專利名稱：四氟芐基衍生物及含有其成分的用于治療和預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急慢性神經(jīng)變性疾病的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及四氟芐基衍生物以及將其作為藥物有效成分的藥物組合物，更具體地，涉及一種對(duì)神經(jīng)病學(xué)疾病和眼科疾病的治療和預(yù)防具有醫(yī)療效果的新型四氟芐基衍生物。
背景技術(shù)：
當(dāng)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步延長(zhǎng)了人類的生命，而由此導(dǎo)致老年急慢性神經(jīng)性疾病的上升，例如阿耳茨海默氏癥、中風(fēng)、帕金森癥等。這些神經(jīng)性疾病以疾病進(jìn)程中特定神經(jīng)元變性的不斷發(fā)展為特征。由于成熟神經(jīng)元細(xì)胞在其死亡后不能再生，在上述神經(jīng)性疾病中神經(jīng)元的死亡可能導(dǎo)致大腦基本功能(包括識(shí)別、感覺和行動(dòng)功能)的不能治愈的損傷以及由此產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的過重負(fù)擔(dān)。
在各種神經(jīng)性疾病中，興奮毒性(exicitotoxicity)、氧化應(yīng)激(oxidativestress)和細(xì)胞凋亡(apoptosis)被認(rèn)為是神經(jīng)元死亡的主要途徑，并通過各途徑特定的信號(hào)傳導(dǎo)途徑進(jìn)行傳播。
谷氨酸鹽作為有興奮性神經(jīng)遞質(zhì)通過N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)緩慢興奮突觸傳遞和通過海人藻酸(kainate)或α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)受體介導(dǎo)快速興奮突觸傳遞。神經(jīng)元在靜息狀態(tài)時(shí)，Mg2+以電位調(diào)控(voltage-dependent)方式阻塞NMDA受體通道。當(dāng)刺激(物)引起膜去極化時(shí)，Mg2+從上述NMDA通道中被釋放出來，使得該通道容許Ca2+和Na+通過。NMDA受體的活化作用在包括學(xué)習(xí)和記憶的生理過程中起著重要的作用[Siegel G.J.et al.，Basic Neurochemistry，6thedition，Lippincott Williams&Wilkins，315-333(1999)]。除了生理作用，NMDA受體的短時(shí)過度活化作用能造成迅速發(fā)展的神經(jīng)元死亡，而近20年來對(duì)NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的機(jī)理進(jìn)行了廣泛的研究。
在1969年，Olney等人報(bào)道口服monodium谷氨酸鹽造成了小鼠和猴子大腦中神經(jīng)元細(xì)胞的死亡[Olney，J.W.和Sharpe，L.G.，Science，166386-388(1969)；Olney，J.W.和Ho，O.L.，Nature，227(258)609-611(1970)]，表明谷氨酸鹽(所述興奮性神經(jīng)遞質(zhì))介導(dǎo)了癲癇中神經(jīng)元的興奮性和死亡[Olney，J.W.，Int.Rev.Neurobiol.，27337-62337-362(1985)]。通過NDMA受體的活化作用并依靠Ca2+的進(jìn)入，谷氨酸鹽的給藥可導(dǎo)致培養(yǎng)的腦皮質(zhì)神經(jīng)元的死亡[Choi，D.W.，J.Neurosci.，7(2)369-379(1987)]。谷氨酸鹽的神經(jīng)毒性(或興奮毒性)被認(rèn)為是中風(fēng)和癲癇中神經(jīng)元死亡的主要途徑[Choi.D.W.，Neuron，1623-634(1988)]。大腦血液供應(yīng)的中斷導(dǎo)致氧和葡萄糖的缺乏，致使能量(ATP)不足、依賴ATP的離子通道的功能紊亂及增加谷氨酸鹽釋放的膜去極化作用。能量缺乏也降低了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)谷氨酸鹽的攝取。因此，谷氨酸鹽在突觸間隙中不正常地累積[Choi，D.W.and Rothman，S.M.，Annu.Rev.Neurosci.，13171-182(1990)；Benveniste，H et al.，J.Neurochem.，43(5)1369-1374(1984)]。過度累積的谷氨酸鹽主要通過NMDA受體的活化作用導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。實(shí)際上，據(jù)報(bào)道給予NMDA受體拮抗劑可減少缺氧-缺血腦損傷后的神經(jīng)元死亡[Goldberg，M.P.et al.，J.Pharmac.Exp.Ther.，243784-791(1987)；Simon et al.，Science 226850-852(1984)；Sheardown，M.J.et al.，Science 247571-574(1990)]。
廣泛的證據(jù)表明興奮毒性還促成神經(jīng)變性疾病中神經(jīng)元的死亡。亨廷頓癥(HD)的關(guān)鍵病理特征包括GABAergic神經(jīng)元的變性和紋狀體(striatal)區(qū)域的NADPH含心肌黃酶的神經(jīng)元的選擇性舍棄。在紋狀體內(nèi)注射NMDA或喹啉酸(NMDA受體激動(dòng)劑)后觀察到這些HD的病理特征[Ferrante，R.J et al.，Science，230(4625)561-563(1985)；Beal，M.F.et al.，Nature，321(6066)168-171(1986)；Koh，J.Y.et al.，Science，234(4772)73-76(1986)]。肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)伴隨著上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性，其特征為神經(jīng)性萎縮、虛弱和肌束抽搐。盡管ALS的發(fā)病機(jī)理有待于解答，但人們推測(cè)興奮毒性參與了ALS過程。尤其是ALS患者表現(xiàn)出谷氨酸鹽的合成和運(yùn)輸?shù)娜毕莺图?xì)胞外谷氨酸鹽水平的升高[Rothstein，J.D.，Clin.Neurosci.，3(6)348-359(1995)；Shaw，P.J.andInce，P.G.，J.Neurol.，244 Suppl 2S3-14(1997)]。
盡管NMDA受體介導(dǎo)的興奮毒性是中風(fēng)和神經(jīng)變性疾病的成因，NDMA受體拮抗劑的治療潛力受制于在大腦中的意料不到的副反應(yīng)。尤其是NDMA受體拮抗劑的全身給藥削弱了大腦的正常功能，并可造成成年大鼠大腦的大范圍神經(jīng)元損傷[Olney et al.，Science 2441360-1362(1989)]。上述神經(jīng)精神病理學(xué)副作用是由高親和性的NMDA受體拮抗劑(如苯環(huán)己哌啶)和相關(guān)的NMDA受體拮抗劑(如MK-801(地佐環(huán)平(dizocilpine maltate)、替來他明(tiletamine)和克他命)產(chǎn)生的，且可通過給予具有低親和性和快速動(dòng)力學(xué)反應(yīng)的通道阻斷型NMDA受體拮抗劑來克服[Rogawski，Amino Acids 19133-149(2000)]。
自由基介導(dǎo)神經(jīng)性疾病及全身性組織損傷中發(fā)生的神經(jīng)元死亡[Halliwell，B.and Gutteridge，J.M.，Mol.Aspects.Med.，8(2)89-193(1985)；Siesjo，B.K.et al.，Cerebrovasc.Brain Metab.Rev.，1(3)165-211(1989)；Schapira，A.H.，Curr.Opin.Neurol.，9(4)260-264(1996)]。自由基是在缺氧-缺血或外傷性大腦及脊髓損傷后在腦的變性區(qū)域產(chǎn)生的。清除自由基的抗氧化劑或操作(maneuvers)能夠降低由缺氧-缺血或外傷性損傷造成的大腦損傷。[Flamm，E.s.et al.，Stroke，9(5)445-447(1978)；Kogure，K.et al.，Prog.Brain Res.63237-259(1985)；Chan，P.H.J.Neurotrauma.，9 Suppl 2S417-423(1992)；Faden，Pharmacol.Toxicol.7812-17(1996)]。廣泛的證據(jù)表明自由基在神經(jīng)變性疾病中大腦變性區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生自由基，其產(chǎn)生可能由于ALS中的Cu/Zn超氧化物歧化酶的點(diǎn)突變[Rosen et al.，Nature 36259-62(1993)]，還原谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的減少，帕金森癥中塞梅林氏神經(jīng)節(jié)(substatia nigra)中鐵的增加[Sofic，E.et al.，J.Neural Transm.，74199-205(1988)；Fahn，S.and Cohen，G.，Ann.Neurol.，32(6)804-812(1992)]，脂質(zhì)、核苷酸及蛋白的氧化，變性的神經(jīng)組織中鐵的增加，由患阿耳茨海默氏癥大腦中的β-淀粉狀蛋白產(chǎn)生的自由基[Schubert，D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(6)1989-1993(1995)；Richardson，J.S.et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.777362-367(1996)]，以及HD中線粒體的功能障礙[Dexter，D.T.et al.，Ann Neurol.32SupplS94-100(1992)]。因此，抗氧化劑對(duì)此類神經(jīng)變性疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用[Jenner，Pathol.Biol.(Paris.)4457-64(1996)；Beal，Ann.Neurol.38357-366(1995)]。
鋅(Zn2+)是一種過渡金屬，其在大腦中大量存在并起到動(dòng)力學(xué)作用。在細(xì)胞內(nèi)部，鋅與金屬蛋白結(jié)合控制蛋白的酶活性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。此外，鋅通過與各種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。在CNS中，鋅位于谷氨酸鹽能性(glutamatergic)神經(jīng)元的突觸終端，以活性依賴的形式被釋放，并調(diào)節(jié)各種神經(jīng)遞質(zhì)受體及離子通道的活性。
在癲癇、缺血、外傷和阿耳茨海默氏癥(AD)中觀察到Zn2+介導(dǎo)神經(jīng)變性過程。將海人藻酸(誘發(fā)癲癇的興奮毒素)進(jìn)行中樞給藥，引起Zn2+遷移進(jìn)入幾個(gè)前腦區(qū)域的后突觸變性神經(jīng)元中。在缺血性和外傷性腦病中也發(fā)現(xiàn)鋅遷移到鄰近神經(jīng)元中，對(duì)其遷移的阻塞可抑制神經(jīng)元細(xì)胞的死亡[Frederickson，C.J.and Bush，A.I.，Biometals.14353-366(2001)；Weiss et al.，Trend.Pharmacol.Sci.21395-401(2001)]。已知鋅通過Ca2+可透過的NMDA和AMPA/KA受體、電位開關(guān)的Ca2+通道或鋅運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)進(jìn)入神經(jīng)元，并通過產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)的NADPH氧化酶的活化作用來誘導(dǎo)神經(jīng)元的死亡。在AD的細(xì)胞外斑(extracellular plaque)和變性神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)Zn2+，其很可能參與AD中神經(jīng)元的變性[Suh et al.，Brain Res.852274-278(2000)；Bush et al.，Science 2651464-1467(1994)；Lee et al.，Proc.Natl.acad.Sci.U.S.A.997705-7710(2002)]。因此，已經(jīng)提出將抑制鋅的釋放和毒性作為治療和預(yù)防阿耳茨海默氏癥的新策略[Fredrickson andBush，Biometals；14353-66(2001)]。
如上所述，在神經(jīng)系統(tǒng)的各種急性和神經(jīng)變性疾病中，NMDA受體-介導(dǎo)的興奮毒性、氧化應(yīng)激和鋅參與引起神經(jīng)元的死亡。因此，需要發(fā)展阻斷每種神經(jīng)元死亡途徑的有效治療藥物來治療此類災(zāi)難性的神經(jīng)性疾病。
我們?cè)芯坎㈤_發(fā)了對(duì)興奮毒性或氧化應(yīng)激具有多重神經(jīng)保護(hù)效果的神經(jīng)保護(hù)藥物，并成功地發(fā)明了可用于治療中風(fēng)、外傷和某些神經(jīng)變性疾病的四氟芐基衍生物。
發(fā)明公開由本發(fā)明人進(jìn)行的關(guān)于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂的研究形成了本發(fā)明，研究發(fā)現(xiàn)了對(duì)神經(jīng)性疾病的細(xì)胞培養(yǎng)和生物模型中出現(xiàn)的各種形式的神經(jīng)元死亡具有神經(jīng)保護(hù)活性的新型四氟芐基衍生物。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種新型四氟芐基衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供用于治療和預(yù)防神經(jīng)性疾病和眼科疾病的藥物學(xué)上有效的組合物。
本發(fā)明的一個(gè)方面提供一種以如下化學(xué)式1表示的新型四氟芐基衍生物[化學(xué)式1] 其中，R1、R2和R3為氫或鹵素，R4為羥基、烷基、烷氧基、鹵素、鹵代烷氧基、烷酰氧基(alkanoyloxy)或硝基，及R5為羧酸、C1-C4烷基取代的羧酸酯、酰胺(carboxyamide)、磺酸、鹵素或硝基。
本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于治療和預(yù)防神經(jīng)性疾病和眼科疾病的藥物組合物，其包括所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
本發(fā)明提供一種以如下化學(xué)式1表示的新型四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽。
其中，R1、R2和R3為氫或鹵素，R4為羥基、烷基、烷氧基、鹵素、鹵代烷氧基、烷酰氧基或硝基，及R5為羧酸、C1-C4烷基取代的羧酸酯、酰胺、磺酸、鹵素或硝基。
在本文中，烷基基團(tuán)為C1-C4烷基，且優(yōu)選為C1-C2烷基。上述烷基具體包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
烷氧基基團(tuán)為C1-C4烷氧基，且優(yōu)選為C1-C2烷氧基。上述烷氧基具體包括甲氧基、乙氧基或丙氧基。
鹵素可以被氟、氯、溴或碘取代。
烷酰氧基是指C2-C10的烷酰氧基，優(yōu)選為C3-C5的烷酰氧基。上述烷酰氧基具體包括乙酰氧基(ethanoyloxy)、丙酰氧基(propanoyloxy)或環(huán)己基碳酰氧基(cyclohexanecarbonyloxy)。
在羧酸酯中的碳可以被甲基、乙基、異丙基或丁基所取代的。
化學(xué)式1中所示的化合物中特別重要的化合物如下2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-芐氨基)苯甲酸(在下文中用“2-羥基-TTBA”表示)，2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基芐氨基)苯甲酸，2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-芐氨基)-2-三氟甲基苯甲酸，2-硝基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯酚，2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯酚(在下文中用“2-氯-TTP”表示)，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酰胺(在下文中用“2-羥基-TTA”表示)，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯磺酸(在下文中用“2-羥基-TTS”表示)，
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸甲酯，2-乙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸(在下文中用“2-乙基-TTBA”表示)，2-丙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸(在下文中用“2-丙基-TTBA”表示)，或2-環(huán)己基碳酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸(在下文中用“2-環(huán)己基-TTBA”表示)。
但是，上述化合物僅是本發(fā)明的代表，本發(fā)明還可包括更多化合物。
本發(fā)明提供如化學(xué)式1所示的四氟芐基衍生物，及用于治療和預(yù)防神經(jīng)性疾病和眼科疾病的包括藥物可接受的鹽形式的上述有效成分的藥物組合物。
作為用于醫(yī)藥用途的藥物，化學(xué)式1所示的化合物的鹽是無毒的，并且是藥物可接受的?？梢詰?yīng)用各種鹽來制備藥物可接受的鹽，包括本發(fā)明的無毒化合物。
本發(fā)明化合物的藥物可接受的鹽包括堿金屬(如鋰、鈉或鉀)，和堿土金屬(如鈣或鎂)。通過將藥物可接受的無毒酸(如鹽酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)的溶液與本發(fā)明的化合物反應(yīng)制備酸加合鹽。
本發(fā)明的化學(xué)式1化合物可以用于治療腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癥狀中的常規(guī)或病理性神經(jīng)變性疾病。具體而言，上述化學(xué)式1所示的化合物用于預(yù)防和治療血栓栓塞、缺血性中風(fēng)、出血性中風(fēng)、腦血管痙攣、腦老化、外傷性腦損傷、外傷性脊髓損傷、心搏停止、動(dòng)脈低血壓(hypotention)、低血糖癥、缺氧癥和組織缺氧。此外，本發(fā)明的化學(xué)式1化合物可有效地用于緩解神經(jīng)變性疾病，如亨廷頓癥、阿耳茨海默氏癥、老年癡呆、Pick′s癥、Korsakov′s綜合癥、小腦退化癥(olivopontocerebellardegeneration)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)、帕金森癥、唐氏綜合癥、戊二酸血癥(Glutaric acidaemia)、癲癇癥、多發(fā)梗塞性癡呆(multi-infarctdementia)和腦炎。他們被用于治療眼科疾病，如青光眼、黃斑變性、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、眼色素層炎。此外，他們被用于預(yù)防和治療藥物成癮、抑郁癥和疼痛。
本發(fā)明的組合物可進(jìn)行口服給藥、靜脈內(nèi)注射或非口服給藥，并可以制成各種形式，如片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、無菌溶液、懸浮液或直腸給藥的栓劑?？梢允褂盟幬镙d體加上藥物稀釋溶液將所述組合物的主要有效成分制成固體片劑，所述載體(如常用的片劑成分)例如玉米糊精、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、脫鈣磷酸鹽(decalciumphosphate)或樹脂。應(yīng)用適當(dāng)工業(yè)領(lǐng)域中公知的涂覆方法等可將本發(fā)明中藥物組合物的片劑或丸劑制成方便給藥的緩釋形式。例如，片劑或丸劑可以由內(nèi)部給藥成分和外部給藥成分組成?？梢栽谒銎瑒┗蛲鑴┑膬?nèi)部給藥成分之外包裹外部給藥成分。本發(fā)明組合物的用于口服給藥或注射的液體形式包括溶液、適當(dāng)調(diào)節(jié)口味的糖漿、水溶性懸浮液、非水溶性懸浮液、食用油制成的乳狀液(所述食用油包括棉油、芝麻油、椰子油或花生油)、酏劑及類似藥物載體。在制造水溶性懸浮液中可以使用黃 膠、阿拉伯膠、褐藻酸鈉鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或合成或天然橡膠(如明膠)作為適當(dāng)?shù)姆稚⒒驊腋≈鷦?br> 根據(jù)各種相關(guān)因素如疾病、年齡、性別、體重和患者疾病的程度等來確定治療神經(jīng)變性的藥量。
可以通過如下反應(yīng)方案來合成本發(fā)明的四氟芐基衍生物。但是，所述方案中所示的化合物僅是本發(fā)明的代表，本發(fā)明可包括更多化合物。
所述的四氟芐基衍生物由下列反應(yīng)合成。首先，將3位和4位氫分別被R5和R4所取代的硝基苯化合物在3大氣壓下氫化12小時(shí)(反應(yīng)條件a)。所生成的苯胺化合物與2，3，5，6-四氟-4-甲基芐基溴，在DMF中在三乙胺存在的條件下反應(yīng)12小時(shí)，獲得目標(biāo)物四氟芐基衍生物(反應(yīng)條件b)。
在上述方案中，R1、R2和R3表示氫或鹵素；R4表示羥基、烷基、烷氧基、鹵素、鹵代烷氧基、烷酰氧基、硝基；R5表示羧酸、羧酸酯、酰氨、磺酸、鹵素和硝基基團(tuán)。
為合成R4為羥基，且R5為酰胺基的化合物，首先通過在催化量的c-H2SO4存在下與三氟甲基乙酸酐反應(yīng)將5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟芐氨基)苯甲酸上的羥基和胺基用三氟取代基保護(hù)起來(反應(yīng)條件a)。然后，將所生成的2-羧基-5-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-芐基]-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基酯化合物與SOCl2反應(yīng)，其后與碳酸銨反應(yīng)獲得2-氨基甲?；?4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-芐基-(2，2，2-三氟乙?；?氨基]苯基酯化合物(反應(yīng)條件b)，然后將其用HCl溶液水解獲得目標(biāo)酰胺化合物(反應(yīng)條件c)。在此方案中，R1、R2、R3和R4是相同基團(tuán)，其為上文所定義的，而R5為C1-C4取代的烷基基團(tuán)。
<合成實(shí)施例1>
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸(2-羥基-TTBA)的制備在室溫和氮?dú)猸h(huán)境下，將5-氨基水楊酸(1.02g，6.66mmole，購自Aldrich Chemical Company，USA，A7，980-9)和三乙胺(1ml)溶于干燥的DMF(80ml)中，向溶液中加入2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(1.23g，7.18mmole)(Aldrich，40，640-6)。將反應(yīng)混合物在室溫條件下攪拌2小時(shí)，然后在真空下除去溶劑。用乙酸乙酯將反應(yīng)混合物稀釋，然后用乙酸乙酯萃取反應(yīng)混合物。有機(jī)層用水和鹽水洗滌，其后用無水MgSO4干燥。蒸出溶劑后，殘余物在醚/正己烷(1∶10)中重結(jié)晶，獲得白色固體物質(zhì)2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸1.60g(收率64％)。
mp 179℃，1H-NMR8.0(s，1H)，7.3(d，1H)，6.7(t，1H)，5.5(s，2H)，IR(KBr壓片)3386，1741，1500cm-1，C15H8F7NO3的元素分析

<合成實(shí)施例2>
2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，使用5-氨基-2-硝基苯甲酸(1.03g，5.65mmole)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(1.01g，6.04mmole)(ACROS，33074-0010)，獲得淺黃色固體2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸1.50g(收率76.3％)。
mp 121℃，1H-NMR8.0(d，1H)，7.3(s，1H)，6.7(d，1H)，5.5(s，2H)，IR(KBr壓片)3417，1703，1504cm-1，C15H7F7N2O4的元素分析

<合成實(shí)施例3>
2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，使用5-氨基-2-氯苯甲酸(1.02g，5.94mmole)(ACROS，32525-5000)，DMF(50ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(1.16g，6.99mmole)，獲得淡棕色固體2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸2.04g(收率85.5％)。
mp 58℃，1H-NMR7.26(d，1H)，7.24(s，1H)，6.7(d，1H)，4.12(s，2H)，IR(KBr壓片)3402，1720，1494，1434，929cm-1，HPLC(0.01％TFA-乙酸乙酯(TFA-ethyl acetate)∶0.1％TFA-水＝80∶20，Rt＝4.2分)97％純度，C15H7ClF7NO4的元素分析

<合成實(shí)施例3>
2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備(4-1)5-氨基-2-溴苯甲酸的制備將溶于甲醇中的2-溴-5-硝基苯甲酸(1.10g，4.06mmol)(Aldrich，38，184-5)和活化的Pd-C(43.62mg，0.41mmol)(Aldrich，20，569-9)混合物在30psi的氫氣壓力下氫化4小時(shí)?；旌衔镞^濾后，將濾液濃縮獲得淺黃色固體5-氨基-2-溴苯甲酸0.80g(收率91.2％)。
IR(KBr壓片)3111，2558，2499，1716，1676cm-1。
(4-2)2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，通過使用由合成實(shí)施例(4-1)制備的5-氨基-2-溴苯甲酸(1.05g，6.12mmole)、DMF(50ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(1.16g，6.99mmole)，獲得淺黃色固體2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸2.02g(收率76.9％)。
mp 70℃，1H-NMR7.42(d，1H)，7.3(s，1H)，6.9(d，1H)，5.5(s，2H)，IR(KBr壓片)3438，1695，1491，1425，939cm-1，HPLC(0.1％TFA-乙酸乙酯∶0.1％TFA-水＝80∶20，Rt＝4.5分)99％純度，C15H7BrF7NO2的元素分析

<合成實(shí)施例5>
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基芐氨基)苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，通過使用4-甲基-2，3，5，6-四氟-芐基溴(1.23g，7.18mmole)(Aldrich，40，646-6)代替2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴，獲得白色固體2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基芐氨基)苯甲酸1.60g(收率64.0％)。
mp 212℃，1H-NMR8.0(s，1H)，7.3(d，1H)，6.7(t，1H)，5.5(s，2H)，2.2-2.3(s，3H)，IR(KBr壓片)3386，1741，1500cm-1，C15H11F4NO3的元素分析

<合成實(shí)施例6>
2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備(6-1)2-甲基-5-硝基苯甲酸的制備在0℃下，向溶有2-甲基苯甲酸(3.05g，22.3mmole)(ACROS，13904-0010)的c-HNO3(20ml)中小心加入濃H2SO4(15ml)。所得溶液在100-120℃回流5小時(shí)。待反應(yīng)混合物冷卻至室溫，加入50ml碎冰。將所得沉淀過濾，水洗并干燥，獲得3.90g(收率97.5％)2-甲基-5-硝基苯甲酸白色固體。
IR(KBr壓片)1531，1350cm-1。
(6-2)5-氨基-2-甲基苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例(4-1)相似的步驟，通過使用由合成實(shí)施例(6-1)制備的2-甲基-5-硝基苯甲酸(4.10g，22.6mmole)，獲得2.01g(收率60.0％)5-氨基-2-甲基苯甲酸白色固體。
IR(KBr壓片)3437，3336，1633，1400cm-1。
(6-3)2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，通過使用5-氨基-2-甲基苯甲酸(2.06g，15.0mmole)、DMF(60ml)、TEA(4ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(5.52ml，17.7mmole)，獲得1.50g(收率27.0％)2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸黃色固體。
mp 84℃，1H-NMR7.32(s，1H)，7.3(d，1H)，6.9(d，1H)，5.5(s，2H)，2.2(s，3H)，IR(KBr壓片)3417，1716，1496cm-1，C16H10F7NO2的元素分析

<合成實(shí)施例7>
2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備
(7-1)2-甲氧基-5-硝基苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例(6-1)相似的步驟，通過使用2-甲氧基苯甲酸(2.10g，13.79mmole)(ACROS，17375-2000)，獲得2.50g(收率97.0％)2-甲氧基-5-硝基苯甲酸白色固體。
IR(KBr壓片)3099，2986，2965，1736，1547cm-1。
(7-2)5-氨基-2-甲氧基苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例(4-1)類似的步驟，通過使用由合成實(shí)施例(7-1)制備的2-甲氧基-5-硝基苯甲酸(4.10g，22.6mmole)，獲得1.90g(收率98.0％)5-氨基-2-甲氧基苯甲酸棕色固體。
IR(KBr壓片)1394，1220cm-1。
(7-3)2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，通過使用5-氨基-2-甲氧基苯甲酸(2.10g，12.7mmole)、DMF(50mL)、TEA(6ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(2.00ml，14.0mmole)，得到1.50g(收率31.5％)2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸黃色固體。
mp 94℃，1H-NMR 7.42(s，1H)，6.4(d，1H)，6.2(d，1H)，5.5(s，2H)，3.73(s，3H)，IR(KBr壓片)3429，1730，1496cm-1。
C16H10F7NO3的元素分析

<合成實(shí)施例8>
5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)-2-三氟甲氧基苯甲酸的制備(8-1)5-硝基-2-三氟甲氧基苯甲酸的制備表2

-4-三氟甲基芐氨基)苯酚微紅色固體。
mp 126-128℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ4.23(d，2H)，6.93(m，2H)，7.12(s，1H)，13C NMR(DMSO-D6)δ36.36，105.48，120.63，122.64，123.32，136.17，140.86，142.34，144.06，144.83，146.44，151.23，IR(純的)3391，3255，1545，1339cm-1，C14H7F7N2O3的元素分析

<合成實(shí)施例10>
2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯酚的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，通過使用4-氨基-2-氯苯酚(3.00g，19.6mmole)、DMF(80ml)、TEA(0.5ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(1.40g，8.36mmole)，獲得2.00g(收率76.0％)的2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯酚黃色固體。
mp 52℃，1H-NMR(CDCl3)6.9(d，1H)，6.7(s，1H)，6.5(d，1H)，4.4(s，2H)，IR(KBr壓片)3382，1687，1617，1586cm-1，C14H7F7ClNO的元素分析

<合成實(shí)施例11>
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酰胺的制備
(11-1)2-羧基-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-芐基]-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基三氟乙酸酯的制備在10℃和氮?dú)猸h(huán)境下，向2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸(2.00g，5.12mmole)和三氟乙酸酐(15ml)溶液中加入C-H2SO4(0.50ml)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌20分鐘，然后用冰(10g)冷卻。真空除溶劑后，將殘余物溶于乙酸乙酯(50ml)中。有機(jī)層用下列物質(zhì)洗滌，水(20ml×2)、10％NaHCO3(20ml×3)、0.5N HCl(20ml×2)和水(20ml)。該有機(jī)層用無水Na2SO4干燥。蒸出溶劑后，殘余物在乙酸乙酯/己烷(1∶10)中重結(jié)晶，獲得1.40g(收率47％)的2-羧基-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-芐基]-(2，2，2-三氟乙?；?氨基]苯基三氟乙酸酯黃色固體。
mp 174-180℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ5.16(d，2H)，6.94(d，1H)，7.44(d，1H)，7.81(s，1H)，13C-NMR(DMSO-d6)δ43.03，113.2，114.3，117.2，117.8，118.9，128.7，130.2，135.5，141.8，143.8，144.3，146.2，146.3，155.2，155.5，161.6，170.5，IR(純的)1711，1673，1498，1331，724cm-1。
(11-2)2-氨基甲酰-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基三氟乙酸酯的制備在40℃和氮?dú)猸h(huán)境下，向2-羧基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基)苯基三氟乙酸酯(600mg，1.05mmole)的無水二氯甲烷(15ml)溶液中加入SOCl2(1.18ml，21.0mmole)。反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)后，真空除去溶劑。所得殘余物用無水二氯甲烷(60ml)溶解，并加入碳酸銨(分析含量＞30％，2.00g)。反應(yīng)混合物攪拌1小時(shí)后，過濾除去剩余的碳酸銨。有機(jī)層水洗(40ml×3)，然后用無水Na2SO4干燥。蒸出溶劑后，殘余物在二氯甲烷/己烷(1∶10)中重結(jié)晶，獲得370mg(收率61％)的2-氨基甲酰-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基-(2，2，2-三氟乙?；?氨基]苯基三氟乙酸酯白色固體。
mp 179-180℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ5.05(d，2H)，6.91(d，1H)，7.20(d，1H)，7.62(s，1H)，13C NMR(DMSO-d6)δ42.31，114.05，114.39，117.25，118.28，118.60，127.47，128.43，134.14，141.66，143.72，144.20，146.26，155.48，161.19，170.32，IR(純的)3415，3202，1692，1673，1498，1331cm-1。
(11-3)2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酰胺的制備在40℃和氮?dú)猸h(huán)境下，向溶于甲醇(8ml)和水(3ml)的2-氨基甲酰-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基-(2，2，2-三氟乙酰基)氨基]苯基三氟乙酸酯(300mg，0.52mmole)溶液中加入c-HCl(2.0ml)。將反應(yīng)混合物攪拌24小時(shí)后，真空除去有機(jī)溶劑。殘余物用乙酸乙酯(20ml×3)萃取。有機(jī)層用水洗，其后用無水Na2SO4干燥。蒸出溶劑后，殘余物在二氯甲烷/己烷中重結(jié)晶，獲得120mg(收率60％)的2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酰胺白色固體。
mp 143-145℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ4.37(s，2H)，6.63(d，LH)，6.76(d，1H)，7.14(s，1H)，13C NMR(DMSO-d6)6 36.25，111.20，112.36，117.44，121.71，123.29，123.46，139.87，141.61，143.55，145.86，146.07，153.12，171.56，IR(純的)3453，3415，3202，1692，1673，735cm-1。
<合成實(shí)施例12>
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯磺酸的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，通過使用4-氨基-2-羥基苯磺酸(1.00g，5.30mmole)、DMF(10ml)、TEA(1.0ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(0.88g，5.30mmole)，獲得0.61g(收率28.0％)的2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯磺酸黃色固體。
mp約300℃，1H-NMR(DMSO-D6)δ4.28(s，2H)，5.58(m，2H)，6.82(s，1H)，13C NMR(DMSO-D6)δ32.08，106.41，111.39，112.10，119.15，119.33，119.51，126.11，135.09，137.17，139.17，139.70，139.89，140.40，140.59，141.61，IR(純的)3427，3227，1492，1331，1196，1135，628cm-1。
<合成實(shí)施例13>
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸甲酯的制備(13-1)5-氨基-2-羥基苯甲酸甲酯的制備在0℃條件下，向5-氨基水楊酸(3.00g，19.6mmole)的甲醇(80ml)溶液中加入c-H2SO4(8ml)。將反應(yīng)混合物回流6小時(shí)后，真空除去溶劑。所得殘余物用乙酸乙酯和水分層。有機(jī)層用水洗滌(40ml×3)，并用無水MgSO4干燥。蒸出溶劑后，將殘余物在乙酸乙酯/己烷中重結(jié)晶，獲得2.50g(收率76％)的5-氨基-2-羥基苯甲酸甲酯的黃色固體。
1H-NMR(CDCl3)δ7.2(s，1H)，6.7(d，1H)，6.6(d，1H)，IR(KBr壓片)3406，3327，2950，1672，1616，1492，1440，788cm-1。
(13-2)2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸甲酯的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，通過使用5-氨基-2-羥基苯甲酸甲酯(2.00g，11.9mmole)、DMF(60ml)、TEA(0.5ml)和2，3，5，6-四氟-4-甲基芐基溴(2.60g，14.3mmole)，獲得3.20g(收率85.0％)的2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸甲酯淺黃色固體。
mp127℃，1H-NMR(CDCl3)δ7.15(s，1H)，6.9(d，1H)，6.7(d，1H)，4.5(s，2H)，3.9(s，3H)，IR(KBr壓片)3382，1687，1617，1586cm-1，C16H10F7NO3的元素分析

<合成實(shí)施例14>
2-乙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備(14-1)5-叔丁氧基羰基氨基-2-羥基苯甲酸的制備室溫下，將溶于DMF(20.0ml)的5-氨基水楊酸(1.01g，6.59mmole)、Di-BOC(2.87g，13.1mmol)和TEA(1.0ml)的混合物攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物濃縮后，殘余物溶于乙酸乙酯。將有機(jī)層水洗并用無水Na2SO4干燥。在蒸出溶劑后，將殘余物在乙酸乙酯/己烷中重結(jié)晶，獲得1.42g(收率84％)的5-叔丁氧基羰基氨基-2-羥基苯甲酸白色固體。
mp282℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，1.4～1.6(s，9H)，13C NMR(DMSO-d6)δ171.93，156.50，152.97，131.06，126.36，119.39，117.03，113.13，79.05，28.42。
(14-2)2-乙酰氧基-5-叔丁氧基羰基氨基苯甲酸的制備向溶有5-叔丁氧基羰基氨基-2-羥基苯甲酸(1.02g，4.02mmole)的DMF(20.0ml)溶液中加入乙酰氯(39mg，4.83mmole)和碳酸鉀(555mg，4.02mmole)。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌4小時(shí)。反應(yīng)混合物濃縮后，將殘余物溶于乙酸乙酯中。有機(jī)層用水和鹽水洗滌，并用無水Na2SO4干燥。蒸出溶劑后，殘余物在乙酸乙酯/己烷中重結(jié)晶，獲得0.62g(收率52％)的2-乙酰氧基-5-叔丁氧基羰基氨基苯甲酸白色固體。
mp76-78℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，2.0～2.1(s，3H)，1.4～1.6(s，9H)，13C NMR(DMSO-d6)δ171.88，165.59，156.49，144.71，131.27，124.06，79.64，28.441，21.13。
(14-3)2-乙酰氧基-5-氨基苯甲酸的制備將2-乙酰氧基-5-叔丁氧基羰基氨基苯甲酸(1.01g，3.42mmole)溶于TFA/CH2Cl2(20.0ml.1∶1v/v)中，在室溫下將混合物攪拌30分。混合物濃縮后，將殘余物溶于乙醚中。將剩余的殘?jiān)谝宜嵋阴?己烷中重結(jié)晶，獲得0.65g(收率97％)的2-乙酰氧基-5-氨基苯甲酸白色固體。
mp133-136℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.5～7.6(s，1H)，7.2～7.3(d，1H)，7.0～7.1(d，1H)，2.1～2.2(s，3H)，13C NMR(DMSO-d6)δ170.83，165.57，143.40，124.41，123.45，121.09，118.64，113.98，30.98。
(14-4)2-乙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例1相似的步驟，通過使用由合成實(shí)施例(14-3)制備的2-乙酰氧基-5-氨基苯甲酸(0.81g，4.10mmole)、DMF(15ml)、TEA(0.1ml)、四丁基碘化銨(5mg)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(1.02ml，6.15mmole)，獲得0.92g(收率53.0％)的2-乙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸白色固體。
mp185-187℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ21.6(s，3H)，4.46(s，2H)，6.82(d，1H)，6.88(d，1H)，7.17(s，1H)，13C NMR(DMSO-d6)δ21.64，3637，114.36，116.97，123.94，127.78，124.81，141.40，142.44，144.44，145.04，145.84，146.85，166.35，170.18，IR(KBr壓片)3410，1747，1705，1489cm-1，C17H10F7NO4的元素分析

<合成實(shí)施例15>
2-丙酰氧基-5-(2、3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備
(15-1)5-叔丁氧基羰基氨基-2-丙酰氧基苯甲酸的制備依照與合成實(shí)施例(14-2)相似的步驟，通過使用丙酰氯(446mg，4.82mmole)，獲得0.71g(收率57.0％)的5-叔丁氧基羰基氨基-2-丙酰氧基苯甲酸白色固體。
mp137-142℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，2.5～2.6(t，2H)，1.4～1.6(s，9H)，1.0～1.2(q，3H)，13C NMR(DMSO-d6)δ172.689，165.598，152.804，144.674，137.287，124.045，79.618，28.358，27.259，9.080。
(15-2)5-氨基-2-丙酰氧基苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例(14-3)相似的步驟，通過使用5-叔丁氧基羰基氨基-2-丙酰氧基苯甲酸(1.01mg，3.26mmole)，獲得0.67g(收率97.0％)的5-氨基-2-丙酰氧基苯甲酸白色固體。
mp213-220℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.5～7.6(s，1H)，7.2～7.3(d，1H)，7.0～7.1(d，1H)，2.4～2.6(t，2H)，1.0～1.2(q，3H)，13C NMR(DMSO-d6)δ172.78，165.35，145.54，137.100，124.90，124.76，124.23，121.72，27.32，9.10。
(15-3)2-丙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例(14-4)相似的步驟，通過使用由實(shí)施例(15-2)中制備的5-氨基-2-丙酰氧基苯甲酸(0.32g，1.53mmole)、DMF(10ml)、TEA(0.05ml)、四丁基碘化銨(3mg)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(0.38ml，2.30mmole)，獲得0.34g(收率51.0％)的2-丙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸白色固體。
mp188-191℃，1H-NMR(丙酮-d6)δ1.17(t，3H)，2.06(q，2H)，4.67(s，2H)，6.94(m，2H)，7.37(s，1H)，
13C NMR(丙酮-d6)δ8.65，27.41，36.34，114.76，117.27，123.57，124.16，124.59，141.56，142.44，145.29，145.31，165.29，172.77，IR(KBr壓片)3414，1745，1702，1491cm-1，C18H18F7NO4的元素分析

<合成實(shí)施例16>
2-環(huán)己基碳酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備(16-1)5-叔丁氧基羰基氨基-2-環(huán)己基碳酰氧基苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例(14-2)相似的步驟，通過使用環(huán)己基碳酰氯(707mg，4.82mmole)，獲得0.72g(收率49.0％)的5-叔丁氧基羰基氨基-2-環(huán)己基碳酰氧基苯甲酸白色固體。
mp68-74℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，2.4～2.6(t，1H)，1.0～2.0(m，19H)。
(16-2)5-氨基-2-環(huán)己基碳酰氧基苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例(14-3)相似的步驟，通過使用5-叔丁氧基羰基氨基-2-環(huán)己基碳酰氧基苯甲酸(1.01mg，2.78mmole)，獲得0.70g(收率96.0％)的5-氨基-2-環(huán)己基碳酰氧基苯甲酸白色固體。
mp116-121℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.5～7.6(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.9～7.0(d，1H)，2.4～2.6(t，1H)，1.0～2.0(m，10H)，13C NMR(DMSO-d6)173.87，170.74，165.60，160.09，158.61，158.27，143.14，140.71，130.03，124.66，123.44，121.70，119.12，118.61，113.81，42.42，31.25，28.94，25.65，22.38，14.29。
(16-3)2-環(huán)己基碳酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸的制備按照與合成實(shí)施例(14-4)相似的步驟，通過使用由合成實(shí)施例(16-2)制備的5-氨基-2-環(huán)己基碳酰氧基苯甲酸(1.03g，3.95mmole)、DMF(15ml)、TEA(0.10ml)、四丁基碘化銨(10mg)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐基溴(1.01ml，5.92mmole)，獲得0.95g(收率49.0％)的2-環(huán)己基碳酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸白色固體。
mp190-193℃，1H-NMR(丙酮-d6)δ1.20～1.57(m，6H)，1.64～1.81(m，4H)，2.53(m，1H)，4.67(s，2H)，6.90(d，1H)，6.96(d，1H)，7.36(s，1H)，13C NMR(丙酮-d6)δ25.57，26.07，36.23，43.13，114.67，117.21，122.21，122.36，124.45，124.56，142.32，142.74，144.21，145.24，146.82，165.29，173.96，IR(KBr壓片)3402，1724，1707，1491cm-1，C22H18F7NO4的元素分析

附圖的簡(jiǎn)要說明通過下面結(jié)合附圖的詳細(xì)說明，可以更清楚地理解本發(fā)明的上述及其它目的、特征及其它優(yōu)點(diǎn)，其中

圖1a.2-羥基-TTBA對(duì)NMDA-誘導(dǎo)的興奮毒性的作用將小鼠皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV 12-14)暴露于300μM NMDA中10分鐘，單獨(dú)地或含有3-300μM的2-羥基-TTBA。24小時(shí)后，通過測(cè)量釋放到浸泡介質(zhì)中的LDH的水平來分析神經(jīng)元的死亡狀況(平均數(shù)±SEM(每種條件n＝9-12個(gè)培養(yǎng)孔)，調(diào)節(jié)LDH的平均流出值，假清洗24小時(shí)后(＝0)，以及持續(xù)暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA(方差分析)和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖1b.2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環(huán)己基-TTBA對(duì)NMDA-誘導(dǎo)的興奮毒性的作用。
將小鼠皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV 12-14)暴露于300μM NMDA中10分鐘，單獨(dú)地(□)或含有3-300μM的2-羥基-TTS(●)、2-羥基-TTA(○)、2-乙基-TTBA()、2-丙基-TTBA()或2-環(huán)己基-TTBA(■)。24小時(shí)后，通過測(cè)量釋放到浸泡介質(zhì)中的LDH的水平來分析神經(jīng)元的死亡狀況(平均數(shù)±SEM(每種條件n＝9-12個(gè)培養(yǎng)孔)，調(diào)節(jié)LDH的平均流出值，假清洗24小時(shí)后(＝0)，以及持續(xù)暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖2a.2-羥基-TTBA阻斷NMDA進(jìn)程對(duì)處于-60mV的皮質(zhì)神經(jīng)元使用300μM NMDA可引起通常的NMDA-誘導(dǎo)的內(nèi)向進(jìn)程(NMDA進(jìn)程)。連續(xù)使用各種濃度的2-羥基-TTBA能以濃度依賴的方式(n＝8)降低由300μM NMDA引起的響應(yīng)。圖上顯示了2-羥基-TTBA對(duì)NMDA進(jìn)程的劑量響應(yīng)關(guān)系；其IC50值接近35μM，且希爾系數(shù)(Hill coefficient)為0.91。
圖2b.用2-羥基-TTBA預(yù)處理不影響NMDA進(jìn)程。
將皮質(zhì)神經(jīng)元用100μM 2-羥基-TTBA處理，徹底洗滌，其后應(yīng)用300μM NMDA。用2-羥基-TTBA預(yù)處理不影響NMDA-誘導(dǎo)的內(nèi)向進(jìn)程(inward currents)，表明只有當(dāng)受體被激動(dòng)劑(n＝6)活化時(shí)2-羥基-TTBA才發(fā)揮其阻斷作用。
圖3a.2-羥基-TTBA對(duì)FeCl2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用。
將小鼠皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV 12-14)持續(xù)暴露于50μM Fe2+，單獨(dú)地或含有0.1-100μM的2-羥基-TTBA(●)或trolox(維生素E的具有膜透過性的形式)(○)。24小時(shí)后，通過測(cè)量釋放到浸泡介質(zhì)中的LDH的水平來分析神經(jīng)元的死亡狀況(平均數(shù)±SEM(每種條件n＝9-12個(gè)培養(yǎng)孔)，調(diào)節(jié)LDH的平均流出值，假清洗24小時(shí)后(＝0)，以及持續(xù)暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖3b.2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環(huán)己基-TTBA對(duì)FeCl2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用。
將小鼠皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV 12-14)持續(xù)暴露于50μM Fe2+，單獨(dú)的(◆)或含有1-30μM的2-羥基-TTS(●)、2-羥基-TTA(○)、2-氯-TTP()、2-乙基-TTBA()、2-丙基-TTBA(■)或2-環(huán)己基-TTBA(□)之中。24小時(shí)后通過測(cè)量釋放到浸泡介質(zhì)中的LDH的水平來分析神經(jīng)元的死亡狀況(平均數(shù)±SEM(每種條件n＝9-12個(gè)培養(yǎng)孔)，調(diào)節(jié)LDH的平均流出值，假清洗24小時(shí)后(＝0)，以及持續(xù)暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖4.2-羥基-TTBA對(duì)SNP-誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用。
將小鼠皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV 12-14)持續(xù)暴露于5μM硝普鈉(SNP)，單獨(dú)地(●)或含有0.1-10mM的阿司匹林(○)、1-100μM的trolox()或0.1-10μM的2-羥基-TTBA()。24小時(shí)后，通過測(cè)量釋放到浸泡介質(zhì)中的LDH的水平來分析神經(jīng)元的死亡狀況(平均數(shù)±SEM(每種條件n＝9-12個(gè)培養(yǎng)孔)，調(diào)節(jié)LDH的平均流出值，假清洗24小時(shí)后(＝0)，以及持續(xù)暴露于500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖5.2-羥基-TTBA對(duì)鋅毒性的作用。
將小鼠皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV 12-14)暴露于300μM Zn2+，單獨(dú)地或含有3-300μM的2-羥基-TTBA之中30分鐘。24小時(shí)后，通過測(cè)量釋放到浸泡介質(zhì)中的LDH的水平來分析神經(jīng)元的死亡狀況(平均數(shù)±SEM(每種條件n＝9-12個(gè)培養(yǎng)孔)，調(diào)節(jié)LDH的平均流出值，假清洗24小時(shí)后(＝0)，以及持續(xù)暴露于500μM NMDA(＝100))。
圖6a.2-羥基-TTBA的自由基清除活性將2-羥基-TTBA(●)或trolox(○)與溶于乙醇中的100μM 1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazil)(DPPH，一種穩(wěn)定的自由基)反應(yīng)10分鐘。通過測(cè)定在517nm處DPPH水平的下降來確定其自由基清除活性。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖6b.2-羥基-TTS、2-羥基-TTA或2-氯-TTP的DPPH分析。
將2-羥基-TTS(●)、2-羥基-TTA(○)、2-氯-TTP()或?qū)φ战M()與100μM溶于乙醇中的DPPH反應(yīng)。通過測(cè)定在517nm處DPPH水平的下降來確定自由基清除活性。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖7a.2-羥基-TTBA降低ALS動(dòng)物模型的脊髓神經(jīng)元的死亡。
對(duì)過表達(dá)變異型SOD1-G93A的肌萎縮性脊髓神經(jīng)側(cè)索硬化(ALS)小鼠從兩個(gè)月時(shí)開始給予媒介物(A)或2-羥基-TTBA(B，10mg/kg/天通過飲水)8周，其由曙紅染色的脊髓切片的明亮背景的顯微照片。
圖7b.2-羥基-TTBA降低ALS動(dòng)物模型的脊髓神經(jīng)元的死亡。
對(duì)使用媒介物(對(duì)照組)或2-羥基-TTBA處理的ALS小鼠脊髓的(灰質(zhì))背角和(灰質(zhì))腹角用曙紅染色，通過對(duì)其存活的神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)(平均數(shù)±S.E.M(每種條件n＝5只動(dòng)物))來分析圖7a.中的變性神經(jīng)元。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用獨(dú)立t-測(cè)試(independent t-test)p＜0.05。
圖8a.2-羥基-TTBA腹膜內(nèi)給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動(dòng)脈和兩條頸總動(dòng)脈對(duì)成年大鼠造成暫時(shí)腦缺血60分鐘，在再灌注(reperfusion)后5分鐘、30分鐘或1小時(shí)腹腔內(nèi)注射媒介物或50 mg/kg 2-羥基-TTBA。在用2％的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride)(TTC)對(duì)腦部切片染色24小時(shí)后分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝8-11只大鼠)。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖8b.2-羥基-TTBA腹膜內(nèi)給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動(dòng)脈和兩條頸總動(dòng)脈對(duì)成年大鼠造成暫時(shí)腦缺血60分鐘，在再灌注后5分鐘腹腔內(nèi)注射媒介物(對(duì)照組)或50mg/kg或100mg/kg 2-羥基-TTBA。在用2％的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)對(duì)腦部切片染色24小時(shí)后分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝7-8只大鼠)。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖8c.2-羥基-TTBA靜脈內(nèi)注射給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動(dòng)脈和兩條頸總動(dòng)脈對(duì)成年大鼠造成暫時(shí)腦缺血60分鐘，在閉塞后30分鐘或再灌注后5分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)或4小時(shí)靜脈內(nèi)注射媒介物(對(duì)照組)或5mg/kg 2-羥基-TTBA。24小時(shí)后分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝8-11只大鼠)。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖8d.2-羥基-TTBA靜脈內(nèi)注射給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動(dòng)脈和兩條頸總動(dòng)脈對(duì)成年大鼠造成暫時(shí)腦缺血60分鐘，在再灌注后5分鐘靜脈內(nèi)注射媒介物(對(duì)照組)或1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或20mg/kg的2-羥基-TTBA。24小時(shí)后分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝8-10只大鼠)。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖8e.2-羥基-TTBA口服給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動(dòng)脈和兩條頸總動(dòng)脈對(duì)成年大鼠造成暫時(shí)腦缺血60分鐘，在再灌注后5分鐘口服給予媒介物(對(duì)照組)或10mg/kg或20mg/kg的2-羥基-TTBA。24小時(shí)后分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝8-10只大鼠)。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖9a.在全腦缺血后恢復(fù)流通72小時(shí)時(shí)2-羥基-TTBA對(duì)線粒體ROS形成的作用。
在外科失血前24小時(shí)將染色體示蹤劑(Mitotracker)CM-H2X ROS注射入大鼠側(cè)腦室，其后動(dòng)物接受10分鐘的短暫前腦缺血，在再灌注后5分鐘腹膜內(nèi)注射媒介物(對(duì)照組)或2-羥基-TTBA(50mg/kg)。2小時(shí)后分析線粒體ROS水平，平均值±S.E.M.(在每種條件下，從海馬結(jié)構(gòu)(hippocampal formation)的CA1部分隨機(jī)選取n＝50-70個(gè)神經(jīng)元)。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用獨(dú)立t-測(cè)試p＜0.05。
圖9b.在全腦缺血后恢復(fù)流通72小時(shí)時(shí)2-羥基-TTBA預(yù)防CA1部分的神經(jīng)元死亡。
成年大鼠經(jīng)受10分鐘的短暫全腦缺血，在再灌注后5分鐘腹膜內(nèi)注射媒介物(對(duì)照組)或2-羥基-TTBA(50mg/kg)。三天后通過對(duì)甲酚紫染色的存活神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)來分析CA1中變性的神經(jīng)元數(shù)量(平均值±S.E.M)。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用獨(dú)立t-測(cè)試p＜0.05。
圖10a.2-羥基-TTBA降低MPTP注射三天后塞梅林氏神經(jīng)節(jié)中多巴胺能神經(jīng)元的死亡。
明亮背景的顯微照片顯示，C57/BL6小鼠的假手術(shù)對(duì)照組(A)或每天單次注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP，40mg/kg，SC)(單獨(dú)地(B)，或在MPTP給藥之前腹腔內(nèi)注射(每天兩次)2-羥基-TTBA(C，25mg/kg；D，50mg/kg))三天后用抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體進(jìn)行免疫染色(immunostained)的塞梅林氏神經(jīng)節(jié)中多巴胺能神經(jīng)元。
圖10b.2-羥基-TTBA降低MPTP注射三天后塞梅林氏神經(jīng)節(jié)中多巴胺能神經(jīng)元的死亡。
在如上文所述每天單次注射(MPTP，40mg/kg，SC)(單獨(dú)地或結(jié)合使用2-羥基-TTBA進(jìn)行預(yù)處理)三天后在塞梅林氏神經(jīng)節(jié)切片中TH-陽性的多巴胺能神經(jīng)元的量。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
圖10c.2-羥基-TTBA降低MPTP注射七天后塞梅林氏神經(jīng)節(jié)中多巴胺能神經(jīng)元的死亡。
明亮背景的顯微照片顯示，C57/BL6小鼠的假手術(shù)對(duì)照組(A)或每天單次注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP，40mg/kg，SC)(單獨(dú)地(B)或在MPTP給藥之前腹腔內(nèi)注射(每天兩次)2-羥基-TTBA(C，25mg/kg；D，50mg/kg))七天后用抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體免疫染色的塞梅林氏神經(jīng)節(jié)中的多巴胺能神經(jīng)元。
圖11.2-羥基-TTBA防止外傷性損傷后脊髓的(灰質(zhì))背角神經(jīng)元中線粒體ROS的產(chǎn)生。
成年大鼠在脊髓T8節(jié)段上受到壓迫性外傷(單獨(dú)(對(duì)照組)或在損傷后立即注射2-羥基-TTBA(50mg/kg，ip)和染色體示蹤劑CM-H2X ROS)。動(dòng)物在兩天后安樂死，脊髓切片用NeuN抗體(神經(jīng)元標(biāo)記蛋白)進(jìn)行免疫染色，通過檢測(cè)氧化的染色體示蹤劑CM-H2X的熒光強(qiáng)度來分析背角神經(jīng)元(DHN)中線粒體ROS的水平，平均值±S.E.M.[每種條件下的大鼠n＝12(每只大鼠5個(gè)脊髓切片)]。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，5使用獨(dú)立-t測(cè)試p＜0.05。
通過使用2-羥基-TTBA、2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA和2-環(huán)己基-TTBA的實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了如下具體描述，上述化合物的制備如合成實(shí)施例中所述。
但下面所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明代表，其還可包括更多的實(shí)施例。
<實(shí)施例1>
神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的混合皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物為進(jìn)行混合神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)，從14-16天的乳鼠(E14-16)的大腦中分離出小鼠大腦皮質(zhì)，輕輕粉碎并接種在用100μg/ml聚-D-賴氨酸和4μg/ml昆布氨酸預(yù)涂覆的24孔涂板上(2×105細(xì)胞/板)。將培養(yǎng)物保持在37℃、潮濕的、5％CO2氣體環(huán)境中。平面培養(yǎng)基包括添加有5％馬血清、5％胎牛血清、26.5mM碳酸氫鹽、2mM谷氨酸鹽和21mM葡萄糖的Eagles最低必需培養(yǎng)基(MEM，Earles鹽，未供給谷氨酸鹽)。
體外培養(yǎng)7-8天后(DIV 7-8)，用10μM阿拉伯呋喃糖苷(arabinofuranoside)胞嘧啶(Ara-C)來終止神經(jīng)膠質(zhì)的過度生長(zhǎng)。對(duì)DIV12-15皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行藥物處理。在如前所述的神經(jīng)中毒損傷24小時(shí)后，通過檢測(cè)釋放到浸泡介質(zhì)中的乳酸脫氫酶(LDH)的量來評(píng)價(jià)全部的神經(jīng)元細(xì)胞損傷[Koh and Choi，J Neurosci Methods 2083-90，1987]。
<實(shí)施例2>
2-羥基-TTBA、2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環(huán)己基-TTBA對(duì)興奮毒性的抑制效果在如實(shí)施例1所述的混合神經(jīng)元-神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)DIV 13-15時(shí)，將皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于300μM NMDA中10分鐘，單獨(dú)地或結(jié)合3-300μM2-羥基-TTBA、10-300μM 2-羥基-TTS、30-300μM 2-羥基-TTA、30-300μM2-乙基-TTBA、10-300μM 2-丙基-TTBA或10-300μM 2-環(huán)己基-TTBA。24小時(shí)后，通過測(cè)量釋放到浸泡介質(zhì)中的LDH的量來評(píng)價(jià)神經(jīng)元的死亡狀況。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
將皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于300μM NMDA中10分鐘，使神經(jīng)元在其后的24小時(shí)中大幅死亡(約75-80％的神經(jīng)元死亡)。在劑量為10-300μM時(shí)，2-羥基-TTBA以藥物依賴的方式阻斷NMDA-誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡(圖1a)。
同時(shí)給予30-300μM劑量的2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環(huán)己基-TTBA也預(yù)防了NMDA-誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡(圖1b)。
<實(shí)施例3>
2-羥基-TTBA對(duì)NMDA-誘導(dǎo)的內(nèi)向進(jìn)程的阻斷作用如上文所述在室溫下對(duì)皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行全細(xì)胞記錄[Seo et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，299377-384(2001)]。對(duì)保持在-70mV的培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元使用300μM NMDA后立即引起通常的NMDA-誘導(dǎo)的內(nèi)向進(jìn)程(NMDA進(jìn)程)。使用2-羥基-TTBA浴能夠立即以劑量依賴方式抑制NMDA-引起的進(jìn)程(n＝7-15神經(jīng)元/條件，IC50值＝30.55±2.96μM)(圖2a)。單獨(dú)使用100μM 2-羥基-TTBA對(duì)進(jìn)行中的進(jìn)程沒有效果，并對(duì)隨后用300μM NMDA處理后的細(xì)胞響應(yīng)的效果很小(圖2b)，這表明只有當(dāng)NMDA受體被活化時(shí)(n＝6)2-羥基-TTBA才表現(xiàn)出拮抗作用。
<實(shí)施例4>
2-羥基-TTBA、2-羥基-TTA、2-羥基-TTS、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環(huán)己基-TTBA阻斷氧化性神經(jīng)元死亡(4-1)抑制FeCl2誘導(dǎo)的自由基毒性將混合的皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物(DIV 13-15)持續(xù)暴露于50μM FeCl2(其通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基)，單獨(dú)地或結(jié)合指定劑量的2-羥基-TTBA、2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA、2-環(huán)己基-TTBA或trolox(一種維生素E類似物)。24小時(shí)后，通過上述LDH分析來分析神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組(FeCl2)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
暴露于FeCl2中的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)物在其后的24小時(shí)中發(fā)生大幅的神經(jīng)元死亡。2-羥基-TTBA和trolox以劑量依賴方式預(yù)防FeCl2-誘導(dǎo)的自由基神經(jīng)毒性。然而，在預(yù)防自由基神經(jīng)毒性方面2-羥基-TTBA比trolox強(qiáng)30倍(圖3a)。此外，2-羥基-TTBA的合成衍生物(2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環(huán)己基-TTBA)在預(yù)防FeCl2-誘導(dǎo)的自由基神經(jīng)毒性中顯示出比trolox更強(qiáng)的神經(jīng)保護(hù)作用(圖3b)。
(4-2)抑制SNP(硝普鈉)細(xì)胞毒性將混合的皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物持續(xù)暴露于5μM SNP(一氧化氮(NO)給體)，單獨(dú)地或包含0.1-10μM 2-羥基-TTBA、1-10μM trolox或100-10,000μM阿司匹林之中。24小時(shí)后，通過LDH分析來分析神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組(SPN)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
給予SNP造成全部神經(jīng)元細(xì)胞死亡和一些神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞死亡。在2-羥基-TTBA和trolox存在下SPN毒性被徹底阻斷。在預(yù)防NO毒性上前者比后者強(qiáng)100倍。阿司匹林作為2-羥基-TTBA的一種結(jié)構(gòu)組分不會(huì)降低SNP的細(xì)胞毒性。
(4-3)抑制鋅神經(jīng)毒性為誘導(dǎo)鋅(Zn2+)神經(jīng)毒性，在HEPES-緩沖控制鹽溶液(HCSS)中將混合的皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于100μM ZnCl230分鐘，單獨(dú)地或包含3-300μM 2-羥基-TTBA，所述緩沖溶液包括120mM NaCl、5mM KCl、1.6mMMgCl2、2.3mM CaCl2、15mM葡萄糖、20mM HEPES和10mM NaOH。暴露后，將培養(yǎng)物洗滌3次，并用調(diào)節(jié)至25mM葡萄糖和26.2mM碳酸氫鈉的MEM進(jìn)行替換。24小時(shí)后，通過分析LDH來分析神經(jīng)元細(xì)胞的死亡。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組(SNP)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
同時(shí)用2-羥基-TTBA進(jìn)行處理，在10-300μM劑量時(shí)以劑量依賴的方式預(yù)防鋅-誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡(圖5)。
(4-4)2-羥基-TTBA、2-羥基-TTA、2-羥基-TTS或2-氯-TTP的DPPH分析為檢驗(yàn)清除自由基的效果，將1-100μM 2-羥基-TTBA、2-羥基-TTA、2-羥基-TTS、2-氯-TTP或trolox與溶于乙醇的100μM DPPH(2，2-二苯基-1-苦基偕腙肼自由基，一種穩(wěn)定的自由基)反應(yīng)。孵育30分鐘后，通過分光光度計(jì)檢測(cè)517nm處DPPH吸收的相對(duì)減少，平均值±SEM(每種條件下n＝3試管)。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組(單獨(dú)DPPH)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗(yàn)p＜0.05。
與抗氧化劑trolox比較，2-羥基-TTBA在較低的劑量時(shí)可降低DPPH水平，表明2-羥基-TTBA是強(qiáng)于trolox的直接抗氧化劑(圖6a)。其它合成衍生物也能降低DPPH的水平(圖6b)。
<實(shí)施例5>
2-羥基-TTBA預(yù)防ALS小鼠的脊髓神經(jīng)元的死亡具有G93A人SOD1突變的轉(zhuǎn)基因小鼠(B6SJL-TgN(SODL-G93A)1Gur)(ALS的動(dòng)物模型(ALS小鼠))是從Jackson Laboratories(ME，USA)獲得的。通過飲用水瓶對(duì)2個(gè)月的野生型及ALS轉(zhuǎn)基因小鼠給藥2-羥基-TTBA(10mg/kg每天)8周。然后使動(dòng)物安樂死，并通過蘇木精和曙紅染色對(duì)脊髓進(jìn)行處理用于組織學(xué)檢驗(yàn)。嗜曙紅染色顯示，未經(jīng)2-羥基-TTBA處置的ALS小鼠的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(對(duì)照組)明顯發(fā)生變性，而該變性在2-羥基-TTBA處置的ALS小鼠中降低(圖7a)。
通過對(duì)灰質(zhì)腹角(VH)和背角(DH)的嗜曙紅神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)來分析變性神經(jīng)元的數(shù)量。給予2-羥基-TTBA顯著預(yù)防了ALS小鼠脊髓灰質(zhì)背角和腹角神經(jīng)元的變性(圖7b)。*表示明顯不同于媒介物對(duì)照組，使用獨(dú)立t-測(cè)試p＜0.05。
<實(shí)施例6>
2-羥基-TTBA預(yù)防缺氧-缺血性腦損傷(6-1)誘導(dǎo)大鼠的短暫局部腦缺血用水合三氯乙醛將Sprague-Dawley大鼠麻醉，并如前所述通過閉塞其中腦動(dòng)脈(MCAO)使其產(chǎn)生局部腦缺血[Tamura et al.，J.Cerebr.BloodFlow Metab.153-60(1981)]。通過使3mm直徑的穿顱術(shù)喙(craniotomyrostral)到達(dá)卵圓孔將兩條頸總動(dòng)脈(CCAs)和右中腦動(dòng)脈(rMCA)暴露在外科顯微鏡下。用顯微夾子將CCAs和rMCA閉塞。60分鐘后釋放所述夾子，并在顯微鏡下觀察rMCA中血流的恢復(fù)。
(6-2)60分鐘MCAO后2-羥基-TTBA減少梗塞體積對(duì)動(dòng)物進(jìn)行MCAO 60分鐘，單獨(dú)或在再灌注后指定時(shí)間點(diǎn)給予2-羥基-TTBA(50mg/kg，i.p.)。注射鹽水作為對(duì)照組。24小時(shí)后使動(dòng)物安樂死，取出其大腦并在腦基質(zhì)中按冠狀線方向切割成7個(gè)2mm的切片。將腦切片置于2％的2，3，5，-三苯基氯化四氮唑溶液中，然后在10％福爾馬林中過夜。檢測(cè)梗塞形成區(qū)域(用白色標(biāo)出)(TINA圖像分析系統(tǒng))，并通過加和連續(xù)2mm厚的切片中顯白色的梗塞體積來計(jì)算梗塞形成的體積，平均值±SEM(每種條件n＝8-12只大鼠)(圖8a)。注意到在再灌注后達(dá)1小時(shí)延遲給予(ip)2-羥基-TTBA，顯著減少梗塞體積。較高劑量的2-羥基-TTBA(100mg/kg，ip)也表現(xiàn)出相似的抵御60分鐘MCAO的保護(hù)作用(圖8b)。
進(jìn)行額外的實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)靜脈注射2-羥基-TTBA(5mg/kg)抵御60分鐘MCAO的效果。再灌注后在指定的時(shí)間點(diǎn)將2-羥基-TTBA給藥。再灌注后達(dá)4小時(shí)延遲注射2-羥基-TTBA顯著減少了60分鐘MCAO后24小時(shí)內(nèi)形成的梗塞體積，平均值±SEM(每種條件n＝8-12只大鼠)(圖8c)。
靜脈注射2-羥基-TTBA的劑量-響應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示，在低至1mg/kg的劑量時(shí)2-羥基-TTBA可減少梗塞體積。當(dāng)劑量高于2.5mg/kg時(shí)觀察到2-羥基-TTBA的保護(hù)效果，平均值±SEM(每種條件n＝8-12只大鼠)(圖8d)。
同樣檢驗(yàn)了口服給予2-羥基-TTBA的保護(hù)效果。尤其是再灌注后5分鐘給予2-羥基-TTBA(10或20mg/kg，p.o.)能減少60分鐘MCAO后24小時(shí)的梗塞體積，平均值±SEM(每種條件n＝8-12只大鼠)(圖8e)。
<實(shí)施例7>
2-羥基-TTBA預(yù)防短暫前腦缺血后的CA1神經(jīng)元細(xì)胞死亡
(7-1)誘導(dǎo)大鼠全腦缺血將雄性成年Sprague-dawley大鼠(250-300g)用三氯乙醛麻醉，并如上文所述接受四血管閉塞(封閉兩條頸總動(dòng)脈和椎動(dòng)脈)[Pulsinelli andBrierley，stroke 10267-272(1979)]。
(7-2)2-羥基-TTBA抑制全腦缺血后線粒體ROS的形成大鼠接受腦室內(nèi)注射0.4nmol染色體示蹤劑CM-H2X ROS。24小時(shí)后，大鼠接受四血管閉塞10分鐘。再灌注后，大鼠立即接受腹膜內(nèi)注射鹽水(對(duì)照組)或2-羥基-TTBA(50mg/kg)。2小時(shí)后通過測(cè)定線粒體中氧化的染色體示蹤劑CM-H2X ROS的熒光強(qiáng)度來分析線粒體的ROS水平。給予2-羥基-TTBA減少了短暫全腦缺氧后2小時(shí)線粒體ROS的產(chǎn)生。
(7-3)2-羥基-TTBA抑制短暫前腦缺血后CA1區(qū)域的神經(jīng)元細(xì)胞死亡對(duì)接受四血管閉塞10分鐘的大鼠隨后給予鹽水(對(duì)照組)或2-羥基-TTBA(50mg/kg，ip)。3天后使動(dòng)物安樂死，并在蘇木精和曙紅染色后分析CA1區(qū)域的神經(jīng)元死亡(平均值±SEM，每種條件n＝12只大鼠)。給予2-羥基-TTBA預(yù)防短暫全腦缺血后發(fā)展的延時(shí)神經(jīng)元細(xì)胞死亡(圖9b)。*表示明顯不同于對(duì)照組，使用獨(dú)立t測(cè)試p＜0.05。
<實(shí)施例8>
2-羥基-TTBA抑制MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)注射后塞梅林氏神經(jīng)節(jié)中多巴胺能神經(jīng)元的死亡(8-1)2-羥基-TTBA抑制多巴胺能神經(jīng)元C57/BL6小鼠(雌性，8周)接受注射40mg/kg MPTP(s.c.)，單獨(dú)地或每天每12小時(shí)在MPTP注射前30分鐘給予25或50mg/kg 2-羥基-TTBA(ip)。3或7天后，所有動(dòng)物用三氯乙醛麻醉，并先后用PBS和4％多聚甲醛進(jìn)行穿心灌注。立即取出大腦并在固定劑(fixative)中浸泡8-10小時(shí)。將所述固定劑用30％蔗糖代替，在4℃孵育2天，并在-70℃儲(chǔ)存。用滑動(dòng)式切片機(jī)(TPI，Inc.，MO)將所述大腦切割成厚度為30μm的切片。然后將切片在4℃儲(chǔ)存于0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4，30％(v/v)甘油，30％乙二醇)中直到使用。將所述切片用抗-TH(酪氨酸氫化酶)抗體進(jìn)行免疫染色，用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine)著色，其后在光學(xué)顯微鏡下觀察分析多巴胺能神經(jīng)元的變性。
用MPTP處理的小鼠在其后的3天中在塞梅林氏神經(jīng)節(jié)中顯示出顯著的多巴胺能神經(jīng)元變性。所述的腹膜內(nèi)注射2-羥基-TTBA顯著減少了多巴胺能神經(jīng)元的變性(圖10a和10b)。在給予MPTP 7天后同樣觀測(cè)到2-羥基-TTBA的保護(hù)作用(圖10c和10d)。
<實(shí)施例9>
外傷性脊髓損傷后抑制脊髓中線粒體ROS的產(chǎn)生通過壓迫背部脊髓使Sprague-Dawley大鼠(250-300g，雌性)遭受外傷性脊髓損傷。將脊髓T8節(jié)段在背側(cè)暴露以20g力壓迫10分鐘，然后立即將線粒體CM-H2X ROS注射入脊髓中。將2-羥基-TTBA(50mg/kg，ip)或媒介物對(duì)照組(對(duì)照組)與線粒體CM-H2X ROS一起注射。如上文所述，在用抗-NeuN抗體(神經(jīng)元特異性標(biāo)記物)進(jìn)行免疫標(biāo)記，48小時(shí)后分析灰質(zhì)背角神經(jīng)元中線粒體ROS的水平。給予2-羥基-TTBA顯著減少外傷性脊髓損傷后脊髓神經(jīng)元中線粒體ROS的產(chǎn)生(圖11)(平均值±SEM，每種條件N＝12只大鼠)。*表示明顯不同于對(duì)照組，使用獨(dú)立t測(cè)試p＜0.05。
綜上所述，本發(fā)明的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽可用作NMDA受體拮抗劑、抗氧化劑和鋅神經(jīng)毒性抑制劑。
可應(yīng)用四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽的具體疾病如下所述。
下列應(yīng)用實(shí)施例是本發(fā)明的部分實(shí)施例。本發(fā)明不限于應(yīng)用實(shí)施例。
<應(yīng)用實(shí)施例1>中風(fēng)腦血液供應(yīng)中斷或中風(fēng)主要通過在突觸間隙中由谷氨酸鹽(興奮性神經(jīng)遞質(zhì))累積誘導(dǎo)的CA2+-透過性谷氨酸鹽受體的過度活化來誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡。大量文獻(xiàn)表明NMDA受體拮抗劑減少由缺血性中風(fēng)(占中風(fēng)的80％)引起的神經(jīng)元細(xì)胞死亡[Simon et al.，Science，226850-852(1984)；Park etal.，Ann Neurol.，24543-551(1988)；Wieloch，Science，230681-683(1985)；Kass et al.，Exp.Neurol.，103116-122(1989)；Weiss et al.，Brain Res.，380186-190(1986)]。也有報(bào)道稱ROS和鋅是中風(fēng)后神經(jīng)元死亡的主要機(jī)制。抗氧化劑或鋅毒性抑制劑保護(hù)中風(fēng)的動(dòng)物模型的缺血性損傷[Flamm，E.S.et al.，Stroke，9(5)445-447(1978)；Kogure，K.et al.，Prog.Brain Res.，63237-259(1985)；Chan，P.H.，J.Neurotrauma.，9 Suppl2S417-423(1992)]。因此，顯示抗興奮毒性、抗氧化應(yīng)激和抗鋅毒性的多重保護(hù)作用的本發(fā)明化合物可以用作治療中風(fēng)的藥物。
<應(yīng)用實(shí)施例2>外傷外傷性腦損傷(TBI)和外傷性脊髓損傷(TSCI)后的神經(jīng)元細(xì)胞變性與興奮毒素密切相關(guān)。在TBI患者體內(nèi)喹啉酸(一種存在于人體內(nèi)的NMDA受體激動(dòng)劑)上升50-500倍[Sinz et al.，J.Cereb.Blood Flow Metab.，18610-615(1988)]。有報(bào)導(dǎo)稱NMDA受體拮抗劑可減少TBI和TSCI后的神經(jīng)元死亡[Faden et al.，J Neurotrauma，533-45(1988)；Okiyama et al.，JNeurotrauma，14211-222(1997)]?？寡趸瘎┻€可抑制TBI或TSCI后的組織損傷[Faden&Salzman，Trends Pharmacol.Sci.，1329-35(1992)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應(yīng)激的多重保護(hù)作用的本發(fā)明化合物可以用作TBI和TSCI的治療藥物。
<應(yīng)用實(shí)施例3>癲癇癥給予海人藻酸(一種AMPA激動(dòng)劑和海人藻酸谷氨酸鹽受體)誘導(dǎo)包括海馬結(jié)構(gòu)的若干大腦區(qū)域的癲癇發(fā)作和神經(jīng)元細(xì)胞死亡。NMDA受體拮抗劑在許多引起癲癇的動(dòng)物模型中表現(xiàn)出抑制驚厥和癲癇發(fā)作的作用。[Anderson et al.，J.Neurophysiol，571-21(1987)；Wong et al.，NeurosciLett.，85261-266(1988)；Mc Namara et al.，Neuropharmacology，27563-568(1988)]?？寡趸瘎┮种瓢d癇發(fā)作和癲癇發(fā)作誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡[He et al.，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med.22917-922(1997)；Kabuto et al.，Epilepsia，39237-243(1998)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應(yīng)激的多重保護(hù)作用的本發(fā)明化合物可以用作癲癇和由癲癇誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡的治療藥物。
<應(yīng)用實(shí)施例4>肌萎縮性骨髓側(cè)索硬化ALS患者表現(xiàn)出細(xì)胞外谷氨酸鹽水平增加和星形膠質(zhì)細(xì)胞中谷氨酸鹽的運(yùn)輸缺陷。向脊髓中給予谷氨酸鹽受體拮抗劑模擬ALS患者脊髓中的病理變化[Rothstein et al.，Clin Neurosci.，3348-359(1995)；Ikonomidouet al.，JNeuropathol Exp Neurol，55211-224(1996)]。除了興奮毒性，許多證據(jù)表明氧化應(yīng)激參與ALS中神經(jīng)元的死亡[Cookson&Shaw，BrainPathol.，9165-186(1999)]。事實(shí)上，利魯唑(riluzole，一種FDA許可的用于ALS患者的新型藥物)的主要藥理學(xué)作用包括預(yù)防興奮毒性和氧化應(yīng)激[Obrenovitch，Trends.Pharmacol.Sci.199-11(1998)；Noh et al.，Neurobiol.Dis.，7375-383(2000)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應(yīng)激的多重保護(hù)作用的本發(fā)明化合物可以用作ALS的治療藥物。
<應(yīng)用實(shí)施例5>帕金森癥(PD)PD是一種神經(jīng)變性疾病，通過塞梅林氏神經(jīng)節(jié)中多巴胺能神經(jīng)元的選擇性死亡表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)功能紊亂。許多NMDA受體拮抗劑保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元抵御多巴胺能神經(jīng)毒素MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)[Lange et al.，Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol.348586-592(1993)；Brouillet and Beal.Neuroreport.4387-390(1993)]。NMDA受體拮抗劑也能改善左旋多巴(levodopa)誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)障礙，因此可改善左旋多巴的治療效果[Papa and Chase，Ann.Neurol.39574-578(1996)；Marin et al.，BrainRes.736202-205(1996)]。氧化應(yīng)激及興奮毒性被證明是PD患者體內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的主要機(jī)制[Schapira et al.，biochem.Soc.Trans.，21367-370(1993)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應(yīng)激的多重保護(hù)作用的本發(fā)明化合物可以用作PD的治療藥物。
<應(yīng)用實(shí)施例6>亨廷頓癥(HD)HD是一種進(jìn)行性的神經(jīng)變性疾病，主要影響紋狀體(striata)中較小或中等尺寸的中間神經(jīng)元。給予NMDA受體激動(dòng)劑后可在體內(nèi)和體外觀察到HD的這些病理特征，這些特征提高了NMDA受體介導(dǎo)的神經(jīng)毒性造成HD中選擇性神經(jīng)元死亡的可能性[Koh et al.，Science 23473-76(1986)；Beal et al.，Nature 321168-171(1986)；Beal et al.，J.Neurosci.111649-1659(1991)]。由于積累的證據(jù)顯示氧化應(yīng)激(例如線粒體功能紊亂和產(chǎn)生ROS)導(dǎo)致HD中觀察到的神經(jīng)元死亡，因此抑制ROS的藥物有可能用于治療HD。[Jenner，Pathol.Biol.4457-64(1996)；Albers&Beal，J.Neural.Transm.Suppl.，59133-154(2000)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應(yīng)激的多重保護(hù)作用的本發(fā)明化合物可以用作HD的治療藥物。
<應(yīng)用實(shí)施例7>阿耳茨海默氏癥(AD)大腦皮質(zhì)及海馬結(jié)構(gòu)中谷氨酸能性神經(jīng)元以及基底(basal)前腦中膽堿能神經(jīng)元的變性、淀粉斑塊的細(xì)胞外沉積、及細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)是AD的病理學(xué)特征。已報(bào)道，在AD中自由基的過度生成產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷、蛋白羰基、硝化作用或蛋白的氧化交聯(lián)，這表明氧化應(yīng)激是AD中神經(jīng)元死亡的主要成因[Vitek et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，914766-4770(1994)；Smith et al.，Trends.Neurosci.，18172-176(1995)，Mol.Chem.Neuropathol.，2841-48(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，949866-9868(1997)；Montine et al.，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55202-210(1996)]。事實(shí)上，已經(jīng)在AD患者體內(nèi)對(duì)抗氧化劑的療效進(jìn)行了廣泛研究。Zn2+在AD患者的大腦中(扁桃體(amygdala)、海馬體、頂下小葉(inferior parietal lobule)、頂部和中部顳颥腦回(superior andmiddle temporal gyri))累積，主要在淀粉斑塊的中央和周圍，并引起β淀粉質(zhì)的聚集[Bush et al.，Science 2651464-1467(1994)；Lovell et al.，J.Neurol.Sci.，15847-52(1998)]。因此，顯示抗氧化應(yīng)激和抗ZN2+毒性的保護(hù)作用的本發(fā)明化合物可以用作AD的治療藥物。
<應(yīng)用實(shí)施例8>眼科疾病和白內(nèi)障在青光眼中，眼內(nèi)壓力上升阻礙了血液流入視網(wǎng)膜中，造成視網(wǎng)膜缺血，并誘導(dǎo)谷氨酸鹽過度釋放入突觸間隙中。一旦釋放，谷氨酸鹽通過在后突觸(post-synaptic)神經(jīng)元中打開鈣通道并提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度來誘導(dǎo)NMDA受體介導(dǎo)的興奮毒性。也可以通過在再灌注過程中增加活性氧類物質(zhì)的產(chǎn)生來造成視網(wǎng)膜細(xì)胞的變性。[Osborne N.N.et al.，Surv.Opththalmol.，43 suppl.，1S102-28(1999)；Hartwick A.T.，Optom.Vis.Sci.，7885-94(2001)]。給予NMDA受體拮抗劑或抗氧化劑來抑制青光眼動(dòng)物模型中視網(wǎng)膜的變性[Gu.Z.et al.，Nippon Ganka Gakkai Zasshi，10411-6(2000)；Vorwerk C.K.et al.，Surv Ophthalmol.，43 suppl.，1S142-50(1999)；Schwartz M.et al.，Eur.J.Ophthalmol.，9 Suppl.，1S9-11(1999)]。
在視網(wǎng)膜病和斑點(diǎn)變性(macular degeneration)中，神經(jīng)元變性可以通過抑制興奮毒性和氧化應(yīng)激(此類疾病的主要成因)來阻斷[Lieth E.et al.，Clin.Experiment Ophthalmol.，28(1)3-8(2000)；Moor P.et al.，Exp.EyeRes.，7345-57(2001)；Winkler B.S.et al.，Mol.Vis.，532(1999)；Simonelli F.et al.，Clin.Chim.Acta.，320111-5(2002)]。
白內(nèi)障是一種伴隨晶狀體不透明的老年疾病。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是白內(nèi)障的主要媒介。實(shí)際中已經(jīng)使用抗氧化劑來治療白內(nèi)障[Varma et al.，Curr.Eye Res.335-57(1984)；Anderson et al.，Adv.Exp.Med.Biol.，36673-86(1994)]。
因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應(yīng)激的多重保護(hù)作用的本發(fā)明化合物可以用作眼科疾病的治療藥物。
<應(yīng)用實(shí)施例9>藥物成癮在凸出至伏隔核的中腦腹側(cè)被蓋區(qū)內(nèi)的中腦邊緣(mesolimbic)多巴胺能神經(jīng)元的活化是需要神經(jīng)元興奮性的藥物成癮過程所必需的。[Self D.W.and Nestler E.J.，Annu.Rev.Neurosci.，18463-95(1995)]。多方面的證據(jù)支持可以使用NMDA受體拮抗劑來減少神經(jīng)元對(duì)濫用藥物的適應(yīng)性，并已經(jīng)被建議作為藥物成癮的新型治療藥劑[Boening et al.，Alcohol Clin.Exp.Res.，25127S-131S(2001)；Vorel et al.，Science，2921175-8(2001)]。
<應(yīng)用實(shí)施例10>抑郁癥三環(huán)抗抑郁劑和MAO(單胺氧化酶)抑制劑(抗抑郁劑)可增強(qiáng)去甲腎上腺素和5-羥色胺的神經(jīng)傳遞。現(xiàn)有的治療藥物通過與其它神經(jīng)系統(tǒng)相互作用誘導(dǎo)許多副作用，并且對(duì)30％的抑郁癥患者沒有治療效[Pacher etal.，Curr.Med.Chem.，F(xiàn)eb.8(2)89-100(2001)]，近來發(fā)現(xiàn)NMDA受體拮抗劑可用作抑郁癥的新型治療藥物[Le D.A.and Lipton S.A.，DrugsAging，18717-724(2001)；Petrie et al.，Pharmacol.Ther.，8711-25(2000)]。
<應(yīng)用實(shí)施例11>疼痛與外科手術(shù)、癌癥患者和外傷等相關(guān)的外周損傷和神經(jīng)組織損傷后神經(jīng)傳遞的增強(qiáng)造成神經(jīng)性疼痛[Hempenstall K.and Rice A.S.，Curr.Opin.Investig.Drugs.，Mar；3(3)441-8(2002)；McDonnell et al.，Curr.Oncol.Rep.，2351-7(2000)]。由于NMDA受體的活化作用是神經(jīng)性疼痛過程必需的，有報(bào)道稱NMDA受體拮抗劑可用作治療神經(jīng)性疼痛的治療藥物[Parson C.G.，Eur.J.Pharmacol.，42971-8(2001)；Hewitt，Clin.J.Pain.，16S73-9(2000)]。
<應(yīng)用實(shí)施例12>多發(fā)性硬化、腦膜炎、腦炎或腦積水氧化應(yīng)激在多發(fā)性硬化、腦膜炎、腦炎或腦積水的發(fā)病機(jī)理中起作用。在多發(fā)性硬化患者的體內(nèi)抗氧化劑(如視黃醛、a-維生素E、b-胡蘿卜素和抗壞血酸)的水平降低[Calabrese，V et al.，Int.J.Clin.Pharmacol.Res，14(4)119-123(1994)；Besler H.T.et al.，Nutr.Neurosci.5(3)215-220(2002)；Nutr.Neurosci.6(3)189-196(2002)]。在腦膜炎患者及其動(dòng)物模型[Maurizi C.P.，Med.Hypotheses，52(1)85-87(1999)；Christen S.et al.，F(xiàn)ree Radic.Biol.Med，31(6)754-762(2001)；Kastenbauer S.et al.，Neurology，58(2)186-191(2002)]、腦炎病毒感染模型[Fujii，S.et al.，Virology，256(2)203-212(1999)；Raung S.et al.，Neurosci.Lett.，315(1-2)9-12(2001)]、及腦積水患者[Nuss J.I.et al.Am.J.Vet Res.，28(127)1909-1913(1967)；Vannucci R.C.et al.，Dev.Med.Child.Neurol.，22(3)308-316(1980)；Radwanska-Wala B.et al.，Pathol.Res.Pract.，198(6)421-423(2002)]中發(fā)現(xiàn)ROS產(chǎn)生和神經(jīng)元細(xì)胞死亡的增加。因此，顯示抗氧化應(yīng)激保護(hù)作用的本發(fā)明化合物可以用作治療由多發(fā)性硬化、腦膜炎、腦炎或腦積水引起的神經(jīng)元死亡的藥物。
本發(fā)明是以說明的方式進(jìn)行描述的，且應(yīng)該理解，所用術(shù)語具有描述性質(zhì)而不具有限定作用。依照上述教導(dǎo)可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種修改和變化。因此，可以理解，在所附權(quán)利要求范圍內(nèi)可以不同于以上具體描述的方式實(shí)施本發(fā)明。
工業(yè)實(shí)用性如上文中所述，四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽，以及含有上述物質(zhì)作為有效成分的藥物組合物可預(yù)防和治療如上所述的神經(jīng)變性疾病(例如肌萎縮性脊髓側(cè)索神經(jīng)硬化、帕金森癥、亨廷頓癥或阿耳茨海默氏癥)，神經(jīng)元痙攣性疾病(如癲癇癥等)，以及由中風(fēng)、外傷或腦積水造成的腦損傷，由青光眼和視網(wǎng)膜疾病引起的眼科疾病，由藥物成癮和抑郁癥引起的精神疾病，神經(jīng)性疼痛，由腦膜炎和腦炎引起的炎癥。
權(quán)利要求
1.一種以如下化學(xué)式1表示的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽[化學(xué)式1] 其中，R1、R2和R3為氫或鹵素，R4為羥基、烷基、烷氧基、鹵素、鹵代烷氧基、烷酰氧基或硝基，及R5為羧酸、C1-C4烷基取代的羧酸酯、酰胺、磺酸、鹵素或硝基。
2.如權(quán)利要求1所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟芐基衍生物為2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基芐氨基)苯甲酸，2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-芐氨基)苯甲酸，5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)-2-三氟甲氧基苯甲酸，2-硝基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯酚，2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-甲基芐氨基)苯酚，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酰胺，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯磺酸，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸甲酯，2-乙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，2-丙酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸，或2-環(huán)己胺碳酰氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸。
3.如權(quán)利要求2所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟芐基衍生物為2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酸。
4.如權(quán)利要求2所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟芐基衍生物為2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯磺酸。
5.如權(quán)利要求2所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟芐基衍生物為2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯甲酰胺。
6.如權(quán)利要求2所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟芐基衍生物為2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基芐氨基)苯酚。
7.一種用于治療和預(yù)防神經(jīng)變性疾病的藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分，其中所述的神經(jīng)變性疾病選自肌萎縮性骨髓側(cè)索硬化、帕金森癥、亨廷頓癥、阿耳茨海默氏癥及其組合。
8.一種用于治療和預(yù)防癲癇癥的藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
9.一種用于治療和預(yù)防中風(fēng)的藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
10.一種用于治療和預(yù)防外傷性腦損傷、外傷性脊髓損傷或腦積水的藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
11.一種用于治療和預(yù)防青光眼、視網(wǎng)膜病或黃斑變性(視網(wǎng)膜)的藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
12.一種用于治療和預(yù)防藥物成癮的藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
13.一種用于治療和預(yù)防抑郁癥的藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
14.一種用于治療和預(yù)防疼痛的藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
15.一種用于治療和預(yù)防腦炎、腦膜炎和/或多發(fā)性硬化的藥物組合物，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
16.一種N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
17.一種抗氧化劑，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
18.一種鋅毒性抑制劑，包括如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的四氟芐基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
全文摘要
本發(fā)明涉及四氟芐基衍生物及含有其成分的用于治療和預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急慢性神經(jīng)變性疾病和眼科疾病的藥物組合物。本發(fā)明的四氟芐基衍生物可有效地用于預(yù)防和治療諸如帕金森癥、亨廷頓癥及阿耳茨海默氏癥的慢性神經(jīng)變性疾病，諸如癲癇的腦變性疾病和諸如中風(fēng)的缺血性腦病。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1668576SQ03816752
公開日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月19日
發(fā)明者郭秉周, 尹性和, 文鎬相, 樸恩贊, 元碩駿, 李英愛, 李海彥 申請(qǐng)人:紐若泰克有限公司