。
圖1B所示為利用圖1A的篩選技術(shù),分別來自單一的小孔的熒光數(shù)據(jù)的圖示,其中顯示了對照(無活化劑、無試驗(yàn)化合物)、非活性化合物,及活性CFTR抑制劑化合物。
圖1C所示為通過圖1A篩選技術(shù)鑒定的CFTR抑制劑化學(xué)結(jié)構(gòu)。
圖1D所示為具有最大的CFTR抑制活性的噻唑烷酮衍生物環(huán)2的化學(xué)結(jié)構(gòu)。完整的噻唑烷酮衍生物結(jié)構(gòu)如圖1C所示。相對勢能為0.2(CFTRinh-020)、0.3(CFTRinh-029)、1.0(CFTRinh-172)、0.2(CFTRinh-185)、0.1(CFTRinh-214)及0.1(CFTRinh-236)。
圖2A所示為利用圖1A篩選技術(shù)的CFTR抑制劑3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(本文指CFTRinh-172)對時(shí)間作圖的多個(gè)濃度的相對熒光圖示。
圖2B所示為抑制的時(shí)間過程曲線,顯示加入2μM CFTRinh-172后在不同時(shí)間CFTR介導(dǎo)的I-轉(zhuǎn)運(yùn)率。插入的圖為抑制逆轉(zhuǎn)的時(shí)間過程曲線圖示,顯示1μM CFTRinh-172沖洗后不同時(shí)間的I-轉(zhuǎn)運(yùn)率。三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
圖2C所示為利用不同激動劑刺激后CFTR抑制的圖示,所述激動劑包括苯并黃酮和苯并咪唑酮UCCF化合物(UCCF-029(2-(4-吡啶)苯并[h]-4H-苯并吡喃(chromen)-4-酮硫酸氫鹽)和UCCF-853(Galietta et al.2001J.Biol.Chem.27619723-19728))、染料木黃酮(genistein)、CPT-cAMP、8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-methoxypsoralen)(8-MPO),8-環(huán)戊烷-1,3-二丙基黃嘌呤(dipropyxanthine)(CPX)(均為50μM)(三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±標(biāo)準(zhǔn)誤表示)。實(shí)心條顯示激動劑,空心條顯示伴有5μM CFTRinh-172的激動劑。
圖3A所示為CFTRinh-172對表達(dá)人CFTR的通透性FRT細(xì)胞中短路電流(short-circuit current)的抑制作用,通過100μM CPT-cAMP來刺激CFTR。
圖3B所示為CFTRinh-172(圓)與優(yōu)降糖(方塊)的劑量-抑制作用數(shù)據(jù)總結(jié)圖(三組實(shí)驗(yàn)結(jié)果以標(biāo)準(zhǔn)誤表示)。
圖3C所示為在原代培養(yǎng)的(非通透性)人支氣管上皮細(xì)胞中短路電流的CFTRinh-172抑制作用。在頂端灌洗溶液中加入抑制劑(左側(cè)圖)或在基底側(cè)及隨后的頂端溶液中加入抑制劑(右側(cè)圖)。
圖3D所示為CFTR表達(dá)FRT細(xì)胞的全細(xì)胞膜片鉗的圖示,顯示在+80mV(空心圓)和-100mV(實(shí)心圓)處引出的膜電流。由5μM毛喉萜(forskolin)刺激CFTR,隨后加入2μM CFTinh-172。
圖3E所示為間斷交替刺激(a-c)(alternate stimulation)產(chǎn)生分級的膜電勢的圖示。
圖3F所示為基礎(chǔ)狀態(tài)下(對照,空心圓)、毛喉萜刺激后(實(shí)心圓)、及加入0.2μM CFTRinh-172后出現(xiàn)~50%抑制作用(空心三角)的電流-電壓關(guān)系圖示。
圖4A所示為在有或沒有5μM CFTRinh-172存在時(shí)以短路電流分析來檢測的氣道上皮細(xì)胞中UTP-(100μM)刺激Ca2+依賴Cl-分泌圖示。
圖4B所示為在FRT細(xì)胞中全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢測的容積-活化Cl-電流(低滲的250mosM/kg H2O)圖示。在有和沒有5μM CFTRinh-172存在時(shí)記錄電流。
圖4C所示為MDR-1表達(dá)上調(diào)的9HTEo-/Dx細(xì)胞中的3H-長春新堿(vincristine)累積圖示。在有和沒有異搏定(verapamil)(100μM)或CFTRinh-172(5μM)時(shí)檢測細(xì)胞內(nèi)長春新堿(標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3)。
圖4D所示為采用CFTRinh-172、二氮嗪(diazoxide)(100μM)及優(yōu)降糖(10μM)進(jìn)行細(xì)胞外灌注記錄的胰腺β細(xì)胞(INS-1)膜電勢圖示。
圖4E所示為圖4D所示的由操作引起的膜電勢平均改變(ΔmV)圖示(標(biāo)準(zhǔn)誤,n=4)。
圖5A所示為在沒有(頂端)和有(中間)腹腔內(nèi)注射CFTRinh-172(150μg/kg)時(shí)、1μg霍亂毒素腔內(nèi)注射后6小時(shí)時(shí)分離的小鼠回腸環(huán)(loop)照片。鹽水對照(沒有霍亂毒素,底部)作為對比顯示。
圖5B從14-16環(huán)中研究得到的6小時(shí)時(shí)的回腸環(huán)重量,數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=6-8只小鼠)。對于無活性類似物,CFTRinh-172中的4-羧基苯基基團(tuán)被3-甲氧基-4-甲氧基乙烯基苯基取代(標(biāo)準(zhǔn)誤,每組6-8只小鼠,*p<0.001,方差分析)。
圖5C所示為口服強(qiáng)飼法給藥后6小時(shí)時(shí)移去腔液前與移去后之間的整個(gè)小腸的重量比值(標(biāo)準(zhǔn)誤,每組4只小鼠,p<0.001)。
圖5D所示為在分離的大鼠結(jié)腸粘膜中加入氨氯吡脒及用毛喉萜(20μM)的刺激后CFTRinh-172抑制作用的短路電流。如所示將CFTRinh-172加入到漿膜、隨后是粘膜表面(n=4)。
圖6所示為14C-標(biāo)記CFTRinh-172合成的示意圖。利用標(biāo)記的14C溴乙酸作為起始材料將14C結(jié)合到噻唑烷酮核中。
圖7所示為大鼠經(jīng)單劑量靜脈內(nèi)彈丸(bolus)輸注50μCi14C標(biāo)記CFTRinh-172后,一組CFTRinh-172藥代動力學(xué)分析結(jié)果圖。血清放射活性數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(n=3-6只大鼠)。擬合曲線(Fitted curve)對應(yīng)2室模型,其中再分布半衰期為0.14hr,清除半衰期10.3hr,最大血清濃度為3.2μg/mL,曲線下面積為3.8μg.hr/mL,分布容積為1.2L,清除率為99mL/hr。
圖8所示為在彈丸輸注后14C標(biāo)記CFTRinh-172的器官分布圖。圖A中的結(jié)果來自單劑量靜脈內(nèi)彈丸輸注2μCi14C標(biāo)記CFTRinh-172的小鼠,在所指示的時(shí)間處死動物,收集器官進(jìn)行14C放射活性的分析,數(shù)據(jù)以輸注后指定時(shí)間的整體器官(除骨骼肌以每克組織報(bào)道外)14C放射活性表示(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,每一時(shí)間點(diǎn)4只小鼠)。圖B中的結(jié)果來自給予彈丸輸注50μCi14C標(biāo)記CFTRinh-172的大鼠,且在輸注后60分鐘檢測整體器官的CFTRinh-172(3只大鼠)。
圖9所示為通過薄層層析檢測的小鼠體液和肝臟CFTRinh-172代謝分析結(jié)果的一組照片,該小鼠如圖8中圖A的14C標(biāo)記CFTRinh-172灌注。14C標(biāo)記CFTRinh-172標(biāo)準(zhǔn)為1、3和6nCi(左側(cè)圖),以及10、30和60nCi(右側(cè)圖)。對底片進(jìn)行48小時(shí)(左側(cè)圖)和12小時(shí)(右側(cè)圖)的放射性自顯影。
圖10所示為小鼠閉合腸環(huán)模型特征結(jié)果的一組圖示。圖A利用200μL緩沖液進(jìn)行腸環(huán)注射,在所指示的時(shí)間進(jìn)行環(huán)重量的檢測(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4只小鼠)。插入圖(底部)為有和沒有CFTRinh-172(20μgi.p.(腹腔注射),n=4)時(shí)在30分鐘的吸收率%。插入圖(上部)為CFTRinh-172的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。圖B為在小鼠閉合環(huán)模型中霍亂毒素誘導(dǎo)的體液分泌時(shí)間曲線。虛線顯示對照(鹽水注射)環(huán)。注射環(huán)(1μg霍亂毒素/環(huán))的數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(4-6只小鼠)表示。
圖11所示為給予小鼠霍亂毒素后CFTRinh-172對腸液分泌的抑制作用一組圖示。圖A在小鼠環(huán)模型中體液累積抑制作用的量-效圖。通過腹腔內(nèi)注射給予小鼠單劑量的CFTRinh-172,在6小時(shí)檢測環(huán)的重量(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,每個(gè)劑量4-6只小鼠)。虛線表示相同小鼠的鹽水注射對照環(huán)的平均重量。圖BCFTRinh-172抑制作用的持續(xù)性。在給予霍亂毒素前后的指定的時(shí)間給小鼠注射20μg CFTRinh-172(i.p.)(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)4-6只小鼠)。圖C靜脈注射(i.v.)(尾靜脈,左縱坐標(biāo))和口服給藥(TPGS中的CFTRinh-172,右縱坐標(biāo))后血漿14C-CFTRinh-172放射活性的時(shí)間曲線。數(shù)據(jù)以每分鐘每μCi注射的計(jì)數(shù)表示(4只小鼠)。圖D14C-CFTRinh-172靜脈注射和口服給藥后6小時(shí),14C-CFTRinh-172在胃腸消化器官的累積(4只小鼠)。圖E口服給予CFTRinh-172(TPGS中200μg)對小鼠開放環(huán)模型中霍亂毒素誘導(dǎo)的體液分泌的抑制作用。數(shù)據(jù)以口服強(qiáng)飼后6小時(shí)腔液移去前后的全小腸重量比值表示(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,每組4只小鼠,*p<0.01)。圖FCFTRinh-172跨Caco-2細(xì)胞單層的通透性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,18個(gè)插片(insert)),其中Papp=16×10-6cm/s。
圖12所示為大鼠閉合環(huán)模型中CFTRinh-172對霍亂毒素(圖A)和STa毒素(圖B)誘導(dǎo)的體液分泌的抑制作用的一組圖示。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(每組4只大鼠),*p<0.01。
圖13所示為小鼠回腸(圖A)和人結(jié)腸(圖B)中CFTRinh-172對毛喉萜和STa毒素刺激的短路電流的抑制作用的一組圖示。STa毒素如插入圖所示。數(shù)據(jù)表示5只小鼠和兩套人組織的研究結(jié)果。在組織的兩側(cè)同時(shí)加入CFTRinh-172。氨氯吡脒(10μM)存在于頂端溶液中。
圖14所示為CFTRinh-172對T84結(jié)腸上皮細(xì)胞Cl-分泌的抑制作用的短路電流分析的一組圖示。圖A數(shù)據(jù)以實(shí)驗(yàn)(每種條件下5-12個(gè)插片)的描記表示。在細(xì)胞層的兩側(cè)同時(shí)加入CFTRinh-172。CFTR激動劑包括毛喉萜(左側(cè))、8-Br-cGMP(中間)及CFTRACT-16(右側(cè))。圖B(左側(cè))利用兩性霉素B(250μg/mL)進(jìn)行基底側(cè)通透作用后,CFTRinh-172對毛喉萜刺激的短路電流的抑制作用。所示為6次插片的實(shí)驗(yàn)。(中央)在通透性與(vs.)非通透性T84細(xì)胞中CFTRinh-172對毛喉萜刺激(圓)和8-Br-cGMP刺激(三角)短路電流的抑制作用平均量-效圖(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,6-12個(gè)插片)。(右側(cè))存在高K+(68mM)的基底側(cè)溶液與低Cl-頂端溶液中CFTRinh-172對毛喉萜刺激短路電流的抑制作用。所示為4次實(shí)驗(yàn)。
在描述本發(fā)明之前,應(yīng)理解本發(fā)明并不限于所述的特定實(shí)施方案,其應(yīng)該可以變化。也應(yīng)理解,本文所用術(shù)語僅為描述特定實(shí)施方案的目的,并不是為了限制的目的,因?yàn)楸景l(fā)明的范圍只能由所附的權(quán)利要求所限制。
除非有其它的定義,本文所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管與本文所述的方法和材料相似和等價(jià)的方法和材料能夠用于本發(fā)明的實(shí)踐和試驗(yàn),但本文將對優(yōu)選的方法和材料進(jìn)行描述。本文所提及的所有出版物在此引用作為參考來公開和描述與所引用出版物相關(guān)的方法和/或材料。
應(yīng)指出,本文和所附權(quán)利要求中的單數(shù)形式“a”“an”及“the”包括復(fù)數(shù)的所述事物,除非文中有其它清楚的闡述。因此,例如“an抑制劑”的表示包括此抑制劑的復(fù)數(shù),而且“the細(xì)胞”包括本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的一種和多種細(xì)胞和其等價(jià)物的表示,等等。
本發(fā)明所討論的出版物僅提供本申請?zhí)峤蝗掌谥暗墓_,并在此引用作為本文的參考。本文的任何參考不能認(rèn)為是由于在早的發(fā)明而否定本發(fā)明早于這些出版物。此外,所提供的發(fā)表日期也可能與實(shí)際的發(fā)表日期不同,這需要分別對其證實(shí)。
本文所采用的定義是為了說明的原因而提供,而不能認(rèn)為是限制。本文所用技術(shù)和科學(xué)術(shù)語應(yīng)具有與本發(fā)明所屬技術(shù)人員通常理解的相同含義。
發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明的根據(jù)是噻唑烷酮化合物和衍生物的發(fā)現(xiàn),其為高親和性的CFTR抑制劑。以下將更加詳細(xì)地描述本發(fā)明所述化合物和衍生物的結(jié)構(gòu),以及藥物制劑和使用方法。
定義“囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白介導(dǎo)的疾病狀態(tài)或癥狀”或“CFTR介導(dǎo)的疾病狀態(tài)或癥狀”指由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白(CFTR)的活性(例如,CFTR在離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的活性)引起的任何狀態(tài)、病癥或疾病,或者這種狀態(tài)、病癥、或疾病癥狀。通過抑制CFTR的活性可對這種狀態(tài)、病癥、疾病或其癥狀進(jìn)行治療,例如,CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)抑制作用。已發(fā)現(xiàn)CFTR活性包括,例如對各種激動劑(包括霍亂毒素)反應(yīng)的腸分泌(參見例如,Snyder et al.1982 Bull.World Health Organ.60605-613;Chao et al.1994 EMBO J.131065-1072;Kimberg et al.1971 J.Clin.Invest.501218-1230)。
本文所用“CFTR抑制劑”為降低由CFTR引起的離子轉(zhuǎn)運(yùn)效率的化合物,特別是由CFTR引起的氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)。優(yōu)選地,本發(fā)明的CFTR抑制劑為特異性CFTR抑制劑,即抑制CFTR活性而對其它離子轉(zhuǎn)運(yùn)劑的活性沒有顯著的或相反的作用,例如其它氯轉(zhuǎn)運(yùn)劑、鉀轉(zhuǎn)運(yùn)劑等等。優(yōu)選地,所述CFTR抑制劑為高親和性CFTR抑制劑,例如,對CFTR的親和性至少為約一個(gè)微摩爾,通常約一個(gè)到五個(gè)微摩爾。
本文所用的“治療(Treating)”或“治療(treatment)”涵蓋個(gè)體中疾病、疾病狀態(tài)、病癥或癥狀的治療,其中所述疾病、疾病狀態(tài)、病癥或癥狀由CFTR活性來介導(dǎo),并包括(1)預(yù)防所述疾病、疾病狀態(tài)、或病癥,即導(dǎo)致個(gè)體中所述疾病的臨床癥狀不進(jìn)展,其可暴露出或傾向于患有所述疾病、狀態(tài)、或病癥,但還沒有經(jīng)歷或表現(xiàn)其癥狀,(2)抑制疾病、狀態(tài)、或病癥,即停滯或減少所述疾病、疾病狀態(tài)或病癥、或其臨床癥狀的發(fā)展,或(3)緩解所述疾病、疾病狀態(tài)、或病癥,即導(dǎo)致所述疾病、疾病狀態(tài)、或病癥、或其臨床癥狀的恢復(fù)。
“治療有效作用劑量”或“有效劑量”指本發(fā)明化合物的劑量,其在將本發(fā)明化合物對需要該化合物的哺乳動物或其他個(gè)體給藥時(shí),對由所述CFTR活性介導(dǎo)的疾病、疾病狀態(tài)、病癥或癥狀,足以產(chǎn)生有效的如上所定義的治療作用。構(gòu)成“治療有效劑量”的本發(fā)明化合物的量依據(jù)所述化合物、所述疾病及其嚴(yán)重程度以及待治療個(gè)體的年齡、體重等等而有所不同,但本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員根據(jù)其掌握的知識并根據(jù)本公開能夠常規(guī)確定。
所述術(shù)語“個(gè)體”和“患者”為任何哺乳動物和非哺乳動物種屬的一個(gè)成員或多個(gè)成員,其可能需要本發(fā)明所述的制藥方法、組合物和治療。由此個(gè)體和患者包括但不限于,靈長類(包括人)、犬科、貓科、有蹄類動物(例如,馬、牛、豬(例如豬(pig))、鳥類及其它個(gè)體。特別關(guān)注具有商業(yè)價(jià)值的人和非人動物(例如家畜和馴養(yǎng)動物)。
“哺乳動物”指任何哺乳動物種屬的一個(gè)成員和多個(gè)成員,并包括作為示例的,犬科;貓科;馬;牛;羊;嚙齒動物等等以及靈長類,特別是人。非人動物模型特別是哺乳動物,例如靈長類、鼠科動物、兔類等可用于實(shí)驗(yàn)研究中。
本文所述術(shù)語“單位劑量形式”指物理分散的適合用于人和動物個(gè)體的單一劑量單位,每一單位中的成分含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物,其根據(jù)足以產(chǎn)生所需效果的劑量來計(jì)算,并同時(shí)含有藥物可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。說明本發(fā)明新的單位劑量形式的說明書依據(jù)所用的特定化合物和預(yù)產(chǎn)生的作用、以及在宿主中每種化合物的藥代動力學(xué)來確定。
所述術(shù)語“生理狀態(tài)”包括與活存細(xì)胞匹配的狀態(tài),例如與活存的細(xì)胞匹配的溫度、pH、鹽度等等的主要的水環(huán)境狀態(tài)。
“藥物可接受的賦形劑”指用于制備藥物組合物的賦形劑,其通常為安全、無毒、非生物的和不是其它不必要的物質(zhì),并包括獸用可接受和人用藥物可接受的賦形劑。本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書所用的“藥物可接受賦形劑”同時(shí)包括一種和多種此類賦形劑。
本文所用的本發(fā)明化合物的“藥物可接受衍生物”包括鹽、酯、烯醇醚、烯醇酯、乙縮醛、酮縮醇、原酸酯、半縮醛、半酮縮醇、酸、堿、溶劑化物、水合物或其前藥。本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員使用公知的這種衍生作用的制備方法可容易地制備這種衍生物。由此制備的化合物不含基本毒性作用可對動物或人給藥,或者其是制藥活性的或是前藥。
本發(fā)明化合物的“藥物可接受的鹽”指藥物可接受并具有母體化合物的所需藥理活性。這種鹽包括(1)酸加和鹽,與無機(jī)酸(諸如鹽酸、溴化氫、硫酸、硝酸、磷酸等等)形成;或與有機(jī)酸形成,該有機(jī)酸諸如乙酸、丙酸、己酸、環(huán)戊基丙酸、羥基乙酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、馬來酸、反丁烯二酸(延胡索酸)、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥苯基)苯甲酸、月桂酸、苦杏仁酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙二磺酸、2-羥基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯亞磺酸、樟腦磺酸、4-甲基二環(huán)[2.2.2]八-2-烯基-1-羧酸、葡庚糖酸、4,4’-亞甲基雙-(3-羥基-2-烯基-1-羧酸)、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羥基萘甲酸、水楊酸、硬脂酸、己二烯二酸等等;或(2)當(dāng)出現(xiàn)在母體化合物中的酸性質(zhì)子被金屬離子(例如堿金屬離子、堿土離子或鋁離子)取代時(shí),可形成鹽;或與有機(jī)堿(例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨基丁三醇、N-甲基葡糖胺等等)共同形成鹽。
本發(fā)明化合物的“藥物可接受的酯”指藥物可接受并具有所述母體化合物的所需藥理學(xué)活性,且包括但不限于酸性基團(tuán)(包括但不限于羧酸、磷酸、次磷酸、磺酸、亞磺酸及硼酸)的烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、環(huán)烷基和雜環(huán)基酯。
本發(fā)明化合物的“藥物可接受的烯醇醚”指藥物可接受的烯醇醚并具有所述母體化合物的所需藥理學(xué)活性,且包括但不限于通式C=C(OR)的衍生物,其中R為氫、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基。
本發(fā)明化合物的“藥物可接受的烯醇酯”指藥物可接受的烯醇酯并具有所述母體化合物的所需藥理學(xué)活性,且包括但不限于通式C=C(OC(O)R),其中R為氫、烷基、烯基、炔基、芳基、雜芳基、芳基烷基、雜芳基烷基、環(huán)烷基或雜環(huán)基。
本發(fā)明化合物的“藥物可接受的溶劑或水合物”指藥物可接受的溶劑或水合物復(fù)合物并具有所述母體化合物的所需藥理學(xué)活性,且包括但不限于本發(fā)明化合物與一種或多種溶劑或水分子、或1至約10種、或1至2、3、或4種溶劑或水分子的復(fù)合物。
“前藥”指當(dāng)前藥對哺乳動物個(gè)體給藥時(shí),在體釋放通式(I)的活性母體化合物的任何化合物。所述通式(I)化合物的前藥包含在標(biāo)準(zhǔn)的生理?xiàng)l件下可水解成為對應(yīng)的羧基、羥基、氨基或巰基的功能基團(tuán)。這種功能基團(tuán)的例子包括但不限于通式(I)化合物中羥基酯(例如乙酯、甲酯、苯甲酯衍生物)和氨基甲酸酯(例如,N,N-二甲基氨基羰基)等等。其它的例子包括通式(I)化合物中羥基或羧基的二肽或三肽酯等等。這種功能化合物的制備是本領(lǐng)域公知的。例如,含有與之相連的羥基(例如,當(dāng)X1、X2、X3、Y1、Y2或Y3為羥基時(shí))的通式(I)化合物可用含有自由羧基末端的羧酸或二肽來處理,在本領(lǐng)域公知的酯化條件下產(chǎn)生所需的酯類功能基團(tuán)。同樣地,含有與之相連的自由羧基的通式(I)化合物可用含有諸如絲氨酸殘基的羥基(例如,-N(H)-C(H)(CH2OH)-C(O)-)的醇或三肽來處理,在本領(lǐng)域公知的酯化條件下產(chǎn)生所需的酯類功能基團(tuán)。此外,含有與之相連的羧基酯基團(tuán)的通式(I)化合物可用不同的羧基酯來處理,在酯基轉(zhuǎn)移作用條件下生成具有所需功能酯基與之相連的通式(I)化合物。所有這種功能基團(tuán)屬于本發(fā)明的范圍。
本文所用術(shù)語“有機(jī)基團(tuán)”和“有機(jī)根”指任何含碳基團(tuán),包括烴基,其分為脂肪烴、環(huán)烴、芳香烴、其功能化衍生物和/或其各種組合物。術(shù)語“脂肪烴”指飽和或不飽和直鏈或支鏈烴基并包括例如烷基、烯基和炔基。術(shù)語“烷基”指取代或非取代、飽和直鏈或支鏈烴基或鏈(例如,C1-C8)包括例如,甲基、乙基、異丙基、t-丁基、庚基、n-辛基、十二烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基等等。適合的取代包括羧基、保護(hù)的羧基、氨基、保護(hù)的氨基、鹵素、羥基、保護(hù)的羥基、巰基、低級烷基硫基(lower alkylthio)、硝基、氰基、單取代氨基、保護(hù)的單取代氨基、雙取代氨基、C1-C7烷氧基、C1-C7?;?、C1-C7酰氧基等等。術(shù)語“取代烷基”指上述定義的烷基基團(tuán)被羥基、保護(hù)的羥基、氨基、保護(hù)的氨基、氰基、鹵素、三氟甲基、單取代氨基、雙取代氨基、低級烷氧基、巰基、低級烷基硫基、羧基、保護(hù)的羧基、或羧基、氨基、和/或羥基鹽進(jìn)行了一至三次的取代。如與雜芳香環(huán)的取代基使用相關(guān)聯(lián),下文定義的術(shù)語“取代(環(huán)烷基)烷基”和“取代環(huán)烷基”由所列出的“取代烷基”相同基團(tuán)所取代。術(shù)語“烯基”指具有諸如乙烯基的具有一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵的不飽和、直鏈或支鏈烴基。術(shù)語“炔基”指具有一個(gè)或多個(gè)碳-碳三鍵的不飽和、直鏈或支鏈烴基。術(shù)語“環(huán)基”指閉合的環(huán)烴基,其分為脂環(huán)基、芳香基或雜環(huán)基。術(shù)語“脂環(huán)基”指具有類似脂肪族基性的環(huán)烴基?!胺枷慊被颉胺蓟敝竼苇h(huán)或多環(huán)芳香烴基,并可包括一種或多種雜原子,下文對其做了進(jìn)一步定義。術(shù)語“雜環(huán)”指閉合的烴,其中環(huán)中的一個(gè)或多個(gè)原子為非碳元素(例如,N、O、S等)且下文做了進(jìn)一步定義。
“有機(jī)基團(tuán)”可以功能化或另外含有附加的與有機(jī)基團(tuán)相關(guān)的功能基團(tuán),諸如羧基、氨基、羥基等等,其可以是保護(hù)的或未保護(hù)的。例如,短語“烷基基團(tuán)”應(yīng)不僅包括純的開鏈飽和烴烷基取代基,諸如甲基、乙基、丙基、t-丁基等等,而且還包括含有另外本領(lǐng)域公知的取代基的烷基取代基,所述取代基諸如羥基、烷氧基、巰基、烷基硫基、烷基磺酰、鹵素、氰基、硝基、氨基、羧基等等。因此“烷基基團(tuán)”包括醚、酯、鹵代烷基、硝基烷基、羧基烷基、羥基烷基、磺烷基等等。
本文替換使用的術(shù)語“鹵代基團(tuán)”或“鹵素”指氟、氯、溴、碘基團(tuán)。優(yōu)選的鹵素為氯和氟。
術(shù)語“鹵代烷基”指由一種或多種鹵素原子取代的上述定義的烷基基團(tuán)。所述的鹵素可以相同或不同。術(shù)語“二鹵代烷基”指由兩個(gè)鹵基取代的上述烷基基團(tuán),鹵基可以相同或不同。術(shù)語“三鹵代烷基”指由三個(gè)鹵基取代的上述烷基基團(tuán),鹵基可以相同或不同。術(shù)語“全鹵烷基”指上述定義的鹵烷基基團(tuán),其中烷基基團(tuán)中的每個(gè)氫原子都被鹵素原子取代。術(shù)語“全氟代烷基”指上述定義的鹵烷基基團(tuán),其中所述烷基基團(tuán)中的每個(gè)氫原子都被氟基取代。
術(shù)語“環(huán)烷基”指單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)的飽和環(huán),其為完全飽和/或部分不飽和。這種基團(tuán)的例子包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、金剛烷基、環(huán)辛基、順-或反-萘烷、二環(huán)[2.2.1]七-2-烯(bicycle[2,2,1]hept-2-ene)、環(huán)己-1-炔基、環(huán)戊-1-炔基、1,4-環(huán)辛二炔基,等等。
術(shù)語“(環(huán)烷基)烷基”指上述定義的烷基基團(tuán)被一個(gè)上述環(huán)烷基取代。這種基團(tuán)的例子包括(環(huán)己基)甲基、3-(環(huán)丙基)-n-丙基、5-(環(huán)戊烷)己基、6-(金剛烷基)己基,等等。
術(shù)語“取代苯基”特指由一個(gè)或多個(gè)部分取代的苯基基團(tuán),在一些例子中,由一個(gè)或兩個(gè)或三個(gè)部分所取代,其選自鹵素、羥基、保護(hù)的羥基、氰基、硝基、巰基、烷基硫基、三氟甲基、C1-C7烷基、C1-C7烷氧基、C1-C7?;?、C1-C7酰氧基、羧基、氧羧基、保護(hù)的羧基、羧甲基、保護(hù)的羧甲基、羥甲基、保護(hù)的羥甲基、氨基、保護(hù)的氨基、(單取代)氨基、保護(hù)的(單取代)氨基、(雙取代)氨基、甲酰氨基、保護(hù)的甲酰氨基、N-(C1-C6烷基)甲酰氨基、保護(hù)的N-(C1-C6烷基)甲酰氨基、N,N-二(C1-C6烷基)甲酰氨基、三氟甲基、N-((C1-C6烷基)磺酰)氨基、N-(苯磺酰)氨基或苯基、取代或非取代的例如二苯基或萘基基團(tuán)產(chǎn)物。
術(shù)語“取代苯基”的例子包括單或雙(鹵代)苯基基團(tuán),例如,2-,3-或4-氯苯基、2,6-二氯苯基、2,5-二氯苯基、3,4-二氯苯基、2-,3-或4-溴苯基、3,4-二溴苯基、3-氯-4-氟苯基、2-,3-或4-氟苯基等等;單或雙(羥基)苯基基團(tuán),例如2,3,或4-羥基苯基、2,4-二羥基苯基、及其保護(hù)的羥基衍生物等等;硝基苯基基團(tuán)例如,2-,3-或4-硝基苯基;氰基苯基基團(tuán),例如,2-,3-或4-氰基苯基;單或雙(烷基)苯基例如,2-,3-或4-甲基苯基、2,4-二甲基苯基、2-,3-或4-(異丙基)苯基、2-3-或4-乙基苯基、2-,3-或4-(n-丙基)苯基等等;單或二(烷氧基)苯基基團(tuán),例如,2,6-二甲氧基苯基、2-,3-或4-(異丙氧基)苯基、2-,3-或4-(t-丁氧基)苯基、3-乙氧基-4-甲氧苯基等等;2-,3-或4-三氟甲基苯基;單羧基苯基或二羧基苯基或(保護(hù)的羧基)苯基基團(tuán),例如2-,3-或4-羧基苯基或2,4-二(保護(hù)的羧基)苯基;單或二(羥甲基)苯基或(保護(hù)的羥甲基)苯基,例如2-,3-或4-(保護(hù)的羥甲基)苯基或3,4-二(羥甲基)苯基;單或二(氨甲基)苯基或(保護(hù)的氨甲基)苯基例如,2-,3-或4-(氨甲基)苯基或2,4-(保護(hù)的氨甲基)苯基;或單或二(N-(甲磺酰氨基))苯基例如,2-,3-或4-(N-(甲磺酰氨基))苯基。而且,所述術(shù)語“取代苯基”代表雙取代苯基基團(tuán),其中所述的取代基是不同的,例如,3-甲基-4-羥基苯基、3-氯-4-羥基苯基、2-甲氧基-4-溴苯基、4-乙基-2-羥基苯基、3-羥基-4-硝基苯基、2-羥基-4-氯苯基等等。
術(shù)語“(取代苯基)烷基”指一種上述取代苯基基團(tuán)連于一種上述烷基基團(tuán)上。這種基團(tuán)的例子包括2-苯基-1-氯乙基、2-(4’-甲氧基苯基)乙基、4-(2’,6’-二羥基苯基)-n-己基、2-(5’-氰基-3’-甲氧基苯基)-n-苯基、3-(2’,6’-二甲基苯基)丙基、4-氯-3-氨基芐基、6-(4’-甲氧基苯基)-3-羧基己基、5-(4’-氨甲基苯基)-3-(氨甲基)苯基、5-苯基-3-羰基戊基-1-基、(4-羥基萘基-2-基)甲基等等。
如上所述,術(shù)語“芳香的”或“芳基”指五元和六元碳環(huán)。同時(shí)如上所述,術(shù)語“雜芳基”指任意取代的五元或六元環(huán),其含有1-4個(gè)雜原子,例如氧、硫和/或氮原子,特別是氮原子,可單獨(dú)或與環(huán)上的氧或硫原子連接。這些五元或六元環(huán)可以是完全不飽和的。
此外,上述任意取代五元或六元環(huán)可能任意地稠合到芳香族五元或六元環(huán)體系中。例如,所述的環(huán)能任意地稠合到諸如吡啶或三唑體系的五元或六元環(huán)體系中,且優(yōu)選苯環(huán)。
下列環(huán)體系為由術(shù)語“雜芳基”表示的雜環(huán)(無論取代或非取代)基團(tuán)的例子噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡咯烷基、咪唑基、異噁唑基、三唑基、噻二唑基、氧雜二唑基、四唑基、噻三唑基、氧雜三唑基(oxatriazolyl)、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、噁嗪基、三嗪基、噻二嗪基四唑并、1,5-[b]噠嗪基及嘌呤基、以及苯并稠合衍生物,例如苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并咪唑基及吲哚基。
上述任意取代的雜芳基環(huán)的取代基來自一到三個(gè)鹵素、三鹵代甲基、氨基、保護(hù)的氨基、氨鹽、單取代氨基、雙取代氨基、羧基、保護(hù)的羧基、羧酸鹽、羥基、保護(hù)的羥基、羥基基團(tuán)的鹽、低級烷氧基、巰基、低級烷基硫基、烷基、取代烷基、環(huán)烷基、取代環(huán)烷基、(環(huán)烷基)烷基、取代的(環(huán)烷基)烷基、苯基、取代苯基、苯基烷基以及(取代的苯基)烷基。雜芳基基團(tuán)的取代基如上所定義,或當(dāng)為三鹵代甲基時(shí),為三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基或三碘甲基。用作與上述雜芳基環(huán)相關(guān)的的取代基時(shí),“低級烷氧基”指C1-C4烷氧基基團(tuán),同時(shí)“低級烷基硫基”指C1-C4烷基硫基基團(tuán)。
術(shù)語“(單取代)氨基”指由一種取代基取代的氨基,該取代基選自苯基、取代苯基、烷基、取代烷基、C1-C4?;?、C2-C7烯基、C2-C7取代烯基、C2-C7炔基、C7-C16烷基芳基、C7-C16取代烷基芳基及雜芳基基團(tuán)。所述的(單取代)氨基可另外含有氨基保護(hù)的基團(tuán)作為術(shù)語“保護(hù)的(單取代)氨基”所包含的內(nèi)容。術(shù)語“(雙取代)氨基”指由兩種取代基取代的氨基基團(tuán),該取代基選自苯基、取代苯基、烷基、取代烷基、C1-C7?;?、C2-C7烯基、C2-C7炔基、C7-C16烷基芳基、C7-C16取代烷基芳基和雜芳基。這兩種取代基可以相同或不同。
術(shù)語“雜芳基(烷基)”指由上述定義的雜芳基基團(tuán)在任何位置上取代上述定義的烷基基團(tuán)。
“任意的”或“任意地”指隨后描述的事件、情況、特征或元素可以(但不必要)發(fā)生,且該描述包括該事件和情況發(fā)生的例子及其不發(fā)生的例子。例如,“利用烷基基團(tuán)任意地單取代或雙取代的雜環(huán)基團(tuán)”指所述的烷基可以(但不必要)出現(xiàn),且該描述包括利用烷基基團(tuán)對該雜環(huán)基團(tuán)進(jìn)行單取代或雙取代的狀態(tài)以及不用該烷基基團(tuán)對該雜環(huán)基團(tuán)進(jìn)行取代的狀態(tài)。
術(shù)語“吸電子基團(tuán)”指在分子中功能基團(tuán)將電子吸至其本身的能力多于如果是氫原子占據(jù)了所述分子中相同的位置時(shí)的吸電子能力。吸電子基團(tuán)的例子包括但不限于,鹵素基團(tuán),-C(O)R基團(tuán)(其中R為烷基);羧酸和酯基;-NR3+基團(tuán)(其中R為烷基或氫);偶氮基;硝基;-OR和-SR基(其中R為氫或烷基);以及含有此類吸電子基團(tuán)的有機(jī)基團(tuán)(如本文所定義的),例如鹵代烷基基團(tuán)(包括全鹵代烷基基團(tuán)),等等。
具有相同分子式但其原子成鍵的特性或順序不同、或者其原子的空間排列不同的化合物稱為“同分異構(gòu)體”。其原子的空間排列不同的同分異構(gòu)體稱為“立體異構(gòu)體”。相互不是鏡像對映的立體異構(gòu)體稱為“非對映異構(gòu)體”,而相互為非疊加鏡像對映的立體異構(gòu)體稱為“對映異構(gòu)體”。當(dāng)化合物具有非對稱中心時(shí),例如,其結(jié)合有四種不同的基團(tuán),一對立體異構(gòu)體的存在是有可能的。能夠利用其非對稱中心的絕對構(gòu)型來標(biāo)記對映異構(gòu)體,并可利用Cahn與Prelog的R-與S-順序規(guī)則來描述,或者通過其分子旋轉(zhuǎn)偏振光平面并可指定為右旋的或左旋的異構(gòu)體(即,分為為(+)或(-)異構(gòu)體)來描述。手性化合物能以單一的對映異構(gòu)體或以其混合物的形式存在。含有所述對映異構(gòu)體等份的混合物稱為“外消旋混合物”。
本發(fā)明的化合物可具有一個(gè)或多個(gè)非對稱中心;因此這種化合物可制備成為獨(dú)立的(R)-或(S)-立體異構(gòu)體或其混合物。除非有其它提示,本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中的特定化合物的描述或命名應(yīng)同時(shí)包括單一對映異構(gòu)體及其混合物、其外消旋體或其它。立體化學(xué)的鑒定和立體異構(gòu)體的分離方法是本領(lǐng)域公知的(參見例如,“Advanced OrganicChemistry”第四章,第四版,J.March,John Wiley and Sons,New York,1992中的討論)。
概述本發(fā)明提供噻唑烷酮組合物、噻唑烷酮衍生物組合物及其用于高度親和性的抑制囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白(CFTR)的方法,以及對CFTR介導(dǎo)疾病和狀態(tài)的研究和治療方法。本發(fā)明主題噻唑烷酮化合物及其衍生物的發(fā)現(xiàn)是利用鑒定與CFTR直接作用的CFTR抑制劑的分析來進(jìn)行的大量潛在候選化合物的篩選實(shí)現(xiàn)的。由于通過不同活化途徑發(fā)揮作用的多種CFTR活化劑包括在鑒定該主題化合物的研究中,因此沒有堅(jiān)持任何特定理論和操作模式,本發(fā)明所述的抑制性化合物似乎通過在或鄰近CFTR Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)通道發(fā)揮抑制作用。對50,000種不同化合物的篩選確定出了作為有效CFTR抑制劑的一些2-硫代-4-噻唑烷酮化合物及衍生物。這些化合物和衍生物與以往公知的CFTR激動劑和以往公知的CFTR抑制劑DPC、NPPB或優(yōu)降糖(glibenclamide)沒有化學(xué)和結(jié)構(gòu)上的關(guān)聯(lián)。從篩選中鑒定的大多數(shù)有效的CFTR抑制劑在人氣道細(xì)胞中Cl-電流抑制作用的KI為~300nM。抑制作用是快速、可逆且CFTR特異的。
現(xiàn)在對本發(fā)明的組合物和方法作更加詳盡的描述噻唑烷酮化合物和衍生物用于本發(fā)明組合物和方法中的所述噻唑烷酮化合物和衍生物包括五個(gè)或更多原子的雜環(huán),其包括苯環(huán)取代的氮、至少一個(gè)硫、氧或硒雜原子,以及與雜環(huán)結(jié)合的一種或多種羰基或硫代羰基。更具體地,該主題噻唑烷酮化合物和衍生物可具有以下通式(I) 其中X1、X2和X3獨(dú)立選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;A1和A2獨(dú)立選自氧和硫,A3選自硫和硒;以及A4含有一個(gè)或多個(gè)碳或雜原子且可存在或不存在;或者其藥物可接受的衍生物,作為單一的立體異構(gòu)體或其混合物。當(dāng)在該中心雜環(huán)中沒有A4時(shí),其為五元環(huán)。
在某些實(shí)施方案中,上述通式(I)的所述噻唑烷酮化合物和衍生物包括通式(Ia) 其中X1、X2和X3獨(dú)立選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;以及A1和A2獨(dú)立選自氧和硫。在特定的實(shí)施方案中,X1可以是吸電子基團(tuán)、并可包括鹵代烷基基團(tuán)、二鹵代烷基基團(tuán)、三鹵代烷基基團(tuán)(例如,三氟烷基基團(tuán))和氟基。Y2獨(dú)立選自烷基、羥基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及鹵素基團(tuán),Y1獨(dú)立選自羥基和溴基,以及Y3獨(dú)立選自氫和硝基。
在許多實(shí)施方案中,通式(I)所述的噻唑烷酮化合物和衍生物可包括通式(Ib)的3-芳基-5-芳基亞甲基-2-硫代-4-噻唑烷酮, 其中至少一種X1、X2和X3為吸電子基團(tuán);以及Y1、Y2和Y3獨(dú)立選自氫、烷基、羥基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及鹵素基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中,X1所在的位置選自2、3、或4;Y2所在位置選自2、3或4;以及Y1和Y3可以為氫。
所述的3-芳基-5-芳基亞甲基-2-硫代-4-噻唑烷酮可具體地具有通式(Ic) 其中Y1-Y3如上所述。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述三氟甲基基團(tuán)所處的位置選自2、3或4;Y2所處的位置選自2、3或4;其中此實(shí)施方案中的Y1和Y3可以為氫。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中,本發(fā)明所述的噻唑烷酮化合物包括 即,3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;及 即,3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-氧羧苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;及 即,3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;及
即,3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,4-二羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;及 即,3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,5-二溴-4-羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;及 即,3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-溴-4-羥基-5-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮??蛇x擇地,任何上述的化合物中的三氟甲基基團(tuán)可以處于苯環(huán)的2位或4位。
藥物制備本發(fā)明還提供上述主題化合物的藥物制備。該主題化合物可組成用于治療性給藥的各種給藥途徑的各種制劑。更特別的是,本發(fā)明化合物通過與適合的藥物可接受載體、稀釋劑、賦形劑和/或佐劑組合能夠組方成為藥物組合物,也可組方成為固體、半固體、液體或氣態(tài)形式的制劑,例如片劑、膠囊、粉劑、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑及氣霧劑。優(yōu)選地,所述制劑不含能檢測到的DMSO(二甲基亞砜),其不是非局部、腸道外和腸道內(nèi)給藥的藥物可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或佐劑。所述的制劑可通過包括口服、口腔、直腸、非腸道、腹腔內(nèi)、皮內(nèi)、透皮、氣管內(nèi)等等不同的給藥途徑對需要該藥物的個(gè)體或患者給藥。
在一個(gè)實(shí)施方案中,局部給藥(例如透皮給藥)是有益的。局部給藥制劑可以是透皮貼、栓劑、糊劑、洗劑、膏劑、膠劑等等的形式。局部制劑可包括一種或多種滲透劑、增稠劑、稀釋劑、乳化劑、分散劑或結(jié)合劑。當(dāng)所述化合物制備成為透皮傳輸時(shí),所述化合物可與滲透增強(qiáng)劑一同組方或與其一同使用。滲透增強(qiáng)劑(penetration enhancers)包括化學(xué)滲透增強(qiáng)劑和物理滲透增強(qiáng)劑,能促進(jìn)所述化合物通過皮膚傳輸,并也可替代地稱為“滲透增強(qiáng)劑(permeation enhancers)”。物理的滲透增強(qiáng)劑包括例如,諸如離子電滲法的電泳技術(shù)、超聲的應(yīng)用(或“phonophoresis”)等等?;瘜W(xué)滲透增強(qiáng)劑是在化合物給藥前、同時(shí)或給藥后即刻給藥的試劑,其可增加皮膚特別是角質(zhì)層的通透性,來提供該藥物通過皮膚的增強(qiáng)的滲透效果。
用來增強(qiáng)皮膚通透性的化合物包括亞砜,二甲基亞砜(DMSO)和癸基甲基亞砜(C10MSO);醚,諸如二乙二醇單乙基醚、十氧乙烯基-十八碳烯醚(dekaoxyethylene-oleylether),和二乙二醇單乙基醚;表面活性劑,諸如月桂酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴化十六烷基三甲基銨、氯化芐烷銨、泊咯沙姆(Poloxamer)(231,182,184)、吐溫(20,40,60,80)及卵磷脂;1-取代氮雜環(huán)庚烷-2-酮,特別是1-N-月桂基氮雜環(huán)庚烷-2-酮;醇,諸如乙醇、丙醇、辛醇、芐基醇等等;礦脂,諸如石油凍膠(礦酯),礦物油(液體礦脂)等等;脂肪酸,諸如C8-C22和其它脂肪酸(例如,異硬脂酸、辛酸,油酸、月桂酸、戊酸);C8-C22脂肪醇(例如,油烯醇、月桂醇);C8-C22脂肪酸和其它脂肪酸的低級烷基酯(例如,油酸乙酯、豆蔻酸異丙酯、硬脂酸丁酯、月桂酸甲酯、豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、甲基丙酸酯、油酸乙酯);C8-C22脂肪酸的甘油一酯(例如,十二烷基甘油一酯);四氫化糠基醇聚乙烯乙二醇醚;2-(2-乙氧基乙氧基)乙醇;二乙二醇單甲醚;聚乙烯氧化物的烷基芳基醚;聚乙烯氧化單甲基醚;聚乙烯氧化二甲基醚;C6-C8二酸的聯(lián)低級烷基酯(例如乙二酸二異丙酯);乙酸乙酯;乙酰乙酸酯;其多元醇和酯,諸如丙烯乙二醇、乙烯乙二醇、甘油、丁二醇、聚乙烯乙二醇及單十二酸聚乙烯乙二醇酯;胺和其它含氮化合物,例如尿素、二甲基乙酰胺(DMA)、二甲基甲酰胺(DMF)、2-吡咯烷酮、N-烷基吡咯烷酮(例如1-甲基-2-吡咯烷酮);乙醇胺、二乙醇胺及三乙醇胺;萜烯;烷酮(alkanones)及有機(jī)酸,特別是水楊酸和水楊酸鹽、檸檬酸和琥珀酸。其它的化學(xué)和物理滲透增強(qiáng)劑例如Transdermal Delivery of Drugs,A.F.Kydonieus(ED)1987 CRL Press;Percutaneous Penetration Enhancers,eds.Smith et al.(CRC Press,1995);Lenneruas et al.,J Pharm Pharmacol 2002;54(4)499-508;Karande et al.,Pharm Res 2002;19(5)655-60;Vaddi et al.,J Pharm Sci 2002 July;91(7)1639-51;Ventura et al.,J Drug Target 2001;9(5)379-93;Shokri et al.,Int J Pharm 2001;228(1-2)99-107;Suzuki etal.,Biol Pharm Bull 2001;24(6)698-700;Alberti et al.,J Control Release2001;71(3)319-27;Goldstein et al.,Urology 2001;57(2)301-5;Kiijavainen et al.,Eur J Pharm Sci 2000;10(2)97-102;及Tenjarla et al.,Int J Pharm 1999;192(2)147-58中所述。
當(dāng)所述化合物與化學(xué)滲透增強(qiáng)劑組方時(shí),所述的滲透增強(qiáng)劑選自與所述化合物匹配的并以滿足促進(jìn)所述化合物通過個(gè)體皮膚傳輸?shù)膭┝看嬖?,例如用于將該化合物對全身循環(huán)的傳輸。在一個(gè)實(shí)施方案中,所述化合物與滲透增強(qiáng)劑而不是DMSO組方。
在一個(gè)實(shí)施方案中,所述化合物在藥物傳輸貼劑中提供,例如透粘膜和透皮貼劑,并可與滲透增強(qiáng)劑組方。所述的貼劑通常包括支持層(其對化合物和其它制劑組分是不通透的)、與所述支持層的一面接觸的基質(zhì)(該基質(zhì)提供緩釋所述化合物,即可控制釋放)、以及粘合層(其與所述基質(zhì)位于所述支持層的相同的一側(cè))。所述基質(zhì)可選擇為適合給藥途徑的,且可為例如可為聚合的或水溶膠基質(zhì)。
在藥物制劑中,本發(fā)明所述的主題化合物可以其藥物可接受的衍生物形式給藥,例如鹽,或者其可單一或與其它藥物活性化合物以適當(dāng)?shù)穆?lián)合、以及組合的形式使用。以下的方法和賦形劑僅僅是實(shí)例而不是對本發(fā)明的任何限制。
對于口服制劑,所述的主題化合物可單一或與適合的添加劑組合來制備片劑、粉劑、顆粒和膠囊,例如,與常規(guī)的添加劑,諸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或馬鈴薯淀粉;與結(jié)合劑,諸如結(jié)晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠;與崩解劑,諸如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉或羧甲基纖維素鈉;與潤滑劑,諸如滑石或硬脂酸鎂;如需要,與稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑及調(diào)味劑組合。特別有益的是,所述主題噻唑烷酮化合物與緩沖劑的組方可提供所述化合物對低pH的胃酸環(huán)境的保護(hù)的作用。也可優(yōu)選提供一種腸包被來避免通過胃時(shí)所述化合物的沉淀。
本發(fā)明所述的主題化合物可通過將其在水溶性或非水溶性溶液(諸如植物或其它類似的油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯或丙稀乙二醇)中溶解、懸浮或乳化組方到注射制劑中;及如果需要,可與常規(guī)的添加劑(諸如增溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑劑防腐劑)組合。特別有益的增溶劑包括維生素E TPGS(d-α-生育酚聚乙烯乙二醇1000琥珀酸酯)、環(huán)糊精等等。
本發(fā)明的化合物能夠用于氣霧劑制劑通過吸入給藥。本發(fā)明的化合物可組方到壓力可接受的諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮?dú)獾鹊鹊陌l(fā)射劑(氣霧劑基質(zhì))中。
此外,所述的主題化合物可通過與多種堿(諸如乳化堿或水溶性堿)混合制成栓劑。本發(fā)明所述化合物可通過栓劑進(jìn)行直腸給藥、所述的栓劑能夠包括諸如可可酯、聚乙二醇及聚乙烯乙二醇的賦形劑,其在體溫下溶化,而在室溫下固化。
可提供口服或直腸給藥的單位劑型,例如糖漿劑、酏劑、懸浮液,其中每種劑量單位,例如一茶匙容量、一湯匙容量、片劑或栓劑,含有組合物(含有一種或多種抑制劑)的預(yù)定劑量。同時(shí),注射或靜脈內(nèi)給藥的單位劑型可包括溶于無菌水、生理鹽水或其它藥物可接受載體的溶液組合物中的所述抑制劑。
根據(jù)個(gè)體和所治療的疾病狀態(tài),以及給藥途徑,所述的主題化合物以例如每天0.1μg-10mg/kg體重劑量給藥。由于治療作用的通常效力對于不同的哺乳動物有很大的不同,表現(xiàn)為在人中的劑量通常小于大鼠的20、30或甚至40倍(每單位體重),因此所述的劑量范圍較廣。同樣地,給藥的形式對劑量的影響也較大。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)小鼠中霍亂毒素誘導(dǎo)的腸液分泌可被約10-20微克的單劑量腹腔內(nèi)給藥阻斷,約10倍高于大鼠的有效劑量。因此例如口服劑量可以是注射劑量的約10倍。更高的劑量可用于局部途徑給藥。
通常的劑型可以是適合于靜脈內(nèi)給藥的溶液;片劑每天攝入2-6次,或每天攝入一次含有較高比例含量活性成分的時(shí)間-控釋膠囊或片劑等等。通過溶解在不同pH值的膠囊材料、利用滲透壓緩慢釋放的膠囊、或通過其它任何公知的控制釋放手段可獲得所述的時(shí)間-控釋作用。
對于主題方法的應(yīng)用,所述主題化合物可與其它藥物活性試劑包括CFTR抑制劑組方。
用于本發(fā)明的藥物可接受賦形劑,諸如賦形劑(vehicles)、佐劑、載體或稀釋劑,公眾可容易地得到。此外,藥物可接受的輔助物質(zhì),諸如pH調(diào)節(jié)劑和緩沖試劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、穩(wěn)定劑、潤濕劑等等,也是公眾容易得到的。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可以理解,根據(jù)特定化合物的功能、所述癥狀的嚴(yán)重程度以及所述個(gè)體產(chǎn)生副作用的敏感性,可改變劑量水平。本領(lǐng)域所述技術(shù)人員利用各種手段可容易地確定所給出化合物的優(yōu)選劑量。
本發(fā)明提供含有所述主題化合物的單位劑型的藥盒,通常為口服或注射劑型。在這種藥盒中,除含有所述單位劑型外,該容器應(yīng)包括描述所述藥物在治療所感興趣的病理學(xué)狀態(tài)的用途和伴隨效果的信息性包裝插頁。優(yōu)選的化合物和單位劑量是上文中所描述的。
屬于本發(fā)明CFTR抑制劑進(jìn)行治療的疾病狀態(tài)本文所公開的CFTR抑制劑可用于CFTR介導(dǎo)的疾病狀態(tài)的治療,即,由CFTR活性(例如,離子轉(zhuǎn)運(yùn)中的CFTR活性)導(dǎo)致的任何疾病狀態(tài)、病癥或疾病、或這種疾病狀態(tài)、病癥或疾病狀態(tài)的癥狀。這種疾病狀態(tài)、病癥或疾病、或其癥狀適用通過CFTR活性抑制作用進(jìn)行治療,例如CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中,本發(fā)明所述CFTR抑制劑用于異常增加的腸分泌相關(guān)的疾病狀態(tài)的治療,特別是急性異常增加腸分泌。已揭示了CFTR活性在腸分泌中的作用,該腸分泌是對各種激動劑包括霍亂毒素的反應(yīng)(參見例如,Snyder et al.1982 Bull.World Health Organ.60605-613;Chaoet al.1994 EMBO J.131065-1072;Kimberg et al.1971 J Clin.Invest.501218-1230)。因此本發(fā)明的CFTR抑制劑可以通過抑制CFTR轉(zhuǎn)運(yùn)的有效劑量給藥由此降低腸液分泌。
因此,CFTR抑制劑可用于腸道過敏性病狀和腹瀉、特別是分泌性腹瀉的治療。在發(fā)展中國家,分泌性腹瀉是嬰兒死亡的最重要原因,每年約有5百萬死亡人數(shù)(Gabriel et al.,1994 Science 266107-109)。一些研究,包括使用CF小鼠的研究,表明CFTR是對各種激動劑反應(yīng)的腸氯離子(并因此形成液體)分泌的最終通用通道(Snyder et al.,1982,Bull.World HealthOrgan.60605-613;Chao et al.,1994 EMBO.J.131065-1072;和Kimberget al.,1971,J.Clin.Invest.501218-1230)。本發(fā)明使用小鼠腸液分泌模型表明,非毒性劑量的所述抑制劑的系統(tǒng)給藥產(chǎn)生的CFTR抑制作用可有效地阻斷有霍亂毒素誘導(dǎo)的腸液分泌(見實(shí)施例)。
能夠使用本發(fā)明所述的CFTR抑制劑治療的腹瀉是由于暴露于各種病原體和制劑而產(chǎn)生的,其包括但不限于霍亂毒素(Vibrio cholera)、大腸桿菌E.coli(特別是產(chǎn)腸毒素的(ETEC))、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、彎曲桿菌(Campylobacter)、艱難梭狀芽孢桿菌(Clostridiurra difficile)、寄生蟲(例如,賈第鞭毛蟲屬(Giardia)、腸阿米巴屬(Entamoeba histolytica)、隱孢子蟲病(Cryptosporidiosis)、無孢子綱(Cyclospora))、腹瀉病毒(例如輪狀病毒)、食物毒素、或能夠產(chǎn)生由CFTR介導(dǎo)的增加的腸分泌的腸毒素暴露。
其它的腹瀉包括AIDS伴隨腹瀉(例如,AIDS相關(guān)腹瀉)以及炎性胃腸病癥,例如潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸病(IBD)、Crohn′s病等等。有報(bào)道,腸炎癥可改變?nèi)N主要的腸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)劑的表達(dá)并可產(chǎn)生潰瘍性結(jié)腸炎的腹瀉,其同時(shí)通過增加跨上皮Cl-分泌和抑制上皮的NaCl吸收而產(chǎn)生(參見例如,Lohi et al.,2002,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.283(3)G567-75)。
本發(fā)明的CFTR抑制劑也可用于諸如多囊腎臟疾病的治療,并發(fā)現(xiàn)通過抑制睪丸的CFTR活性可用作男性不育藥物。
本發(fā)明的CFTR抑制劑還可用于大動物模型的篩選中(例如,Spira etal.,1981,Infect.Immun.32739-747所述的家兔模型)。此外,對使用活霍亂弧菌(Vibrio cholerae)產(chǎn)生的大便排泄物的分析也可進(jìn)一步檢測本發(fā)明所述CFTR抑制劑的特性。
CFTR缺陷的非人動物模型和人組織模型本發(fā)明所述的CFTR抑制劑也可用于產(chǎn)生疾病的非人動物模型,其中所述疾病與降低的CFTR功能有關(guān)(例如,降低的離子轉(zhuǎn)運(yùn))。不斷增加的證據(jù)表明在CFTR缺乏患者中,特別是在受到囊性纖維化(CF)作用的患者中,氣道粘膜下腺產(chǎn)生的液體和大分子分泌缺陷可導(dǎo)致粘膜纖毛和細(xì)菌清除功能的損傷;然而,在人氣道腺的功能研究限于在肺移植中獲得的嚴(yán)重患病氣道(Jayaraman et al.2001 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 988119-8123)。急性CFTR抑制作用使測定CFTR在粘膜下腺介導(dǎo)的水、鹽和大分子分泌中的作用成為可能。高親和性CFTR抑制劑能夠產(chǎn)生模擬人CFTR缺乏(例如模擬人CF表型)的非人動物模型的藥理學(xué)創(chuàng)造物。特別是,發(fā)現(xiàn)CFTR缺乏的大動物模型(例如CF)在闡明CF氣道疾病開始和進(jìn)程中病理生理學(xué)機(jī)制,以及評價(jià)CF的治療效果,例如篩選CFTR缺陷或其癥狀治療的候選試劑中的特定用途。
在氣道和胰腺病癥以及男性不育中可闡明CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)的抑制作用。例如,在所述肺和氣道中的CFTR通道抑制作用可影響氣道表面液體產(chǎn)生的粘液堆積,其進(jìn)一步阻塞氣道并嚴(yán)重聚集在肺壁上,提供了發(fā)生感染的基本環(huán)境,從而導(dǎo)致慢性肺病。這種相同的情況會發(fā)生在胰腺中,其中堆積的粘液破壞了胰腺的外分泌功能并阻止了必需的食物處理酶進(jìn)入腸道。
通過能夠有效降低CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性的CFTR抑制劑劑量的給藥可產(chǎn)生非人動物模型。特別有益的是,本發(fā)明的CFTR抑制劑在誘導(dǎo)非人動物囊性纖維化(CF)表型中的用途。在例如肺中進(jìn)行有效抑制CFTR受體的CFTR抑制劑劑量的給藥可模擬在CF中發(fā)現(xiàn)的CFTR缺乏。CFTR抑制劑的給藥途徑如上已做了詳細(xì)的描述。依據(jù)所使用的非人動物,所述主題化合物可以例如50-500μg/kg體重,每天1至3次的劑量提供腹腔內(nèi)、皮下或其它的途徑來產(chǎn)生非人的動物模型??诜┝靠筛哂谒龈骨粌?nèi)或皮下給藥劑量的約10倍。
CFTR相關(guān)疾病的非人動物模型能夠用作任何適合的與降低的CFTR活性相關(guān)的疾病狀態(tài)的模型。這種疾病狀態(tài)包括與CFTR突變相關(guān)的疾病,該突變可產(chǎn)生上皮離子和轉(zhuǎn)運(yùn)的異常。這些異常可進(jìn)一步與氣道以及其它粘膜上皮和管道上皮粘膜纖毛的清除擾亂有關(guān)。通過在非人動物中誘導(dǎo)CFTR缺乏表型,可藥理學(xué)模建的疾病狀態(tài)包括但不限于囊性纖維化(包括非典型CF)、特發(fā)性慢性胰腺炎(idiopathic chronic pancreatitis)、輸精管缺陷(vas deferens defects)、輕度肺病、哮喘等等。與CFTR功能損失有關(guān)的病癥綜述參見例如,Noone et al.Respir Res 2 328-332(2001)。CFTR抑制劑產(chǎn)生的非人動物模型也可用作CFTR缺乏個(gè)體中微生物感染的模型(例如,細(xì)菌、病毒和真菌,特別是呼吸道感染)。在一個(gè)特別有益的實(shí)施方案中,本發(fā)明所述的CFTR抑制劑用于藥理學(xué)誘導(dǎo)囊性纖維化(CF)表型。
適合用于產(chǎn)生本發(fā)明的動物模型的動物包括任何動物,特別是哺乳動物,例如非人靈長類(例如,猴子、黑猩猩、大猩猩等等)、嚙齒類(例如,大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、雪貂等等)、兔類、豬(swine)(例如豬(pig)、小型豬(miniature pig))、馬、犬科、貓科等等。對大型動物是特別感興趣的。
所述的CFTR抑制劑也可與分離的人組織接觸來產(chǎn)生疾病的離體處理在體應(yīng)用(ex vivo)模型。這種組織可與有效降低所述組織中CFTR活性的CFTR抑制劑劑量接觸,其可少至15分鐘或多達(dá)2小時(shí)或更長。感興趣的人組織包括但不限于,肺(包括氣管和氣道)、肝、胰腺、睪丸等等。在抑制劑處理的組織上可進(jìn)行生理學(xué)、生物化學(xué)、基因組學(xué)或其它研究來鑒定對疾病的病理生理學(xué)有重要意義的新的治療靶分子。例如來自人肺CF的分離組織可暴露于足以誘導(dǎo)所述的CF表型的抑制劑,并且可進(jìn)行這種研究來鑒定對CF病理生理有重要意義的新的治療靶分子。
本發(fā)明化合物的合成根據(jù)本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員公知的方法或與US 5,326,770和US6,380,186(其全部引用作為本的參考)公開的相似方法,或與以下所述方法相似的方法,可制備本發(fā)明的化合物。
應(yīng)理解,在以下的描述中,所述通式的取代基和/或變體的組合只在其結(jié)構(gòu)產(chǎn)生穩(wěn)定化合物的時(shí)候是允許的。
本領(lǐng)域所述技術(shù)人員也可理解,在以下所述的步驟中只有中間化合物的功能基團(tuán)可能需要通過穩(wěn)定的保護(hù)基團(tuán)來保護(hù)。這種功能基團(tuán)包括羥基、氨基、巰基和羧酸。對羥基適合的保護(hù)基團(tuán)包括三烷基甲硅烷基或二烷基甲硅烷基(例如,t-丁基二甲基甲硅烷基、t-丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氫吡喃基、苯甲基等等。對于氨基、脒基和胍基的適的保護(hù)基團(tuán)包括t-丁氧基羰基、芐氧基羰基等等。對于巰基適合的保護(hù)基團(tuán)包括-C(O)-R(其中R為烷基、芳基或芳基烷基)、p-甲氧基芐基、三苯甲基等等。對于羧酸適合的保護(hù)基團(tuán)包括烷基酯、芳基酯或芳烷基酯。
根據(jù)本領(lǐng)域所述技術(shù)人員公知的并如本文所述的常規(guī)技術(shù)可加入或移去保護(hù)基團(tuán)。
保護(hù)基團(tuán)的用途參見Theodora W.Greene,Peter G.M.Wuts,Protective groups in Organic Synthesis(1999),3rd Ed.,Wiley-Interscience中的詳細(xì)描述。所述的保護(hù)基團(tuán)可以是諸如Wang樹脂或2-氯代三苯甲基氯化物樹脂的聚合樹脂。
本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員也可理解,盡管這種通式(I)化合物的保護(hù)衍生物如上所述(例如,在本文的概述和噻唑烷酮化合物和衍生物中所述),可能不具有如此的藥理學(xué)活性,但它們可對哺乳動物給藥并隨后在體內(nèi)代謝形成本發(fā)明的具有藥理學(xué)活性的化合物。因此這種衍生物稱為“前藥”。所有通式(I)的前藥均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
以下的反應(yīng)方案顯示了制備本發(fā)明化合物的方法。應(yīng)理解,本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員可根據(jù)相似的方法和根據(jù)本領(lǐng)域所述技術(shù)人員公知的方法能夠制備本發(fā)明的化合物。通常,從諸如Aldrich的來源或根據(jù)本領(lǐng)域所述技術(shù)人員公知的來源合成獲得起始組分(參見例如,Smith and March,March's Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms,andStructure,5thedition(Wiley Interscience,New York))。此外,根據(jù)本領(lǐng)域所述技術(shù)人員公知的方法可將本發(fā)明化合物的各種取代基團(tuán)(例如,X1、X2、X3、Y1、Y2及Y3等)連于所述的起始組分、中間組分和/或終產(chǎn)物上。
在以下的反應(yīng)方案中,R代表烷基或芳基烷基,W代表諸如Cl、Br或I的鹵素原子。
以下的反應(yīng)方案1針對通式(1)化合物的制備,其為上述本發(fā)明的化合物(例如,在本文的概述及噻唑烷酮化合物和衍生物中所述),其中A4不存在,且A1、A2、A3、X1、X2、X3、Y1、Y2及Y3如上所述(例如,在本文的概述及噻唑烷酮化合物和衍生物中所述)。
反應(yīng)方案1 通常,首先通過通式(a)化合物與等當(dāng)量的諸如NaOH的堿在室溫下反應(yīng)制備通式(1)化合物。隨后將溶解于適當(dāng)?shù)闹T如THF的溶劑中的通式(b)化合物加入反應(yīng)混合物中。然后將所產(chǎn)生的反應(yīng)混合物攪拌約1小時(shí)-約24小時(shí)。再將一種諸如HCl的酸加入該反應(yīng)混合物中。然后將所產(chǎn)生的反應(yīng)混合物攪拌約1小時(shí)-約24小時(shí)。通過常規(guī)的分離和純化技術(shù)將通式(c)的化合物從該反應(yīng)混合物中分離。在常規(guī)的Knoevenagel縮合條件下隨后將該通式(c)化合物與通式(d)化合物反應(yīng)產(chǎn)生所需的通式(1)產(chǎn)物。
可選擇地,能夠根據(jù)以下的反應(yīng)方案2來制備通式(1)化合物,其中A1、A2、A3、Y1、Y2及Y3如上所述(例如,在本文的概述及噻唑烷酮化合物和衍生物中所述),且W為鹵素反應(yīng)方案2
通常,首先通過在常規(guī)的Knoevenagel縮合條件下,例如在含有催化劑量的哌啶的冰醋酸、乙醇和其它適當(dāng)?shù)娜軇┲校诨亓鳁l件下,將通式(e)化合物與通式(f)化合物反應(yīng)產(chǎn)生通式(1)化合物。隨后通過常規(guī)的分離和純化技術(shù)從該反應(yīng)混合物中分離通式(g)化合物。然后在標(biāo)準(zhǔn)的Ullmann縮合條件下,例如升高溫度及Cu和Cu2O或CuO的存在下,用通式(h)化合物處理通式(g)化合物來產(chǎn)生所需的通式(1)產(chǎn)物。
可選擇地,根據(jù)以下的反應(yīng)方案3來制備通式(1)化合物,其中A1、A2、A3、Y1、Y2及Y3如上所述(例如,在本文的概述及噻唑烷酮化合物和衍生物中所述),且W為鹵素。
反應(yīng)方案3
在此反應(yīng)方案中,第一步為在通式(e)化合物與通式(h)化合物間的Ullmann縮合來產(chǎn)生通式(c)的化合物,隨后其與通式(d)化合物進(jìn)行Knoevenagel縮合來產(chǎn)生所需的通式(1)產(chǎn)物。
可從不同的化學(xué)供應(yīng)商購得或根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法、或利用F.C.Brown et.al.,J.Am.Chem.Soc.,78,384-388(1956);R.E.Strube,OrganicSynthesis,CV 4,6;K.S.Markley and E.E.Reid,J.Am.Chem.Soc.,52,2137-2141(所有這些文獻(xiàn)在此全部引用作為本文的參考)中公開的相似方法合成所述的通式(e)的起始化合物。
與上述相似的方法,3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(本文指CFTRinh-172)(參見圖1C)以及含有不同位置三氟甲基和羧基取代基的類似物(參見例如,圖1D)的合成是通過將2-硫代-3-[a-三氟甲基-4-苯基]-4-噻唑烷酮(a=2、3或4)與b-羰基苯甲醛(b=2,3或4)在哌啶的存在下進(jìn)行Knoevenagel縮合來完成。過濾該沉淀,用乙醇洗滌,干燥,從乙醇中重結(jié)晶2-3次來產(chǎn)生明亮的黃色結(jié)晶(70-85%收率)。由1H-NMR驗(yàn)證結(jié)構(gòu)。通過薄層層析和HPLC證明其純度為>99%。
實(shí)施例給出以下的實(shí)施例為本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員提供怎樣制備和使用本發(fā)明的完整公開和描述,而不是本發(fā)明者發(fā)明范圍的限制,以及不是表示以下的實(shí)驗(yàn)是全部實(shí)驗(yàn)或只進(jìn)行了這些實(shí)驗(yàn)。對于所使用的數(shù)據(jù)(例如,劑量、溫度等等)盡量保證準(zhǔn)確,但一些實(shí)驗(yàn)誤差和偏離應(yīng)考慮在內(nèi)。除非有其它的說明,比例為重量比例、分子量為平均分子量、溫度以攝氏溫度表示,壓力為大氣壓或接近大氣壓。
本發(fā)明化合物的合成由以下的非限定性實(shí)施例示例。
合成實(shí)施例3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮的合成A.攪拌下,在30分鐘內(nèi)向3-三氟甲苯胺(trifluromethylanilne)(1.6g,10mmol)和三乙胺(1g,10mmol)的乙酸乙酯(10mL)溶液中逐滴加入二硫化碳(0.8g,10mmol)。當(dāng)加入步驟進(jìn)行約一半時(shí),開始輕度放熱反應(yīng),通過使用間斷的冰浴可容易控制。攪拌過夜后,過濾深黃的粘稠液并用50mL的乙醚洗滌沉淀,空氣干燥,獲得3g(89%)的淺黃色二硫代氨基甲酸酯固體,m.p.92-95℃(dec.)。
B.攪拌氯代乙酸鈉(將氯代乙酸(0.064g,0.46mmol)加入0.6mL的NaHCO3溶液,pH8-9中制備)并冷卻至5-10℃,在10分鐘內(nèi)加入二硫代氨基甲酸酯(0.3g,0.9mmol)。繼續(xù)攪拌直到該燒瓶升溫到環(huán)境溫度。在攪拌2小時(shí)后,將溶液冷卻到10℃并用濃鹽酸酸化,并將該反應(yīng)混合物加熱到90-95℃,30分鐘。過濾所產(chǎn)生的沉淀,用水洗滌并從乙醇中重結(jié)晶產(chǎn)生0.103g的2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-4-噻唑烷酮的發(fā)光晶體,收率83%,m.p.177-178℃,1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.18(s,2H,CH2),7.40(d,1H,苯基,J=8.0Hz),7.48(s,1H,苯基),7.64(t,1H,苯基,J=8.0Hz),7.72(d,1H,苯基,J=7.6Hz)ppm。
C.攪拌下回流上述獲得的2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-4-噻唑烷酮(0.1g,0.36mmol)與4-羧基苯甲醛(0.054g,0.36mmol)的無水乙醇(1mL)和哌啶(1滴)的混合物30分鐘。過濾黃色沉淀,用乙醇洗滌,干燥并從乙醇重結(jié)晶產(chǎn)生0.108g(73%)的黃色結(jié)晶固體的目標(biāo)化合物,m.p.180-182℃,1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.78(d,2H,羧苯基,J=8.2Hz),7.80-8.00(m,5H,三氟甲基苯基和CH),8.07(d,2H,羧基苯基,J=8.31Hz),13.20(s,1H,COOH,可替代的D2O)ppm。
D.用與上述相似的方法,制備以下化合物3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-羧基-4-羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,4,5-三羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(2,3,4-三羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基-4-氟)苯基]-5-[(3-羧基-4-羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;及3-[(4-氟-3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。
以下材料和方法用于下面的實(shí)施例中。
細(xì)胞株、小鼠及化合物根據(jù)以往報(bào)道(Galietta et al.2001 J.Biol.Chem.27619723-19728)來產(chǎn)生共表達(dá)人野生型CFTR的Fischer大鼠甲狀腺(FRT)細(xì)胞和鹵素指示劑YFP-H148Q。以每孔20,000個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種在含有5%胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素的Coon′s改良F12培養(yǎng)液的96孔黑壁小板(Corning Costar)中。在接種后48小時(shí),進(jìn)行分析,此時(shí)細(xì)胞恰好為融合單層(每孔-40,000個(gè)細(xì)胞)。
利用不同收集的來自ChemBridge(San Diego,CA)的50,000種藥物樣化合物進(jìn)行最初的篩選,該化合物以DMSO中的10mM儲存溶液形式獲得并在96孔小板中稀釋到100mM。對購自ChemBridge與ChemDiv(SanDiego,CA)的類似物的結(jié)構(gòu)-活性進(jìn)行分析。
野生型和囊性纖維化(ΔF508純合子突變體)小鼠由University ofCalifornia,San Francisco(UCSF)的CF動物飼養(yǎng)中心(Animal Core facility)飼養(yǎng)。由UCSF動物研究委員會(Committee on Animal Research)授權(quán)動物實(shí)驗(yàn)。
從UCSF細(xì)胞培養(yǎng)中心獲得T84和Caco-2細(xì)胞。將T84細(xì)胞培養(yǎng)在含有5%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的1∶1混合的DMEM和Hams F12培養(yǎng)液中并接種在Snapwell inserts(Corning Costar)中,在濕度的(5%O2/95%CO2)氣氛,37℃培養(yǎng)細(xì)胞。接種后10-14天使用細(xì)胞。將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10胎牛血清、1%非必需氨基酸、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM中,在Snapwell inserts上培養(yǎng)。在接種后21-24天使用細(xì)胞。CD1遺傳背景的野生型小鼠如上述飼養(yǎng)。雄性Wistar大鼠(200-250g)購自Jackson實(shí)驗(yàn)室。由動物研究委員會授權(quán)動物實(shí)驗(yàn)。在切除外科手術(shù)的當(dāng)時(shí)獲得新鮮的人結(jié)腸段并轉(zhuǎn)移到冰冷的鹽水中,在切除后1小時(shí)內(nèi)使用。
毛喉萜、8-溴cGMP、氨氯吡脒(amiloride)、霍亂毒素和STa毒素購自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)。CFTRACT~16來自ChemBridge(SanDiego,CA)。
篩選步驟利用定制的篩選系統(tǒng)(Beckman)進(jìn)行分析,該系統(tǒng)含有3-meter機(jī)械手、CO2培養(yǎng)箱、平板洗劑器、液體處理平臺(liquid handling workstation)、條形碼閱讀器、開蓋臺(delidding station)及兩臺FluoStar熒光平板計(jì)數(shù)器(BMG Labtechnologies,Offenburg,Germany),每臺配備兩個(gè)注射泵及HQ500/20X(500±10nm)激發(fā)和HQ535/30M(535±15nm)發(fā)射濾波器(Chroma)。利用針對兩臺平板計(jì)數(shù)器進(jìn)行改良的SAMI version 3.3軟件(Beckman)集合成機(jī)器人系統(tǒng)。用戶軟件寫入VBA(Visual Basic forApplications)來從儲存的數(shù)據(jù)文件中計(jì)算基線扣除,標(biāo)準(zhǔn)化熒光斜度(fluorescence slopes)(給出鹵化物流入速率)。
通過在所述的培養(yǎng)箱(37℃、90%濕度、5%CO2)中加載40-60塊含有FRT細(xì)胞的96孔板、在傳送帶中加載含有試驗(yàn)化合物的96孔板和一次性使用的塑料移液管頭,來建立所述的分析。為開始分析,用PBS對96孔板中的每個(gè)小孔洗滌3次(300uL/每次洗滌),留下50μLPBS。加入10μL的CFTR-活化雞尾酒(5μM毛喉萜、100μM IBMX,25μM芹黃素的PBS液),5分鐘后,向每孔加入一種試驗(yàn)化合物(0.5μL的1mM DMSO溶液)得到10μM的終濃度。10分鐘后,將96孔板轉(zhuǎn)移至平板計(jì)數(shù)器進(jìn)行熒光分析。通過連續(xù)記錄熒光(每點(diǎn)200ms)2秒(基線),并在快速加入(<0.5s)160μL isosmolar PBS(其中137mM Cl-由I-取代)后再記錄12秒,來分別分析每孔的CFTR-介導(dǎo)的I-轉(zhuǎn)運(yùn)。
細(xì)胞內(nèi)[cAMP]和毒性分析[cAMP]與磷酸酶的分析如以往報(bào)道(Galietta et al.2001 J.Biol.Chem.27619723-19728)。利用二氫若丹明(dihydrorhodamine)方法在細(xì)胞用0-1000μM抑制劑培養(yǎng)24小時(shí)后評價(jià)細(xì)胞毒性作用。在對小鼠每天進(jìn)行腹腔內(nèi)0-100ug/kg的抑制劑注射后第5天時(shí)利用血清化學(xué)和血液學(xué)分析(UCSF臨床實(shí)驗(yàn)室)來評價(jià)動物的毒性作用。
MDR-1活性通過檢測在永生人氣管細(xì)胞株9HTEo-/Dx中的3H-長春新堿累積來評價(jià)MDR-1活性,其中在增加阿霉素濃度的選擇中內(nèi)源性MDR-1表達(dá)上調(diào)(Rasola et al.1994 J.Biol.Chem.2691432-1436)。將細(xì)胞接種在24孔小板中(200,000細(xì)胞/每孔)。48小時(shí)后,用含有(單位為mM)130 NaCl、2 KCl、1 KH2PO4、2 CaCl2、2 MgCl2、10 Na-Hepes(pH7.3)及10葡萄糖的溶液洗滌細(xì)胞,并用含有3H-長春新堿(0.7μM;1μCi/mL)的200μl相同溶液在37℃孵育1小時(shí)。用冰冷的溶液洗滌細(xì)胞三次并用0.25M NaOH裂解。通過閃爍計(jì)數(shù)來測定長春新堿的含量。
利用CFTR表達(dá)FRT細(xì)胞進(jìn)行短路電流試驗(yàn)將含有表達(dá)CFTR的FRT細(xì)胞或人支氣管上皮細(xì)胞的Snapwell插片(Snapwell inserts)裝入U(xiǎn)ssing槽系統(tǒng)中。對于FRT細(xì)胞,用5mL的75mMNaCl和75mM葡萄糖酸鈉(頂端)以及150mM NaCl(基底)(pH7.3)來充滿半槽,而且用250μg/mL兩性霉素B來對基底膜進(jìn)行通透性處理(Galiettaet al.2001 J.Biol.Chem.27619723-19728)。對映支氣管上皮細(xì)胞和T84細(xì)胞,兩個(gè)半槽均含有Krebs碳酸氫鹽溶液。用空氣(FRT細(xì)胞)或含5%CO2的空氣(支氣管和T84細(xì)胞)對半槽連續(xù)充氣并保持在37℃。通過DVC-1000電壓膜片鉗(World Precision Instruments,Sarasota,F(xiàn)lorida)利用Ag/AgCl電極和1M KCl瓊脂橋來連續(xù)記錄短路電流。
Cl-通道活性的膜片鉗分析以全細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形式檢測膜電流。對于記錄Cl-通道,所用的細(xì)胞外(浴)溶液含有(單位為mM)150 NaCl、1 CaCl2、1 MgCl2、10葡萄糖、10甘露糖醇、10 TES(pH7.4),以及細(xì)胞內(nèi)(移液管)溶液含有120 CsCl、1MgCl2、10 TEA-Cl、0.5 EGTA、1 Mg-ATP、10 Hepes(pH7.3)。在所述細(xì)胞外溶液中用毛喉萜(5μM)將CFTR活化。監(jiān)測膜轉(zhuǎn)導(dǎo)對-100和+80mV交替電壓脈沖反應(yīng)的時(shí)間過程。在確定的時(shí)間,中斷實(shí)驗(yàn)來產(chǎn)生電流-電壓關(guān)系(電壓脈沖以20mV的增加幅度從-100增至+100mV)。容量敏感Cl-通道由低滲溶液活化(細(xì)胞外NaCl降低到120 NaCl;250mosM/kg)。通過在所述細(xì)胞外溶液中加入100μM UTP來活化人支氣管上皮細(xì)胞中的鈣敏感Cl-通道。
ATP敏感K+通道的膜片鉗分析記錄胰腺β細(xì)胞株INS-1的膜電勢,其中所用的細(xì)胞外(浴)溶液含有(單位為mM)130 NaCl、2 KCl、1 KH2PO4、2 CaCl2、2 MgCl2、10 Na-Hepes(pH7.3)及10葡萄糖。所用的移液管含有(單位為mM)140 KCl、1 CaCl2、2mM MgCl2、10 EGTA、0.5 MgATP、10 K-Hepes(pH7.3)。當(dāng)獲得全細(xì)胞結(jié)構(gòu)后,將放大器轉(zhuǎn)換到電流鉗(current-clamp)模式。
腸液分泌和短路電流在前3個(gè)分析中,檢測了在回腸環(huán)中的液體累積(Oi et al.2002 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 993042-3046;Gorbach et al.1971 J.Clin.Invest.50881-889)。將有CD1遺傳背景的小鼠(或ΔF508純合子小鼠)(鼠齡8-10周,體重25-35g)饑餓24小時(shí)后通過腹腔注射克他明(氯氨酮,40mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)來麻醉。在手術(shù)中使用加熱墊使體溫維持在36℃-38℃。采用小的腹部切口來暴露小腸并通過縫合來分離近盲腸的閉合回腸環(huán)(長度20-30mm)。單獨(dú)用100μL PBS或含有霍亂毒素(1μg)的PBS來對環(huán)進(jìn)行注射。在某些實(shí)驗(yàn)中,所述的抑制劑(150μg/kg)通過腹腔內(nèi)注射給藥。利用縫合關(guān)閉腹部切口并使小鼠從麻醉中蘇醒。在6小時(shí)時(shí),將該小鼠麻醉,從腹腔中取出腸環(huán),在移去腸系膜和結(jié)締組織后檢測環(huán)長度和重量。
在封閉的成年小鼠分泌性腹瀉模型中,利用orogastric喂食針頭對小鼠灌胃(強(qiáng)飼法)給予溶于0.1mL的7%碳酸氫鹽緩沖液的霍亂毒素(10μg)(或單獨(dú)給予緩沖液)(Richardson et al.1986 Infect.Immun.54522-528;Gabriel et al.1999 Am J.Physiol.276G58-G63)。四個(gè)實(shí)驗(yàn)組為對照組(單獨(dú)給予緩沖液)、霍亂處理組、霍亂處理+抑制劑組(灌胃前2分鐘腹腔注射150μg/kg)、以及單獨(dú)抑制劑組。6小時(shí)后,將小鼠安樂死,從腹腔中取出小腸(從幽門到盲腸)并剝離相連的腸系膜和結(jié)締組織。將腸稱重,隨后縱向剖開移去腔中液體(通過吸干)并再次稱重。根據(jù)腔中液體移去前后的腸重比值來計(jì)算液體累積。對于短路電流的檢測,分離大鼠的結(jié)腸條,通過鈍性分離剝離肌肉層,放入U(xiǎn)ssing槽中(面積0.7cm2),孵育在含有10μM消炎痛(indomethacin)的氧合碳酸氫鹽Ringers溶液中。通過加入氨氯吡脒(10μM),隨后用毛喉萜(20μM)刺激并后續(xù)加入抑制劑來抑制Na+電流,而后檢測短路電流。
14C-標(biāo)記的CFTRinh-172的合成(圖6)通過在30分鐘內(nèi)向攪拌的3-三氟甲基苯胺(1.6g,10mM)和三乙胺(1g,10mM)的乙酸乙酯(10mL)溶液中滴加二硫化碳(0.8g,10mM)來合成中間產(chǎn)物2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-4-噻唑烷酮。利用冰浴防止反應(yīng)過熱。攪拌過夜后,過濾深黃色的粘稠液并用50mL乙醚洗滌所得沉淀,用空氣干燥得到3g(收率89%)的淺黃色二硫代氨基甲酸鹽固體(熔點(diǎn)92°-95℃)。攪拌Br-14C-乙酸鈉(由Br-14C-乙酸制備(Amersham)、55mCi/mmol、64mg、在0.6mL水中為0.46mM、利用NaHCO3調(diào)節(jié)pH8-9)并冷卻至5°-10℃,10分鐘內(nèi)加入二硫代氨基甲酸鹽(0.3g,0.9mM)。持續(xù)攪拌同時(shí)使該燒瓶升到室溫。2小時(shí)后,將所述的溶液冷卻到10℃,用濃HCl酸化,并加熱到90°-95℃保持30分鐘。過濾所得到的沉淀,用水洗滌并從乙醇中再結(jié)晶得到103mg所需的有光澤的晶體產(chǎn)物(收率83%),m.p.177°-178℃;特異活性(14C)55mCi/mmol;1H NMR(300MHz,CDCl3)δ4.18(s,2H,CH2),7.40(d,1H,苯基,J=8.0Hz),7.48(s,1H,苯基),7.64(t,1H,苯基,J=8.0Hz),7.72(d,1H,苯基,J=7.6Hz)ppm。
對于2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-5-[4-羧基苯基亞甲基]-4-噻唑烷酮(14C-5)(14C-CFTRinh-172)的合成,將溶于無水乙醇中的2-硫代-3-(3-三氟甲基苯基)-4-噻唑烷酮(14C-5)(100mg,0.36mM)與4-羧基苯甲醛(54mg,0.36mM)混合物與哌啶回流30分鐘。過濾所得的黃色沉淀,用乙醇洗滌、干燥、并從乙醇中再結(jié)晶得到108mg(收率73%)的黃色晶體,m.p.180°-182℃;特異活性(14C)54mCi/mmol;1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ7.78(d,2H,羧基苯基,J=8.2Hz),7.80-8.00(m,5H,三氟甲基苯基和CH)8.07(d,2H,羧基苯基,J=8.31Hz),13.20(s,1H,COOH,D2O交換)ppm。通過反復(fù)的重結(jié)晶使純度達(dá)到>99.9%。
藥代動力學(xué)研究將溶于含3%DMSO的PBS(用NaOH滴定到pH7.4)中的14C-CFTRinh-172(50μCi)彈丸劑(bolus)在1分鐘內(nèi)通過預(yù)留的頸靜脈插管靜脈給藥到大鼠(雄性Sprague-Dawley大鼠,360-420克)。在特定的時(shí)間從頸靜脈收集血液。使用LS-6500多功能閃爍計(jì)數(shù)儀(Multi-PurposeScintillation Counter,Beckman)通過閃爍計(jì)數(shù)(Scintiverse SE,F(xiàn)isher,CA)測定血漿(通過將全血以14,000g離心10分鐘分離)中的14C-放射活性。利用WinNonLin軟件(Pharsight)進(jìn)行藥代動力學(xué)分析。在收集最后的血液/組織樣品后,用過量的戊巴比妥處死大鼠。所有動物操作得到UCSF動物研究委員會的許可。
組織分布和清除研究將14C-CFTRinh-172(2μCi)彈丸劑在1分鐘內(nèi)通過尾靜脈靜脈內(nèi)給藥到小鼠(雄性CD1小鼠,30-35g)。在5、30、120和240分鐘處死小鼠。取出器官、稱重并在蒸餾水(10-50體積%)中研磨。通過對勻漿(25-50μL)進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)測定放射活性并表示為每器官的總14C-放射活性(或?qū)趋兰槊靠私M織)。在相同的時(shí)刻,收集血液、尿液和膽汁(從膽囊和十二指腸),檢測14C-放射活性并表示為每mL液體的形式。在14C-CFTRinh-172給藥后第一個(gè)24小時(shí)內(nèi)通過收集尿液和糞便進(jìn)行清除研究。在經(jīng)過與藥代動力學(xué)研究中相同的處理的大鼠中進(jìn)行了組織分布研究。
抑制劑代謝分析將體液(血漿、尿液、膽汁)和肝勻漿的等分試樣點(diǎn)在二氧化硅板上,通過采用乙酸乙酯∶己烷∶甲醇(1∶1∶0.1)溶劑體系的薄層層析來溶解,對于原始抑制劑其得到rf~0.5。用Transcreen LE放大系統(tǒng)(Kodak)使用Hyperfilm(Amersham)進(jìn)行放射性自顯影。所有板中均包括14C-標(biāo)記的CFTRinh-172標(biāo)準(zhǔn)。
短路電流檢測(實(shí)施例7)對于細(xì)胞研究,將含有T84細(xì)胞單層的Snapwell插片(Snapwell inserts)放入U(xiǎn)ssing槽系統(tǒng)中(Navicyte,Harvard Apparatus,Holliston,MA)。用含有(單位為mM)NaCl 120、NaHCO325、KH2PO43.3、K2HPO40.8、MgCl21.2、CaCl21.2、葡萄糖10(保持在37℃)的Krebs-碳酸氫鹽溶液充滿半槽,并連續(xù)通入5%CO2/95%O2氣體。高K+緩沖液含有(單位為mM)NaCl 65、KCl 67.5、KH2PO41.5、CaCl21、MgCl20.5、HEPES 10、葡萄糖10。低Cl-緩沖液含有(單位為mM)葡萄糖酸鈉120、KH2PO43.3、K2HPO40.8、MgCl21.2、CaCl21.2、HEPES 10、葡萄糖10(保持在37℃),并連續(xù)通入空氣。對于小鼠結(jié)腸內(nèi)的檢測,通過腹腔內(nèi)注射氯胺酮(40mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg)來麻醉小鼠。取出回腸,用冰冷的Krebs緩沖液洗滌,沿腸系膜線切開,并放入微Ussing槽(面積0.7cm2,World PrecisionInstruments,Sarasota,F(xiàn)L)。對于人腸的檢測,通過鈍性分離剝離結(jié)腸段的肌肉層并放入上述槽中。用含有10μM消炎痛的氧合Ringers碳酸氫鹽溶液充滿半槽。用DVC-1000電壓鉗(World Precision Instruments)利用Ag/AgCl電極和1M KCl瓊脂橋記錄短路電流。如下所述將激動劑/抑制劑加入半槽。
小鼠和大鼠模型中的在體腸液分泌(實(shí)施例5和7)對具有CD1遺傳背景的小鼠(鼠齡8-10周,體重25-35g)只給水不給食物24小時(shí)。用上述方法麻醉小鼠并在手術(shù)期間使用加熱墊將體溫維持在36℃-38℃。采用小的腹部切口來暴露小腸,并利用縫合來分離近盲腸的閉合回腸環(huán)(長度20-30mm)。用100μL單獨(dú)的PBS或含有霍亂毒素的PBS(1μg)注射腸環(huán)。在一些實(shí)驗(yàn)中,在霍亂毒素注射前或后的特定的時(shí)間點(diǎn)通過腹腔注射進(jìn)行CFTRinh-172(0-200μg)給藥。用縫合關(guān)閉腹部切口并使小鼠從麻醉中蘇醒。在6小時(shí)時(shí),麻醉小鼠,從腹腔中取出腸環(huán),在去除腸系膜和結(jié)締組織后檢測環(huán)長度和重量。
對于檢測大鼠閉合環(huán)模型中腸毒素誘導(dǎo)的液體分泌,用戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉雄性Wistar大鼠(體重200-250g)。分離腸環(huán)(40-60mm)并用單獨(dú)的300μL PBS或含有霍亂毒素(10μg)或STa毒素(0.1μg)的PBS注射。在一些實(shí)驗(yàn)中,在霍亂毒素或STa毒素給藥后通過腹腔內(nèi)注射給予CFTRinh-172(200μg)。在3小時(shí)(STa)或6小時(shí)(霍亂毒素)時(shí)檢測環(huán)長度和重量。
CFTRinh-172的口服給藥研究中,使用開放環(huán)小鼠模型,其中使用orogastric喂食針頭對小鼠以單獨(dú)的7%碳酸氫鹽緩沖液或霍亂毒素(1μg溶于7%碳酸氫鹽緩沖液)并與CFTRinh-172(維生素E TPGS中200μg,參見如下)一起灌胃。6小時(shí)后,從腹腔中取出小腸(從幽門到盲腸)并剝離連帶的腸系膜和結(jié)締組織。稱重該小腸,并縱向刨開移去腔液,再次稱重以定量液體的累積。
Caco-2通透性分析將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在多孔插片上達(dá)到400-600Ωcm-1的阻抗。對于轉(zhuǎn)運(yùn)研究,用等體積的Hank′s緩沖鹽溶液(HBSS)代替培養(yǎng)液,該溶液含有15mM葡萄糖和25mM HEPES(pH7.3)。1小時(shí)后,在上槽中加入CFTRinh-172(25μM)并在37℃柔和搖動平板。在特定的時(shí)間從底(接收)槽取出50μL溶液,通過UV吸收(385nm)檢測CFTRinh-172濃度。表觀通透性(Papp)通過下式計(jì)算Papp=dC/dT X(Vr/ACO),其中dC/dT為接收槽中CFTRinh-172濃度的增加速率,Vr為接收槽的體積,A為單層表面積,以及C0為供體槽中的CFTRinh-172初始濃度。
藥代動力學(xué)和口服生物利用度的研究利用三氟溴氯乙烷對小鼠進(jìn)行短暫麻醉,并將溶于維生素E TPGS(d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯,0.5%w/v)CFTRinh-172溶于10%w/v的TPGS水懸浮液中)的14C標(biāo)記-CFTRinh-172(12μCi)經(jīng)口灌胃給予小鼠。作為比較,其它小鼠通過尾靜脈輸注靜脈內(nèi)給予14C-CFTRinh-172(2μCi)。在特定的時(shí)間點(diǎn)收集血液來檢測血漿中的14C放射活性。在6小時(shí)時(shí),用過量戊巴比妥處死小鼠并取出器官用于檢測勻漿中的放射活性。
生物學(xué)實(shí)施例1CFTR抑制劑的篩選鑒定本發(fā)明化合物的初步篩選技術(shù)設(shè)計(jì)為通過直接的CFTR-抑制劑相互作用來鑒定CFTR Cl-轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑。如圖1A的流程所示,通過含有毛喉萜、IBMX和芹黃素(apigenin)的活化雞尾酒組合在CFTR-表達(dá)FRT細(xì)胞中預(yù)刺激CFTR。通過多種機(jī)制活化CFTR(cAMP升高、磷酸二酯酶抑制以及直接CFTR結(jié)合)使得可對抑制劑進(jìn)行鑒定,該抑制劑直接阻斷CFTR Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)途徑而不阻斷信號途徑中的其它臨近步驟。FRT細(xì)胞共表達(dá)黃色熒光蛋白為基礎(chǔ)的Cl-/I-感應(yīng)器,其提供抑制效果的定量熒光讀出分析(參見例如,Jayaraman et al.,2000,J.Biol.Chem.2756047-6050;Galiettaet al.,2001,Am.J.Physiol.281C1734-C1742.)。在CFTR預(yù)刺激和化合物加入后,使細(xì)胞處于內(nèi)向的I-梯度中以驅(qū)使I-內(nèi)流并產(chǎn)生降低的熒光。每種分析包括記錄兩秒的基線熒光,隨后在快速加入含I-的溶液后進(jìn)行12秒的連續(xù)熒光記錄。使用全自動高通量篩選設(shè)備分別在96孔板模式中檢測濃度為10μM的化合物(參見以下的實(shí)施例2)。
圖1B所示為利用圖1A的分析方法對50,000化合物初步篩選得到的相對YFP熒光對時(shí)間作圖的代表性曲線。根據(jù)I-加入后熒光降低的斜率進(jìn)行定量分析,49,993化合物對I-內(nèi)流的動力學(xué)沒有顯著的作用(<10%的斜率降低)。七種化合物的負(fù)斜率有小幅度降低(10-52%),幾乎所有這類化合物具有相似的結(jié)構(gòu)核心,該核心由帶有取代的苯基亞甲基和苯基部分的2-硫代-4-噻唑烷酮雜環(huán)構(gòu)成(圖1C)。隨后對超過250種具有噻唑烷酮核心結(jié)構(gòu)的類似物進(jìn)行篩選來鑒定最有效的CFTR抑制劑。
圖1D顯示,篩選中鑒定的最有效的噻唑烷酮CFTR抑制劑為3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(本文稱為CFTRinh-172),以及五種具有顯著抑制效力的類似物。因此下列化合物被鑒定為CFTR抑制劑3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-172);3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-020);3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-氧代羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-029);3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,4-二羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-185),3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,5-二溴代-4-羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-214)及3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-溴代-4-羥基-5-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-236)。最有效的CFTR抑制劑包括一種或多種吸電子基團(tuán),例如上述環(huán)1上的3-三氟甲基基團(tuán)和環(huán)2上的吸電子基團(tuán)或極性取代基。選取CFTRinh-172做進(jìn)一步分析。相對效力為0.2(CFTRinh-020)、0.3(CFTRinh-029)、1.0(CFTRinh-172)、0.2(CFTRinh-185)、0.1(CFTRinh-214)及0.1(CFTRinh-236)。
為檢驗(yàn)三氟甲基和羧基取代基在環(huán)上的位置的作用,合成了CFTRinh-172的8種類似物,其中將所述取代基轉(zhuǎn)移至環(huán)1(三氟甲基)和環(huán)2(羧基)上的每一獨(dú)特位置。與CFTRinh-172比較(效力1.0),3-[(a-三氟甲基)苯基]-5-[(b-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮類似物的相對抑制效力為0.69(a=2,b=2),0.70(2,3),0.66(2,4),0.74(3,2),0.90(3,3),0.67(4,2),0.64(4,3)和0.56(4,4)。
生物學(xué)實(shí)施例2CFTRinh-172的特性主題噻唑烷酮化合物的特定劑量對CFTR的抑制水平可利用如圖1A所示的熒光分析法如上所述進(jìn)行測定。圖2A所示為以相對YFP熒光對時(shí)間表示的CFTRinh-172劑量-抑制數(shù)據(jù)。此噻唑烷酮化合物在0.3-0.6μM濃度時(shí)可觀察到顯著的CFTR抑制作用。圖2B顯示CFTRinh-172的抑制作用(顯示為加入或洗滌后相對轉(zhuǎn)運(yùn)速率對時(shí)間的圖像)在~10分鐘(t1/2為4分鐘)完成,并在洗滌后以t1/2為~5分鐘發(fā)生逆轉(zhuǎn)(插圖)。相對轉(zhuǎn)運(yùn)速率如圖2C所示,表明CFTRinh-172可有效地抑制由多種不包括在起始篩選所用活化雞尾酒組合中的激動劑引起的CFTR活化。這些激動劑包括染料木黃酮(genistein)、CPT-cAMP、CPX、8-MPO及強(qiáng)力的苯并萸酮(benzoflavone)CFTR活化劑UCCF-029(2-(4-吡啶鎓)苯并[h]4H-苯并吡喃-4-酮硫酸氫鹽)及苯并咪唑酮(benzimidazolone)CFTR活化劑UCCF-853(參見Galietta,et al.,2001,J Biol.Chem.27619723-19728)。
還進(jìn)行了電生理實(shí)驗(yàn)來建立CFTRinh-172的抑制效力和特異性。圖3A所示為CFTRinh-172對CFTR表達(dá)FRT細(xì)胞中的短路電流的快速、劑量依賴的抑制作用,其中將CFTRinh-172加入到孵育頂端細(xì)胞表面的溶液中。圖3B顯示了在相同條件下檢測的CFTRinh-172(Kd~300nM,Hill系數(shù)~1)和優(yōu)降糖(Kd~200μM)的平均劑量-抑制關(guān)系。
已發(fā)現(xiàn)這種噻唑烷酮在天然表達(dá)野生型CFTR的細(xì)胞(包括T84細(xì)胞和人支氣管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)物)以及表達(dá)G551D-CFTR和ΔF508-CFTR的轉(zhuǎn)染FRT細(xì)胞中具有相似的抑制效力(低溫校正后(lowtemperature correction))。對于支氣管細(xì)胞中的研究,用氨氯吡脒阻斷Na+通道使得基準(zhǔn)電流很大程度上依賴于CFTR。用CPT-cAMP最大活化CFTR后,從頂端側(cè)應(yīng)用CFTRinh-172強(qiáng)烈地抑制了短路電流(圖3C,左側(cè))。當(dāng)從基底側(cè)加入時(shí)CFTRinh-172也可抑制短路電流(圖3C,右側(cè))。
如圖3D所示,在CFTR-表達(dá)FRT細(xì)胞中檢測了全細(xì)胞膜電流。用5μM毛喉萜刺激,在+100mV可產(chǎn)生381±47pA/pF(n=4)的膜電流(總膜電容21±3pF)。如對純CFTR電流所預(yù)期的該電流-電壓關(guān)系為線性(圖3F)。用2μM CFTRinh-172進(jìn)行細(xì)胞外灌注,在所有膜電勢下均使電流迅速降低,表明非電壓依賴的CFTR抑制作用。利用較低濃度的CFTRinh-172(0.2μM)獲得~50%的抑制作用證明通道阻斷缺乏電壓依賴性(圖3F)。
也檢測了CFTRinh-172對CFTR抑制作用的特異性。對兩種非CFTRCl-通道進(jìn)行了研究。5μM濃度的CFTRinh-172不能抑制極化的人支氣管上皮細(xì)胞中的Ca2+活化的Cl-分泌,該分泌通過在頂端孵育溶液中加入U(xiǎn)TP(100μM)產(chǎn)生(圖4A)。在有和沒有CFTRinh-172存在下最大的UTP依賴的短路電流分別為9.9±0.5μA/cm2和10.0±0.2μA/cm2(標(biāo)準(zhǔn)誤,n=4)。5μM的CFTRinh-172也不能阻斷用250mosM/kg低滲溶液進(jìn)行細(xì)胞外灌注在FRT細(xì)胞中引起的容量活化的Cl-電流(圖4B)。
在過表達(dá)MDR-1的9HTEo-/Dx細(xì)胞中對CFTR同源物,ATP結(jié)合級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子(ATP-binding cassette transpoter)MDR-1(多藥物抗性蛋白-1)的活性進(jìn)行了檢測(Rasola et al.1994 J.Biol.Chem.2691432-1436)。MDR-1抑制劑異搏定(verapamil,100μM)可使長春新堿的累積強(qiáng)烈上升,其與MDR-1介導(dǎo)的活性藥物排出反向相關(guān)(圖4C)。CFTRinh-172(5μM)不影響長春新堿的累積因此不抑制MDR-1。
另一種CFTR同源物為磺脲(sulphonylurea)受體(SUR),其調(diào)節(jié)ATP敏感K+通道(K-ATP通道)的活性(Aguilar-Bryan and Bryan 1999 Endocr.Rev.20101-135)。SUR1在胰腺β細(xì)胞中表達(dá),其可控制膜電勢和胰島素釋放。如優(yōu)降糖,磺脲通過阻斷K-ATP通道和膜的去極化引起胰島素釋放(及低血糖反應(yīng))。為確定CFTRinh-172是否也阻斷K-ATP通道,對大鼠胰腺β細(xì)胞株INS-1的膜電勢進(jìn)行了檢測(圖4D,圖4E)。與優(yōu)降糖引起的較大的膜去極化相對,CFTRinh-172(2和5μM)不能使膜電勢去極化。5μM的CFTRinh-172可引起較小的超極化,其明顯小于K-ATP通道活化劑二氮嗪(diazoxide,100μM)引起的超極化。其它的研究表明,5μM的CFTRinh-172不能阻斷水通道(AQP1)、尿素轉(zhuǎn)運(yùn)因子(UT-B)、Na+/H+交換因子(NHE3)和Cl-/HCO3-交換因子(AE1)。
進(jìn)一步的分析表明,5μM的CFTRinh-172不能影響細(xì)胞的cAMP產(chǎn)生或磷酸酶活性。在FRT細(xì)胞中,基礎(chǔ)cAMP含量為225±22fmol/每孔,其在20μM毛喉萜刺激后30分鐘可增加至1290±190fmol/每孔(沒有抑制劑)和1140±50(+CFTRinh-172)(n=3)。如用二氫若丹明分析所判斷的,在高至100μM的濃度下24小時(shí)后CFTRinh-172對FRT細(xì)胞沒有毒性。在小鼠中,每天腹腔內(nèi)注射1000μg/kg CFTRinh-172共7天不引起明顯的毒性。食物和水的攝取沒有減少、血清電解質(zhì)濃度、葡萄糖、肝功能指標(biāo)、血清肌酐、淀粉酶和血細(xì)胞比容沒有改變。此外,單次較大全身劑量的CFTRinh-172(10mg/kg)不引起明顯的毒性。
生物學(xué)實(shí)施例3在體效力利用對霍亂毒素誘導(dǎo)的腸液分泌的兩種分析,以及在分離的腸中通過短路電流分析對CFTRinh-172的效力進(jìn)行了在體測試。在第一種分析中,在體建立了一系列的小腸閉合環(huán),并用少量的鹽水或含有霍亂毒素的鹽水對間隔(alternate)環(huán)的腔進(jìn)行注射。6小時(shí)后測定腔中的液體累積。如圖5A所示,在霍亂毒素處理的環(huán)中有明顯的液體累積和擴(kuò)張,而鄰近的對照(鹽水)環(huán)仍然是空的。在灌注霍亂毒素之前單次給予CFTRinh-172(150μg/kg,腹腔內(nèi))可有效防止所述毒素處理的腸環(huán)中的液體累積。
一系列這些實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)總結(jié)如圖5B所示。CFTRinh-172使液體分泌明顯降低到鹽水對照環(huán)中的水平,其中非活性噻唑烷酮類似物不能抑制液體分泌。如以往的資料(Gabriel et al.1994 Science 266107-109)所表明的,霍亂毒素處理的來自純合子ΔF508-CFTR小鼠的腸環(huán)也保持為空的,表明CFTR參與了腸液分泌。在第二種分析中,通過口服霍亂毒素給藥(10μg)和系統(tǒng)CFTRinh-172給藥來誘導(dǎo)腸液分泌。6小時(shí)后,通過對整個(gè)小腸進(jìn)行稱重檢測到有明顯的液體累積。如所示地,CFTRinh-172給藥可明顯降低腸液的累積,并可用腔液移出前后的腸重比值來定量化(圖5C)。
圖5D顯示了CFTRinh-172對跨完整大鼠結(jié)腸粘膜的短路電流的抑制作用。用氨氯吡脒抑制Na+電流后,毛喉萜可使短路電流迅速上升。將CFTRinh-172加入到粘膜溶液中時(shí)對短路電流的抑制作用比加入到漿膜(serosal)溶液中時(shí)大得多,這可能與通過殘余的粘膜下組織到達(dá)結(jié)腸上皮細(xì)胞時(shí)的損失有關(guān)。單獨(dú)向粘膜溶液中加入5μM CFTRinh-172可降低>80%的短路電流。這些結(jié)果提供了CFTRinh-172在腸中對CFTR Cl-通道具有抑制作用的電生理證據(jù)。
生物學(xué)實(shí)施例4藥代動力學(xué)分析在單劑量靜脈內(nèi)灌注14C標(biāo)記的CFTRinh-172大丸劑后,通過對血清14C放射活性進(jìn)行系列檢測完成了大鼠的藥代動力學(xué)分析。灌注的抑制劑總量(400μg,~1mg/kg)可有效地作為大鼠的抗腹瀉藥。圖7顯示血清14C放射活性動力學(xué)與二室模型吻合較好,并具有1.2L的分布容積和3.8μg·hr/mL的AUC(曲線下面積)。半衰期為0.14hr(再分布)和10.3hr(清除)。給藥后72小時(shí)在血漿中,或給藥后14天在肝或腎勻漿中沒有檢測到14C標(biāo)記的CFTRinh-172。
在單劑量靜脈內(nèi)灌注大丸劑后,根據(jù)器官勻漿和體液的放射活性可確定14C標(biāo)記的CFTRinh-172的組織分布。圖8中,圖A總結(jié)了CFTRinh-172灌注后指定的時(shí)間點(diǎn)在小鼠的主要器官中的14C分布。5分鐘內(nèi)首先在肝和腎中觀察到14C放射活性,并隨時(shí)間降低。在腦、心臟、骨骼肌或睪丸中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)放射活性。在較晚的時(shí)間點(diǎn)(30-240分鐘),14C放射性在腸中累積。圖3中,圖B顯示在靜脈內(nèi)灌注大丸劑后60分鐘在大鼠中檢測到14C放射活性的相似器官分布,而在腦、心臟和骨骼肌中幾乎沒有放射性。在一些實(shí)驗(yàn)中,在灌注14C-標(biāo)記的CFTRinh-172(50μCi)后第10天處死大鼠。
為確定CFTRinh-172在腎臟、肝臟和腸中累積的機(jī)制,檢測了血清、尿及膽汁中的14C放射活性。灌注后的頭2小時(shí)內(nèi),小鼠的平均尿放射活性為4.2±1.2×105cpm/mL。尿與血液的14C放射活性比值在5-7∶1范圍,與尿與血清的摩爾滲透壓比值~5∶1(1550mOsm比310mOsm)相比較,表明CFTRinh-172通過腎小球過濾被腎清除,而不經(jīng)腎小管吸收或分泌。14C放射活性在血清、尿和腎組織中降低的動力學(xué)大致相同支持了CFTRinh-172清除的腎臟清除機(jī)制(數(shù)據(jù)未顯示)。根據(jù)14C放射活性在肝臟中迅速累積并隨后在腸中累積的觀測結(jié)果研究了CFTRinh-172在膽汁中累積的可能性。在對小鼠給藥后60分鐘,膽汁中的14C放射活性強(qiáng)度為血液中的~9倍。為確定膽汁中的CFTRinh-172是排泄到糞便中還是返回到循環(huán)中,在灌注放射性標(biāo)記的抑制劑后的頭24小時(shí)內(nèi)對小鼠的尿和糞便進(jìn)行收集。在尿中發(fā)現(xiàn)了93±3%的排泄的放射活性,支持了利用腸肝循環(huán)的腎臟排泄為主的機(jī)制。
為確定在器官和體液中檢測到的14C放射活性是對應(yīng)完整的CFTRinh-172還是對應(yīng)化學(xué)修飾的CFTRinh-172,對尿、血清和膽汁樣本以及通過離心制備的肝勻漿上清進(jìn)行薄層層析和放射性自顯影。圖9所示為對應(yīng)大丸劑灌注給予的原始CFTRinh-172的rf~0.5的單一斑點(diǎn)。體液和器官勻漿的放射性自顯影在同一rf處顯示單一斑點(diǎn),表明沒有發(fā)生CFTRinh-172的化學(xué)修飾。
通過分光光度pH滴定測定CFTRinh-172為pKa為5.5的弱酸。在生理pH下,~1%的CFTRinh-172以具有低極性及高膜通透性的非離子酸存在。上述細(xì)胞模型中CFTRinh-172被快速攝取表明口服生物利用制劑的可行性,但為避免沉淀防止低胃酸pH的影響是必需的。從這些藥物代謝動力學(xué)研究得出的結(jié)果表明,在嚙齒動物中CFTRinh-172通過腎臟清除被緩慢地排除而不發(fā)生化學(xué)修飾,且CFTRinh-172在膽汁中濃縮并累積在腸中。CFTRinh-172不能明顯跨越血腦屏障,且很少發(fā)現(xiàn)CFTRinh-172在包括心臟、肺、骨骼肌和睪丸的其它重要器官中累積。CFTRinh-172的緩慢腎臟清除、腸累積以及幾乎沒有血腦屏障滲透的特性對于抗腹瀉劑應(yīng)用是有益的。
生物學(xué)實(shí)施例5CFTRinh-172抑制作用的劑量效應(yīng)和持續(xù)時(shí)間本實(shí)施例的目的是將上述與腹腔內(nèi)注射單劑量CFTRinh-172的作用有關(guān)的觀測結(jié)果擴(kuò)展到在小鼠閉合腸環(huán)模型中抑制霍亂毒素刺激的液體分泌作用。特別地,本實(shí)施例的目的是檢測維持CFTRinh-172抑制作用的劑量效應(yīng)關(guān)系和表觀半衰期。
首先,測定腸環(huán)液體吸收和分泌的動力學(xué)從而確定小鼠模型的特征。為進(jìn)行吸收研究,將200μL PBS注射到獨(dú)立的腸環(huán)后,在特定的時(shí)間點(diǎn)檢測腸環(huán)液體含量。圖10中,圖A顯示在~25分鐘時(shí)有50%液體保留的快速液體吸收。與對照組比較(圖10中,圖A的插圖),以強(qiáng)烈抑制霍亂毒素誘導(dǎo)的腸液分泌的劑量(20μg)進(jìn)行CFTRinh-172的腹腔內(nèi)給藥不能改變液體吸收的速率(在30分鐘時(shí)檢測)。為研究分泌,用霍亂毒素(1μg溶于0.1mL PBS)對腸環(huán)進(jìn)行注射。圖10中,圖B顯示在6小時(shí)內(nèi)液體分泌緩慢啟動,這與以往在嚙齒動物模型中的研究一致(Gorbach et al.J.Clin.Invest.1971 50-881-889;Oi et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002993042-3046)。正常條件下液體在腸中的快速吸收表明,如果分泌被阻斷,活化分泌后腸腔中累積的液體可被快速吸收,預(yù)示甚至在給予霍亂毒素之后CFTR抑制作用可有效地防止液體的累積。
圖11中,圖A總結(jié)了小鼠中CFTRinh-172劑量-效應(yīng)研究的結(jié)果,其中在對閉合腸環(huán)進(jìn)行霍亂毒素灌注后立即通過腹腔注射進(jìn)行單劑量抑制劑的給藥。如在非霍亂毒素注射的環(huán)中所觀察到的,基礎(chǔ)腸液含量(虛線)接近零。CFTRinh-172對霍亂毒素注射的腸環(huán)中的液體累積的抑制可達(dá)~90%,在~5μg CFTRinh-172(150μg/kg)的抑制作用為50%。在所述劑量-效應(yīng)研究中,除在霍亂毒素給藥前后的不同時(shí)間的單劑量20μg的CFTRinh-172給藥外,對抑制作用的持續(xù)時(shí)間進(jìn)行了檢測。圖11中,圖B顯示在霍亂毒素給藥前后3小時(shí)給予CFTRinh-172對腔中的液體累積具有顯著的抑制作用。但在霍亂毒素給藥前6小時(shí)沒有顯著的抑制作用??紤]到霍亂毒素負(fù)載研究的6小時(shí)持續(xù)時(shí)間,CFTRinh-172抑制作用的持續(xù)t1/2為~9-10小時(shí)。
生物學(xué)實(shí)施例6CFTRinh-172的口服生物利用度為測試口服給予CFTRinh-172的抗腹瀉效果,在小鼠中對CFTRinh-172的藥代動力學(xué)進(jìn)行了測定,并對CFTRinh-172的跨Caco-2單層轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行了檢測。因?yàn)镃FTRinh-172為相對非極性的弱酸(pKa5.5),其可能會在胃中沉淀,所以利用兩種通常用來增溶口服給藥藥物的試劑-維生素E TPGS和環(huán)糊精來實(shí)現(xiàn)口服給藥。利用14C標(biāo)記的CFTRinh-172來進(jìn)行檢測。
圖11中,圖C顯示了在口服及靜脈內(nèi)給藥后14C-CFTRinh-172在小鼠中的藥代動力學(xué)。靜脈內(nèi)給藥產(chǎn)生較高的起始血清濃度,其在~30分鐘內(nèi)降低(組織再分布),而血清放射活性在剛口服后較低,在~60-90分鐘到達(dá)峰值,隨后開始降低。圖11中,圖D總結(jié)了口服和靜脈給藥后6小時(shí)時(shí)14C-CFTRinh-172的器官分布,顯示在胃腸道以及肝和腎中有累積。14C放射活性在膽汁中比血清中濃縮了~10倍,而在糞便中幾乎沒有放射活性排泄(在24小時(shí)內(nèi)<10%的總排泄放射活性),表明腸肝循環(huán)促進(jìn)了CFTRinh-172在腸中的累積??诜﨏FTRinh-172給藥與靜脈內(nèi)給藥相比(在4-6小時(shí)的組織/血清含量)表明TPGS制劑中CFTRinh-172口服生物利用度為15-20%。
圖11中,圖F顯示CFTRinh-172在跨Caco-2單層中表現(xiàn)出線性增加,由此推導(dǎo)得CFTRinh-172的通透性系數(shù)為16×10-6cm/s。此值包含在對各種口服給藥藥物建立的取值范圍內(nèi)(例如,心得樂(pindolol)為36×10-6cm/s、sildenafil為48×10-6cm/s)(Stenberg et al.J.Med.Chem.2001441927-1937。
生物學(xué)實(shí)施例7cGMP-與cAMP-介導(dǎo)的液體分泌的抑制作用利用在體大鼠腸環(huán)模型來測定CFTRinh-172對cGMP-和cAMP-介導(dǎo)的液體分泌的抑制效果,以及測試CFTRinh-172在替代的動物模型中的效果。鳥苷酸(guanylyl)環(huán)化酶C受體在大鼠的腸細(xì)胞(enterocytes)中表達(dá),使得STa毒素結(jié)合和細(xì)胞漿cGMP升高(Mann et al.Biochem Biophys Rescommun 1997 239463-466)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)STa毒素在3小時(shí)后可在大鼠回腸內(nèi)引起液體分泌(Cohen et al.Am J Physiol 1989 257G118-123)。在對小鼠有效的劑量(600μg/kg)時(shí),CFTRinh-172可防止大鼠腸環(huán)中霍亂毒素誘導(dǎo)的液體分泌(圖12中,圖A)。對于STa毒素誘導(dǎo)的液體分泌,用STa毒素(0.1μg溶于300μL PBS)對腸環(huán)進(jìn)行注射,并在3小時(shí)后檢測環(huán)重量。圖12中,圖B顯示CFTRinh-172抑制了~75%的腸液分泌。
在小鼠和人腸上皮片中檢測了短路電流,以評價(jià)CFTRinh-172對跨上皮離子分泌的抑制作用。圖13中,圖A顯示了毛喉萜或STa毒素(插圖)刺激后CFTRinh-172對小鼠回腸中的短路電流的劑量依賴抑制作用。對cAMP和cGMP依賴的氯分泌,~5μM的CFTRinh-172均有50%的抑制作用。圖12中,圖B顯示在人結(jié)腸中CFTRinh-172對短路電流有相似的抑制效力。
不理想的觀測結(jié)果是,CFTRinh-172對腸短路電流(2-5μM)的表觀抑制效力基本上低于在對包括CFTR表達(dá)FRT細(xì)胞(0.2-0.5μM)和Calu-3細(xì)胞(0.5μM)在內(nèi)的幾種細(xì)胞株進(jìn)行的電生理研究發(fā)現(xiàn)的結(jié)果。對這種差異有幾種解釋可以考慮,包括細(xì)胞類型差異、達(dá)到完整腸中的腸細(xì)胞的CFTRinh-172有限、膜電勢作用(內(nèi)部負(fù)細(xì)胞電勢降低了細(xì)胞內(nèi)[CFTRinh-172]),以及ATP與CFTRinh-172的競爭作用。
對T84結(jié)腸上皮細(xì)胞進(jìn)行的短路電流檢測對這種現(xiàn)象進(jìn)行分析。如圖14中的代表性實(shí)驗(yàn)所示,圖A顯示通過cAMP激動劑毛喉萜(左側(cè))、細(xì)胞通透性cGMP類似物8-Br-cGMP(中央)或由高通量篩選鑒定的CFTR氯轉(zhuǎn)導(dǎo)直接激動劑CFTRact-16刺激后,~3μM CFTRinh-172對非通透性T84細(xì)胞單層中的短路電流產(chǎn)生50%的抑制作用。為測定CFTRinh-172在T84細(xì)胞中效力相對減弱是否需要完整的細(xì)胞,在用兩性霉素B對細(xì)胞基底膜進(jìn)行通透性化后,以及在Cl-梯度存在(產(chǎn)生可檢測的電流)下對短路電流進(jìn)行了檢測。圖14中,圖B(左側(cè))顯示通透性化后CFTRinh-172對短路電流的抑制效能基本增加。圖14總結(jié)了劑量-效應(yīng)數(shù)據(jù),圖B(中央)表明細(xì)胞通透性化后對從~3至0.3μM的CFTRinh-172抑制作用表觀KI下降。為測試CFTRinh-172在完整細(xì)胞中的效能下降是否是由內(nèi)部負(fù)膜電勢(降低細(xì)胞漿對細(xì)胞外的[CFTRinh-172])引起的,在用高K+基底孵育溶液去極化后對T84細(xì)胞進(jìn)行了短路電流檢測。圖14中,圖C顯示在去極化的細(xì)胞中增加的CFTRinh-172效能(KI~0.3μM)得以恢復(fù),表明細(xì)胞膜電勢在對CFTRinh-172效能中發(fā)揮重要作用。
根據(jù)以上數(shù)據(jù),可推測本發(fā)明的噻唑烷化合物(以CFTRinh-172為代表)對由諸如大腸桿菌(E.coli)和霍亂中的霍亂弧菌(Vibrio cholerae)產(chǎn)腸毒素(enterotoxogenic)生物體引起的腸毒素誘導(dǎo)分泌性腹瀉、Traveller’s及AIDS并發(fā)癥相關(guān)的腹瀉中具有抗腹瀉作用。CFTR抑制作用可用于由諸如梭狀芽胞桿菌和沙門氏菌屬種的腸侵入性細(xì)菌引起的腹瀉的附屬治療;然而,CFTR抑制作用不會降低由這些生物體產(chǎn)生的粘膜損傷。類似地,不能期望CFTR抑制作用會矯正炎癥性腸疾病中的基本病理改變,但可降低腸液體的分泌量。最近有證據(jù)表明,由諸如輪狀病毒的病毒性腹瀉引起的液體分泌可有諸如Ca2+介導(dǎo)Cl-通道的其它機(jī)制參與,盡管CFTR在液體分泌中的作用仍不清楚,因此可在適合的動物模型中使用本發(fā)明化合物進(jìn)行測試。
綜上,噻唑烷酮CFTR阻斷劑CFTRinh-172在嚙齒動物和人腸中防止cAMP與cGMP誘導(dǎo)的離子/液體分泌而不影響腸液吸收。其良好的藥理學(xué)和活性特征為開發(fā)進(jìn)一步的抗腹瀉應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
雖然本發(fā)明是參考具體的實(shí)施方案進(jìn)行描述的,但本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明真實(shí)精神和范圍的條件下,可對其作出各種改變和進(jìn)行等價(jià)替換。此外,為適應(yīng)特定的環(huán)境、材料、材料組合物、過程、過程步驟,可根據(jù)本發(fā)明的目標(biāo)、精神和范圍作出各種修改。所有這些修改應(yīng)包括在本發(fā)明附屬的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.治療患有囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)蛋白介導(dǎo)的疾病狀態(tài)或癥狀的個(gè)體的方法,所述方法包括給予所述個(gè)體治療有效劑量的以其單一的或混合的立體異構(gòu)體的形式存在的通式(I)化合物或其藥物可接受的衍生物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;A1和A2獨(dú)立地選自氧和硫,A3選自硫或硒;及A4包括一個(gè)或多個(gè)碳或雜原子,并可存在或不存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述疾病狀態(tài)或癥狀與異常增加的腸分泌有關(guān)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法,其中所述疾病狀態(tài)或癥狀為分泌性腹瀉。
4.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述通式(I)化合物為,A4不存在,每個(gè)A1與A3為硫、及A2為氧,即,3-芳基-5-芳基亞甲基-2-硫代-4-噻唑烷酮的化合物。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述通式(I)化合物選自3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-氧羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,4-二羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,5-二溴-4-羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;及3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-溴-4-羥基-5-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。
6.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述通式(I)化合物為通式(Ia)的化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;及A1和A2獨(dú)立地選自氧和硫。
7.如權(quán)利要求6所述的方法,其中所述X1是吸電子基團(tuán)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法,其中所述X1選自全氟代烷基基團(tuán)和氟。
9.如權(quán)利要求8所述的方法,其中所述Y2選自烷基、羥基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及鹵素基團(tuán)。
10.如權(quán)利要求7所述的方法,其中所述X1為3-三氟甲基基團(tuán)。
11.如權(quán)利要求6所述的方法,其中所述Y2為羥基基團(tuán)。
12.如權(quán)利要求11所述的方法,其中所述Y1為羥基基團(tuán)。
13.如權(quán)利要求11所述的方法,其中所述Y1為溴。
14.如權(quán)利要求11所述的方法,其中所述Y3為硝基。
15.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述通式(I)化合物為通式(Ib)的化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫和有機(jī)基團(tuán);以及Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫和有機(jī)基團(tuán)。
16.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述通式(I)化合物為通式(Ib)的化合物 其中的X1、X2和X3至少其中之一為吸電子基團(tuán);以及Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及鹵素基團(tuán)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法,其中X1為三氟甲基基團(tuán)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法,其中X1為3-三氟甲基基團(tuán)。
19.如權(quán)利要求1所述的方法,其中所述通式(I)化合物選自 及
20.一種抑制個(gè)體細(xì)胞中囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白活性的方法,包括將以足以抑制所述細(xì)胞中CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)劑量的、以其單一的或混合的立體異構(gòu)體形式存在的通式(I)化合物或其藥物可接受的衍生物與所述的細(xì)胞接觸,所述通式(I)化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;A1和A2獨(dú)立地選自氧和硫,A3選自硫或硒;及A4包括一個(gè)或多個(gè)碳或雜原子,并可存在或不存在。
21.如權(quán)利要求20所述的方法,其中所述通式(I)化合物為,A4不存在,每個(gè)A1與A3為硫、及A2為氧,即,3-芳基-5-芳基亞甲基-2-硫代-4-噻唑烷酮的化合物。
22.如權(quán)利要求21所述的方法,其中所述通式(I)化合物選自3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-氧羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,4-二羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,5-二溴-4-羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;及3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-溴-4-羥基-5-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。
23.如權(quán)利要求20所述的方法,其中所述通式(I)化合物為通式(Ia)的化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;以及A1和A2獨(dú)立地選自氧和硫。
24.如權(quán)利要求23所述的方法,其中X1是吸電子基團(tuán)。
25.如權(quán)利要求24所述的方法,其中X1選自全氟代烷基基團(tuán)和氟。
26.如權(quán)利要求24所述的方法,其中X1為3-三氟甲基基團(tuán)。
27.如權(quán)利要求23所述的方法,其中Y2選自烷基、羥基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及鹵素基團(tuán)。
28.如權(quán)利要求23所述的方法,其中Y2為羥基基團(tuán)。
29.如權(quán)利要求28所述的方法,其中Y1為羥基。
30.如權(quán)利要求28所述的方法,其中Y1為溴。
31.如權(quán)利要求28所述的方法,其中Y3為硝基。
32.如權(quán)利要求20所述的方法,其中所述通式(I)化合物為通式(Ib)的化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫和有機(jī)基團(tuán);以及Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫和有機(jī)基團(tuán)。
33.如權(quán)利要求20所述的方法,其中所述通式(I)化合物為通式(Ib)的化合物 其中的X1、X2和X3至少其中之一為吸電子基團(tuán);以及Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及鹵素基團(tuán)。
34.如權(quán)利要求33所述的方法,其中X1為三氟甲基基團(tuán)。
35.如權(quán)利要求34所述的方法,其中X1為3-三氟甲基基團(tuán)。
36.如權(quán)利要求20所述的方法,其中所述通式(I)化合物選自 及
37.如權(quán)利要求20所述的方法,其中接觸所述細(xì)胞包括由所述個(gè)體攝取所述通式(I)化合物。
38.如權(quán)利要求37所述的方法,其中所述攝取進(jìn)一步包括與所述通式(I)化合物一起攝取藥物可接受的載體。
39.抑制在體分析的細(xì)胞中囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白活性的方法,包括以足以抑制所述細(xì)胞中CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)的劑量的、以其單一或混合的立體異構(gòu)體的形式存在的通式(I)化合物或其藥物可接受的衍生物與所述的細(xì)胞接觸,其中所述通式(I)化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;A1和A2獨(dú)立地選自氧和硫,A3選自硫或硒;及A4包括一個(gè)或多個(gè)碳或雜原子,并可存在或不存在。
40.一種產(chǎn)生非人動物囊性纖維化(CF)表型的方法,其中所述的方法包括以足以誘導(dǎo)所述非人動物中囊性纖維化(CF)表型的劑量的、以其單一的或混合的立體異構(gòu)體形式存在的通式(I)化合物或其藥物可接受的衍生物對非人動物給藥,所述通式(I)化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;A1和A2獨(dú)立地選自氧和硫,A3選自硫或硒;及A4包括一個(gè)或多個(gè)碳或雜原子,并可存在或不存在。
41.一種治療患有與由囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)引起的異常離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的疾病狀態(tài)個(gè)體的方法,所述的方法包括將有效劑量的噻唑烷酮化合物對所述個(gè)體給藥;其中CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制且所述疾病狀態(tài)得以治療。
42.如權(quán)利要求41所述方法,其中所述的異常增加的CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)與腹瀉相關(guān)。
43.如權(quán)利要求42所述的方法,其中所述的腹瀉為分泌性腹瀉。
44.一種含有噻唑烷酮化合物以及藥物可接受載體、藥物可接受稀釋劑、藥物可接受賦形劑和藥物可接受佐劑中的至少一種的藥物組合物,所述噻唑烷酮化合物獨(dú)立地選自3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-氧羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,4-二羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3,5-二溴-4-羥基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮;及3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(3-溴-4-羥基-5-硝基苯基)亞甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮。
45.如權(quán)利要求44所述組合物,其中所述的組合物不含有能檢測到的二甲基亞砜。
46.含有以其單一的或混合的立體異構(gòu)體形式存在的通式(I)化合物或其藥物可接受的衍生物,以及藥物可接受載體、藥物可接受稀釋劑、藥物可接受賦形劑及藥物可接受佐劑中的至少一種的藥物組合物,所述通式(I)化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;A1和A2獨(dú)立地選自氧和硫,A3選自硫或硒;及A4包括一個(gè)或多個(gè)碳或雜原子,并可存在或不存在,條件是,當(dāng)1)A4不存在,每個(gè)A1與A2為氧、及A3為硫,X1、X2和X3中之一為4-位上的三氟甲基或氯,且X1、X2和X3中其它的均為氫,當(dāng)Y1、Y2和Y3中余下的均為氫時(shí),Y1、Y2和Y3中之一不能是2-位上的4-甲基哌嗪-1-基;2)A4不存在,每個(gè)A1與A3為硫、及A2為氧,X1、X2和X3中之一為4-位上的羧基且X1、X2和X3中其它的均為氫,Y1、Y2和Y3不能均為氫;3)A4不存在,每個(gè)A1與A3為硫、及A2為氧,X1、X2和X3中之一為2-、3-或4-位上羥基或4-位上的乙氧基,且X1、X2和X3中其它的均為氫,Y1、Y2和Y3中之一是氫,且Y1、Y2和Y3中的另一個(gè)為4-位上的羥基或甲氧基,而Y1、Y2和Y3中余下的一個(gè)不能是3-位上的甲氧基;及4)A4不存在,每個(gè)A1與A3為硫、及A2為氧,X1、X2和X3中之一為4-位上的甲基,且X1、X2和X3中的另一個(gè)為3-位上的氯,Y1、Y2和Y3中之一為4-位上的甲氧基,且Y1、Y2和Y3中余下的為不能均為氫。
47.如權(quán)利要求46所述組合物,其中所述的通式(I)化合物為通式(Ia)化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、有機(jī)基團(tuán)、鹵素、硝基、偶氮基、羥基及巰基;以及A1和A2獨(dú)立地選自氧和硫。
48.如權(quán)利要求47所述的組合物,其中X1是吸電子基團(tuán)。
49.如權(quán)利要求48所述的組合物,其中X1選自全氟代烷基基團(tuán)和氟。
50.如權(quán)利要求47所述的組合物,其中Y2選自烷基、羥基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及鹵素基團(tuán)。
51.如權(quán)利要求47所述的組合物,其中X1為3-三氟甲基基團(tuán)。
52.如權(quán)利要求47所述的組合物,其中Y2為羥基基團(tuán)。
53.如權(quán)利要求52所述的組合物,其中Y1為羥基。
54.如權(quán)利要求52所述的組合物,其中Y1為溴。
55.如權(quán)利要求54所述的組合物,其中Y3為硝基。
56.如權(quán)利要求46所述的組合物,其中所述通式(I)化合物為通式(Ib)的化合物 其中X1、X2和X3獨(dú)立地選自氫和有機(jī)基團(tuán);以及Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫和有機(jī)基團(tuán)。
57.如權(quán)利要求46所述的組合物,其中所述通式(I)化合物為通式(Ib)的化合物 其中X1、X2和X3至少其中之一為吸電子基團(tuán);以及Y1、Y2和Y3獨(dú)立地選自氫、烷基、羥基、羧基、硝基、碳酸酯、氨基甲酸酯、烷氧基、烷基羰基及鹵素基團(tuán)。
58.如權(quán)利要求57所述的組合物,其中X1為三氟甲基基團(tuán)。
59.如權(quán)利要求57所述的組合物,其中X1為3-三氟甲基基團(tuán)。
60.如權(quán)利要求46所述組合物,其中所述的組合物不含有能檢測到的二甲基亞砜。
61.具有囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)缺陷的非人動物,其中所述的缺陷是由對所述動物給予能夠抑制CFTR離子轉(zhuǎn)運(yùn)的有效劑量的噻唑烷酮來產(chǎn)生。
62.如權(quán)利要求61所述的非人動物,其中所述的動物為哺乳動物。
63.如權(quán)利要求62所述的非人動物,其中所述的哺乳動物為非人靈長類、嚙齒類、有蹄類或鳥類。
64.如權(quán)利要求61所述的非人動物,其中所述的動物具有與囊性纖維化相似的表型。
全文摘要
本發(fā)明提供抑制囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子蛋白(CFTR)的組合物、藥物制劑及方法,其可用于CFRT介導(dǎo)疾病和病癥的研究和治療。本發(fā)明的組合物藥物制劑可包括一種或多種噻唑烷酮化合物以及可另外含有一種或多種藥物可接受載體、賦形劑和/或佐劑。本發(fā)明的方法包括,在某些實(shí)施方案中,給予患有CFTR介導(dǎo)疾病或病癥的患者有效劑量的噻唑烷酮化合物或衍生物。在其它的實(shí)施方案中,本發(fā)明提供抑制CFTR的方法,其包括利用有效劑量的噻唑烷酮化合物接觸個(gè)體細(xì)胞。本發(fā)明的特點(diǎn)還在于CFTR介導(dǎo)疾病的非人動物模型,該模型通過給予非人動物足以抑制CFTR的噻唑烷酮化合物或衍生物來產(chǎn)生。
文檔編號A61K31/549GK1684686SQ03823366
公開日2005年10月19日 申請日期2003年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月30日
發(fā)明者艾倫·韋克曼, 麻彤輝 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會
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