專利名稱：基因重組人溶菌酶針對(duì)冠狀病毒sars在制藥中的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因重組人溶菌酶的新用途，特別是涉及制藥領(lǐng)域中基因重組人溶菌酶在針對(duì)冠狀病毒SARS的新用途。
背景技術(shù)：
抗生素創(chuàng)造了許多醫(yī)學(xué)奇跡，使許多疾病消失無蹤，如肺炎、腦膜炎、產(chǎn)褥熱、敗血癥、結(jié)核等。21世紀(jì)的今天，冠狀病毒sars是一種RNA的變異病毒，具有極強(qiáng)的傳染性，給人們的生活和工作都帶來了很大的影響，目前還沒有找到根治的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因重組人溶菌酶在針對(duì)冠狀病毒SARS在制藥中的新用途。
實(shí)際上，本發(fā)明涉及基因重組人溶菌酶作為制備預(yù)防和抑制冠狀病毒SARS的制藥中的應(yīng)用。
為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用基因重組人溶菌酶的藥理試驗(yàn)及結(jié)果來說明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。
基因重組人溶菌酶以配制200毫升培養(yǎng)基為準(zhǔn)，用磷酸6毫升、硫酸鎂3克，硫酸鉀4克，氫氧化鉀1克，硫酸鈣1.5克，加蒸餾水至200毫升，高壓滅菌后接種甘油管種子，搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20-35℃，在恒溫床上培養(yǎng)36-48小時(shí)。進(jìn)行種子罐培養(yǎng)，最后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。將凍干粉2mg，溶于水中制得針劑即每瓶30000U/mg備用；制得氣霧劑、滴劑每瓶5ml每ml10000U備用；制得粉劑2mg備用。
基因重組人溶菌酶藥物體外預(yù)防、抑制冠狀病毒的藥效在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，采用病毒CPE法，觀察不同濃度的重組人溶菌酶藥物對(duì)冠狀病毒的預(yù)防、抑制的效果。
實(shí)驗(yàn)例一、試驗(yàn)材料1.驗(yàn)證藥物重組人溶菌酶 蛋白含量4.3845mg由長(zhǎng)春奇龍生物技術(shù)研究所提供2.陽(yáng)性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋批號(hào)020802由湖北科益藥業(yè)股份有限公司提供。
3.細(xì)胞人宮頸癌傳代細(xì)胞(HELA)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒資源中心提供。
4.病毒冠狀病毒04號(hào)分離株(SARS病人血清04號(hào)標(biāo)本)由佑安醫(yī)院提供。
5.CO2培養(yǎng)箱NUAIR US AUTO FLOW提供6.(XSZ-D2)由重慶光學(xué)儀器廠生產(chǎn)7.其它試劑、器材等均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒資源中心提供。二、試驗(yàn)方法預(yù)備試驗(yàn)1.重組人溶菌酶對(duì)HELA細(xì)胞的毒性測(cè)定
HELA細(xì)胞以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃、5％CO2培養(yǎng)2小時(shí)，加入驗(yàn)證藥物，重組人溶菌酶倍比稀釋為6000ug/ml～11.7ug/ml，陽(yáng)性對(duì)照藥物更昔洛韋稀釋為6000ug/ml～11.7ug/ml，每濃度接種3孔，每孔100μl，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)6天，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化(CPE)，以25％以下形態(tài)變化為“+”，26％～50％形態(tài)變化為“++”，51％～75％形態(tài)變化為“+++”，76％～100％形態(tài)變化為“++++”，用Reed-Muench法，計(jì)算藥物半數(shù)中毒濃度(TD50)和最大無毒濃度(TD0)。2.在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的毒力的測(cè)定冠狀病毒04號(hào)的分離(SARS病人血清分離)HELA細(xì)胞以每毫升40萬濃度接種試管，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，每管加入SARS病人血清0.2ml，33℃轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)5小時(shí)后，加入維持液1ml，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，33℃轉(zhuǎn)鼓培養(yǎng)5～7天。細(xì)胞出現(xiàn)CPE變化后，采用PCR的方法檢測(cè)冠狀病毒，04號(hào)標(biāo)本PCR陽(yáng)性，確定為冠狀病毒分離株。用終末稀釋法純化病毒2次，PCR檢測(cè)冠狀病毒仍為陽(yáng)性，經(jīng)免疫熒光測(cè)定雙份SARS病人血清，IgM陽(yáng)性，IgG4倍升高，確定為冠狀病毒。采用病毒CPE法測(cè)定其效價(jià)。病毒CPE法HELA細(xì)胞以每毫升40萬濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時(shí)，加入病毒液，病毒稀釋10-1～10-5，5個(gè)濃度，每濃度3孔，每孔100μl，設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照，37℃5％CO2培養(yǎng)5～7天，每24小時(shí)在倒置顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞形態(tài)變化(CPE)以25％以下變化為“+”，26％～50％變化為“++”，5 1％～75％為“+++”，76％～100％變化為“++++”，用Reed-Muench法，計(jì)算病毒半數(shù)感染濃度TCID50。正式試驗(yàn)重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的抑制作用試驗(yàn)?zāi)康挠^察不同濃度的重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的抑制作用，試驗(yàn)采用病毒細(xì)胞(CPE)法，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)TI，判斷藥效。
HELA細(xì)胞以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)至單層，棄掉培養(yǎng)液，加入100 TCID50的冠狀病毒液，置37℃5％CO2吸附2小時(shí)后，棄掉病毒液，加入不同濃度的重組人溶菌酶藥液，藥物選用對(duì)細(xì)胞的最大無毒濃度(TD0)2倍稀釋10個(gè)濃度即750μg/ml～1.46μg/ml，陽(yáng)性對(duì)照藥物更昔洛韋為2倍稀釋10個(gè)濃度即6000μg/ml～1.46μg/ml，將稀釋的藥物分別加入細(xì)胞孔內(nèi)，每濃度3孔，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對(duì)照出現(xiàn)+++-++++時(shí)結(jié)束試驗(yàn)，用Reed-Muench法，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)(TI)判斷藥效，試驗(yàn)重復(fù)三次。重組人溶菌酶對(duì)冠狀病毒04號(hào)的預(yù)防作用試驗(yàn)?zāi)康挠^察不同濃度的重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的預(yù)防作用，試驗(yàn)采用病毒細(xì)胞(CPE)法，計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)TI，判斷藥效。
HELA細(xì)胞以40萬/ml濃度接種96孔培養(yǎng)板，37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)至單層，棄掉培養(yǎng)液，加入不同濃度的重組人溶菌酶藥液，藥物選用對(duì)細(xì)胞的最大無毒濃度(TD0)2倍稀釋10個(gè)濃度即750μg/ml～1.46μg/ml，陽(yáng)性對(duì)照藥物更昔洛韋為2倍稀釋13個(gè)濃度即6000μg/ml～1.46μg/ml，將稀釋的藥物分別加入細(xì)胞孔內(nèi)，每濃度3孔，置37℃5％CO2吸附2.5小時(shí)后，加入100 TCID50的冠狀病毒液，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7天，逐日在倒置顯微鏡下觀察病毒CPE，以病毒對(duì)照出現(xiàn)+++-++++時(shí)結(jié)束試驗(yàn)，用Reed-Muench法計(jì)算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)(TI)判斷藥效，試驗(yàn)重復(fù)三次。三、試驗(yàn)結(jié)果預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果重組人溶菌酶對(duì)HELA細(xì)胞的毒性作用由長(zhǎng)春奇龍生物技術(shù)研究所提供的重組人溶菌酶和陽(yáng)性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)，采用細(xì)胞形態(tài)變化(CPE)法。計(jì)算藥物最大無毒濃度(TD0)和半數(shù)中毒濃度(TD50)，以下試驗(yàn)結(jié)果為三次試驗(yàn)結(jié)果的均值。1.重組人溶菌酶對(duì)HELA細(xì)胞的毒性試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證藥物重組人溶菌酶最大無毒濃度(TD0)為750±0μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為1500±0μg/ml陽(yáng)性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋最大無毒濃度(TD0)為＞6000±0μg/ml，半數(shù)中毒濃度(TD50)為＞6000±0μg/ml。2.在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)毒力測(cè)定結(jié)果(TCID50)冠狀病毒04號(hào)半數(shù)感染量(TCID50)為10-3，見圖1。正式試驗(yàn)結(jié)果，見圖1。重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的抑制作用(以下試驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次試驗(yàn)結(jié)果的均值)驗(yàn)證藥物重組人溶菌酶CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為23.4±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為46.8±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為16。陽(yáng)性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為11.7μg/ml±0，最小有效濃度(MIC)為23.44μg/ml±0，治療指數(shù)(TI)為256。重組人溶菌酶在HELA細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對(duì)冠狀病毒04號(hào)的預(yù)防作用(以下試驗(yàn)數(shù)據(jù)為三次試驗(yàn)結(jié)果的均值)驗(yàn)證藥物重組人溶菌酶CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為5.9±0μg/ml，最小有效濃度(MIC)為11.7±0μg/ml，治療指數(shù)(TI)為64。陽(yáng)性對(duì)照藥物注射用更昔洛韋CPE法，藥物半數(shù)有效濃度(IC50)為11.7μg/ml±0，最小有效濃度(MIC)為23.44μg/ml±0，治療指數(shù)(TI)為256。
以上結(jié)果，可以得出本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于基因重組人溶菌酶發(fā)掘了新的醫(yī)療用途，開拓了一個(gè)新的應(yīng)用領(lǐng)域?；蛑亟M人溶菌酶使用安全無毒副作用，有很好的藥用前景?；蛑亟M人溶菌酶來源豐富，制備工藝簡(jiǎn)單，并可做成各種注射劑、片劑、顆粒劑、氣霧劑、滴劑等，使用方便，用法與用量靜脈注射成人每日1～3次，每次100萬U～300萬U，小兒每日1～3次，每次50萬U～200萬U。氣霧劑直接噴霧作用于病灶局部給藥，每日1～6次，每次1500u～30000u成人與小兒相同。滴劑直接作用于病灶局部給藥每日1～6次，每次1500u～30000u。片劑、膠囊劑、顆粒劑成人每日1～3次，每次100萬u～300萬u。小兒每日1～3次，每次50萬u～150萬u。


圖1冠狀病毒04號(hào)。
圖2冠狀病毒04號(hào)半數(shù)感染量(TCID50)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的描述實(shí)施例1將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種人溶菌酶菌株、搖床轉(zhuǎn)數(shù)為每分鐘250轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為20℃，在恒溫床上培養(yǎng)36小時(shí)。進(jìn)行種子罐培養(yǎng)，最后進(jìn)行生產(chǎn)罐培養(yǎng)。并將發(fā)酵表達(dá)完成的培養(yǎng)液進(jìn)行提取純化，對(duì)提取純化的蛋白濃縮液進(jìn)行凍干，測(cè)得蛋白活性后保存。取人溶菌酶凍干粉1％，磷酸鹽緩沖液5mM(pH5.0)90％；制成注射劑，主要用于冠狀病毒SARS(非典型性肺炎)疾病。
實(shí)施例2將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種人溶菌酶菌株、在恒溫床上培養(yǎng)40小時(shí)后，再將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成含人溶菌酶凍干粉0.1％、磷酸鹽緩沖液20mM(pH7.0)80％、25％丙三醇、5/萬吐溫80的氣霧劑。
實(shí)施例3將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種人溶菌酶菌株、在恒溫床上培養(yǎng)36小時(shí)后，再將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成含人溶菌酶凍干粉0.005％、磷酸鹽緩沖液10(pH6.0)80％、20％丙三醇、6％2-吡咯烷酮-5-羧酸鈉、0.9％水溶性氮酮、3/萬吐溫80的滴劑。
實(shí)施例4將培養(yǎng)基高壓滅菌后，接種人溶菌酶菌株、在恒溫床上培養(yǎng)40小時(shí)后，再將培養(yǎng)液進(jìn)行純化制成膠囊劑、片劑、顆粒劑。其含人溶菌酶凍干粉10％、藥用淀粉50、藥用糊精25％、磷酸鹽緩沖液10mM(pH6.0)、蔗糖5％。
權(quán)利要求
1.基因重組人溶菌酶涉及作為一種制備預(yù)防冠狀病毒SARS的藥中的應(yīng)用。
2.基因重組人溶菌酶涉及作為一種制備抑制冠狀病毒SARS藥中的應(yīng)用。
3.基因重組人溶菌酶涉及作為一種制備預(yù)防和抑制冠狀病毒SARS的藥物包括注射劑、片劑、膠囊、顆粒劑、氣霧劑、滴劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基因重組人溶菌酶的新用途，特別是涉及制藥領(lǐng)域中基因重組人溶菌酶在預(yù)防和抑制冠狀病毒SARS的新用途?？勺龀勺⑸鋭⑵瑒?、膠囊、顆粒劑、氣霧劑、滴劑。其來源豐富，制備工藝簡(jiǎn)單，使用安全方便，無毒副作用，具有很好的藥用前景。
文檔編號(hào)A61P31/14GK1449822SQ0312701
公開日2003年10月22日 申請(qǐng)日期2003年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月4日
發(fā)明者張華 , 安米, 安獻(xiàn)祿, 李元 申請(qǐng)人:長(zhǎng)春奇龍生物技術(shù)研究所