專利名稱：金屬蛋白酶-4的人組織抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新鑒定的多核苷酸，由該多核苷酸編碼的多肽，該多核苷酸和多肽的應(yīng)用以及該多核苷酸和多肽的生產(chǎn)。更具體地說，本發(fā)明的多肽是金屬蛋白酶-4多肽的人組織抑制劑，下文稱為“人TIMP-4”。本發(fā)明還涉及對該多肽的作用的抑制。
背景技術(shù)：
胞外基質(zhì)是一種復(fù)合結(jié)構(gòu)，它含有膠原，蛋白聚糖，糖胺聚糖，糖蛋白(纖連蛋白，軟骨粘連蛋白，層粘連蛋白)，且在有些組織中還含有彈性蛋白(Hay，E.D.，細(xì)胞生物學(xué)雜志.91205-223(1981))。
基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP′s)構(gòu)成鋅結(jié)合內(nèi)肽酶的主要部分，鋅結(jié)合內(nèi)肽酶在正常生理和有些病理過程中在結(jié)締組織的重建中降解胞外基質(zhì)蛋白，例如結(jié)締組織，膠原和明膠。MMP的過度活性可導(dǎo)致廣泛的組織降解，且這些酶涉及各種疾病過程，包括腫瘤細(xì)胞侵入，腫瘤血管生成和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Okada，Y.等，生物化學(xué)雜志，26114245-14255(1986))。MMP作為無活性的酶原從細(xì)胞中分泌，且其在胞外環(huán)境中的活性受各種激活劑和抑制劑的調(diào)節(jié)(Matrisian，L.M.，Trends Genet.，6121-125(1990))。
金屬蛋白酶介導(dǎo)的蛋白水解的調(diào)節(jié)可受天然存在的抑制劑蛋白，如金屬蛋白酶的組織抑制劑(TIMP)引發(fā)。MMP的生產(chǎn)和活化之間的平衡，以及它們被天然抑制劑如TIMP的抑制，無論在生理還是病理情況下，決定著結(jié)締組織是否被降解。
MMP包括許多蛋白酶，例如間質(zhì)(I型)膠原酶本身，溶基質(zhì)素(也稱為蛋白聚糖酶或transin)，成纖維細(xì)胞和多形核白細(xì)胞明膠酶(也稱為膠原IV酶)，和“pump-1”(推斷的金屬蛋白酶1，子宮金屬蛋白酶)〖Goldberg等，生物化學(xué)雜志26106600(1986)；Witham等，生化雜志，240913(1986)；Breathnach等，核酸研究，151139(1987)；Muller等，生化雜志，253187(1988)；Collier等，生物化學(xué)雜志，2636579(1988)；Murphy等，生化雜志，258463(1989)；Quantin等，生化，(N.Y.)，285327(1989)；Birkedal-Hansen，口腔病理學(xué)雜志，17445(1988)〗。
一般來說，蛋白酶的哺乳動物家族具有一種或多種下列特征(a)在大約中性pH時的最佳蛋白水解活性；(b)酶活性依賴于鋅的存在，證據(jù)為當(dāng)用二價金屬離子螯合劑如1.10鄰二氮雜菲(優(yōu)先螯合鋅)或EDTA(螯合特性限制較少；EDTA和EGTA也通過螯合為酶穩(wěn)定性所需的鈣離子導(dǎo)致酶失活)處理時失去活性；(c)受TIMP抑制；(d)中性含鋅金屬蛋白酶其它家族的已知抑制劑，如熱分解，血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶和腦啡肽酶缺乏明顯的抑制作用；(e)生物合成并以潛伏前體形式(酶原)分泌，需要胞外激活。以許多內(nèi)切蛋白酶，有機(jī)汞制劑和離液劑實(shí)現(xiàn)活化。
一般來說，中性金屬蛋白酶家族的成員有明顯的底物特異性。因此，膠原酶I型在其裂解間質(zhì)膠原(例如，I，II和III型)天然纖絲內(nèi)的特異性肽鍵的能力上有專一性。明膠酶對這些膠原只有微弱的活性，便能降解變性的間質(zhì)膠原及非纖維性膠原，例如IV型，如在基底膜中發(fā)現(xiàn)的。pumpl據(jù)報道優(yōu)先作用于變性的膠原(明膠)，盡管其特征不同于溶基質(zhì)素或膠原酶IV型。溶基質(zhì)素和明膠酶也能降解非膠原性結(jié)構(gòu)蛋白，如蛋白聚糖的核心蛋白和彈性蛋白。在細(xì)胞與基質(zhì)和細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用中涉及的大分子，如層粘連蛋白和纖連蛋白也對由一些這類金屬蛋白酶引起的降解敏感。
這一家族的酶由滑膜和皮膚成纖維細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，外周單核細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞和牙齦組織產(chǎn)生，也存在于多形核白細(xì)胞(PMNL)的顆粒儲存泡囊內(nèi)。
目前的信息表明存在一個金屬蛋白酶抑制劑的家族，包括TIMP-1(金屬蛋白酶1的組織抑制劑)；TIMP-2；已被克隆、表達(dá)并定位于人染色體22上的人TIMP-3；金屬蛋白酶的雞組織抑制劑(ChIMP-5)。本發(fā)明的多肽根據(jù)氨基酸序列的同源性經(jīng)推斷鑒定為新的人TIMP多肽。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一個是人TIMP-4的新的成熟多肽及其生物學(xué)有活性的和診斷上或治療上有用的片段，類似物和衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了分離的編碼人TIMP-4的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因組DNA及其有生物活性的和診斷或治療上有用的片段，類似物及衍生物。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了通過重組技術(shù)生產(chǎn)這一多肽的方法，包括在促進(jìn)該蛋白質(zhì)表達(dá)的條件下培養(yǎng)含有人TIMP-4核酸序列的重組的原核和/或真核宿主細(xì)胞及隨后回收上述蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了治療涉及人TIMP-4活性不足的癥狀的方法，包括對需要該酶的患者施用含有本發(fā)明的人TIMP-4蛋白的藥用組合物，該組合物可有效地補(bǔ)充患者的內(nèi)源性人TIMP-4從而緩解上述癥狀，例如，包括關(guān)節(jié)炎疾病，如類風(fēng)濕和骨關(guān)節(jié)炎，軟組織風(fēng)濕癥，多發(fā)軟骨炎和腱炎；骨再吸收疾病如骨質(zhì)疏松，Paget′s疾病，副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)和膽脂瘤；與糖尿病并發(fā)的增強(qiáng)的膠原損傷；隱性營養(yǎng)不良性表皮溶解泡；牙周病，牙槽炎和與膠原酶牙齦產(chǎn)物有關(guān)的后果；角膜潰爛；皮膚和胃腸道潰爛及不正常傷口愈合；膠原酶水平升高的后效癥狀，由于組織基底膜破壞受抑制而導(dǎo)致癌轉(zhuǎn)移的癌癥，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘疾??；氣喘；腎小球硬化癥；膿毒性休克和感染；及牛皮癬。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了抗此類多肽的抗體。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了含有可與人TIMP-4序列特異性雜交的足夠長度的核酸分子的核酸探針。
根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步的方面，提供了可用于治療目的的針對此多肽的拮抗物，例如，用來進(jìn)行組織的重建和修復(fù)及瘢痕組織的破壞。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于檢測涉及人TIMP-4序列內(nèi)突變和多肽過度表達(dá)的疾病的診斷方法。
根據(jù)本文的教導(dǎo)，本發(fā)明的這些和其它方面對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
以下附圖用以說明本發(fā)明的實(shí)施方案，不用以限制權(quán)利要求書所包含的本發(fā)明的范圍。


圖1表示全長人TIMP-4多肽的cDNA序列和相應(yīng)的推導(dǎo)氨基酸序列。使用標(biāo)準(zhǔn)的單字母氨基酸簡寫。使用373自動DNA測序儀(Applied Biosystems，Inc.)進(jìn)行測序，預(yù)計(jì)測序的準(zhǔn)確率大于97％。
圖2是本發(fā)明的多肽和其他人TIMP多肽的氨基酸序列比較。
圖3顯示Northern印跡的分析結(jié)果，表明人TIMP-4在不同人組織中的表達(dá)。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一個分離的核酸(多核苷酸)，它編碼具有圖1的推導(dǎo)氨基酸序列的成熟多肽或編碼由以ATCC保藏號75946于1994年11月11日保藏的cDNA克隆編碼的成熟多肽。
編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸可以從早期人腦中得到。它包含一個開放閱讀框并且編碼有224個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，其中大約前29個殘基代表前導(dǎo)序列，成熟的蛋白質(zhì)包含195個氨基酸殘基。本發(fā)明的多核苷酸是從來自于早期人腦的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)的。該蛋白顯示與人TIMP-2有最高程度的同源性，在超過136個氨基酸的長度上，有48％的相同性和72％的相似性。人TIMP-4具有12個在TIMP家族的所有成員中都保守的半胱氨酸殘基。在TIMP-1和TIMP-2中這12個半胱氨酸殘基都是以二硫鍵連接的。這一證據(jù)強(qiáng)烈地表明本發(fā)明的多肽是TIMP家族的一個新成員。
本發(fā)明的多核苷酸可以是RNA的形式或是DNA的形式，DNA包括cDNA，基因組DNA和人工合成DNA。DNA可以是雙鏈的或是單鏈的。如果是單鏈，可以是編碼鏈或非編碼鏈(反義鏈)。編碼成熟多肽的編碼序列可與圖1所示的或保藏克隆的編碼序列相同，或由于遺傳密碼的重復(fù)性和簡并性也可能編碼與圖1所示DNA或保藏cDNA相同的成熟多肽，但編碼序列不同。
編碼圖1所示成熟多肽或保藏cDNA編碼的成熟多肽的多核苷酸可包括只有成熟多肽的編碼序列，成熟多肽的編碼序列和附加編碼序列如前導(dǎo)序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的編碼序列(及任選的附加編碼序列)和非編碼序列，如內(nèi)含子或成熟多肽編碼序列的5’和/或3’非編碼序列。
因此，術(shù)語“編碼多肽的多核苷酸”既包括僅含有多肽的編碼序列的多核苷酸，也包括還含有附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上文所描述的多核苷酸的變異體，它們編碼具有圖1的推導(dǎo)氨基酸序列的多肽或保藏克隆cDNA編碼的多肽的片段，類似物及衍生物。多核苷酸的變異體可以是天然存在的多核苷酸等位基因變異體或非天然存在的多核苷酸變異體。
因此，本發(fā)明包括編碼與圖1所示相同的成熟多肽的多核苷酸或保藏克隆的cDNA編碼的相同成熟多肽的多核苷酸，以及編碼圖1所示多肽或保藏克隆的cDNA編碼的多肽的片段，衍生物或類似物的多核苷酸變異體。這些多核苷酸的變異體包括缺失變異體，取代變異體和添加或插入變異體。
如上文所示，多核苷酸可能具有天然存在的圖1所示的編碼序列或保藏克隆編碼序列的等位基因變異體的編碼序列。在本領(lǐng)域內(nèi)已知等位基因變異體是一個多核苷酸序列的另外一種形式，它可能具有一個或多個核苷酸的替換，缺失或添加且基本上不改變所編碼的多肽的功能。
本發(fā)明也包括成熟多肽的編碼序列與輔助多肽從宿主細(xì)胞中表達(dá)和分泌的多核苷酸序列，例如，控制多肽從細(xì)胞中運(yùn)輸、起分泌序列功能的前導(dǎo)序列融合在一個閱讀框中的多核苷酸。具有前導(dǎo)序列的多肽是一個前蛋白(preprotein)，并且可能由宿主細(xì)胞切去前導(dǎo)序列從而形成成熟形式的多肽。多核苷酸還可編碼一個由成熟蛋白質(zhì)加上另外的5’氨基酸殘基組成的蛋白原(proprotein)。具有序列原的成熟蛋白質(zhì)是一個蛋白原，它是蛋白質(zhì)的非活性形式。一旦切除序列原就會得到一個有活性的成熟蛋白質(zhì)。
因此，例如，本發(fā)明的多核苷酸可編碼一個成熟的蛋白質(zhì)，或編碼一個具有序列原的蛋白質(zhì)，或編碼一個既有序列原又有前序列(前導(dǎo)序列)的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的多核苷酸還可具有與標(biāo)記序列融合在一個讀框內(nèi)的編碼序列，它可幫助對本發(fā)明的多肽進(jìn)行純化。標(biāo)記序列可以是由pQE-9載體提供的6組氨酸標(biāo)記，在宿主為細(xì)菌時，標(biāo)記序列可對與標(biāo)記融合在一起的成熟多肽提供純化，或者，例如，當(dāng)使用一個哺乳動物細(xì)胞宿主如COS-7細(xì)胞時，標(biāo)記序列可以是一個血細(xì)胞凝集素(HA)標(biāo)記。HA標(biāo)記對應(yīng)一個來源于流感血細(xì)胞凝集素蛋白的抗原決定基(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及多核苷酸，它們?nèi)襞c上述序列有至少50％，優(yōu)選有70％的相同性，就可進(jìn)行雜交。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與上述多核苷酸雜交的多核苷酸。本文所使用的名詞“嚴(yán)格條件”，是指在序列間至少有95％的相同性、優(yōu)選有至少97％的相同性時才發(fā)生的雜交。在優(yōu)選實(shí)施方案中，與上述多核苷酸雜交的多核苷酸編碼的多肽實(shí)質(zhì)上保留與圖1的cDNA或保藏cDNA編碼的成熟多肽相同的生物學(xué)功能或活性。
本文提及的保藏物是按用于專利程序的國際承認(rèn)的微生物保藏布達(dá)佩斯條約的要求進(jìn)行保藏。這些保藏物只是為本領(lǐng)域的技術(shù)人員的方便而提供而并非對根據(jù)35 U.S.C.§112索取保藏物的許可。包含于保藏物中的多核苷酸序列，以及由此編碼的多肽的氨基酸序列編入本文以供參考，并且在任何與本文序列的任何描述中相沖突的情況中是決定性的。制造、使用或售賣此保藏物需要許可，本文沒有允許此種許可。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及具有圖1的推導(dǎo)氨基酸序列或保藏cDNA編碼的氨基酸序列的人TIMP-4多肽及此多肽的片段，類似物及衍生物。
當(dāng)提及圖1或保藏cDNA所編碼的多肽時，術(shù)語“片段”、“衍生物”和“類似物”指基本上保留與該多肽相同生物學(xué)功能或活性的多肽，因此，類似物包括能經(jīng)蛋白原部分裂解激活，以產(chǎn)生活性成熟多肽的蛋白原。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽，天然多肽或人工合成多肽，優(yōu)選重組多肽。
圖1所示的多肽或由保藏cDNA編碼的多肽的片段、衍生物或類似物可以是(i)其中一個或多個氨基酸殘基被保守的或非保守的氨基酸殘基(優(yōu)選保守的氨基酸殘基)取代并且此取代氨基酸殘基可以是或不是由遺傳密碼編碼的；或(ii)其中一個或多個氨基酸殘基包含一個取代的基團(tuán)；或(iii)其中成熟多肽與另一化合物，如提高多肽半衰期的化合物(如聚乙二醇)融合；或(iv)其中的成熟多肽與附加的氨基酸如前導(dǎo)序列，分泌序列，或用于純化成熟多肽的序列，或蛋白原序列融合。相信根據(jù)本文的教導(dǎo)，這些片段、衍生物或類似物在本領(lǐng)域的技術(shù)人員掌握的范圍內(nèi)。
本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，并且優(yōu)選純化成同質(zhì)。
名詞“分離”意指物質(zhì)從它的原始環(huán)境中分離出來(如，如果它是天然存在的時指其自然環(huán)境)。例如，存在于活體動物中的天然存在的多核苷酸或多肽是未分離的，但從天然系統(tǒng)中一些或全部共存的物質(zhì)中分離的同樣的多核苷酸或多肽是分離的。這些多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，并且只要這些載體或組合物不是它的自然環(huán)境的一部分，其仍然是分離的。
本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明的多核苷酸的載體，使用本發(fā)明的載體進(jìn)行遺傳改造的宿主細(xì)胞和通過重組技術(shù)生產(chǎn)的本發(fā)明的多肽。
宿主細(xì)胞可使用本發(fā)明的載體，例如克隆載體或表達(dá)載體，進(jìn)行遺傳工程化(轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)。載體可以是，例如，質(zhì)粒，病毒顆粒，噬菌體等形式。工程化的宿主細(xì)胞可以在經(jīng)調(diào)整適合于啟動子激活，轉(zhuǎn)化子選擇或人TIMP-4基因擴(kuò)增的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件，諸如溫度，pH等是以前用于選擇的宿主細(xì)胞表達(dá)的條件，并且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。
本發(fā)明的多核苷酸可用于通過重組技術(shù)生產(chǎn)多肽。例如，多核苷酸可包含于任何一個不同的表達(dá)載體中，以表達(dá)多肽。這些載體包括染色體的，非染色體的和合成的DNA序列，如SV40的衍生物，細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體DNA，桿狀病毒，酵母菌質(zhì)粒，來源于質(zhì)粒和噬菌體DNA組合的載體，諸如牛痘病毒，腺病毒，雞痘病毒，假狂犬病毒的病毒DNA。然而，任何一種可復(fù)制并可在宿主中存活的其它載體都可以使用。
適當(dāng)?shù)腄NA序列可通過一系列方法插入到載體中。通常，通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法將DNA序列插入到適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶位點(diǎn)，相信這些方法和其他方法在本領(lǐng)域的技術(shù)人員掌握的范圍內(nèi)。
表達(dá)載體中的DNA序列與一個適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列(啟動子)有效連接，以指導(dǎo)mRNA的合成。作為該啟動子的有代表性的例子，可提及的有LTR或SV40啟動子，大腸桿菌Lac或trp，噬菌體λP攬L攭啟動子和其他已知的可控制基因在原核或真核細(xì)胞及它們的病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括一個用于翻譯起始和轉(zhuǎn)錄終止的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。載體也可包括用于過量表達(dá)的適當(dāng)序列。
另外，表達(dá)載體優(yōu)選包括一個或多個選擇標(biāo)記基因以便為轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的選擇提供表型特征。如真核細(xì)胞培養(yǎng)物的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，或大腸桿菌中的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
上文所述的包含有適當(dāng)DNA序列以及適當(dāng)?shù)膯幼踊蚩刂菩蛄械妮d體，可用于轉(zhuǎn)化一個適當(dāng)?shù)乃拗饕栽试S主表達(dá)該蛋白質(zhì)。
可提到的有代表性的適當(dāng)?shù)乃拗骼佑屑?xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，鏈霉菌，鼠傷寒沙門氏菌，真菌細(xì)胞如酵母，昆蟲細(xì)胞如果蠅S2和Sf9，動物細(xì)胞如CHO，COS或Bowes黑色素瘤；腺病毒，植物細(xì)胞等。相信根據(jù)本文的教導(dǎo)，適當(dāng)宿主的選擇在本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握的范圍內(nèi)。
更具體地說，本發(fā)明也包括包含一個或多個上述廣義序列的重組構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含一個載體，如質(zhì)?；虿《据d體，其中以正向或反向插入了本發(fā)明的序列。從本實(shí)施方案優(yōu)選的一方面，該構(gòu)建體還包括調(diào)節(jié)序列，例如，包括一個與序列有效連接的啟動子。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知大量的合適載體及啟動子，而且在商業(yè)上可獲得。下列載體以舉例的方式提供細(xì)菌pQE70，pQE60，pQE9(Qiagen)，pbs，pD10，phagescript，pSiX174，pbluescriptSK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，只要能夠在宿主中復(fù)制并存活，任何其他質(zhì)?；蜉d體都可使用。
使用CAT(氯霉素轉(zhuǎn)移酶)載體或其他帶有選擇標(biāo)記的載體可以從任何需要的基因中選擇啟動子區(qū)。兩個合適的載體是pKK232-8和pCM7。尤其應(yīng)提到的細(xì)菌啟動子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，Lambda P攬R攭，P攬L攭和trp。真核啟動子包括CMV立即早期，HSV胸苷激酶，早期和晚期SV40，反轉(zhuǎn)錄病毒中的LTRs和小鼠金屬硫蛋白-I。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的水平可進(jìn)行適當(dāng)載體和啟動子的選擇。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含有上述構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞，或低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞，或宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞。構(gòu)建體向宿主細(xì)胞的導(dǎo)入可通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，或電穿孔來進(jìn)行(Davis，L.，Dibner，M.，Batey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。
宿主細(xì)胞中的構(gòu)建體可用于傳統(tǒng)方法生產(chǎn)由重組序列編碼的基因產(chǎn)物。另外，本發(fā)明的多肽可通過傳統(tǒng)的肽合成儀進(jìn)行人工合成。
成熟的蛋白質(zhì)可在哺乳動物細(xì)胞，酵母，細(xì)菌或其他細(xì)胞中在適當(dāng)啟動子控制下表達(dá)。無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)也可用于使用來源于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體的RNAs生產(chǎn)此類蛋白質(zhì)。原核和真核宿主使用的適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體詳見Sambrook etal.，Molecular CloningA Laboratory Mannal，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989))的描述，本文將它列為參考文獻(xiàn)。
高等真核細(xì)胞中編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)錄可通過在載體中插入一個增強(qiáng)子序列而提高。增強(qiáng)子是DNA的順式作用因子，通常大約10到300bp，作用于啟動子以提高它的轉(zhuǎn)錄。例子包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期位點(diǎn)100-270bp的SV40增強(qiáng)子，細(xì)胞肥大病毒的早期啟動子增強(qiáng)子，位于復(fù)制起點(diǎn)晚期位點(diǎn)的多形瘤增強(qiáng)子及腺病毒增強(qiáng)子。
通常，重組表達(dá)載體包括復(fù)制起點(diǎn)及允許宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的選擇標(biāo)記，如，大腸桿菌的氨芐青霉素抗性基因和啤酒酵母的TRP1基因，及來源于指導(dǎo)下游結(jié)構(gòu)序列轉(zhuǎn)錄的高表達(dá)基因的啟動子。這類啟動子可來源于編碼糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)，α-因子，酸性磷酸酶，或熱休克蛋白等的操縱子。異源結(jié)構(gòu)序列與翻譯起始和終止序列以合適的方式結(jié)合在一起，而且優(yōu)選的是，與能夠指導(dǎo)翻譯的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞周質(zhì)空間或胞外介質(zhì)的前導(dǎo)序列結(jié)合?；蛘撸愒葱蛄锌删幋a一個包括賦予所需特征，例如，使表達(dá)的重組產(chǎn)物穩(wěn)定或易于純化的N-末端識別肽的融合蛋白。
細(xì)菌中使用的表達(dá)載體是通過將編碼所需蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)DNA序列及合適的翻譯起始和終止信號以有效的閱讀方式與功能性啟動子一起插入而構(gòu)建的。載體可包含一個或多個表型上可選擇的標(biāo)記及一個保證載體存在并且如果需要可在宿主內(nèi)提供擴(kuò)增的復(fù)制起點(diǎn)，適于轉(zhuǎn)化的原核宿主包括大腸桿菌，枯草桿菌，鼠傷寒沙門氏菌及小單胞菌屬，鏈霉菌屬及葡萄球菌屬內(nèi)的各種種類，然而也可選擇使用其他宿主。
作為一個有代表性但非限制性的例子，細(xì)菌中使用的有用的表達(dá)載體包括一個選擇性標(biāo)記及來源于商業(yè)上或獲得的包含已知的克隆載體pBR322(ATCC37017)的遺傳成份的質(zhì)粒的細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)。這些商業(yè)載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)。這些pBR322的“骨架”部分與一個適當(dāng)?shù)膯幼雍鸵磉_(dá)的結(jié)構(gòu)序列結(jié)合在一起。
適當(dāng)?shù)乃拗骶瓯晦D(zhuǎn)化并生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)姆椒?如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時間。
經(jīng)離心典型地收獲細(xì)胞，通過物理或化學(xué)方法破碎，所得的粗提物留待進(jìn)一步純化。
在蛋白質(zhì)表達(dá)中使用的微生物細(xì)胞可通過任何方便的方法包括凍融循環(huán)，超聲處理，機(jī)械破碎或使用細(xì)胞溶胞劑進(jìn)行破碎。這些方法都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。
各種哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)也可用于表達(dá)重組蛋白質(zhì)。哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的例子包括猴腎成纖維細(xì)胞COS-7系，詳見Gluzman，Cell，23175(1981)，及其它可用來表達(dá)相容載體的細(xì)胞系如C127，3T3，CHO，Hela和BHK細(xì)胞系。哺乳動物表達(dá)載體包含一個復(fù)制起點(diǎn)，一個適當(dāng)?shù)膯幼雍驮鰪?qiáng)子，及任何必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，及5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。來源于SV40剪接及多腺苷酸位點(diǎn)的DNA序列可用于提供需要的非轉(zhuǎn)錄遺傳成份。
人TIMP-4多肽通過包括硫酸銨或乙醇沉淀，酸提取，陽離子或陰離子交換層析，磷酸纖維素層析，疏水相互作用層析，親和層析，羥基磷灰石層析和植物凝集素層析等方法從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收及純化。如有必要，在完成成熟蛋白質(zhì)的構(gòu)型時可以使用蛋白質(zhì)的重折疊步驟。最后在最后純化步驟中可使用高效液相色譜(HPLC)。
本發(fā)明的多肽可以是一個天然純化的產(chǎn)物，或化學(xué)合成方法的產(chǎn)物，或通過重組技術(shù)從原核或真核宿主(如，通過細(xì)菌，酵母，高等植物，昆蟲和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物)產(chǎn)生的產(chǎn)物。根據(jù)在重組生產(chǎn)過程中使用的宿主細(xì)胞，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本發(fā)明的多肽也可包括一個起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明亦部分涉及具有限定的抑制MMP′s活性的能力之特征的人TIMP-4。人TIMP-4多肽可用于作為一個金屬蛋白酶抑制劑以阻止腫瘤入侵和血管生成及其后的轉(zhuǎn)移。人TIMP-4多肽也可用于治療關(guān)節(jié)炎疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎，軟組織風(fēng)濕癥，多發(fā)軟骨炎和腱炎，及骨再吸收疾病，如骨質(zhì)疏松，Paget′s疾病，副甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)和膽脂瘤。人TIMP-4也可用于防止在與糖尿病，隱性營養(yǎng)缺陷表皮溶解泡，牙周病和膠原酶牙齦生產(chǎn)的相關(guān)后果并發(fā)的增強(qiáng)的膠原破壞。人TIMP-4也可用于抑制細(xì)胞浸潤發(fā)炎的牙齦后的PMNL膠原酶的釋放，包括抵抗糖尿病患者對牙周炎疾病的更大敏感性。
人TIMP-4也可用于治療由諸如堿或其它灼傷，放射，維生素E或視黃醛(retinoid)缺乏誘導(dǎo)的角膜潰爛，皮膚和胃腸道潰爛，及不正常傷口愈合，以及包括膠原酶水平升高的結(jié)腸網(wǎng)結(jié)手術(shù)后癥狀。
MMP′s介導(dǎo)腫瘤的原位生長。因此人TIMP-4可用于阻斷細(xì)胞基底膜的破壞，后者是癌癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制。MMP′s涉及支持腫瘤生長和存活所需的新血管生成，涉及調(diào)節(jié)生長的初級和二級腫瘤中所需的組織重建，并涉及腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中通過血管壁基底膜的穿透。
MMP′s負(fù)責(zé)排卵過程中濾泡壁的局部降解和用于胚細(xì)胞植入的子宮壁的局部降解。因此，人TIMP-4可用作避孕藥。
人TIMP-4也可用作普通生長因子以治療(瓣膜)再狹窄(restenosis)及類似疾病。人TIMP-4尤其可用作紅細(xì)胞胞樣細(xì)胞譜系的生長歷子。
用人TIMP-4可治療的其他疾病還包括牙槽炎，氣喘，牛皮癬，腎小球硬化癥和膿毒休克，因?yàn)镸MP′s參與某些寄生物的組織侵入。
全長人TIMP-4基因的片段可用作雜交探針，從cDNA文庫中分離全長基因并分離與該基因有高序列相似性或相似生物學(xué)活性的其他基因。例如，這類探針可介于20和2000個堿基之間。然而優(yōu)選的探針具有30至50個堿基對。探針還可用來鑒定對應(yīng)全長轉(zhuǎn)錄物的cDNA克隆和一個基因組克隆或含有完整人TIMP-4基因，包括調(diào)節(jié)區(qū)和啟動區(qū)，外顯子和內(nèi)含子的克隆。篩選的例子包括使用已知的DNA序列分離人TIMP-4基因的編碼區(qū)以合成一個寡核苷酸探針。具有與本發(fā)明的基因互補(bǔ)的序列的標(biāo)記寡核苷酸用于篩選人cDNA文庫，基因組DNA或mRNA文庫以決定探針與文庫中的哪個成員雜交。
本發(fā)明還涉及使用人TIMP-4基因作為檢測與人TIMP-4突變存在有關(guān)的疾病或易感性的診斷方法的一部分。
在人TIMP-4基因上攜帶有突變的個體可通過各種各樣的技術(shù)在DNA水平上檢測出來?？蓮幕颊叩募?xì)胞如血，尿，唾液，活體組織檢查和尸體解剖材料中得到用于診斷的核酸?；蚪MDNA可直接用于檢測或在分析前使用PCR經(jīng)酶方法擴(kuò)增(Saiki et al.，Nature，324163-166(1986))。RNA或cDNA也可用于同樣目的。例如，與編碼人TIMP-4的核酸互補(bǔ)的PCR引物可用于鑒定和分析人TIMP-4的突變。例如，通過與正?；蛐偷谋容^從擴(kuò)增產(chǎn)物大小的變化上可檢測出缺失或插入。點(diǎn)突變可通過擴(kuò)增DNA與放射性標(biāo)記的人TIMP-4RNA或放射性標(biāo)記的人TIMP-4反義DNA序列雜交來鑒定。通過RNaseA的消化或解鏈溫度的差異可將完全配對的序列從錯配的雙鏈中區(qū)分出來。
基于DNA序列差異的遺傳學(xué)測定可通過在含有或不含有變性劑的凝膠中DNA片段的電泳遷移率變化來實(shí)現(xiàn)。通過高分辨率凝膠電泳可看到小的序列缺失或插入。不同序列的DNA片段可在變性甲酰胺梯度凝膠上進(jìn)行區(qū)分，在這種膠中不同DNA片段根據(jù)它們特定的熔解或部分熔解溫度停滯在不同的凝膠位置上(例如，見Myers et al.，science，2301241(1985))。
特定位置上的序列變化也可通過核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)如RNase和S1保護(hù)或化學(xué)切割方法揭示(例如Cotton et al.，PNAS，USA，854397-4401(1985))。
因此，特異性DNA序列的檢測可通過諸如雜交，RNase保護(hù)，化學(xué)切割，直接DNA序列測定或使用限制性內(nèi)切酶(例如限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP))和基因組DNA的Southern印跡實(shí)現(xiàn)。
除更方便的凝膠電泳和DNA測序外，也可通過原位分析檢測突變。
本發(fā)明還涉及檢測各種組織中人TIMP-4蛋白水平改變的診斷實(shí)驗(yàn)，因?yàn)榕c正常對照組織樣品相比較蛋白質(zhì)的過度表達(dá)可檢測出由人TIMP-4調(diào)節(jié)的疾病或疾病的易感性。用于檢測來自宿主的樣品中人TIMP-4蛋白水平的實(shí)驗(yàn)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，并且包括放射免疫測定，競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)，Western印跡分析，ELISA測定及“夾心”實(shí)驗(yàn)。ELISA測定(coligan，et al.，Current Pro tocolsin Immunology，1(2)，Chapter 6，(1991))最初包括制備對人TIMP-4抗原有特異性的抗體，優(yōu)選單克隆抗體。另外，還要制備抗單克隆抗體的報告抗體。在報告抗體上連接一個可檢測的試劑如放射物，熒光物或如在本實(shí)施例中，使用一個辣根過氧化物酶。從宿主中取得樣品并在可與樣品中的蛋白質(zhì)結(jié)合的固體支持物如聚苯乙烯盤上培養(yǎng)。通過與非特異性蛋白質(zhì)如BSA濁育而覆蓋盤上的游離蛋白結(jié)合位點(diǎn)。然后，在盤中溫育單克隆抗體，在培養(yǎng)時間內(nèi)單克隆抗體與聚苯乙烯盤上結(jié)合的任意人TIMP-4蛋白質(zhì)結(jié)合。用緩沖液洗去所有未結(jié)合的單克隆抗體，現(xiàn)在將與辣根過氧化酶結(jié)合的報告抗體置于盤中，導(dǎo)致報告抗體與人TIMP-4結(jié)合的單克隆抗體結(jié)合。然后洗去未結(jié)合的報告抗體。向盤中加入過氧化物酶的底物，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，在給定的時間內(nèi)顯色的量是給定體積的患者樣品中存在的人TIMP-4蛋白的量的測量值。
可做競爭實(shí)驗(yàn)，其中對人TIMP-4特異性的抗體與固體支持物結(jié)合，標(biāo)記的人TIMP-4及來自宿主的樣品通過固體支持物，通過例如液閃色譜檢測標(biāo)記的量與樣品中人TIMP-4的量呈相關(guān)性。
“夾心”測定與ELISA測定相似。在夾心測定中，人TIMP-4通過一個固體支持物并與結(jié)合到固體支持物上的抗體結(jié)合。隨后第二抗體結(jié)合到人TIMP-4上。標(biāo)記的特異于第二抗體的第三抗體通過固體支持物與第二抗體結(jié)合，然后可定量。
本發(fā)明也提供了篩選化合物的方法，以確定哪些是人TIMP-4多肽的刺激劑或拮抗劑。此方法的一個例子包括獲得含有胞外基質(zhì)的哺乳動物組織如牛輻射腕關(guān)節(jié)。將關(guān)節(jié)軟骨切成較小的園片，并在DMEM中用35S-硫酸鈉標(biāo)記(10μCi/ml)足夠長的時間使軟骨摻入標(biāo)記的硫酸鈉。然后，在適當(dāng)?shù)臈l件下，將MMP，例如溶基質(zhì)素或IL1或TNF加入到軟骨園片中以使組織損壞正常發(fā)生。隨后向反應(yīng)混合物中加入人TIMP-4和欲篩選的化合物，時間要足夠長以使MMP正常破壞軟骨園片。收集上清液，它是軟骨園片外的介質(zhì)，并通過液閃計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)放射活性。計(jì)算釋放到介質(zhì)中的35S的百分率。釋放的35S-GAG是軟骨胞外基質(zhì)中蛋白多糖的代表，并反應(yīng)MMP進(jìn)行的蛋白多糖的降解。由液閃色譜確定的35S-GAG的量與在沒有待篩選的化合物存在的情況下的對照實(shí)驗(yàn)相比較，即可確定化合物對人TIMP-4的刺激或拮抗作用的能力。
除上面所鑒定的那些外，潛在的人TIMP-4拮抗劑的例子包括抗體或在某些例子中是與多肽結(jié)合的寡核苷酸。另外，潛在的拮抗劑可以是人TIMP-4的突變形式，它可識別天然底物，但無活性，因此阻礙人TIMP-4的作用。
潛在的人TIMP-4拮抗劑還包括使用反義技術(shù)制備的反義構(gòu)建體。反義技術(shù)可用于通過形成三螺旋或反義DNA或RNA控制基因表達(dá)，兩種方法都基于多核苷酸與DNA或RNA的結(jié)合。例如，用編碼本發(fā)明的成熟多肽的多核苷酸序列5’編碼區(qū)設(shè)計(jì)一個長度為大約10-40堿基對的反義RNA寡核苷酸。將DNA寡核苷酸設(shè)計(jì)為與參與轉(zhuǎn)錄的基因區(qū)域互補(bǔ)(三螺旋，見Lee ed al.，Nucl.Acids.Res.63073(1979)；Coondy et al.，Science，241456(1988)；and Dervan et al.，Science，251136091991))，從而阻止人TIMP-4的轉(zhuǎn)錄和生產(chǎn)。反義RNA寡核苷酸與mRNA在體內(nèi)雜交，并且阻止mRNA分子翻譯成人TIMP-4(反義-Okano，J.Neurochem.，561360(1991))；寡聚脫氧核苷酸作為基因表達(dá)的反義抑制劑，CRC出版社，Boca Raton，F(xiàn)L(9188))。上述寡核苷酸也可轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，使反義RNA或DNA可在體內(nèi)表達(dá)以抑制人TIMP-4的產(chǎn)生。
另一類潛在的人TIMP-4的拮抗劑是一個小分子，它結(jié)合并占據(jù)人TIMP-4的活性位點(diǎn)，從而阻斷人TIMP-4與MMP′s的相互作用，因此阻斷正常的生物學(xué)活性。小分子的例子包括但不限于小肽或類肽分子，例如肽結(jié)合分子。
人TIMP-4拮抗劑可用于組織修復(fù)及重建，例如，需要對瘢痕組織進(jìn)行破壞時。在某些情況下，可能需要提高結(jié)締組織的更新和重建，例如瘢痕組織的再吸收，產(chǎn)后子宮退化，肺，肝或關(guān)節(jié)的纖維重建。在這些情況下，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的更新的適當(dāng)控制需要MMP′s和人TIMP-4之間的平衡以適當(dāng)?shù)乜刂平到狻?br> 根據(jù)本發(fā)明，多肽及同為多肽的刺激劑或拮抗劑可通過此類多肽的體內(nèi)表達(dá)進(jìn)行應(yīng)用，通常稱作“基因治療”。
因此，例如，可使用一個多核苷酸(DNA或RNA)對來自患者的細(xì)胞在體外進(jìn)行工程化，然后將工程化的細(xì)胞提供給使用多肽治療的患者。這些方法在本領(lǐng)域內(nèi)是熟知的。例如，采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，使用一個含有編碼本發(fā)明的多肽的RN A的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒可工程化細(xì)胞。
相似地，也可采用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法在體內(nèi)工程化細(xì)胞以使多肽在體內(nèi)表達(dá)。如本領(lǐng)域內(nèi)已知的，用于生產(chǎn)含有編碼本發(fā)明的多肽的RNA的反轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的生產(chǎn)細(xì)胞可給患者用藥以在體內(nèi)工程化細(xì)胞和在體內(nèi)表達(dá)多肽。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，以這類方法施用本發(fā)明的多肽的這類和其它方法對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。例如，工程細(xì)胞的表達(dá)載體可以不是反轉(zhuǎn)錄病毒，如經(jīng)與適當(dāng)?shù)膫鬟f載體結(jié)合后用于體內(nèi)工程化細(xì)胞的腺病毒。
本發(fā)明的多肽及其刺激劑或拮抗劑可與一種合適的藥用載體結(jié)合使用。此組合物包含一種治療上有效量的多肽，及一種藥用上可接受的載體或賦形劑。載體包括但不限于鹽水，緩沖性鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其組合。配方應(yīng)適合于給藥的方式。
本發(fā)明也提供了包含一個或多個充滿一種或多種本發(fā)明藥用組合物的成份的容器的藥物包裝或試劑盒。與此容器一起有一個調(diào)節(jié)藥物或生物制品的生產(chǎn)、使用和銷售的政府機(jī)構(gòu)出具的說明書，此說明書反應(yīng)人類用藥的生產(chǎn)使用和銷售機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)。另外，此藥用組合物可與其他治療化合物結(jié)合使用。
藥用組合物可以方便的形式用藥。如通過局部用藥，靜脈注射，關(guān)節(jié)內(nèi)，腫瘤內(nèi)，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，鼻內(nèi)，或皮內(nèi)途徑進(jìn)行。藥用組合物的施用量以對特定適應(yīng)癥的有效治療和/或預(yù)防為宜。通常，藥用組合物的施用量以至少約10ug/kg體重，并且在多數(shù)情況下，它們的施用量不超過約每天8mg/kg體重，優(yōu)選的劑量為每天約10ug/kg到1mg/kg體重，要考慮給藥的途徑，癥狀等。
本發(fā)明的序列對于染色體鑒定也是有價值的。序列可以特異性地靶向并與單個人染色體上的特殊位點(diǎn)雜交。而且，現(xiàn)在需要在染色體上鑒定特殊位點(diǎn)?，F(xiàn)在有很少的基于實(shí)際序列數(shù)據(jù)的染色體標(biāo)記試劑(重復(fù)多態(tài)性)可用來標(biāo)記染色體位置。根據(jù)本發(fā)明的DNA在染色體上的定位是使這些序列與和疾病有關(guān)的基因聯(lián)系起來的重要的第一步。
簡單地說，可通過從cDNA中制備PCR引物(優(yōu)選15-25bp)將序列定位到染色體上，3’非翻譯區(qū)的計(jì)算機(jī)分析可用于快速選擇在基因組DNA中長度不超過一個外顯子的引物，否則使擴(kuò)增的過程變得復(fù)雜。然后這些引物用來經(jīng)PCR篩選含有單個染色體的體細(xì)胞雜種。只有含有與引物相應(yīng)的人基因的雜種細(xì)胞才會產(chǎn)生一個擴(kuò)增片段。
體細(xì)胞雜種的PCR作圖是將特定的DNA定位到特定染色體上的快速方法。使用具有相同寡核苷酸引物的本發(fā)明，可通過類似的方法，用一組來自特定染色體或大的基因組克隆庫的片段實(shí)現(xiàn)亞定位。其他相似的用于定位其染色體的定位方案包括原位雜交，使用標(biāo)記的流選染色體的預(yù)篩選和使用雜交的預(yù)選擇以建立染色體特異性cDNA文庫。
cDNA克隆與中期染色體涂片的熒光原位雜交(FISH)可用于一步提供準(zhǔn)確的染色體定位。這一技術(shù)可使用短至500至600堿基的cDNA，然而，大于2000bp的克隆與單一染色體位點(diǎn)結(jié)合的可能性較高，并能產(chǎn)生可進(jìn)行簡單測定的足夠強(qiáng)度的信號。FISH需要使用EST來源的克隆，而且越長越好。例如，2000bp為好，4000bp更好，大于4000bp可能對于在合理的時間比例得到好的結(jié)果是不必要的。這一技術(shù)的綜述見Verma et al.，人類染色體基礎(chǔ)技術(shù)手冊，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦一個序列已定位到精確的染色體位置上，序列在染色體上物理位置就可與遺傳圖譜資料相聯(lián)系。例如，可在V.Mckasick，人類孟德爾遺傳(可從JohnHopkins大學(xué)Welch醫(yī)學(xué)圖書館在線獲得)中找到此類資料。然后通過連鎖分析(物理臨近基因的共遺傳)鑒定定位在同一染色體區(qū)域上的基因和疾病之間的關(guān)系。
以下，需要確定被影響及未被影響的個體間在cDNA或基因組序列中的差別。如果在一些或全部未被影響的個體中發(fā)現(xiàn)突變，但在任何正常的個體中未發(fā)現(xiàn)突變，那么突變就可能是疾病的起因。
以當(dāng)今的物理圖譜和遺傳圖譜技術(shù)的分辨率，準(zhǔn)確定位于與疾病相關(guān)的染色體區(qū)域的cDNA可能是50-500潛在的致病基因中的一個。(這假定1兆堿基的圖譜分辨率和每20kb一個基因)。
多肽，它們的片段或其它衍生物或其類似物，或表達(dá)它們的細(xì)胞可用作免疫原以生產(chǎn)抗體。例如，這些抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。本發(fā)明還包括嵌合的，單鏈的，和人源化的抗體，以及Fab片段，或Fab表達(dá)文庫的產(chǎn)物。本領(lǐng)域內(nèi)已知的各種方法可用于這類抗體和片段的產(chǎn)生。
與本發(fā)明的序列相對應(yīng)的多肽的抗體可通過將多肽直接注射進(jìn)動物或給動物施用該多肽而獲得，優(yōu)選非人類動物。如此獲得的抗體就會與多肽本身結(jié)合。以這種方式，即使僅編碼多肽片段的序列也可用來產(chǎn)生與全長天然多肽結(jié)合的抗體。隨后此類抗體可用于從表達(dá)該多肽的組織中分離多肽。
對于制備單克隆抗體，任何可提供由細(xì)胞系培養(yǎng)物產(chǎn)生的抗體的技術(shù)都可使用。實(shí)施例包括雜文瘤技術(shù)(Kolher and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三體雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜文瘤技術(shù)(Kozbor et al.，1983.今日免疫學(xué)472)，及EBV雜交瘤技術(shù)以生產(chǎn)人單克隆抗體(Cole，et al.，1985，《單克隆抗體和癌癥治療》，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
描述生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利4,946,778)也適用于生產(chǎn)抗本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的單鏈抗體。也可使用轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)抗本發(fā)明的免疫原性多肽產(chǎn)物的人源化抗體。
在以下實(shí)施例中本發(fā)明得到進(jìn)一步的描述，然而，應(yīng)理解本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。所有的組份和含量，除非另有說明，都是重量比。
為幫助理解以下實(shí)施例，將描述以下一些經(jīng)常出現(xiàn)的方法和/或術(shù)語。
“質(zhì)粒、用小寫的p置于前面和/或后為大寫字母和/或數(shù)字來表示。本文中的起始質(zhì)粒都是商業(yè)上可獲得的，在非限制的基礎(chǔ)上可由公眾獲得或能根據(jù)發(fā)表的方法從可獲得的質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建。另外，與上述描述等效的質(zhì)粒在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的并且對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。
DNA的“消化”指的是使用一個只作用于DNA上某些序列的限制性內(nèi)切酶對DNA進(jìn)行催化切割。本文中使用的各種限制性內(nèi)切酶是商業(yè)上可獲得的，它們的反應(yīng)條件，輔助因子及其它需要對領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是已知的。為達(dá)到分析目的，典型的在約20ul的緩沖液中將1ug質(zhì)?；駾NA片段與約2單位酶一起使用。為了用于質(zhì)粒構(gòu)建而分離DNA片段，典型地將5至50ugDNA在更大體積中用20至250單位的酶消化。特定限制性酶的合適緩沖液及底物的量由廠商限定。通常使用的培養(yǎng)時間為約37℃，1小時，但根據(jù)廠商的建議可有所變化。消化完畢反應(yīng)物直接在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳以分離所需的片段。
被切割片段的大小分離使用8％的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行，見Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)。
“寡核苷酸”指的是單鏈多聚脫氧核苷酸或可通過化學(xué)合成的兩個互補(bǔ)的多聚脫氧核苷酸鏈。此合成的寡核苷酸不具有5’磷酸，因此若在激酶存在下不加入ATP以提供磷酸，就不會與另一個寡核苷酸連接。合成寡核苷酸會與一個未經(jīng)去磷酸化處理的片段連接。
“連接”指在2個雙鏈核酸片段之間形成磷酸二酯鍵的過程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p 146)。除非另外提供，連接使用已知的緩沖液和條件，每0.5ug大約等摩爾要連接的DNA片段使用10單位T4DNA連接酶(“連接酶”)。
除非有其它說明，轉(zhuǎn)化的方法參照Graham，F(xiàn).and Van der Eb，A.，Vir ology，52456-457(1973)。
實(shí)施例1人TIMP-4的細(xì)菌表達(dá)及純化首先使用相對于加工的人TIMP-4蛋白質(zhì)的5′序列(減去信號肽序列)及TIMP-4基因的3′側(cè)的載體序列的PCR寡核苷酸引物擴(kuò)增編碼人TIMP-4的DNA序列，ATCC#75946。分別向5’和3’序列添加與人TIMP-4相應(yīng)的附加核苷酸。5’寡核苷酸引物的序列為5’GCCAGAGGATCCTGCAGCTGCGCCCCGGCGCAC 3′，含有一個BamH1限制酶切位點(diǎn)，其后是從加工的蛋白質(zhì)密碼子的推斷的末端氨基酸開始的人TIMP-4編碼序列的21個核苷酸。3’序列5’CGGCTTCTAGAACTAGGGCTGAACGATGTCAAC 3’含有一個XbaI位點(diǎn)，其后是人TIMP-4的18個核苷酸。限制酶切位點(diǎn)與細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen，Inc.9259 Eton Avenue，C hatsworth，CA，91311)上的限制酶切位點(diǎn)相對應(yīng)。pQE-9編碼抗生素抗性(Ampr)，一個細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)，一個PTG調(diào)節(jié)的啟動子操縱子(P/O)，一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，一個6組氨酸標(biāo)記及限制酶切位點(diǎn)。然后用BamH1和XbaI消化pQE-9，擴(kuò)增的序列與pQE-9連接，并連同組氨酸標(biāo)記和RBS編碼序列插入到閱讀框內(nèi)。然后用連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株m 15/pREP4，該菌株可從Qiagen得到，方法見Sambrook，J.et al.，Molecular CloningA Labo ratory Mannal，Cold Spring Laboratory Press，(1989)。m 15/pREP4含有多拷貝的表達(dá)lacI阻遏物并提供卡那素抗性(Kanr)的質(zhì)粒pREP4。通過在LB平板上生長的能力來鑒別轉(zhuǎn)化子并選擇出氨芐青霉素/卡那霉素抗性克隆。分離質(zhì)粒DNA，并通過限制性分析確認(rèn)。含有所需構(gòu)建體的克隆在同時補(bǔ)充Amp(100ug/ml)和Kan(25ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中生長過夜(O/N)。O/N培養(yǎng)物用于接種大的培養(yǎng)物，比率為1∶100到1∶250。細(xì)胞生長至光密度600(O.D.600)在0.4和0.6之間。然后以終濃度1mM加入IPTG(異丙基-B-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)。IPTG通過使lacI阻遏物失活清除P/O，導(dǎo)致基因表達(dá)提高來進(jìn)行誘導(dǎo)。將細(xì)胞再培養(yǎng)3-4小時。然后通過離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀溶在離液劑6摩爾鹽酸胍中。澄清后，以允許含有6組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下，在鎳螯合柱上經(jīng)層析將溶解的人TMP-4從溶液中純化出來(Hochul，E.et al.，J.Chromatography 411177-184(1984)。用pH 5.0的6摩爾鹽酸胍將人TIMP-4(純度為90％)從柱子上洗脫下來，為了復(fù)性，則調(diào)節(jié)為3摩爾鹽酸胍，100mM磷酸鈉，10毫摩爾谷胱甘肽(還原型)及2毫摩爾谷胱甘肽(氧化型)。在這種溶液中培養(yǎng)12小時后，將蛋白質(zhì)在10毫摩爾的磷酸鈉中透析。
實(shí)施例2重組人TIMP-4在COS細(xì)胞中的表達(dá)人TIMP-4HA的表達(dá)來源于pcDNAI/Amp載體(Invitrogen)，該載體包含1)SV40的復(fù)制起點(diǎn)；2)氨芐青霉素抗性基因；3)大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)；4)CMV啟動子，隨后有一個多接頭區(qū)，一個SV40內(nèi)含子及多腺苷酸位點(diǎn)。編碼全長人TIMP-4前體及一個與它的3’末端在閱讀框內(nèi)融合的HA標(biāo)記的DNA片段克隆到載體的多接頭區(qū)，因此，重組蛋白質(zhì)的表達(dá)在CMV啟動子的控制下進(jìn)行。HA標(biāo)記相應(yīng)于來源于前面描述過的流感血細(xì)胞凝集素蛋白抗原決定基(I.Wilson，H.NIm an，K.Heighten，A Cherenson，M.Connolly，and R.Lerner，1984，Cell，37，767)。HA標(biāo)記與靶蛋白的融合使得使用一個識別HA抗原決定基的抗體檢測重組蛋白質(zhì)易于進(jìn)行。
質(zhì)粒構(gòu)建的策略描述如下通過PCR構(gòu)建編碼人TIMP-4的DNA序列ATCC#75946，2個引物為5’端引物5’GCCAGAGGATCCGCCACCATGCCTGGGAGCCCTCGGCCC3’，含有一個BamHI位點(diǎn)，后隨起始于起始密碼子的人TIMP-4編碼序列的21個核苷酸。3’序列5’CGGCTTCTAGAATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAGGGCTGAACGATGTCAAC 3’含有一個與XbaI位點(diǎn)，翻譯終止密碼子，HA標(biāo)記及人TIMP-4編碼序列的最后18個核苷酸(不包括終止密碼子)互補(bǔ)的序列。因此，PCR產(chǎn)物含有一個BamHI位點(diǎn)，人TIMP-4編碼序列及后隨的框內(nèi)融合的HA標(biāo)記，緊接HA標(biāo)記的一個翻譯終止密碼子及一個XbaI位點(diǎn)。用BamHI和XbaI限制酶消化PCR擴(kuò)增的DNA片段和載體pcD NAI/Amp，并連接。連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌菌株SURE(可以從Stratagene Clon ing Systes，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA92037獲得)。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)物在氨芐青霉素培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)并選擇抗性克隆。從轉(zhuǎn)化子中分離質(zhì)粒DNA并通過限制性分析檢查正確片段的存在。為重組人TIMP-4的表達(dá)，用表達(dá)載體通過DEAE-DEXTRAN方法轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989))。通過放射性標(biāo)記及免疫沉淀的方法檢測人TIMP-4HA蛋白的表達(dá)(E.Harlow，D.Lane，抗體實(shí)驗(yàn)手冊，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，(1988))。轉(zhuǎn)染2天后用35S半胱氨酸對細(xì)胞標(biāo)記8個小時。然后收集培養(yǎng)基并用去污劑(RIPA緩沖液(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH 7.5)(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))裂解細(xì)胞。使用HA特異性單克隆抗體同時沉淀溶胞產(chǎn)物和培養(yǎng)基。在15％SDS-PAGE凝膠上分析沉淀的蛋白。
實(shí)施例3使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)克隆和表達(dá)TIMP-4使用對應(yīng)于基因的5’和3’序列的PCR的寡核苷酸引物對編碼全長TIMP-4蛋白的DNA序列ATCC#75946進(jìn)行擴(kuò)增。
5’引物的序列為5’GCCAGAGGATCC敁ATG敋CCTGGGAGCCCTCGGCCC 3’，并在TIMP-4基因(翻譯起始密碼子ATG下劃線)的起始21個核苷酸之后含有一個BamHI限制酶切位點(diǎn)(粗體表示)。
3’引物的序列為5’CGGCTTCTAGAACTAGGGCTGAACGATGTCAAC3’并含有限制性內(nèi)切酶XbaI的切點(diǎn)和與TIMP-4基因的3’非翻譯序列互補(bǔ)的18個核苷酸。使用商品化試劑盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)從1％的瓊脂糖凝膠上分離擴(kuò)增的序列。然后用核酸內(nèi)切酶BamHI和XbaI消化片段并再次在1％的瓊脂糖凝膠上純化。這一片段命名為F2。
載體pA2(載體pVL941經(jīng)修飾而獲得，以下討論)用來在桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(綜述見Summers，M.D.and smith，GE.1987，桿狀病毒載體和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)程序的方法手冊，Texas Agricultural Experimen tal Station BulletinNO.1555)中表達(dá)TIMP-4蛋白。此表達(dá)載體含有苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(AcMNPV)的強(qiáng)多角體蛋白啟動子及其后的限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI的識別位點(diǎn)。猿猴病毒SV40的多聚腺苷酸位點(diǎn)用于有效的多聚腺苷酸化。為使重組病毒易于選擇，來自大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因與多角體蛋白啟動子同向插入，其后是多角體蛋白基因的多聚腺苷酸化信號。多角體蛋白的序列的兩側(cè)是用于共轉(zhuǎn)染野生型病毒DNA的細(xì)胞介導(dǎo)的同源重組的病毒序列。很多其它的桿狀病毒載體可用于代替pGR1，如pAc373，pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A.a nd Summers，M.D，，Virology，17031-39)。
使用限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI消化質(zhì)粒，然后用商業(yè)化試劑盒從1％的瓊脂糖凝膠上分離DNA(“Geneclean”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)。此載體DNA命名為V2。
使用T4DNA連接酶將片段F2和質(zhì)粒V2連接起來。然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101細(xì)胞并用限制酶BamHI和XbaI對含有TIMP-4基因的質(zhì)粒(pBacTIMP-4)的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。通過DNA測序確認(rèn)克隆片段的序列。
5ug的質(zhì)粒pBacTIMP-4與1.0ug商業(yè)化線形桿狀病毒(“BaculogoldTMBaculovirus DNA”.Phamingen，San Diego，CA.)使用脂轉(zhuǎn)染方法(Felgner et al.，Proc.Natl.ACad.Sci.USA，847413-7417(1987))共轉(zhuǎn)染。
將1ug BaculoGoldTM病毒DNA和5ug質(zhì)粒pBac TIMP-4在含50ul無血清的Grace′s培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微滴定板的無菌孔中混合。然后加入10ul脂轉(zhuǎn)染試劑和90ul Grace′s培養(yǎng)基的混合物，在室溫下混合并培養(yǎng)15分鐘。然后將轉(zhuǎn)染混合物滴加到接種于含1ml無血清Gr ace′s培養(yǎng)液的35mm組織培養(yǎng)板中的Sf9昆蟲細(xì)胞(ATCC CRL 1711)中。前后搖動培養(yǎng)板以混勻新加的溶液。將培養(yǎng)盤置于27℃培養(yǎng)5小時。5小時后從平板上傾去轉(zhuǎn)染液，加入1ml含10％胎牛血清的Grace′s昆蟲培養(yǎng)基將培養(yǎng)盤放回培養(yǎng)箱并于27℃繼續(xù)培養(yǎng)4天。
4天后，收集上清液，按Summer和Smith(出處同上)所述相似地進(jìn)行噬斑分析。作為改進(jìn)，使用含‘Blue Gal’的瓊脂糖凝膠(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)以便于分離藍(lán)色噬斑。(詳細(xì)的‘噬斑分析’可參考Life TechnologiesInc.，Gaithersburg發(fā)表的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和桿狀病毒學(xué)用戶指南第9-10頁)。
系列稀釋4天后，向細(xì)胞中加入病毒，用Eppendorf管頭挑取藍(lán)色噬斑。將含有重組病毒的瓊脂重懸于含200ul Gracer′s培養(yǎng)基的Eppendorf管中。簡單離心去除瓊脂，用含重組桿狀病毒的上清液感染接種于35mm皿上的Sf9細(xì)胞。4天后，收集這些培養(yǎng)皿中的上清液，然后4℃保存。
Sf9細(xì)胞生長于含10％熱滅活FBS的Grace′s培養(yǎng)基中。用重組桿狀病毒V-TIMP-4感染細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)(MOI)為2。6小時后除去培養(yǎng)基，用不含甲硫氨酸和半胱氨酸的SF 900 II培養(yǎng)基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg)替代。42小時后加入5uCi35S-甲硫氨酸和5uCi35S-半胱氨酸(Amersham)。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞16小時，然后，離心收集細(xì)胞，用SDS-PAGE和放射自顯影觀察標(biāo)記蛋白。
實(shí)施例4人TIMP-4在人組織中的表達(dá)模式將上述各組織的20ul總RNA變性，進(jìn)行1.2％甲醛瓊脂糖凝膠電泳，毛細(xì)印跡到尼龍膜上，過夜。經(jīng)UV交聯(lián)將RNA固定在濾膜上。從部分TIMP-4核酸序列的EcoRI-Xhol插入片段制備隨機(jī)引物探針，并用于經(jīng)過用100ug/ml變性鮭精DNA作封閉劑，在Church緩沖液中雜交過夜探查印跡。依次用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS在65℃進(jìn)行洗滌。大小標(biāo)準(zhǔn)樣是BRLRNA序列梯和18S，28S核糖體RNA帶，見圖3。
序列表(1)一般信息(i)申請人GREENE，ET AL.
(ii)發(fā)明名稱人TIMP-4(iii)序列數(shù)2(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，CECCHI，STEWART & OLSTEIN(B)街道6 BECKER FARM ROAD(C)城市ROSELAND(D)州NEW JERSEY(E)國別USA(F)郵政編碼07068(v)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒體類型3.5英寸盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PS/2(C)操作系統(tǒng)MS-DOS(D)軟件WORD PERFECT 5.1(vi)本申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日(viii)律師/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)登記號36，134(C)參考/文檔號325800-278(ix)電信信息(A)電話201-994-1700(B)傳真201-994-1744
(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度675個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATGCCTGGGA GCCCTCGGCC CGCGCCAAGC TGGGTGCTGT TGCTGCGGCT GCTGGCGTTG 60CTGCGGCCCC CGGGGCTGGG TGAGGCATGC AGCTGCGCCC CGGCGCACCC TCAGCAGCAG120ATCTGCCACT CGGCACTTGT GATTCGGGCC AAAATCTCCA GTGAGAAGGT AGTGCCGGCC180AGTGCAGACC CTGCTGACAC TGAAAAAATG CTCCGGTATG AAATCAAACA GATAAAGATG240TTCAAAGGGT TTGAGAAAGT CAAGGATGTT CAGTATATCT ATACGCCTTT TGACTCTTCC300CTCTGTGGTG TGAAACTAGA AGCCAACAGC CAGAAGCAGT ATCTCTTGAC TGGTCAGGTC360CTCAGTGATG GAAAAGTCTT CATCCATCTG TGCAAGTACA TCGAGCCCTG GGAGGACCTG420TCCTTGGTGC AGAGGGAAAG TCTGAATCAT CACTACCATC TGAACTGTGG CTGCCAAATC480ACCACCTGCT ACACAGTACC CTGTACCATC TCGGCCCCTA ACGAGTGCCT CTGGACAGAC540TGGCTGTTGG AACGAAAGCT CTATGGTTAC CAGGCTCAGC ATTATGTCTG TATGAAGCAT600CTTGACTTCA CCTGCAGCTG GTACCGGGGC CACCTGCCTC TCAGGAAGGA GTTTGTTGAC660ATXGTTCAGC CCTAG 675(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度224個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)渚€型(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Pro Gly Ser Pro Arg Pro Ala Pro Ser Trp Val Leu Leu Leu-25 -20 -15Arg Leu Leu Ala Leu Leu Arg Pro Pro Gly Leu Gly Glu Ala Cys-10 -51Ser Cys Ala Pro Ala His Pro Gln Gln His Ile Cys His Ser Ala5 10 15Leu Val Ile Arg Ala Lys Ile Ser Ser Glu Lys Val Val Pro Ala20 25 30
Ser Ala Asp Pro Ala Asp Thr Glu Lys Met Leu Arg Tyr Glu Ile35 40 45Lys Gln Ile Lys Met Phe Lys Gly Phe Glu Lys Val Lys Asp Val50 55 60Gln Tyr Ile Tyr Thr Pro Phe Asp Ser Ser Leu Cys Gly Val Lys65 70 75Leu Glu Ala Asn Ser Gln Lys Gln Tyr Leu Leu Thr Gly Gln Val80 85 90Leu Ser Asp Gly Lys Val Phe Ile His Leu Cys Asn Tyr Ile Glu95 100 105Pro Trp Glu Asp Leu Ser Leu Val Gln Arg Glu Ser Leu Asn His110 115 120His Tyr His Leu Asn Cys Gly Cys Gln Ile Thr Thr Cys Tyr Thr125 130 135Val Pro Cys Thr Ile Ser Ala Pro Asn Glu Cys Leu Trp Thr Asp140 145 150Trp Leu Leu Glu Arg Lys Leu Tyr Gly Tyr Gln Ala Gln His Tyr155 160 165Val Cys Met Lys His Val Asp Gly Thr Cys Ser Trp Tyr Arg Gly170 175 180His Leu Pro Leu Arg Lys Glu Phe Val Asp Ile Val Gln Pro185 190 19權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，選自(a)編碼具有圖1的第30位至第224位氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)編碼具有由包含于ATCC保藏號75946的cDNA編碼的成熟多肽的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；和(c)與(a)或(b)的多核苷酸具有至少95％相同性的多核苷酸，其中所述多核苷酸編碼抑制金屬蛋白酶活性的多肽。
2.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
3.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
4.權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是基因組DNA。
5.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸是(a)。
6.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸是(b)。
7.權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸是(c)。
8.一種載體，其含有權(quán)利要求2的DNA。
9.一種用權(quán)利要求8的載體遺傳工程化的宿主細(xì)胞。
10.一種生產(chǎn)多肽的方法，包括從權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞表達(dá)由所述DNA編碼的多肽。
11.一種由權(quán)利要求10的方法生產(chǎn)的TIMP-4多肽。
12.一種生產(chǎn)能表達(dá)多肽的細(xì)胞的方法，包括用權(quán)利要求8的載體對細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程化。
13.一種多肽，選自(a)具有圖1的第30位至第224位氨基酸的多肽；和(b)具有由包含于ATCC保藏號75946的cDNA編碼的成熟多肽的多肽。
14.一種抗體，其特異性結(jié)合于權(quán)利要求11或13的多肽。
15.權(quán)利要求14的抗體，其是單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、人源化抗體、或Fab片段。
16.一種分離的細(xì)胞，其產(chǎn)生權(quán)利要求14的抗體。
17.權(quán)利要求11或13的多肽在制備用來施用于需要人TIMP-4的患者的治療組合物中的用途。
18.權(quán)利要求1的多核苷酸在制備用來施用于需要人TIMP-4的患者的治療組合物中的用途。
19.權(quán)利要求1的多核苷酸在制備用來診斷與人TIMP-4核酸序列中的突變相關(guān)的疾病或疾病易感性的診斷劑中的用途。
20.權(quán)利要求14的抗體在制備用來施用于需要抑制人TIMP-4的患者的治療組合物中的用途。
21.權(quán)利要求14的抗體在制備用來診斷與人TIMP-4蛋白水平的變化相關(guān)的疾病或疾病易感性的診斷劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了金屬蛋白酶－4多肽的人組織抑制劑(TIMP－4)，編碼該多肽的DNA(RNA)和以重組技術(shù)生產(chǎn)該多肽的方法，還公開了利用該多肽治療包括關(guān)節(jié)炎和癌癥的疾病的方法。還公開了針對該多肽的拮抗劑及其作為再吸收瘢痕組織的治療劑的用途。還公開了用于檢測人TIMP－4蛋白水平和人TIMP－4核酸序列的突變的診斷方法。
文檔編號A61P19/08GK1495258SQ03101209
公開日2004年5月12日 申請日期1994年12月13日 優(yōu)先權(quán)日1994年12月13日
發(fā)明者約翰·M·格林, 克雷格·A·羅森, A 羅森, 約翰 M 格林 申請人:人體基因組科學(xué)有限公司