專利名稱：一種治療原發(fā)性腎小球疾病的中藥組合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物，特別涉及用于一種治療原發(fā)性腎小球疾病的中藥組合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
病名概念及分類標(biāo)準(zhǔn)原發(fā)性腎小球疾病是病損局限于腎小球或主要是腎小球損害的一組腎臟病。原發(fā)性腎小球疾病大多是特發(fā)的(即發(fā)病原因不明)，少部分由細(xì)菌感染或藥物所誘發(fā)。對原發(fā)性腎小球疾病的分類可從兩個(gè)方面，即臨床分型和病理分型。參照1992年原發(fā)性腎小球疾病臨床分型標(biāo)準(zhǔn)，可將其分為(1)急性腎小球腎炎為急性起病，以血尿、蛋白尿、水腫和高血壓為主要表現(xiàn)，并可有一過性氮質(zhì)血癥的一組疾病。多見于鏈球菌感染后，其它細(xì)菌、病毒及寄生蟲感染也可引起。
(2)急進(jìn)性腎小球腎炎臨床起病過程和表現(xiàn)類似急性腎小球腎炎，但腎功能急劇壞轉(zhuǎn)、早期出現(xiàn)少尿性急性腎功能衰竭為特征，病理表現(xiàn)為大量新月體形成的一組疾病。
(3)慢性腎小球腎炎是各種原發(fā)性腎小球疾病導(dǎo)致的一組長病程的(甚至數(shù)十年)、病情遷延、病變進(jìn)展緩慢、最終將發(fā)展成慢性腎功能衰竭的一組腎小球疾病。臨床以水腫、高血壓、蛋白尿、血尿及腎功損害為基本表現(xiàn)，但由于疾病病理類型和病期不同，它們的主要表現(xiàn)可相異，呈多樣化。慢性腎小球腎炎為臨床常見病，尤以青壯年男性青年發(fā)病率高。本病治療困難，大多漸進(jìn)為慢性腎功能衰竭，預(yù)后較差。
(4)腎病綜合征要表現(xiàn)為“三高一低”，即高度浮腫、大量蛋白尿(≥3.5克/日)、高脂血癥和低蛋白血癥(血漿白蛋白≤30克/升)。只要具備大量蛋白尿和低蛋白血癥診斷即可成立。
(5)隱匿性腎小球疾病以無癥狀蛋白尿(尿蛋白量＜1克/日，以白蛋白為主)和(或)單純性血尿(持續(xù)或間斷鏡下血尿，并偶見肉眼血尿，其性質(zhì)為腎小球源性)為臨床表現(xiàn)的一組腎小球疾病。病人無水腫、高血壓及腎功能損害。
根據(jù)1982年世界衛(wèi)生組織對原發(fā)性腎小球疾病的病理分型標(biāo)準(zhǔn)，可分為①輕微腎小球病變；②局灶性節(jié)段性病變；③彌漫性腎小球腎炎包括膜性腎病、增生性腎炎(后者又可分為系膜增生性腎炎、毛細(xì)血管增生性腎炎、系膜毛細(xì)血管性腎炎、致密沉積物性腎炎和新月體性腎炎)和硬化性腎炎。④未分類的腎小球腎炎。
原發(fā)性腎小球疾病臨床發(fā)病特點(diǎn)及研究意義我國作為一個(gè)發(fā)展中國家具有特殊的疾病構(gòu)成譜既有不斷增長著發(fā)達(dá)國家的常見“富貴相關(guān)疾病”如糖尿病、高血壓、與血管成形技術(shù)(血管造影PTCA、冠脈搭橋術(shù)等)有關(guān)的腎小管壞死等；又仍然保存著不發(fā)達(dá)國家常見的“貧困相關(guān)疾病”，原發(fā)性腎小球疾病就是其中很主要的一類。按照我國的實(shí)際國情，這種“兩極并存”的疾病構(gòu)成譜將會存在相當(dāng)一個(gè)時(shí)期。因此，作為“貧困相關(guān)疾病”的原發(fā)性腎小球疾病在相當(dāng)一個(gè)時(shí)期中我國腎臟病學(xué)界對原發(fā)性腎小球疾病的研究將仍占重要地位，不應(yīng)被對糖尿病腎病等疾病的研究所取代。大部分原發(fā)性腎小球疾病的治療效果尚不可稱滿意，半個(gè)世紀(jì)以來也沒有重大突破，因此，臨床研究的一個(gè)重點(diǎn)應(yīng)是針對這些疾病的治療措施開展有組織、前瞻性、雙盲對照研究為評價(jià)療效(如尿蛋白、改善腎病綜合征、降血壓、甚至改善病理改變、改善腎功能等)提供證據(jù)，即近些年來所重視的循證醫(yī)學(xué)(Evidance Medicine)。據(jù)數(shù)組不完全資料統(tǒng)計(jì)，腎小球疾病在我國患病率約0.2％-4％，患病人數(shù)較多，尤好發(fā)于生活、勞動條件；較差的青少年，占我國慢性腎功能衰竭病因的3/4以上。IgA腎病的發(fā)病率占原發(fā)性腎小球疾病的26％-34％。男女之比大約是2∶1。關(guān)于發(fā)病機(jī)理研究目前認(rèn)為腎炎的發(fā)病與下列因素有關(guān)1、免疫介導(dǎo)損傷近代研究工作證實(shí)免疫介導(dǎo)損傷在大部分腎小球疾病的發(fā)病過程中起著主要的、啟動的作用①免疫病理技術(shù)(免疫熒光及免疫酶標(biāo)技術(shù))證實(shí)免疫球蛋白及補(bǔ)體成分在腎小球毛細(xì)血管袢及系膜區(qū)沉著。②同時(shí)可于一些病人血循環(huán)中測知循環(huán)免疫復(fù)合物、冷球蛋白或抗基底膜抗體，而補(bǔ)體成分下降。③可采用免疫手段于實(shí)驗(yàn)動物，制備多種與人類腎小球疾病相類似的病變。絕大部分腎小球疾病均由免疫復(fù)合物介導(dǎo)而致病。循環(huán)免疫復(fù)合物由抗原及抗體二者結(jié)合而成。當(dāng)抗原與抗體數(shù)量相等或抗原稍過剩時(shí)形成大小適中的可溶性免疫復(fù)合物，當(dāng)其含量較高和單核吞噬系統(tǒng)功能減弱時(shí)則有利于免疫復(fù)合物沉積于腎小球。循環(huán)免疫復(fù)合物主要沉積于腎小球系膜區(qū)，當(dāng)炎癥廣泛而嚴(yán)重沉著于毛細(xì)血管袢內(nèi)皮下側(cè)。腎小球毛細(xì)血管袢固有成分(糖蛋白GP330或600)及通過化學(xué)、電荷反應(yīng)而“種植”在其上的外源性抗原(病毒、組織成分)可與循環(huán)中的抗體成分于腎小球毛細(xì)血管袢上相結(jié)合而形成免疫復(fù)合物形成，見于膜性腎病。
2、炎癥介導(dǎo)過程大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究證明僅有廣泛、大量免疫復(fù)合物沉著仍不足引起腎小球炎癥反應(yīng)而致病。免疫復(fù)合物引起的各種炎癥個(gè)導(dǎo)過程在發(fā)病中起重要作用。免疫復(fù)合物與通過C1(經(jīng)典)途徑和C3(旁路)途徑激活補(bǔ)體；被破壞的細(xì)菌和組織細(xì)胞可釋放出細(xì)菌內(nèi)毒素、組織蛋白酶、脂多糖等按旁路途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體系統(tǒng)生成一系列生物活性的片段具有膜攻擊作用，從而增加其通透性引起蛋白尿。炎性細(xì)胞沉積于系膜區(qū)及毛細(xì)血管袢的免疫復(fù)合物及激活的補(bǔ)體通過免疫粘附及趨化作用吸引中性料細(xì)胞和單核細(xì)胞于局部浸潤。這些效應(yīng)細(xì)胞通過釋放蛋白酶及超氧陰離子等代謝產(chǎn)物直接損害腎小球。腎小球上的免疫復(fù)合物及其激活的補(bǔ)體系列損傷毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，釋放出內(nèi)皮細(xì)胞活性因子并導(dǎo)致血小板聚集，激活XIII因子引起一系列凝血、纖溶過程。血小板本身釋放生長因子，另一方面又吸引單核細(xì)胞、釋放單核因子，均能促進(jìn)系膜細(xì)胞增殖及基質(zhì)增生。非免疫、非炎癥腎小球損傷過程由于腎小球內(nèi)血液動力學(xué)改變而引起腎小球內(nèi)血液灌注、跨膜壓力及濾過壓的“三高”現(xiàn)象，從而導(dǎo)致腎小球進(jìn)行性硬化。引起腎小球內(nèi)血液內(nèi)血液動力學(xué)改變的因素包括健存腎單位的代償過程、一些影響入球小動脈擴(kuò)張和出球小動脈收縮的內(nèi)泌素及飲食中過多的蛋白質(zhì)、磷、脂肪等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于公開一種新的治療原發(fā)性腎小球疾病的中藥組合物；本發(fā)明的另一個(gè)目的在于公開制備一種新的治療原發(fā)性腎小球疾病中藥組合物的制備方法。
本發(fā)明中藥組合物的原料藥組成及配比如下(按重量份)虎杖600-1100重量份 白花蛇舌草600-1100重量份白茅根400-800重量份紅花100-400重量份。
本發(fā)明組合物的制備方法為以上四味，虎杖、白花蛇舌草用60-80％乙醇回流提取2-4次，每次1.5-3.5小時(shí)；合并乙醇提取液，濾過；濾取上清液；回收乙醇至相對密度1.10(50-70℃測)；噴霧干燥成細(xì)粉，備用；另取白茅根、紅花加水煎煮1-3次，每次1.5-3.5小時(shí)；合并水煎液，濾過；濾取上清液，濃縮至相對密度1.20(50-70℃測)；加乙醇至醇含量為70％；徐徐攪拌，靜置過夜；濾取上清液；濃縮至相對密度1.10(50-70℃測)；噴霧干燥成細(xì)粉；將上述兩細(xì)粉加入藥學(xué)上可接受的賦型劑，按照常規(guī)的制劑工藝制備成臨床可接受的藥物劑型，例如，丸劑、片劑、顆粒劑、口服液體制劑、膠囊劑、咀嚼劑等。
本發(fā)明組合物具有很好的治療原發(fā)性腎小球疾病的效果，主要藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究其結(jié)果完全支持治療原發(fā)性腎小球疾病的良好效果，不產(chǎn)生副作用，還能夠整體調(diào)節(jié)患者機(jī)體狀態(tài)，改善其他綜合指標(biāo)。在同類藥物中具有明顯的療效優(yōu)越性，因此具有良好的治療作用和相對低廉的成本以及極大的社會效益。
下面實(shí)驗(yàn)例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明。
實(shí)驗(yàn)例本發(fā)明組合物的藥效學(xué)研究試驗(yàn)用本發(fā)明組合物制劑為四味清腎顆粒藥效學(xué)研究劑量設(shè)定為人臨床每天使用劑量為生藥52g/d.人。大鼠用量為2.34-9.36g生藥/kg；小鼠給藥劑量13.52、6.76、3.38g(生藥量)/Kg，家兔給藥劑量1.2-4.8g生藥/kg。
試驗(yàn)材料四味清腎顆粒黑色顆粒，由北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供，批號20020901；含量2.6g生藥/g提取物。配制方法用蒸餾水配成所需濃度。
陽性藥保腎康片白色片劑，主要成分3-甲氧基-4-羥基桂皮酸哌嗪，成都亨達(dá)制藥廠生產(chǎn)，批號020210，規(guī)格50mg/片，配制方法研磨后溶于蒸餾水中，然后配成所需濃度。
動物新西蘭純種白兔一級，北京市通利試驗(yàn)動物養(yǎng)殖場，許可證編號京動管第0.24號。SD大鼠二級，北京市維通利華試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK(京)2002-0003。ICR小鼠(二級)，北京市維通利華試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK(京)2002-0003。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、四味清腎顆粒對大鼠的利尿作用取合格大鼠50只，雄性，體重250-300g，隨機(jī)分為5組，每組10只。分為對照組灌胃等容量的蒸餾水；陽性對照保腎康組55mg/kg；受試物四味清腎顆粒高、中、低劑量組9.4、4.68、2.34(生藥量)g/kg。給藥量10ml/kg。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)3天。
給藥前測量每只大鼠給藥前1h的尿量，然后開始給藥，將陽性藥和受試物均勻加入負(fù)荷水中同時(shí)灌服，然后測給藥后15min、30min、1h、2h、4h、8h、12h、24h尿量及尿液ph值。在每個(gè)收集尿液容器內(nèi)預(yù)先加入2ml甲苯，收集12h內(nèi)尿液，放入4攝氏度冰箱內(nèi)待測尿中Na+、K+、cl-的數(shù)值。
結(jié)果四味清腎顆粒連續(xù)灌胃給藥3天，高、中、低給藥組對正常水負(fù)荷大鼠尿量和Na+、K+、cl-含量有明顯的增加，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05-0.01)。
表1.四味清腎顆粒對正常水負(fù)荷大鼠24h尿量與尿中鈉、鉀、氯的影響劑量 鉀鈉24h尿量(ml)氯(mg/100ml)(g/kg) (mg/100ml)(mg/100ml)對照組- 16.27±7.962.04±0.939.04±3.6313.15±5.89陽性藥組 55(mg/kg) 24.10±9.57* 2.57±1.1713.22±5.14* 20.78±7.33*高劑量組9.4 25.60±10.63* 3.09±1.46** 11.77±4.59* 20.27±6.43**中劑量組4.7 28.00±13.20* 2.73±1.1514.84±5.71* 20.98±8.54*低劑量組2.3 20.90±3.932.90±0.76* 10.81±2.77 18.68±5.96與對照組比較*P＜0.05。
二.四味清腎顆粒對腎毒血清性腎炎(Masugi腎炎)模型的影響取新西蘭白兔10只，雄性，1.8-2.0kg。取上等量均漿與弗氏完全佐劑充分混勻，給兔腳掌皮下多點(diǎn)注射(5-6點(diǎn)，每點(diǎn)0.3ml)。兩周后用弗氏不完全佐劑與等量勻漿混勻，背部皮下多點(diǎn)注射(5-6點(diǎn)，每點(diǎn)0.3ml)，每兩周一次。用瓊脂雙擴(kuò)散法檢測血清抗體效價(jià)?？贵w效價(jià)達(dá)到1∶16時(shí)，頸總動脈放血，取血清，即為兔抗大鼠腎毒血清。分裝后，凍存于-20攝氏度備用。
檢測指標(biāo)(1)測給藥前(造模后)和給藥后8周的24h尿量及尿蛋白定量；(2)測給藥前(造模后)和給藥后8周的血尿素氮、肌苷、白蛋白、膽固醇、甘油三酯；(3)給藥后8周取腎臟稱重并做腎臟病理組織學(xué)檢查；(4)觀察藥后8周對靜脈血栓的影響在腎毒血清性病理模型基礎(chǔ)上，經(jīng)過四味清腎顆粒治療8周，制備大鼠實(shí)驗(yàn)性深靜脈血栓形成模型，觀察比較模型動物與給藥動物實(shí)驗(yàn)性血栓形成的情況[5]。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，用spss進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。
結(jié)果(1).四味清腎顆粒三個(gè)劑量組給藥8周后，均能顯著增加腎炎模型大鼠的24h尿量，減少24h尿蛋白含量。(2).給藥后8周高、中、低組均可降低血清尿素氮、肌酐、白蛋白的含量；高劑量組可以明顯降低甘油三脂的含量。(3).四味清腎顆粒三個(gè)劑量組連續(xù)給藥8周，雖然都能形成血栓，但能明顯減輕靜脈血栓的濕重和干重，明顯減少靜脈血栓的形成，與對照組比較有顯著性差異。(4).連續(xù)給藥8周，腎臟病理結(jié)果顯示，模型組腎小球增大，白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞浸潤，細(xì)胞數(shù)明顯增加，腎小球直徑明顯增大，與對照組比較有顯著性差異P＜0.001，表現(xiàn)出明顯的腎小球腎炎的病理改變。四味清腎顆粒高、中、低給藥組腎小球直徑及腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯降低，P＜0.001。
表2.給藥后血清白蛋白含量、BUN、Cre、膽固醇、甘油三酯的變化(n＝10，x±s)白蛋白 膽固醇 甘油三酯尿素氮 肌酐(g/l) (mmol/l) (mmol/l) (mmol/l) (umol/l)對照組37.88±1.14 1.66±0.400.76±0.135.30±0.7926.52±5.94模型組34.34±2.39*** 2.02±0.39* 1.48±0.83* 6.25±0.78* 40.10±8.92**陽性組37.81±1.23ΔΔ1.57±0.31Δ0.82±0.18Δ4.95±0.58ΔΔ29.03±5.15ΔΔ高劑量組 37.02±1.31ΔΔ1.87±0.620.92±0.43Δ4.92±0.53ΔΔ27.28±5.17ΔΔ中劑量組 37.23±1.72Δ1.73±0.550.81±0.26Δ5.18±0.72Δ29.59±5.00ΔΔ低劑量組 36.29±1.74 1.81±0.970.99±0.475.13±0.58Δ31.73±8.26
與對照組比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001.
表3.給藥8周后腎炎大鼠24h尿量及尿蛋白含量變化(n＝10，x±s)給藥前 給藥后組別尿量(ml) 尿蛋白(g/l) 尿量(ml) 尿蛋白(g/l) 腎重(g)對照組12.50±2.76 0.52±0.15 13.10±3.00 0.67±0.12 2.63±0.22模型組7.50±2.07**1.65±0.85** 7.6±1.71** 1.78±0.53*** 3.19±0.40**陽性組7.10±1.91*** 1.46±0.55*** 12.30±2.75ΔΔ0.80±0.27ΔΔΔ2.66±0.26ΔΔ高劑量組 6.9±2.02***1.52±0.68** 10.9±2.60ΔΔ0.79±0.37ΔΔ2.57±0.26ΔΔΔ中劑量組 7.0±1.49***1.78±0.83** 10.5±2.27ΔΔ0.94±0.34ΔΔ2.71±0.30Δ低劑量組 8.70±2.45**1.74±0.78** 10.5±2.22Δ0.97±0.41*ΔΔ2.76±0.53與對照組比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001。
表4.給藥8周后對深部靜脈血栓的影響(n＝10，x±s)血栓濕重(mg) 血栓干重(mg)對照組 14.51±2.26 4.76±1.57模型對照組 24.50±3.71***8.69±2.36**陽性藥組 12.72±5.36ΔΔΔ5.23±2.18ΔΔ高劑量組 13.06±1.91ΔΔΔ5.19±2.47ΔΔ中劑量組 18.32±8.68Δ5.87±2.82Δ低劑量組 15.53±4.79ΔΔΔ5.2±2.5ΔΔ與對照組比***P＜0.001.與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔΔP＜0.001.
表5.四味清腎顆粒對腎毒血清性腎炎模型腎小球直徑及腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)的影響(x±s)劑量(g/kg) 腎臟數(shù)/個(gè) 直徑/mm 細(xì)胞數(shù)/個(gè)空白對照組 --- 8 0.119±0.017105±22模型對照組 --- 8 0.146±0.013## 140±27##陽性藥組28mg/kg 8 0.131±0.016** 115±13**四味清腎顆粒高劑量組3.8 8 0.136±0.014** 114±15**四味清腎顆粒中劑量組1.9 8 0.133±0.026** 116±20**四味清腎顆粒低劑量組0.958 0.124±0.015** 116±16**與對照組比##P＜0.01.
與模型組比**P＜0.05，***P＜0.001.
三.對家兔C-BSA腎炎模型的影響檢測指標(biāo)造模前、造摸后(給藥前)、給藥3、6周分別測量24h尿量，尿蛋白含量，血清尿素氮(BUN)、肝酐(Cr)、膽固醇、甘油三脂、白蛋白。血及尿中β2-MG含量用放射免疫方法測定；腎臟組織學(xué)檢查給藥6周后取動物腎臟進(jìn)行病理學(xué)檢查，觀察組織形態(tài)變化并計(jì)算腎小球平均直徑和腎小球內(nèi)平均細(xì)胞數(shù)。
結(jié)果(1).對尿量和尿蛋白的影響給藥后第3周，四味清腎顆粒高、中、低劑量組對家兔C-BSA腎炎模型的24h尿量和尿蛋白有明顯的改善，給藥6周后作用更明顯，與模型組比較有顯著性差異。(2).對血清白蛋白、尿素氮、肌酐、膽固醇、甘油三脂的影響給藥3周后對白蛋白、膽固醇、甘油三脂有明顯的降低，對尿素氮、肌酐有降低的趨勢但與對照組比無顯著性差異；給藥6周后對以上5項(xiàng)有明顯的改善作用，與模型組比有顯著性差異。(3).對給藥后腎臟重量的影響給藥6周后四味清腎顆粒三個(gè)劑量組腎臟重量與模型組比較有顯著性差異。(4).對給藥后血及尿中B2-MG的影響給藥6周后四味清腎顆?？擅黠@降低血和尿中B2-MG的含量。(5).病理結(jié)果模型組腎小球增大，白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞浸潤，細(xì)胞數(shù)明顯增加，腎小球直徑明顯增大，與對照組比較有顯著性差異P＜0.001，表現(xiàn)出明顯的腎小球腎炎的病理改變.四味清腎顆粒高、中、低給藥組腎小球直徑及腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯降低，P＜0.001。
表6.四味清腎顆粒對家兔C-BSA腎炎模型24h尿量的影響(n＝10，x±s)劑量 給藥后組別 造模前 給藥前(g/kg)3周 6周對照組 - 115.38±33.11 114.13±48.171025.50±34.02 119.28±38.49模型組 - 96.13±9.93 66.25±22.17** 62.50±14.88*73.50±13.66*保腎康組 28mg/kg 123.25±44.52 65.75±19.83*97.50±30.94Δ106.00±27.30Δ高劑量組 3.8 96.13±24.7666.25±16.20*83.75±19.60Δ101.25±21.67Δ中劑量組 1.9 118.63±30.49 64.25±17.00*85.00±17.93Δ100.63±21.95Δ低劑量組 0.95 102.25±24.03 65.00±19.46*85.00±14.64Δ112.50±27.00Δ與對照組比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001.
表7. 四味清腎顆粒對家兔C-BSA腎炎模型尿蛋白含量的影響(n＝10，x±s)劑量給藥后組別 造模前給藥前(g/kg) 3周 6周對照組 - 0.37±0.220.39±0.190.55±0.26 0.43±0.10模型組 - 0.41±0.133.62±2.10** 4.36±1.62*** 6.00±4.13**保腎康組 28mg/kg0.41±0.232.45±1.14** 2.13±1.91*Δ0.51±0.30ΔΔ高劑量組3.8 0.50±0.233.10±1.73** 2.08±1.22*Δ0.57±0.29ΔΔ中劑量組1.9 0.45±0.263.19±1.76** 1.74±1.31*Δ0.67±0.46ΔΔ低劑量組0.95 0.41±0.202.40±1.45** 0.54±0.06ΔΔΔ0.47±0.16ΔΔ與對照組比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.。
與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001.
表8.對家兔C-BSA給藥6周對血清白蛋白、尿素氮、肌酐、膽固醇、甘油三脂影響(n＝10，x±s)總膽固醇甘油三酯 尿素氮肌酐白蛋白(g/l)(mol/l) (mmol/l) (mmol/l) (umol/l)對照組40.83±3.02 0.97±0.20 0.56±0.155.29±1.58 76.54±9.56模型組27.08±4.14***3.66±2.25*2.61±1.73* 8.34±1.60*102.79±11.56**陽性組37.21±5.79ΔΔ1.14±0.67Δ 0.74±0.29Δ 6.38±1.48Δ 80.91±16.15Δ高劑量組 36.35±3.75ΔΔ1.15±0.54Δ 0.39±0.10ΔΔ4.54±0.75ΔΔΔ 73.4±12.88ΔΔΔ中劑量組 40.09±3.67ΔΔΔ 0.85±0.13ΔΔ0.54±0.19ΔΔ5.69±1.32ΔΔ 86.90±14.22Δ低劑量組 41.08±6.37ΔΔΔ 0.97±0.38Δ 0.86±0.34Δ 6.66±1.74Δ 83.71±11.59Δ與對照組比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001.
表9.四味清腎顆粒對家兔C-BSA給藥6周對血清及尿液B2-MG的影響(n＝10，x±s)劑量給藥前(mg) 給藥6周(mg)(g/kg) 血尿 血 尿?qū)φ战M - 122±1347±13110±15 39±16模型組 - 178±31** 73±16** 165±31** 74±17***陽性組28mg/kg 173±28** 74±11** 118±13ΔΔ47±18ΔΔ高劑量組3.8 168±25** 72±19** 120±16ΔΔ44±11ΔΔ中劑量組1.9 171±30** 71±13** 116±10ΔΔ43±20Δ低劑量組0.95168±29** 73±14** 119±12ΔΔ48±13Δ
與對照組比**P＜0.01，***P＜0.001。
與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
表10.四味清腎顆粒對家兔C-BSA腎炎模型給藥6周后腎臟重量的影響(n＝10，x±s)組別 劑量(g/kg) N(只)腎臟重(g)對照組 - 814.94±1.41模型組 - 827.12±7.02**保腎康組 28mg/kg 816.23±2.52Δ高劑量組3.8 815.87±2.19ΔΔ中劑量組1.9 816.59±2.79Δ低劑量組 0.95 817.59±2.84ΔΔ與對照組比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001.
表11.四味清腎顆粒對C-BSA腎炎模型腎小球直徑及腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)的影響(x±s)劑量(g/kg) 腎臟數(shù)/個(gè) 直徑/mm 細(xì)胞數(shù)/個(gè)空白對照組 --- 8 0.139±0.027 112±26模型對照組 --- 8 0.197±0.022### 197±51###陽性藥組 28mg/kg 8 0.153±0.018**124±32**四味清腎顆粒高劑量組 3.8 8 0.163±0.021**126±23***四味清腎顆粒中劑量組 1.9 8 0.162±0.029**140±25**四味清腎顆粒低劑量組 0.95 8 0.163±0.025**143±56*與對照組比###P＜0.001；與模型組比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
四.對小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響取ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，每組10只?？瞻讓φ战M灌胃給等容量蒸餾水；陽性藥保腎康片156mg/Kg，四味清腎顆粒高、中、低劑量組6.8、3.4、1.2g/Kg，灌胃給藥，每日一次，連續(xù)7日，于末次給藥后1小時(shí)，尾靜脈注射印度墨汁10ml/kg。并于5、10、15、20分鐘各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)眥取血20ul，加入0.1％NaCO32ml中搖勻，在600nm下測定各樣光密度(OD)，最后將小鼠處死，分別稱取肝重、脾重。按以下公式計(jì)算廓清指數(shù)K或校正廓清指數(shù)a。
K＝logOD1-logOD2/t2-t11；a＝3K*體重/(肝重+脾重)，
計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，給藥組與對照組進(jìn)行組間t-檢驗(yàn)。
結(jié)果四味清腎顆粒連續(xù)灌胃給藥7天，能明顯提高K值和a值，表明對單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有明顯的增強(qiáng)作用，各劑量組與對照組比較有顯著差異。
表12.對小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響用(n＝10，x±s)組別 劑量(g/kg) 吞噬指數(shù)K吞噬活性a對照組 - 0.039±0.011 5.33±1.54陽性藥 55(mg/kg) 0.049±0.021 6.99±1.32*高劑量 13.52 0.067±0.022**7.88±2.15**中劑量 6.76 0.072±0.019*** 7.22±1.98*低劑量 3.38 0.056±0.024* 6.57±2.13注與空白組相比*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001.
五.對小鼠溶血素抗體生成的影響取小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分成5組，每組10只?？瞻讓φ战M灌胃給等容量蒸餾水；陽性藥保腎康110mg/kg；四味清腎顆粒高、中、低組13.5、6.8、3.4g(生藥量)/Kg，灌胃給藥，每日一次，連續(xù)8日。各組于給藥后第2天腹腔注射3∶5稀釋的綿羊紅細(xì)胞懸液(SRBC)0.2ml/只，進(jìn)行免疫，于免疫后第6天即實(shí)驗(yàn)第8天內(nèi)眥取血，放置1小時(shí)，2000rpm離心10分鐘，取血清，生理鹽水稀釋500倍備用，進(jìn)行溶血素測定。
計(jì)算按以下公式計(jì)算每只小鼠樣品的半數(shù)溶血值HC50。
計(jì)算各組HC50的平均值，對各給藥組與對照組進(jìn)行組間t-檢驗(yàn)。
結(jié)果四味清腎顆粒連續(xù)灌胃給藥8天，對小鼠溶血素抗體生成具有明顯的促進(jìn)作用(P＜0.05-0.01)。
表13.對小鼠溶血素抗體生成的影響(n＝10)組別 劑量(g/kg)HC50(x±s)對照組 - 155.6±34.3保腎康 110(mg/kg) 246.5±36.1*高劑量13.52245.7±29.8**中劑量6.76 223.4±35.2**低劑量3.38 317.3±37.6**
注與對照組比較*P＜0.05**P＜0.01.
六.急性血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響取SD大鼠60只，雌雄各半，180-200g，隨機(jī)分成6組，每組10只。對照組既空白組、模型組造模后給等容量生理鹽水、陽性藥組給保腎康片55mg/kg、受試物四味清腎顆粒高、中、低劑量組9.4、4.7、2.3(生藥量)g/kg。給藥量10ml/kg。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7天。于第7天(末次給藥后)在大白鼠皮下注射腎上腺素0.8ml/kg，共2次，間隔4h，在第1次注射腎上腺素后2h將大鼠浸入冰水5min(0℃)，第2次注射腎上腺素后停食，造成急性血瘀大鼠模型。次晨取血測血液流變學(xué)指標(biāo)，內(nèi)眥取血，肝素抗凝。
結(jié)果四味清腎顆粒各劑量組能明顯降低急性血瘀大鼠全血粘度，升高紅細(xì)胞變形性，降低其凝聚性；對血漿粘度無明顯影響。
表14對急性血瘀大鼠血液流變學(xué)的影響(n＝6，x±s)劑量 全血粘度/mpa.s血漿粘度組別(g/kg) 高切 低切/mpa.s空白組- 4.59±0.51 8.26±0.14 1.41 ±0.35模型組- 8.95±1.12** 15.3±1.61**1.59±0.29保腎康55(mg/kg) 6.87±0.98ΔΔ12.28±1.36ΔΔ1.55±0.31高劑量組9.4 6.51±0.64ΔΔ12.33±1.35ΔΔ1.49±0.32中劑量組4.68 7.13±0.71ΔΔ13.47±1.2Δ1.51±0.27低劑量組2.34 7.24±0.52ΔΔ13.38±1.59 1.54±0.36與對照組比**P＜0.01。
與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，ΔΔΔP＜0.001.
表15.對急性血瘀大鼠紅細(xì)胞變形性和聚集性的影響(n＝6，x±s)劑量紅細(xì)胞變形性 紅細(xì)胞變形性組別(g/kg) MAXDI SSS MAXD SS空白組- 0.75±0.02 285.95±35.00.39±0.12 69.00±34.02模型組- 0.64±0.04** 354.95±31.0** 1.25±0.21**263.98±34.97**保腎康55(mg/kg) 0.72±0.03ΔΔ367.97±40.10.88±0.14ΔΔ199.00±51.00ΔΔ高劑量組9.4 0.76±0.05ΔΔ374.98±38.90.69±0.25ΔΔ175.00±32.01ΔΔ中劑量組4.68 0.77±0.02ΔΔ335.98±42.10.68±0.16ΔΔ180.98±34.98ΔΔ低劑量 2.34 0.71±0.05Δ354.02±33.90.64±0.14ΔΔ186.98±51.02ΔΔ與對照組比**P＜0.01。與模型組比ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01。
結(jié)論1.四味清腎顆粒連續(xù)灌胃給藥3天，各給藥組對正常水負(fù)荷大鼠24h尿量和Na+、K+、cl-含量有明顯的增加，與對照組比較有顯著性差異(P＜0.05-0.01)。2.四味清腎顆粒連續(xù)灌胃給藥治療8周后，各劑量組均能顯著增加腎毒血清性腎炎模型大鼠的24h尿量，減少24h尿蛋白含量；給藥后8周后組均可降低血清尿素氮、肌酐、白蛋白的含量；高劑量組可以明顯降低甘油三脂的含量；連續(xù)給藥8周，能明顯減輕靜脈血栓的濕重和干重，明顯減少靜脈血栓的形成，與對照組比較有顯著性差異；連續(xù)給藥8周，病理結(jié)果顯示，模型組腎小球增大，白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞浸潤，細(xì)胞數(shù)明顯增加，腎小求直徑明顯增大，表現(xiàn)出明顯的腎小球腎炎的病理改變。四味清腎顆粒高、中、低給藥組腎小球直徑及腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯降低，明顯改善腎毒血清性腎炎模型的病理改變。3.四味清腎顆粒對家兔C-BSA腎炎模型，給藥治療第3周后，家兔的24h尿量和尿蛋白有明顯的降低，給藥6周后作用更明顯；給藥3周后對白蛋白、膽固醇、甘油三脂有明顯的降低，對尿素氮、肌酐有降低的趨勢，給藥6周后對以上5項(xiàng)有明顯的改善作用，與模型組比有顯著性差異；治療給藥6周后四味清腎顆?？擅黠@減輕腎炎家兔的腎重；對給藥后血及尿中B2-MG含量明顯降低。病理結(jié)果顯示，模型組腎小球增大，白細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞浸潤，細(xì)胞數(shù)明顯增加，腎小求直徑明顯增大，與對照組比較有顯著性差異P＜0.001，表現(xiàn)出明顯的腎小球腎炎的病理改變。四味清腎顆粒高、中、低給藥組腎小球直徑及腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯降低，明顯改善家兔C-BSA腎炎模型的病理改變。4.四味清腎顆粒連續(xù)灌胃給藥7天，對單核巨噬細(xì)胞的吞噬功能具有明顯的增強(qiáng)作用。5.四味清腎顆粒連續(xù)灌胃給藥8天，對小鼠溶血素抗體生成具有明顯的促進(jìn)作用。6.四味清腎顆粒各劑量組能明顯降低急性血瘀大鼠全血黏度，升高紅細(xì)胞變形性，降低其凝聚性。
腎小球疾病其發(fā)病機(jī)制皆是由于免疫介導(dǎo)性疾病，由免疫引起炎癥導(dǎo)致腎小球損害-即循環(huán)免疫復(fù)合物沉積、抗腎小球基底膜抗體行成、原位免疫復(fù)合物沉積、不溶性或難溶性免疫復(fù)合物等，但在慢性進(jìn)展中也有非免疫炎癥參與；腎小球疾病的病理改變因類型不同，慢性腎炎可由多種病理類型引起；病理生理改變主要以大量蛋白尿，血漿蛋白減少，高脂血癥及腎功損害為主。
通過動物模型，本藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)著重對彌漫性腎小球腎炎進(jìn)行研究。家兔C-BSA腎炎模型是一種異種血清免疫復(fù)合物模型，其一系列病理改。變造成腎小球損害。其中，血液中免疫復(fù)合物在腎小球基底膜的沉積是造成腎小球損害的重要因素，蛋白尿的出現(xiàn)與免疫損傷造成腎小球基底膜分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。尿中蛋白的含量常反映腎小球的病變程度。經(jīng)過6周的治療給藥，四味清腎顆粒通過降低尿蛋白含量、降低血清白蛋白、肌酐、尿素氮、甘油三脂、膽固醇與血中和尿中B2-MG含量的結(jié)果表明，四味清腎顆?？擅黠@減輕膜性腎炎模型動物機(jī)體的免疫損傷和腎小球病變程度，對腎小球?yàn)V過功能有所改善。腎小球直徑及腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯降低，明顯改善家兔C-BSA腎炎模型的病理改變。
通過8周治療給藥，四味清腎顆粒對腎小球毛細(xì)血管基底膜病變---大鼠腎毒血清性腎炎有明顯的改善。腎小球毛細(xì)血管基底膜病變導(dǎo)致血漿白蛋白減少，水腫，高血脂等改變。通過實(shí)驗(yàn)顯示，四味清腎顆粒有明顯的利尿、降低尿蛋白；明顯升高血漿白蛋白、降低膽固醇、肌酐和尿素氮來改善腎功能和腎小球病變。腎小球直徑及腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)明顯降低，明顯改善腎毒血清性腎炎模型的病理改變。
此外，四味清腎顆粒還具有提高單核巨噬細(xì)胞吞噬功能而有助于免疫復(fù)合物的清除，而減少了免疫復(fù)合物的沉積。腎小球疾病同時(shí)伴有血液粘度升高、循環(huán)阻力增大等病理改變，同時(shí)伴有血栓形成等等，四味清腎顆粒通過對急性血瘀大鼠血液流邊學(xué)的影響，對深部靜脈血栓的影響，可以明顯的改善腎炎的高凝狀態(tài)，減少并發(fā)癥的發(fā)生，明顯改善腎功能。通過動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四味清腎顆粒是一個(gè)對腎小球疾病，尤其是彌漫性腎炎有明顯治療效果的中藥制劑，該實(shí)驗(yàn)為其臨床應(yīng)用提供了很的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
下述實(shí)施例均能實(shí)現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)例的效果。
實(shí)施例1顆粒劑虎杖900克白花蛇舌草900克白茅根600克紅花200克以上四味，虎杖、白花蛇舌草用70％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)；合并乙醇提取液，濾過；濾取上清液；回收乙醇至相對密度1.10(60℃測)；噴霧干燥成細(xì)粉，備用；另取白茅根、紅花加水煎煮2次，每次2小時(shí)；合并水煎液，濾過；濾取上清液，濃縮至相對密度1.20(60℃測)；加乙醇至醇含量為70％；徐徐攪拌，靜置過夜；濾取上清液；濃縮至相對密度1.10(60℃測)；噴霧干燥成細(xì)粉；將上述兩細(xì)粉加入適量糊精后混勻制成1000克顆粒，即得。每日2次每次1袋，口服。
實(shí)施例2口服液虎杖700克 白花蛇舌草700克白茅根500克 紅花100克以上四味，虎杖、白花蛇舌草用70％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)；合并乙醇提取液，濾過；濾取上清液；回收乙醇至相對密度1.10(60℃測)備用；另取白茅根、紅花加水煎煮2次，每次2小時(shí)；合并水煎液，濾過；濾取上清液，濃縮至相對密度1.20(60℃測)；加乙醇至醇含量為70％；徐徐攪拌，靜置過夜；濾取上清液；濃縮至相對密度1.10(60℃測)；將上述兩濃縮上清液混勻加入矯味劑，經(jīng)常規(guī)制成1000ml口服液，即得。每日3次，每次1瓶，口服。
實(shí)施例3片劑虎杖1000克 白花蛇舌草1000克 白茅根800克紅花300克以上四味，虎杖、白花蛇舌草用70％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)；合并乙醇提取液，濾過；率取上清液；回收乙醇至相對密度1.10(60℃測)；噴霧干燥成細(xì)粉，備用；另取白茅根、紅花加水煎煮2次，每次2小時(shí)；合并水煎液，濾過；濾取上清液，濃縮至相對密度1.20(60℃測)；加乙醇至醇含量為70％；徐徐攪拌，靜置過夜；濾取上清液；濃縮至相對密度1.10(60℃測)；噴霧干燥成細(xì)粉；將上述兩細(xì)粉加入適量乙醇、糊精、硬脂酸鎂后混勻壓片，制成1000片。每日3次，每次4片，口服。
權(quán)利要求
1.一種治療原發(fā)性腎小球疾病的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物主要是由下述原料藥制成的虎杖600-1100重量份白花蛇舌草600-1100重量份白茅根400-800重量份 紅花100-400重量份。
2.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物主要是由下述原料藥制成的虎杖900重量份 白花蛇舌草900重量份白茅根600重量份紅花200重量份。
3.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物主要是由下述原料藥制成的虎杖700重量份 白花蛇舌草700重量份白茅根500重量份紅花100重量份。
4.如權(quán)利要求1所述的中藥組合物，其特征在于該中藥組合物主要是由下述原料藥制成的虎杖1000重量份白花蛇舌草1000重量份白茅根 800重量份 紅花300重量份。
5.如權(quán)利要求1-4所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于該方法為以上四味，虎杖、白花蛇舌草用60-80％乙醇回流提取2-4次，每次1.5-3.5小時(shí)；合并乙醇提取液，濾過；濾取上清液；回收乙醇至相對密度1.10(50-70℃測)；噴霧干燥成細(xì)粉，備用；另取白茅根、紅花加水煎煮1-3次，每次1.5-3.5小時(shí)；合并水煎液，濾過；濾取上清液，濃縮至50-70℃測相對密度1.20；加乙醇至醇含量為70％；徐徐攪拌，靜置過夜；濾取上清液；濃縮至50-70℃測相對密度1.10；噴霧干燥成細(xì)粉；將上述兩細(xì)粉加入藥學(xué)上可接受的賦型劑，按照常規(guī)的制劑工藝制備成丸劑、片劑、顆粒劑、口服液體制劑、膠囊劑、咀嚼劑中的任一種。
6.如權(quán)利要求5所述的中藥組合物的制備方法，其特征在于制成顆粒劑的方法為以上四味，虎杖、白花蛇舌草用70％乙醇回流提取3次，每次2小時(shí)；合并乙醇提取液，濾過；濾取上清液；回收乙醇至60℃測相對密度1.10；噴霧干燥成細(xì)粉，備用；另取白茅根、紅花加水煎煮2次，每次2小時(shí)；合并水煎液，濾過；濾取上清液，濃縮至60℃測相對密度1.20；加乙醇至醇含量為70％；徐徐攪拌，靜置過夜；濾取上清液；濃縮至60℃測相對密度1.10；噴霧干燥成細(xì)粉；將上述兩細(xì)粉加入適量糊精后混勻制成顆粒劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療原發(fā)性腎小球疾病的中藥組合物及其制備方法。該組合物主要由虎杖、白花蛇舌草、白茅根、紅花組成。該中藥組合物制備時(shí)虎杖、白花蛇舌草用60－80％乙醇回流提取，濾取上清液;回收乙醇至相對密度1.10(50－70℃測)，噴霧干燥成細(xì)粉備用；另取白茅根、紅花加水煎煮合并水煎液，濾過；濾取上清液，濃縮，加乙醇，濾取上清液，濃縮，噴霧干燥成細(xì)粉；將上述兩細(xì)粉加入藥學(xué)上可接受的賦型劑，按照常規(guī)的制劑工藝制備成臨床可接受的顆粒劑、膠囊等藥物劑型。本發(fā)明組合物具有很好的治療原發(fā)性腎小球疾病的效果，不產(chǎn)生副作用，還能夠整體調(diào)節(jié)患者機(jī)體狀態(tài)，改善其他綜合指標(biāo)。
文檔編號A61P13/12GK1491717SQ0316000
公開日2004年4月28日 申請日期2003年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月19日
發(fā)明者圖婭, 孟鳳仙, 圖 婭 申請人:張旭, 張 旭