專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)調(diào)節(jié)交感神經(jīng)緊張性控制骨形成的方法和組合物的制作方法
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本發(fā)明得到政府支持，國(guó)立衛(wèi)生院基金資助號(hào)為DK58883和NASA NCC9-58。政府可以享有本發(fā)明的某些權(quán)利。本發(fā)明要求2001年12月5日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.60/337,054的權(quán)益，其整體在此引入作為參考。
1.引言本發(fā)明涉及治療、診斷和預(yù)防骨病情(conditions)、紊亂或疾病，包括但不局限于骨質(zhì)疏松的組合物和方法。本發(fā)明涉及對(duì)多肽類(lèi)激素瘦素(leptin)受體信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及對(duì)瘦素合成、瘦素受體合成、瘦素與其受體的結(jié)合以及瘦素向骨細(xì)胞傳導(dǎo)信號(hào)的調(diào)節(jié)。本發(fā)明還涉及通過(guò)交感神經(jīng)系統(tǒng)通路調(diào)節(jié)骨質(zhì)平衡。
本發(fā)明還提供了鑒定方法，以及化合物在骨病情、紊亂或疾病中的治療、預(yù)測(cè)和診斷中的預(yù)防性用途或治療性用途。另外，提供了診斷性監(jiān)測(cè)正在接受骨病情或紊亂治療方面臨床評(píng)價(jià)的患者的方法，監(jiān)測(cè)化合物在臨床試驗(yàn)中效率的方法，以及鑒定傾向于患有骨病情、紊亂或疾病的受試者的方法。
2.發(fā)明背景骨重建(remodeling)的生理過(guò)程使骨能夠通過(guò)兩個(gè)明確的連續(xù)細(xì)胞過(guò)程得以持續(xù)性更新(Karsenty，1999，Genes and Development，133037-3051)。最初的事件是破骨細(xì)胞對(duì)預(yù)先存在的骨的吸收，而后是成骨細(xì)胞對(duì)骨的從頭形成。骨重建的這兩個(gè)過(guò)程必須在青春期末期和性腺功能停止之間的窄限度內(nèi)維持骨質(zhì)的平衡。負(fù)責(zé)維持恒定骨質(zhì)的分子機(jī)制尚不清楚，但是有些證據(jù)表明至少部分通過(guò)復(fù)雜的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。例如，性腺障礙和伴隨性的性甾醇缺失刺激骨重建中的骨吸收過(guò)程，最終導(dǎo)致骨質(zhì)稀少(骨質(zhì)輕)或骨質(zhì)疏松(骨質(zhì)輕，并易于骨折)。同樣的，最近對(duì)血清中蝕骨抑制蛋白的鑒定，及通過(guò)系統(tǒng)途徑進(jìn)行的功能分析也說(shuō)明了分泌的分子影響骨折性的骨吸收(Simonet et al.，1997，Cell，89309-309)。對(duì)骨吸收的系統(tǒng)控制說(shuō)明待鑒定的其他循環(huán)分子能夠通過(guò)成骨細(xì)胞控制骨形成。由于影響骨重建的疾病的發(fā)生率和致死率較高，如果這些激素或生長(zhǎng)因子存在的話，它們的鑒定將是非常重要的。
一種這樣的疾病是骨質(zhì)疏松(Riggs et al.，1998，J.Bone Miner.Res.，13763-773)。骨質(zhì)疏松是影響骨重建的最常見(jiàn)疾病，也是西半球最為普遍的疾病。在生理病理水平上，疾病的標(biāo)記物是骨表現(xiàn)出較輕的質(zhì)量，也就是說(shuō)較小的密度，易于骨折。另外，兩種性別中骨質(zhì)疏松的發(fā)生和抑制性腺功能密切相關(guān)，在肥胖個(gè)體中很少發(fā)現(xiàn)。在細(xì)胞水平上，骨質(zhì)疏松的特征是骨重建平衡失調(diào)，骨吸收多于骨形成，導(dǎo)致輕骨質(zhì)，增加骨折的發(fā)生。在分子水平上，骨質(zhì)疏松的病理發(fā)生尚不清楚。
有人描述了復(fù)雜的合成代謝及分解代謝通過(guò)活化和抑制β腎上腺素能受體對(duì)骨的影響。曾有人報(bào)道了活化β腎上腺素能受體所導(dǎo)致的合成代謝和分解代謝對(duì)骨的影響。曾報(bào)道了非常矛盾的結(jié)果，但這些結(jié)果是前后事件依賴性的結(jié)果，源于甲狀旁腺激素的作用(Kellenberger et al.，1998，Bone 22(5)471-478)。另外，不但報(bào)道了β激動(dòng)劑的合成代謝效應(yīng)，還報(bào)道了β拮抗劑的合成代謝效應(yīng)。在卵巢切除大鼠的骨中觀察到了β激動(dòng)劑福莫特羅(formoterol)和沙丁胺醇(salbutamol)的合成代謝效應(yīng)(Pataki et al.，1996，Bone 19(3)，Supplement 129S-169S)。再則，據(jù)報(bào)道β3拮抗劑BRL 35135使腰脊中的骨髓脂肪細(xì)胞減小，但是不使脛骨中的骨髓脂肪細(xì)胞減小(Kurabayashi et al.，2001，Calcif Tissue Int 68248-254)。說(shuō)明了工作量減少的情況下，β2激動(dòng)劑克侖特羅(clenbuterol)對(duì)肌肉和對(duì)骨質(zhì)效應(yīng)之間的直接關(guān)系，經(jīng)推斷這是因?yàn)榭藖鎏亓_使肌肉質(zhì)量發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致失活所致的骨礦物化作用減弱(Zeman et al.，1991，Am J.Physiol Endocrin Metab 261E285-E289)。在用非特異性β阻斷劑普萘洛爾(propranolol)處理的大鼠中觀察到股骨干骺端礦物添附速度增加，說(shuō)明普萘洛爾可以通過(guò)β腎上腺素能機(jī)制或膜穩(wěn)定機(jī)制刺激骨代謝，影響成骨細(xì)胞(Minkowitz et al.，1991，J.Orthop Res 9869-875)。因此，尚不清楚β激動(dòng)劑和/或拮抗劑對(duì)骨類(lèi)型有何作用，不清楚β激動(dòng)劑和/或拮抗劑的作用是直接的，還是間接的。
下丘腦中瘦素的信號(hào)傳導(dǎo)能夠刺激交感神經(jīng)對(duì)某些組織的活性，特別是對(duì)褐色脂肪組織、腎臟、后肢、腎上腺的活性(Haynes et al.，1997，J.Clin.Investigation 100(2)270-278)。對(duì)褐色脂肪組織的交感神經(jīng)活性的增加的結(jié)果是增加生熱活性，以及增加UCP1(非偶聯(lián)的蛋白1)和瘦素自身的基因表達(dá)(Commins et al.，1999，Endocrinology140(10)4772-4778)。還有一些證據(jù)表明瘦素可以通過(guò)刺激交感神經(jīng)來(lái)調(diào)節(jié)胰腺分泌功能(Mizuno et al.，1998，Endocrinology 139(9)3863-3870)。其他的文章表明瘦素表達(dá)缺失的哺乳動(dòng)物交感神經(jīng)活性降低，出現(xiàn)分泌障礙，在某些情況下，腎上腺素能激動(dòng)劑能夠抑制這些動(dòng)物的體重增加(Commins et al.，2000，J.Biol.Chem.275(42)33059-33067；Ozata et al.，1999，J Clin Endocrinol Metab 84(10)3686-95)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目的是通過(guò)調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)通路來(lái)治療、診斷和/或預(yù)防骨病。本發(fā)明的一個(gè)方面中，存在治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括施用β腎上腺素能(adrenergic)拮抗劑。該方面的一個(gè)具體的實(shí)施方案包括，但不局限于進(jìn)一步聯(lián)合施用瘦素拮抗劑和β腎上腺素能拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在有治療或預(yù)防骨骼石化癥(osteopetrosis)或骨硬化(osteoscelerosis)的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括施用β腎上腺素能激動(dòng)劑。進(jìn)一步的實(shí)施方案包括，但不局限于進(jìn)一步聯(lián)合施用瘦素激動(dòng)劑和β腎上腺素能激動(dòng)劑。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及調(diào)節(jié)瘦素對(duì)骨的作用的方法，該方法包括施用治療有效量的藥物組合物，使之改變交感神經(jīng)緊張性(tone)。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及調(diào)節(jié)骨質(zhì)的方法，該方法包括施用治療有效量的藥物組合物，使之改變交感神經(jīng)緊張性，從而調(diào)節(jié)骨質(zhì)。藥物組合物的具體實(shí)施方案包括，但不局限于瘦素拮抗劑、瘦素激動(dòng)劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑，及其組合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及治療或預(yù)防骨病的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括施用治療有效量的藥物組合物，通過(guò)改變交感神經(jīng)緊張性調(diào)節(jié)瘦素在骨中的效應(yīng)。藥物組合物的具體實(shí)施方案包括，但不局限于瘦素拮抗劑、瘦素激動(dòng)劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑，及其組合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物骨病，包括(a)測(cè)定懷疑具有骨病的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的交感神經(jīng)緊張性和瘦素活性；和(b)將步驟(a)中測(cè)得的值和相應(yīng)的對(duì)照值相比較。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及藥物組合物，該藥物組合物包括瘦素拮抗劑、瘦素激動(dòng)劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑的任意組合。這些組合的例子包括，但不局限于瘦素拮抗劑和交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑、瘦素激動(dòng)劑和交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑、瘦素拮抗劑和交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑、瘦素激動(dòng)劑和交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可以接受的載體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)調(diào)節(jié)瘦素信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)治療、診斷和/或預(yù)防骨病?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明治療和/或預(yù)防的骨病包括和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病，包括但不局限于骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)稀少(osteopenia)和佩吉特癥。可以根據(jù)本發(fā)明治療和/或預(yù)防的骨病還包括和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增多的骨病，包括但不局限于骨骼石化癥、骨硬化、骨軟骨病和pynchodisostosis。
因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、能夠降低血清中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些。這些化合物包括反義序列、核酶或瘦素編碼多肽的三聯(lián)(triple)螺旋序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、能夠降低腦脊液中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些，以及和血液中瘦素相結(jié)合的化合物。
本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案包括，例如，治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病，其中的化合物選自能夠和血液中瘦素相結(jié)合的化合物，這些化合物包括但不局限于特異性結(jié)合瘦素的抗體、可溶性瘦素受體多肽、間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈相關(guān)蛋白和α2-巨球蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、降低磷酸化Stat3多肽水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些；和血液中瘦素相結(jié)合的化合物；瘦素受體拮抗性化合物，如乙酰苯酚化合物、特異性結(jié)合瘦素的抗體、特異性結(jié)合瘦素受體的抗體和包括可溶性瘦素受體多肽序列的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療或預(yù)防骨病的方法，該方法包括向需要所述治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、抑制多巴胺β羥化酶(“DBH”)活性的化合物，該酶是將多巴胺轉(zhuǎn)化為去甲腎上腺素所必需的。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制DBH酶活性、DBH基因表達(dá)的那些、特異性結(jié)合DBH的抗體和參與去甲腎上腺素合成途徑的化合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，DBH抑制劑可以和另一個(gè)拮抗劑或激動(dòng)劑(如β腎上腺素能拮抗劑和/或瘦素拮抗劑)同時(shí)施用。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、能夠降低下丘腦中瘦素受體水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素受體合成或增加瘦素受體降解的那些。這些化合物包括反義序列、核酶或瘦素受體編碼多肽的三聯(lián)螺旋序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、能夠增加血清和/或腦脊液中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于增加或誘導(dǎo)瘦素合成或減少瘦素降解的那些。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、增加磷酸化Stat3多肽水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于增加或誘導(dǎo)瘦素合成或減少瘦素降解的那些，以及瘦素受體激動(dòng)性化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、能夠增加下丘腦中瘦素受體水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于增加或誘導(dǎo)瘦素受體合成或減少瘦素受體降解的那些。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在預(yù)防骨病的方法，該方法包括向具有發(fā)生疾病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用能夠降低血清中瘦素水平、濃度足以預(yù)防骨病的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素受體的那些。這些化合物包括反義序列、核酶或瘦素編碼多肽的三聯(lián)螺旋序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在預(yù)防骨病的方法，該方法包括向具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用能夠降低腦脊液中瘦素水平、濃度足以預(yù)防骨病的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些，以及與血液中瘦素相結(jié)合的化合物。
本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案包括，例如預(yù)防骨病的方法，該方法包括向具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用濃度足以預(yù)防骨病的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病，其中的化合物選自能夠和血液中瘦素相結(jié)合的化合物，這些化合物包括但不局限于特異性結(jié)合瘦素的抗體、可溶性瘦素受體多肽、間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈相關(guān)蛋白和α2-巨球蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在預(yù)防骨病的方法，該方法包括向具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用能夠降低磷酸化Stat3水平、濃度足以預(yù)防骨病的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的那些；和血液中瘦素相結(jié)合的化合物；瘦素受體拮抗性化合物，如乙酰苯酚化合物、特異性結(jié)合瘦素的抗體、特異性結(jié)合瘦素受體的抗體和包括可溶性瘦素受體多肽序列的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在預(yù)防骨病的方法，該方法包括向具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用能夠降低下丘腦中瘦素受體水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素受體合成或增加瘦素受體降解的那些。這些化合物包括反義序列、核酶或瘦素編碼多肽的三聯(lián)螺旋序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在預(yù)防骨病的方法，該方法包括向具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用能夠增加血清和/或腦脊液中瘦素水平、濃度足以預(yù)防骨病的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于增加或誘導(dǎo)瘦素合成或減少瘦素降解的那些。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在預(yù)防骨病的方法，該方法包括向具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用能夠增加磷酸化Stat3水平、濃度足以預(yù)防骨病的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于增加或誘導(dǎo)瘦素合成或減少瘦素降解的那些，以及瘦素受體激動(dòng)性化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在預(yù)防骨病的方法，該方法包括向具有發(fā)生疾病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用能夠增加下丘腦中瘦素受體水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于增加或誘導(dǎo)瘦素受體合成或減少瘦素受體降解的那些。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物(如人類(lèi))骨病的方法，該方法包括(a)測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如懷疑為骨病或具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)血清中的瘦素水平；和(b)將(a)中測(cè)得的水平和對(duì)照血清中的瘦素水平相比較，如果(a)中測(cè)得的水平高于對(duì)照水平，則預(yù)測(cè)或診斷哺乳動(dòng)物表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病的危險(xiǎn)性，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物(如人類(lèi))骨病的方法，該方法包括(a)測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如懷疑為骨病或具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平；和(b)將(a)中測(cè)得的水平和對(duì)照腦脊液中的瘦素水平相比較，如果(a)中測(cè)得的水平高于對(duì)照水平，則預(yù)測(cè)或診斷哺乳動(dòng)物表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病的危險(xiǎn)性，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物(如人類(lèi))骨病的方法，該方法包括(a)測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如懷疑為骨病或具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)血清中的瘦素水平；和(b)將(a)中測(cè)得的水平和對(duì)照血清中的瘦素水平相比較，如果(a)中測(cè)得的水平低于對(duì)照水平，則預(yù)測(cè)或診斷哺乳動(dòng)物表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病的危險(xiǎn)性，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物(如人類(lèi))骨病的方法，該方法包括(a)測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如懷疑為骨病或具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平；和(b)將(a)中測(cè)得的水平和對(duì)照腦脊液中的瘦素水平相比較，如果(a)中測(cè)得的水平低于對(duì)照水平，則預(yù)測(cè)或診斷哺乳動(dòng)物表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病的危險(xiǎn)性，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在監(jiān)測(cè)化合物對(duì)哺乳動(dòng)物(如人類(lèi))骨病治療效率的方法，該方法包括(a)向哺乳動(dòng)物施用化合物；(b)測(cè)定哺乳動(dòng)物血清中的瘦素水平；和(c)將(b)中測(cè)得的水平和施用化合物之前的哺乳動(dòng)物血清中的瘦素水平相比較，從而監(jiān)測(cè)化合物的效率，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在監(jiān)測(cè)化合物對(duì)哺乳動(dòng)物(如人類(lèi))骨病治療效率的方法，該方法包括(a)向哺乳動(dòng)物施用化合物；(b)測(cè)定哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平；和(c)將(b)中測(cè)得的水平和施用化合物之前的哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平相比較，從而監(jiān)測(cè)化合物的效率，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在監(jiān)測(cè)化合物對(duì)哺乳動(dòng)物(如人類(lèi))骨病治療效率的方法，該方法包括(a)向哺乳動(dòng)物施用化合物；(b)測(cè)定哺乳動(dòng)物血清中的瘦素水平；和(c)將(b)中測(cè)得的水平和施用化合物之前的哺乳動(dòng)物血清中的瘦素水平相比較，從而監(jiān)測(cè)化合物的效率，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在監(jiān)測(cè)化合物對(duì)哺乳動(dòng)物(如人類(lèi))骨病治療效率的方法，該方法包括(a)向哺乳動(dòng)物施用化合物；(b)測(cè)定哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平；和(c)將(b)中測(cè)得的水平和施用化合物之前的哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平相比較，從而監(jiān)測(cè)化合物的效率，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠調(diào)節(jié)(增加或降低)哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)將受試化合物和多肽相接觸；(b)測(cè)定受試化合物是否和多肽相結(jié)合，如果受試化合物與多肽相結(jié)合，則鑒定到能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)的化合物，其中多肽選自瘦素多肽、瘦素受體多肽和腎上腺素能受體多肽。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠調(diào)節(jié)(增加或降低)哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和多肽相接觸；(b)鑒定能夠和多肽相結(jié)合的受試化合物；和(c)將(b)中的受試化合物施用到非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)，測(cè)定和未處理的對(duì)照非人類(lèi)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的相應(yīng)骨相比，受試化合物是否能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)。
其中多肽選自瘦素多肽、瘦素受體多肽和腎上腺素能受體多肽，如果化合物調(diào)節(jié)了骨質(zhì)，則鑒定到能夠調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定具有調(diào)節(jié)(增加或降低)哺乳動(dòng)物骨質(zhì)能力的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和瘦素多肽及瘦素受體多肽接觸一段時(shí)間，使能夠形成瘦素/瘦素受體復(fù)合物或兒茶酚胺/腎上腺素能受體復(fù)合物；和(b)測(cè)定瘦素/瘦素受體或兒茶酚胺/腎上腺素能受體復(fù)合物水平，如果測(cè)得的水平和不存在受試化合物時(shí)測(cè)得的水平不同，則鑒定到能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠降低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和表達(dá)功能性瘦素受體或功能性腎上腺素能受體的細(xì)胞相接觸，和(b)測(cè)定受試化合物是否活化瘦素受體或腎上腺素能受體，如果化合物活化了瘦素受體或腎上腺素能受體，則鑒定到能夠降低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠減低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和表達(dá)功能性瘦素受體或功能性腎上腺素能受體的細(xì)胞相接觸，測(cè)定受試化合物是否活化瘦素受體或腎上腺素能受體；(b)將(a)中測(cè)定的活化瘦素受體或腎上腺素能受體的受試化合物施用到非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)，測(cè)定與相應(yīng)的對(duì)照非人類(lèi)動(dòng)物相比，受試化合物是否降低動(dòng)物的骨質(zhì)，如果受試化合物降低了骨質(zhì)，則鑒定到能夠降低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使瘦素多肽及受試化合物和表達(dá)功能性瘦素受體的細(xì)胞相接觸；和(b)和不存在受試化合物情況下測(cè)定的瘦素受體活化水平相比，測(cè)定受試化合物是否減弱瘦素受體的活化；其中能夠減弱瘦素受體活化的受試化合物是能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使兒茶酚胺及受試化合物和表達(dá)功能性腎上腺素能受體的細(xì)胞相接觸；和(b)和不存在受試化合物情況下測(cè)定的腎上腺素能受體活化水平相比，測(cè)定受試化合物是否減弱腎上腺素能受體的活化；其中能夠減弱腎上腺素能受體活化的受試化合物是能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使瘦素多肽及受試化合物和表達(dá)功能性瘦素受體的細(xì)胞相接觸，測(cè)定受試化合物能否減弱瘦素受體的活化；和(b)將(a)中測(cè)定的減弱瘦素受體活化的受試化合物施用到非人類(lèi)的動(dòng)物體內(nèi)，和對(duì)照非人類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的相應(yīng)骨相比，測(cè)定受試化合物是否增加骨質(zhì)；如果受試化合物增加了骨質(zhì)，則鑒定到能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使兒茶酚胺及受試化合物和表達(dá)功能性腎上腺素能受體的細(xì)胞相接觸，測(cè)定受試化合物能否減弱腎上腺素能受體的活化；和(b)將(a)中測(cè)定的減弱瘦素受體活化的受試化合物施用到非人類(lèi)的動(dòng)物體內(nèi)，和對(duì)照非人類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的相應(yīng)骨相比，評(píng)價(jià)受試化合物是否增加骨質(zhì)；如果受試化合物增加了骨質(zhì)，則鑒定到能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
本發(fā)明還提供了能夠用于治療和/或預(yù)防骨病的藥物組合物。
通過(guò)閱讀下面的說(shuō)明書(shū)，參考作為說(shuō)明書(shū)一部分的附圖，或者本發(fā)明中優(yōu)選實(shí)施方案的任意實(shí)施例，其他和進(jìn)一步的目的、特征和優(yōu)勢(shì)將是顯而易見(jiàn)的。
3.1術(shù)語(yǔ)這里所用的下列術(shù)語(yǔ)指的是這里所用的瘦素(“Ob”)指的是ob基因(優(yōu)選人ob基因)的內(nèi)源性多肽產(chǎn)物，其已知活性是通過(guò)下丘腦介導(dǎo)的。
這里所用的瘦素受體(“ObR”)指的是瘦素激素與之結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)的受體；優(yōu)選的是，該術(shù)語(yǔ)指人瘦素受體。
這里所用的兒茶酚胺指的是兒茶酚(1，2-二羥基苯)的內(nèi)源性含胺衍生物，優(yōu)選去甲腎上腺素和腎上腺素。
這里所用的腎上腺素能受體(“AR”)指的是兒茶酚胺與之結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)的受體；優(yōu)選的是，該術(shù)語(yǔ)指人腎上腺素能受體。
這里所用的NPY指的是神經(jīng)肽Y，優(yōu)選人神經(jīng)肽Y。神經(jīng)肽Y(NPY)是胰多肽家族的成員之一?？梢岳斫獾氖牵@里所用的術(shù)語(yǔ)NPY不僅包括神經(jīng)肽Y，還包括胰多肽家族中的肽衍生物，如肽YY(PYY)和胰多肽(PP)。
這里所用的神經(jīng)肽Y受體(“NPY”受體或“NPY-R”)指的是在生理?xiàng)l件下與內(nèi)源性NPY結(jié)合的受體，優(yōu)選在生理?xiàng)l件下與內(nèi)源性NPY結(jié)合的人受體。NPY受體是G蛋白偶聯(lián)的受體，包括但不局限于Y1、Y2、Y3、Y4或Y5(或PP)亞型。
這里所用的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(“CNTF”)指的是CNTF基因，優(yōu)選人CNTF基因的內(nèi)源性多肽產(chǎn)物，其已知活性通過(guò)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周(包括自主)神經(jīng)系統(tǒng)介導(dǎo)。
這里所用的CNTF受體指的是CNTF與之結(jié)合產(chǎn)生信號(hào)的受體；優(yōu)選的是，該術(shù)語(yǔ)指人CNTF受體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，CNTF受體包括gp130、LIFR、CNTFRα和傳導(dǎo)CNTF信號(hào)所需的其他分子所形成的多聚復(fù)合物。在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，CNTF受體包括gp130、LIFR、CNTFRα類(lèi)似物所形成的多聚復(fù)合物。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員都知道這種類(lèi)似物能夠產(chǎn)生CNTF受體功能。在這種實(shí)施方案中，CNTF受體具體包括gp130、LIFR、sCNTFRα所形成的多聚復(fù)合物。
這里所用的CNTF受體多肽指的是CNTF受體的多肽組分。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，CNTF受體多肽包括gp130、LIFR、CNTFRα和傳導(dǎo)CNTF信號(hào)所需的其他任意分子，及其功能類(lèi)似物。這種類(lèi)似物包括sCNTFRα，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員都知道這種類(lèi)似物參與CNTF信號(hào)傳導(dǎo)。
這里所用的CNTF受體多聚核苷酸指的是編碼CNTF受體多肽組分的多聚核苷酸。在具體的實(shí)施方案中，CNTF受體多聚核苷酸包括編碼gp130的多聚核苷酸、編碼LIFR的多聚核苷酸、編碼CNTFRα的多聚核苷酸和編碼CNTF受體其他組分的多聚核苷酸。
這里所用的CNTF基因指的是編碼CNTF受體多肽組分的基因，例如編碼gp130、LIFR、CNTFRα或CNTF受體其他組分的基因。
這里所用的可溶性CNTFRα(“sCNTFRα”)是在細(xì)胞外微環(huán)境中可溶的、包含CNTFRα多肽組分的分子?？扇苄訡NTFRα典型地缺少CNTFRα的GPI膜錨定區(qū)。
這里所用的骨病指的是導(dǎo)致或特征是喪失健康或骨完整性的骨病或狀態(tài)，包括但不局限于骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)稀少、異常骨形成或骨吸收、佩吉特癥、骨折和斷骨、骨轉(zhuǎn)移、骨骼石化癥、骨硬化和骨軟骨病。更具體的是，可以根據(jù)本發(fā)明治療和/或預(yù)防的骨病包括和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減少的骨病(如骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)稀少和佩吉特病)以及和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病(如骨骼石化癥、骨硬化和骨軟骨病)。骨病的預(yù)防包括在疾病發(fā)生之前如這里所述進(jìn)行積極介入，以防止疾病。骨病的治療包括在疾病發(fā)生之后進(jìn)行積極介入，以使疾病或病情減緩、改善其癥狀或逆轉(zhuǎn)。更具體的是，這里所用的治療指調(diào)節(jié)骨質(zhì)，使之和非發(fā)病狀態(tài)下的相應(yīng)非發(fā)病骨(同一類(lèi)型的相應(yīng)骨，如長(zhǎng)骨、脊椎骨等)更為近似的方法。
這里所用的瘦素受體拮抗劑指中和或妨礙或減弱瘦素受體作用或效應(yīng)的因子。這種拮抗劑包括與瘦素結(jié)合或與瘦素受體結(jié)合的化合物。這種拮抗劑還包括中和或妨礙或減少瘦素受體信號(hào)輸出的化合物，瘦素受體信號(hào)輸出是瘦素與瘦素受體結(jié)合后瘦素信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響瘦素/瘦素受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。瘦素受體拮抗劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如乙酰苯酚化合物、特異性結(jié)合瘦素的抗體、特異性結(jié)合瘦素受體的抗體和包含可溶性瘦素受體多肽序列的化合物。
這里所用的瘦素受體激動(dòng)劑指活化、誘導(dǎo)或增強(qiáng)瘦素受體作用或效應(yīng)的因子。這種激動(dòng)劑包括與瘦素結(jié)合或與瘦素受體結(jié)合的化合物。這種激動(dòng)劑還包括活化、誘導(dǎo)或增加瘦素受體信號(hào)輸出的化合物，瘦素受體信號(hào)輸出是瘦素與瘦素受體結(jié)合后瘦素信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響瘦素/瘦素受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。瘦素受體激動(dòng)劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如瘦素、瘦素類(lèi)似物、特異性結(jié)合并活化瘦素的抗體。
如果所施用的量使接受者哺乳動(dòng)物發(fā)生所需的生理變化，如增加或降低疾病狀態(tài)下相應(yīng)骨骨質(zhì)；也就是說(shuō)，能夠治療，即將骨質(zhì)調(diào)節(jié)至和非疾病狀態(tài)下相應(yīng)非發(fā)病骨(同一類(lèi)型的相應(yīng)骨，如長(zhǎng)骨、脊椎骨等)較為類(lèi)似的程度，則可以說(shuō)施用了“治療有效量”的試劑。
這里所用的ECD指細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
這里所用的TM指跨膜結(jié)構(gòu)域。
這里所用的CD指胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
4.附圖簡(jiǎn)述

圖1A-1F.ob/ob和db/db小鼠體內(nèi)的高骨質(zhì)表型。在圖1A中示出了6月齡野生型(wt)和ob/ob小鼠體內(nèi)椎骨(vert.)和長(zhǎng)骨(femurs)的X-射線分析。圖1B所示為3月齡(3m.)和6月齡(6m.)wt和ob/ob小鼠骨的組織學(xué)分析。上面的兩組為椎骨的分析結(jié)果，下面的兩組為長(zhǎng)骨的分析結(jié)果。Von Kossa試劑將礦物化的骨基質(zhì)染成橫色。圖1C所示為對(duì)ob/ob小鼠骨體積增加的定量分析。BV/TV為骨體積相對(duì)于小梁體積的比值?；疑硎緒t小鼠；黑色柱表示ob/ob小鼠。圖1D所示為野生型(wt)、ob/ob和野生型卵巢切除(wt-OVX)小鼠長(zhǎng)骨的三點(diǎn)彎曲分析。圖1E所示為6月齡wt和db/db小鼠椎骨的組織學(xué)分析。圖1F所示為對(duì)db/db小鼠骨體積增加的定量分析。星號(hào)表示兩組小鼠之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。誤差柱表示中間值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。
圖2A-2D.ob/ob小鼠的高骨質(zhì)表型緣于瘦素缺陷，而非緣于肥胖。圖2A所示為低脂飲食的1月齡wt(wt 1 mo)和ob/ob小鼠椎骨的組織學(xué)分析。圖2B所示為3月齡wt和ob/+小鼠椎骨的組織學(xué)分析。圖2C所示為6月齡wt和Agouti yellow突變小鼠(Ay/a)椎骨的組織學(xué)分析。圖2D所示為正常飲食或高脂(HF)飲食的6月齡wt椎骨的組織學(xué)分析。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。
圖3A-3H.瘦素信號(hào)的缺失導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能增加。在圖3A中，說(shuō)明了3月齡wt(wt)和ob/ob小鼠的鈣黃綠素雙標(biāo)記。兩種標(biāo)記(白色箭頭)之間的距離表示骨形成速度。在圖3B-3F中，和同窩的wt小鼠相比，ob/ob小鼠(B)和db/db小鼠(D)中骨形成速度分別增加了45％和70％。這種增加發(fā)生在存在有正常數(shù)目的成骨細(xì)胞的情況下(圖3C和3E)。中空柱，wt小鼠；黑色柱，ob/ob小鼠；灰色柱，db/db小鼠；3m.，3月齡動(dòng)物；6m.，6月齡動(dòng)物。在圖3G中，限制脂肪的1月齡ob/ob小鼠和不表現(xiàn)肥胖的雜合ob/+小鼠中骨形成的速度增加。在圖3H，高脂肪飲食的wt小鼠或超重、但沒(méi)有瘦素缺陷的Ay/a小鼠(參見(jiàn)FIGS.2C和D)具有正常的骨形成速度。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。誤差柱表示為SEM。
圖4A-4E.不存在瘦素信號(hào)傳導(dǎo)條件下的正常成骨細(xì)胞功能。示出了對(duì)野生型(wt)和性腺功能減退癥得到或未得到(P，安慰劑)17β-雌二醇(E2)治療糾正的ob/ob小鼠。圖4A說(shuō)明17β-雌二醇糾正了ob/ob小鼠的子宮萎縮。圖4B至4D為椎骨的組織學(xué)分析，說(shuō)明17β-雌二醇處理導(dǎo)致17β-雌二醇處理的wt，甚至17β-雌二醇處理的ob/ob小鼠中骨小梁的顯著增加?；疑?，野生型小鼠；黑色柱，ob/ob小鼠；patterned柱，處理小鼠；實(shí)心柱，安慰劑對(duì)照小鼠。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和未處理小鼠之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。誤差柱表示為SEM。在圖4E中，示出ob/ob和db/db離體成骨細(xì)胞的正常分化和功能。來(lái)源于wt、ob/ob和db/db小鼠的骨髓原祖同樣程度地分化成TRAP陽(yáng)性(TRAP+)的成骨細(xì)胞(上面一組和下面的線)。它們?cè)谘蕾|(zhì)切片基質(zhì)上形成吸收窩的能力也沒(méi)有差異(下面一組)。
圖5A-5F.瘦素在成骨細(xì)胞中不進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)。圖5A中所示為對(duì)組織和原代細(xì)胞(非礦物化(NM)的成骨細(xì)胞、礦物化(M)的成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞)(上面一組)中瘦素表達(dá)的Northern印跡分析。GAPDH表達(dá)用作上樣的內(nèi)部對(duì)照(下面一組)。圖5B表明通過(guò)PCR在長(zhǎng)骨、Calabria和原代成骨細(xì)胞中檢測(cè)不到Ob-Rb(Ob-受體，b型)轉(zhuǎn)錄物，但在下丘腦中能夠檢測(cè)到其信使。擴(kuò)增Hprt用作cDNA質(zhì)量的內(nèi)部對(duì)照。圖5C是Western印跡分析。抑瘤素-M(OSM)的誘導(dǎo)用作陽(yáng)性對(duì)照。圖5D中是使用瘦素或抑瘤素-M處理原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物，對(duì)即早基因表達(dá)(Tisll和c-fos基因)的Northern印跡分析。GAPDH表達(dá)用作上樣的內(nèi)部對(duì)照(下面一組)。圖5E中示出了來(lái)源于野生型小鼠、不存在(賦形劑)或存在瘦素的條件下培養(yǎng)的離體原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物。觀察到對(duì)膠原合成(上面一組，van Gieson染色)或基質(zhì)礦物化(下面一組，von Kossa染色)沒(méi)有作用。圖5F中示出了離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中db/db成骨細(xì)胞的正常功能。說(shuō)明了來(lái)源于wt和db/db小鼠的原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物之間的膠原合成(上面一組，van Gieson染色)和基質(zhì)礦物化(下面一組，von Kossa染色)。
圖6A-6C.脂肪組織對(duì)于高骨質(zhì)表型的呈現(xiàn)來(lái)說(shuō)并非必需的。在圖6A中，示出了6月齡wt和不具有脂肪組織的A-ZIP/F-1轉(zhuǎn)基因小鼠椎骨的組織學(xué)分析。說(shuō)明了轉(zhuǎn)基因小鼠中的骨體積(B)和骨形成速度。星號(hào)表示wt和轉(zhuǎn)基因小鼠之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。誤差柱表示為SEM。
圖7A-7D.瘦素對(duì)骨形成的作用是通過(guò)下丘腦中繼站介導(dǎo)的。在圖7A中，對(duì)中樞灌輸(第三腦室)PBS或瘦素的4月齡ob/ob小鼠和wt小鼠進(jìn)行組織學(xué)比較。說(shuō)明了骨體積(B)、骨小梁體積(C)和骨形成速度(D)。星號(hào)表示PBS灌輸和瘦素灌輸?shù)男∈笾g有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。誤差柱表示為SEM。
圖8.DBH敲除小鼠具有高的骨體積。圖8所示為wt和DBH-/-小鼠椎骨的組織學(xué)分析。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。
圖9A-9F.瘦素在下丘腦中的抑制食欲功能和抗骨形成作用。(圖9A-9C)MSG損傷。(A)對(duì)下丘腦結(jié)構(gòu)的作用，Cresyl紫染色(上面一組)；NPY(中間一組)和SF1(下面一組)的免疫組化。分別用黑色和紅色點(diǎn)狀線圈出了弓形核(ARC)和VMH。MSG處理顯著影響ARC結(jié)構(gòu)和NPY表達(dá)(箭頭)，而VMH結(jié)構(gòu)和表達(dá)SF1的神經(jīng)元完好。(B)MSG損傷小鼠椎骨的組織學(xué)分析；骨體積(％骨體積/組織體積)未受影響。(C)瘦素ICV灌輸不影響MSG損傷的ob/ob小鼠(MSG+瘦素)的體重(左側(cè))，但是減小其骨體積(右側(cè))。(圖9D-9F)GTG損傷。(D)對(duì)下丘腦結(jié)構(gòu)的作用，Cresyl紫染色(上面一組)；NPY(中間一組)和SF1(下面一組)的免疫組化。GTG處理顯著影響VMH，產(chǎn)生粘稠的疤痕，顯著改變表達(dá)SF1的神經(jīng)元的分布，而ARC結(jié)構(gòu)和NPY表達(dá)(箭頭)不受影響。(E)GTG損傷小鼠椎骨的組織學(xué)分析；骨體積和骨形成速度(BFR/BS)都得以增加。(F)瘦素ICV灌輸減輕GTG損傷的動(dòng)物(GTG+瘦素)的體重(左側(cè))，但是不影響其骨體積(右側(cè))。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。
圖10A-10D.抑制食欲的神經(jīng)肽不控制骨形成。(A)ICV灌輸PBS或瘦素的4月齡agouti yellow突變小鼠(Ay/a)椎骨的組織學(xué)分析。ICV瘦素灌輸導(dǎo)致骨體積(骨體積％)和骨形成速度減小(BFR/BS，白色箭頭)。(B)3月齡Mc4-R缺陷小鼠(MC4-R-/-)椎骨的組織學(xué)分析；骨體積是正常的。(C-D)ICV灌輸PBS或MTII的ob/ob小鼠椎骨的組織學(xué)分析；骨體積未受影響(C)，而體重減輕(D)。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。誤差柱表示SEM。
圖11A-11E.對(duì)瘦素抑制食欲功能的外周調(diào)節(jié)。(A)左側(cè)所示為灌輸PBS或瘦素的聯(lián)體ob/ob小鼠的組織學(xué)分析。瘦素ICV灌輸減小同側(cè)小鼠(瘦素)的骨體積(骨體積％)，但是不減小異側(cè)小鼠(瘦素配偶物)的骨體積。PBS對(duì)之沒(méi)有影響(PBS和PBS配偶物)。(B)產(chǎn)生成骨細(xì)胞特異的瘦素(αl(I)-瘦素)轉(zhuǎn)基因小鼠。上面一組，構(gòu)建體示意圖。小鼠瘦素cDNA位于2.3kb成骨細(xì)胞特異的αl(I)膠原啟動(dòng)子片段的控制之下。下面左側(cè)組，骨中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的Northern印跡分析。下面右側(cè)組，αl(I)瘦素小鼠，而非wt小鼠骨中檢測(cè)到了瘦素免疫反應(yīng)性。(C)共轉(zhuǎn)染αl瘦素轉(zhuǎn)基因和Stat3依賴的啟動(dòng)子-luc構(gòu)建體、表達(dá)ObRb的293細(xì)胞中αl瘦素轉(zhuǎn)基因的生物活性分析。(E)12月齡αl(I)瘦素轉(zhuǎn)基因小鼠椎骨的組織學(xué)分析。成骨細(xì)胞中瘦素的表達(dá)不影響骨體積。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。誤差柱表示SEM。
圖12A-12G.骨形成的交感神經(jīng)控制。(A)12月齡Dbh缺陷小鼠(Dbh-/-)椎骨的組織學(xué)分析。Dbh-/-小鼠中骨體積(骨體積％)顯著增加。(B)Dbh-/-小鼠中鈣黃綠素雙標(biāo)記、骨形成速度(BFR/BS，白色箭頭)和成骨細(xì)胞數(shù)目(N.Ob/B.Pm)增加。(C，D)Dbh-/-小鼠中正常的破骨細(xì)胞數(shù)目(N.Oc/B.Pm)和脫氧吡啶啉(deoxypyridinoline)交聯(lián)消除。(E)腎上腺髓質(zhì)切除小鼠(ADX)椎骨的組織學(xué)分析；骨體積未受影響。(F，G)Dbh-/-小鼠中瘦素ICV灌輸。脂肪墊重量減輕，而骨體積未受處理的影響(E)。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。誤差柱表示SEM。
圖13A-13F.成骨細(xì)胞上腎上腺素能受體功能的存在。(A)α-和β-腎上腺素能受體表達(dá)的RT-PCR(上面一組)和Northern印跡分析(下面一組)。在成骨細(xì)胞中僅能檢測(cè)到β2-腎上腺素能受體表達(dá)。樣品來(lái)源于原代成骨細(xì)胞(ob)、心臟(C1、C2、C4和C6)、褐色脂肪組織(C3)和肝臟(C5)。Hprt擴(kuò)增和Gapdh表達(dá)用作上樣和RNA完整性的對(duì)照。(B)在wt小鼠和成骨細(xì)胞中超表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠骨中β2-腎上腺素能受體的免疫定位(插入物)。單核細(xì)胞表達(dá)β2-腎上腺素能受體，那些細(xì)胞是X-gal陽(yáng)性細(xì)胞的，即成骨細(xì)胞。(C，D)成骨細(xì)胞附近神經(jīng)微絲(C)和酪氨酸羥化酶(D，箭頭)的免疫定位。(E)2日齡小鼠骨切片的電子顯微照片。有一根神經(jīng)位于成骨細(xì)胞(ob)和骨小梁(t)的附近。(F)在鼠原代成骨細(xì)胞(左側(cè))和人SaOS-2成骨細(xì)胞(右側(cè))中，β-腎上腺素能激動(dòng)劑(異丙腎上腺素，iso；新腎上腺素，NE)能夠誘導(dǎo)cAMP生成，β-腎上腺素能拮抗劑(普萘洛爾)能夠抑制cAMP生成。PTH用作陽(yáng)性對(duì)照。
圖14A-14I.β-腎上腺素能激動(dòng)劑抑制骨形成。異丙腎上腺素(iso)處理ob/ob小鼠和wt(D-H)小鼠(A，D)。椎骨和脛骨的組織學(xué)分析(A)。Iso處理增加了骨體積(骨體積％)。(B，E)Iso處理降低了鈣黃綠素雙標(biāo)記、骨形成速度(BFR/BS，白色箭頭)和成骨細(xì)胞數(shù)目(N.Ob/B.Pm)。(C，F(xiàn))體重分析。這些劑量的Iso不影響體重。(G)Northern印跡分析。Iso增加褐色脂肪組織中UCP-1的表達(dá)(上面一組)。(H)成骨細(xì)胞增殖.Iso、地塞米松(Dex)或賦形劑(Cont.)處理的小鼠小梁中BrdU摻入的免疫定位。右側(cè)所示為BrdU陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)于對(duì)照的百分比。(I)Iso、Iso和普萘洛爾(Iso+Pro)或賦形劑(Cont.)處理的原代成骨細(xì)胞中Cbfal和αl(I)膠原表達(dá)的Northern印跡分析。Gapdh表達(dá)用作所有Northern印跡分析的內(nèi)部對(duì)照。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.05)。誤差柱表示SEM。
圖15A-15G.β-腎上腺素能激動(dòng)劑增加骨形成。wt普萘洛爾(Pro)處理(A，C)、接受ICV灌輸?shù)膚t小鼠(D，E)、卵巢切除(OVX)和假手術(shù)(假OVX)小鼠(F，G)。椎骨(A、B、E-G)和脛骨(A)的組織學(xué)分析。Pro處理增加了骨體積(骨體積％)。普萘洛爾處理的小鼠(B和G)體內(nèi)鈣黃綠素雙標(biāo)記、骨形成速度(BFR/BS，白色箭頭)和成骨細(xì)胞數(shù)目(N.Ob/B.Pm)增加。體重(C)未受影響。瘦素ICV灌輸降低Pro處理的wt小鼠(D和E)脂肪墊重量，但是不降低骨質(zhì)。Pro處理通過(guò)增加OVX小鼠骨形成參數(shù)來(lái)防止骨質(zhì)喪失(F和G)。星號(hào)表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.01)。菱形表示OVX和假手術(shù)之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(p＜0.01)。誤差柱表示SEM。
圖和圖形沒(méi)有必要刻度(scale)，提到的某些特征可以按比例加以擴(kuò)大或簡(jiǎn)明扼要以示意圖形式表示。
5.發(fā)明詳述這里詳細(xì)地說(shuō)明了本發(fā)明的各個(gè)方面。
5.1.瘦素、瘦素受體和腎上腺素能受體蛋白質(zhì)、多肽和核酸瘦素(“Ob”)、瘦素受體(“ObR”)和腎上腺素能受體(“AR”)蛋白質(zhì)和核酸(正義和反義)可以用作本發(fā)明中治療、診斷、預(yù)測(cè)和篩選方法的一部分。例如，可以使用Ob、ObR和/或AR蛋白質(zhì)、多肽和肽片段；突變、截短或缺失形式的Ob、ObR和AR，包括但不局限于可溶性的衍生物，如和一個(gè)或多個(gè)瘦素受體ECD相對(duì)應(yīng)的肽或多肽；缺失一個(gè)或多個(gè)ECD或TM的截短的瘦素受體多肽；缺失一個(gè)或多個(gè)ECD或TM的截短的腎上腺素能受體多肽；瘦素受體和腎上腺素能受體融合蛋白產(chǎn)物(如瘦素受體-Ig融合蛋白，也就是瘦素受體或瘦素受體的一個(gè)結(jié)構(gòu)域和IgFc結(jié)構(gòu)域形成的融合蛋白)。
瘦素和瘦素受體，包括人瘦素和瘦素受體的序列是人們所熟知的。至于瘦素受體蛋白的綜述，參見(jiàn)Friedman and Halaas，1998，Nature，395763-770和美國(guó)專(zhuān)利No.5,972,621。至于瘦素序列，包括人瘦素編碼序列和瘦素基因調(diào)控序列，參見(jiàn)Zhang et al.，1994，Nature372425-432；de la Brousse et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA934096-4101；He et al.，1995，J.Biol.Chem.27028887-28891；Hwanget al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93873-877和Gong et al.，1996，J.Biol Chem 2713971-3974。
腎上腺素能受體，包括人腎上腺素能受體的序列是人們所熟知的(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No 6,274,706、5,994,506、5,817,477和5,595,880)。
例如，和Ob、或ObR或AR的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域(如ECD、TM或CD)、截短或缺失的Ob、ObR或AR(如缺失TM或CD結(jié)構(gòu)域的ObR)相對(duì)應(yīng)的肽和多肽，以及全長(zhǎng)Ob、ObR或AR，Ob、ObR或AR肽或截短的Ob、ObR或AR(如ObR ECD、TM或CD結(jié)構(gòu)域)和異源非相關(guān)蛋白質(zhì)相融合的融合蛋白都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的Ob、ObR或AR核苷酸序列和Ob、ObR或AR氨基酸序列使用和設(shè)計(jì)。優(yōu)選的是，瘦素多肽能夠在生理和/或細(xì)胞培養(yǎng)條件下與瘦素受體相結(jié)合。同樣，優(yōu)選的瘦素受體多肽能夠在生理和/或細(xì)胞培養(yǎng)條件下與瘦素相結(jié)合。類(lèi)似的，優(yōu)選的腎上腺素能受體多肽能夠在生理和/或細(xì)胞培養(yǎng)條件下與兒茶酚胺相結(jié)合。因此，最低限度是瘦素受體多肽包含能夠和瘦素結(jié)合，也就是形成瘦素/瘦素受體復(fù)合物的瘦素受體氨基酸序列。類(lèi)似的，最低限度是瘦素受體多肽包含能夠和瘦素結(jié)合，的瘦素受體ECD序列。類(lèi)似的，最低限度是腎上腺素能受體多肽包含能夠和腎上腺素結(jié)合，也就是形成腎上腺素/腎上腺素能受體復(fù)合物的腎上腺素能受體氨基酸序列。同樣，最低限度是腎上腺素能受體多肽包含能夠和腎上腺素結(jié)合的腎上腺素能受體氨基酸序列。
考慮到包含全部或部分ObR或AR ECD的ObR和AR肽、多肽、融合肽和融合多肽，這種肽包括可溶性瘦素受體或腎上腺素能受體多肽。優(yōu)選的是，這種可溶性瘦素受體或腎上腺素能受體多肽可以在標(biāo)準(zhǔn)生理和/或細(xì)胞培養(yǎng)條件下分別和瘦素或兒茶酚胺相結(jié)合。因此，最低限度是這種可溶性瘦素受體或腎上腺素能受體多肽包含能夠分別和瘦素或兒茶酚胺結(jié)合的ObR或AR ECD序列。
融合多肽包括，但不局限于能夠用于本發(fā)明的篩選和/或診斷方法的、能夠穩(wěn)定可溶性O(shè)bR或AR蛋白或肽、延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期的IgFc融合體；或者和能夠使融合蛋白錨定在細(xì)胞膜上、使ECD表現(xiàn)在細(xì)胞表面的任意氨基酸序列相融合的融合體；或者和能夠提供標(biāo)記或報(bào)道功能的酶、熒光蛋白或發(fā)光蛋白相融合的融合體。
Ob、ObR或AR多肽和肽可以化學(xué)合成(參見(jiàn)Creighton，1983，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理，W.H.Freeman & Co.，N.Y.)，可以采用本領(lǐng)域人員所熟知的、表達(dá)包含Ob、ObR和AR基因序列和/或編碼序列的技術(shù)，通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生來(lái)源于Ob、ObR和AR的大多肽和全長(zhǎng)Ob、ObR和AR。Ob、ObR和AR編碼多肽不僅指編碼開(kāi)放閱讀框的序列，還指Ob、ObR和AR基因的上游序列和下游序列。這種方法還可用于構(gòu)件包含Ob、ObR和AR核苷酸序列的表達(dá)載體。這些方法包括，例如體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)和體內(nèi)基因重組(參見(jiàn)Sambrook et al.，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，冷泉港出版社，N.Y.和Ausabel et al.，1989，最新分子生物學(xué)方案，GreenPublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.，其整體在此引入作為參考)?？商鎿Q的方案是，能夠編碼Ob、ObR和AR核苷酸序列的RNA可以使用合成儀進(jìn)行化學(xué)合成(參見(jiàn)“寡聚核苷酸合成”中所述技術(shù)，1984，Gait，M.J.ed.，IRL Press，Oxford，其整體在此引如作為參考。
可以使用各種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)本發(fā)明的Ob、ObR和AR核苷酸序列。Ob、ObR和AR肽或多肽是可溶性衍生物(和ECD相對(duì)應(yīng)的ObR和/或AR肽；刪除了TM和/或CD的截短或缺失ObR)的情況下，可以從培養(yǎng)物中回收肽或多肽，ObR或AR肽或多肽為非分泌型的情況下從宿主細(xì)胞中回收，ObR或AR肽或多肽為分泌型時(shí)從培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中回收。但是，表達(dá)系統(tǒng)還包括表達(dá)Ob、ObR和AR或表達(dá)原位，即錨定在細(xì)胞膜上的功能等同物的改造宿主細(xì)胞。使用適當(dāng)?shù)淖冃詣┖椭|(zhì)微團(tuán)和本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所熟知的方法從這些表達(dá)系統(tǒng)中純化或富集Ob、ObR和AR。但是，不但要保留Ob、ObR和AR的結(jié)構(gòu)和功能特征，還要在藥物篩選分析中評(píng)價(jià)生物活性的情況下，可以使用這些改造宿主細(xì)胞。
用于本發(fā)明目的的表達(dá)系統(tǒng)包括，但不局限于微生物，如轉(zhuǎn)化包含Ob、ObR和AR核苷酸序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體的細(xì)菌(E.coli、B.subtilis)；轉(zhuǎn)化包含核苷酸序列的重組酵母表達(dá)載體的酵母(如釀酒膠木、畢赤酵母)；感染包含核苷酸序列的重組病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；感染包含核苷酸序列的重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)或轉(zhuǎn)化包含核苷酸序列的重組質(zhì)粒載體(如Ti質(zhì)粒)的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或者帶有重組表達(dá)構(gòu)建體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，其中的重組表達(dá)構(gòu)建體包含來(lái)源于哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組(金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或哺乳動(dòng)物病毒(如腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘病毒7.5K啟動(dòng)子)的啟動(dòng)子。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，最好根據(jù)要表達(dá)的Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物來(lái)選擇表達(dá)載體數(shù)目。例如，但要產(chǎn)生大量這種蛋白質(zhì)，來(lái)產(chǎn)生Ob、ObR或AR蛋白的組合物或者產(chǎn)生Ob、ObR或AR蛋白的抗體時(shí)，需要已經(jīng)純化的、指導(dǎo)高水平融合蛋白產(chǎn)物表達(dá)的載體。這些載體包括但不局限于E.coli表達(dá)載體Pur278(Ruther et al.，1983，EMBO J.21791)，其中Ob或ObR編碼序列可以單獨(dú)連接到載體中，并和lacZ編碼區(qū)框架一致，從而產(chǎn)生融合蛋白；pIN載體(Inouye & Inouye，1985，Nucleic Acids Res.133101-3109；Van Heeke & Schuster，1989，J.Biol.Chem.2645503-5509)等。pGEX載體也可用于表達(dá)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)相融合的融合蛋白形式的異源多肽。通常來(lái)說(shuō)，這種融合蛋白是可溶性的，通過(guò)將之吸附到谷胱甘肽瓊脂糖磁珠上，并在谷胱甘肽存在的條件下洗脫，易于從裂解的細(xì)胞進(jìn)行純化。pGEX載體可以包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位點(diǎn)，使克隆的靶基因產(chǎn)物從GST基團(tuán)得以釋放。
在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，苜銀蚊夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)用作表達(dá)異源基因的載體。病毒在秋粘蟲(chóng)卵巢細(xì)胞中生長(zhǎng)。Ob、ObR或AR基因編碼序列可以單獨(dú)克隆到病毒的非必需區(qū)(例如多角體蛋白基因)，并置于AcNPV啟動(dòng)子(例如多角體蛋白啟動(dòng)子)的控制之下。成功的Ob、ObR或AR基因編碼序列的插入回導(dǎo)致多角體蛋白基因失活，產(chǎn)生非包含的重組病毒(即缺少多角體蛋白基因所編碼的蛋白衣殼的病毒)。使用這些重組病毒感染秋粘蟲(chóng)卵巢細(xì)胞，使該細(xì)胞中表達(dá)插入的基因(參見(jiàn)Smith et al.，1983，J.Virol.46584和美國(guó)專(zhuān)利No.4,215,051)。
在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，可以使用許多基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。在使用腺病毒作為表達(dá)載體的情況下，目的Ob、ObR或AR核苷酸序列和腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合體，如晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列相連接。然后，通過(guò)體外或體內(nèi)重組將該嵌合基因插入到腺病毒基因組中。往病毒非必需區(qū)(如E1或E3區(qū))的插入將導(dǎo)致存活的重組病毒，能夠在受感染的宿主中表達(dá)Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物(參見(jiàn)Logan& Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-3659)。對(duì)于插入的Ob、ObR或AR核苷酸序列的有效翻譯來(lái)說(shuō)還需要特定的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和臨近序列。在整個(gè)Ob、ObR或AR基因或cDNA，包括其自身起始密碼子和臨近序列插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中時(shí)，則不許要額外的翻譯控制信號(hào)。但是，只插入部分編碼序列的情況下，必須提供外源翻譯控制信號(hào)，可能包括ATG起始密碼子。另外，起始密碼子必須和所需編碼序列的閱讀框架同相，以保證完整插入物的分儀。這些外源翻譯控制信號(hào)和起始密碼子可以是各種來(lái)源的，可以是天然的，也可以是合成的。通過(guò)加入適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件、轉(zhuǎn)錄終止子等可以增加表達(dá)效率(參見(jiàn)Bittner et al.，1987，Mothods in Enzymol.153516-544)。
另外，可以選擇能夠以調(diào)節(jié)插入基因序列的表達(dá)，或者所需的特定方式修飾或加工基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞株。蛋白質(zhì)的這些修飾(如糖基化)和加工(如切割)對(duì)于蛋白質(zhì)的功能是重要的。不同的宿主細(xì)胞對(duì)于蛋白質(zhì)和基因產(chǎn)物的翻譯后加工和修飾具有特征性和特異性機(jī)制?？梢赃x擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)，以保證所表達(dá)外源蛋白質(zhì)的正確修飾和加工。為了這一目的，可以使用真核宿主細(xì)胞，這些細(xì)胞具有正確加工初始轉(zhuǎn)錄物、基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制。這些哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括，但不局限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3、WI38，尤其是脈絡(luò)膜叢細(xì)胞系。
為了重組蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期、高產(chǎn)量生成，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。例如，可以構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Ob、ObR或AR序列的細(xì)胞系。不使用包含病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體，可以將位于適當(dāng)表達(dá)控制元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸化位點(diǎn)等)控制之下的DNA和選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。將外源DNA導(dǎo)入后，構(gòu)建的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1～2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中。重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)記賦予選擇抗性，使細(xì)胞染色體中穩(wěn)定整合有質(zhì)粒，生長(zhǎng)形成細(xì)胞灶，將之克隆并放大培養(yǎng)成細(xì)胞系。該方法可有利地用于構(gòu)建表達(dá)Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物的細(xì)胞系。構(gòu)建的這種細(xì)胞系在篩選和評(píng)價(jià)能夠影響Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物內(nèi)源活性的化合物中尤其有用。
可以使用多種選擇系統(tǒng)，包括但不局限于在tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞中分別使用的皰疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.，1977，Cell 11223)、次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy et al.，1980，Cell 22817)基因?？勾x抗性也可以作為選擇下列基因的依據(jù)dhfr，賦予氨甲喋呤抗性(Wigler et al.，1980，Natl.Acad.Sci.USA773567；O’Hare et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；gpt，賦予霉酚酸抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA782072)；neo，賦予氨基糖苷G418抗性(Colberre-Garapin et al.，1981，J.Mol.Biol.1501)和hygro，賦予潮霉素抗性(Santerre et al.，1984，Gene 30147)。
還可以在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中表達(dá)Ob、ObR和AR基因產(chǎn)物。可以使用任意物種的動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這些物種包括但不局限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、豬、micro-pigs、山羊和非人類(lèi)的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，如狒狒、猴和猩猩。
可以使用本領(lǐng)域已知的任意技術(shù)將Ob、ObR或AR轉(zhuǎn)基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)，或者“敲除”或滅活內(nèi)源Ob、ObR或AR，產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的建立者系。這種動(dòng)物可用作本發(fā)明篩選方法的一部分，獲得來(lái)源于這種動(dòng)物的細(xì)胞和/或組織來(lái)產(chǎn)生另外的組合物(如細(xì)胞系、組織培養(yǎng)系統(tǒng))，這種組合物也可用作本發(fā)明篩選方法的一部分。
產(chǎn)生這種動(dòng)物的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，包括但不局限于原核注射(Hoppe & Wagner，1989，U.S.Pat.No.4,873,191)；逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的向胚系的基因轉(zhuǎn)移(Van der Putten et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 826148-6152)；胚胎干細(xì)胞中的基因打靶(Thompson et al.，1989，Cell 56313-321)；胚胎的電穿孔(Lo，1983，Mol Cell Biol.31803-1814)；精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(Lavitrano et al.，1989，Cell 57717-723)等。這些技術(shù)的評(píng)論參見(jiàn)Gordon，1989，Transgenic Animals，Intl.Rev.Cycol.115171-229，其整體在此引入作為參考。
至于包含轉(zhuǎn)基因Ob、ObR和/或AR的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，這些動(dòng)物可以在其所有的細(xì)胞中攜帶Ob、ObR或AR轉(zhuǎn)基因?？商鎿Q的是，這些動(dòng)物可以在某些，而非全部細(xì)胞中攜帶轉(zhuǎn)基因，如嵌合動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因以單一轉(zhuǎn)基因或串聯(lián)體，如頭-頭串聯(lián)或頭-尾串聯(lián)的形式整合。還可以通過(guò)下列，例如Lasko et al.，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA896232-6236的方法，選擇性地將轉(zhuǎn)基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞類(lèi)型中，并得以活化。這種細(xì)胞類(lèi)型特異性活化所需的調(diào)控序列以來(lái)于目的特定細(xì)胞類(lèi)型，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。當(dāng)需要將轉(zhuǎn)基因整合到內(nèi)源基因的染色體位點(diǎn)時(shí)，優(yōu)選基因打靶。簡(jiǎn)要地說(shuō)，當(dāng)使用該技術(shù)時(shí)，需要設(shè)計(jì)包含和內(nèi)源Ob、ObR或AR基因同源的一些核苷酸序列的載體，以通過(guò)和染色體序列的同源重組進(jìn)行整合，分別破壞內(nèi)源Ob、ObR或AR基因核苷酸序列的功能。還可以通過(guò)下列，例如Gu et al.，1994，Science 265103-106的方法，將轉(zhuǎn)基因選擇性地導(dǎo)入特定的細(xì)胞類(lèi)型中，僅在該細(xì)胞類(lèi)型中滅活Ob、ObR或AR基因。這種細(xì)胞類(lèi)型特異性滅活所需的調(diào)控序列以來(lái)于目的特定細(xì)胞類(lèi)型，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。
一旦產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，就可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)重組基因的表達(dá)進(jìn)行分析。通過(guò)Southern印跡分析或PCR技術(shù)進(jìn)行初篩，分析動(dòng)物組織是否發(fā)生了轉(zhuǎn)基因的整合。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物組織中轉(zhuǎn)基因的mRNA表達(dá)水平可以利用以下技術(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，這些技術(shù)包括但不局限于來(lái)自動(dòng)物的組織樣品的Northern印跡分析、原位雜交分析和RT-PCR。還可以使用對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物特異的抗體，對(duì)表達(dá)Ob、ObR或AR基因的組織樣品進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)分析。
5.1.1.Ob、ObR或AR蛋白質(zhì)的抗體特異性識(shí)別并結(jié)合Ob、ObR或AR一個(gè)或多個(gè)表位、或保守Ob、ObR或AR變體或Ob、ObR或AR肽段的表位的抗體可以用作本發(fā)明方法的一部分。這種抗體包括，但不局限于多克隆抗體、單克隆抗體(mAbs)、人抗體、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段、F(ab’)2片段、Fab表達(dá)文庫(kù)產(chǎn)生的片段、抗獨(dú)特型(抗-Id)抗體和上述任意一項(xiàng)的表位結(jié)合片段。
舉例來(lái)說(shuō)，這種抗體可以用作本發(fā)明診斷或預(yù)測(cè)方法的一部分，通過(guò)測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)的瘦素水平，如哺乳動(dòng)物血清或腦脊液中的瘦素水平來(lái)診斷骨病。舉例來(lái)說(shuō)，這種抗體還可和下面所述的復(fù)雜篩選方案聯(lián)用，評(píng)價(jià)受試化合物對(duì)Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物表達(dá)和/或活性的影響。另外，這種抗體可以用在本發(fā)明的治療和預(yù)防方法中。例如，這種抗體可以作為瘦素或腎上腺素能受體激動(dòng)劑或拮抗劑。進(jìn)而，可以施用這種抗體來(lái)降低大腦中的瘦素水平，其中的瘦素水平通過(guò)對(duì)腦脊液的瘦素水平進(jìn)行分析測(cè)得。再則，這種抗體可以通過(guò)增加瘦素從循環(huán)中去除的速度(加速瘦素降解)來(lái)降低瘦素水平，或通過(guò)增加瘦素受體(和表達(dá)瘦素受體的細(xì)胞)解離或降解速度來(lái)降低瘦素受體水平，包括減少表達(dá)瘦素受體的細(xì)胞。
對(duì)于生成抗體來(lái)說(shuō)，通過(guò)注射Ob、ObR或AR；或ObR或AR肽(對(duì)于ObR來(lái)說(shuō)，為受體的功能性結(jié)構(gòu)域，如ECD、TM或CD)、截短的Ob、ObR或AR多肽(對(duì)于ObR或AR來(lái)說(shuō)，其中缺失了一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如TM或CD)、Ob、ObR或AR的功能等同物、或者Ob、ObR或AR的突變體。這種宿主動(dòng)物可以包括，但不局限于兔、小鼠和大鼠，to name but a few。可以使用增加免疫反應(yīng)性的各種佐劑，取決于宿主物種，包括但不局限于弗氏佐劑(完全和不完全)；礦物膠，如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂、普流尼克多元醇、多陰離子、肽、油狀乳劑、鑰孔嘁血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚；有潛力用于人的佐劑，如BCG(卡介苗)和小型棒狀桿菌。多克隆抗體是來(lái)源于免疫動(dòng)物血清的雜合分子群。
單克隆抗體是針對(duì)一種特定抗原的純合抗體群，使用通過(guò)培養(yǎng)連續(xù)細(xì)胞系產(chǎn)生抗體分子的任意技術(shù)獲得。這些技術(shù)包括但不局限于Kohler & Milstein，1975，Nature 256495-497和U.S.Pat.No.4,376,110中的雜交瘤技術(shù)；人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor et al.，1983，Immunology Today 472；Cole et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA802026-2030)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，1985，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。這種抗體可以是任意免疫球蛋白類(lèi)型，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任意亞類(lèi)。產(chǎn)生本發(fā)明中mAb的雜交瘤細(xì)胞可以在體外或體內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。體內(nèi)高滴度mAb的生成使該方法成為優(yōu)選的生成方法。
另外，可以使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)制備的包含人抗體部分和非人抗體部分的重組抗體，如嵌合及人源化的單克隆抗體，屬于本發(fā)明的范圍。嵌合抗體是其不同部分來(lái)源于不同動(dòng)物物種的分子，如具有來(lái)源于鼠mAb的可變區(qū)和人免疫球蛋白恒定區(qū)的分子(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.4,816,567和4,816,397,其整體在此引入作為參考)。人源化的抗體是來(lái)源于非人類(lèi)物種、具有來(lái)源于非人類(lèi)物種一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來(lái)源于人免疫球蛋白分子構(gòu)架區(qū)的抗體分子(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,585,089，其整體在此引入作為參考)。可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的重組DNA技術(shù)生成這種嵌合及人源化的單克隆抗體，例如使用PCT申請(qǐng)No.WO/87/02671；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)No.184,187；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)No.171,496；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)No.173,494；PCT專(zhuān)利申請(qǐng)No.WO86/01533；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.4,816,567；歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)No.125,023；Better et al.，1988，Science 2401041-1043；Liu et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 843439-3443；Liu et al.，1987，J.Immunol.1393521-3526；Sun et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84214-218；Nishimuraet al.，1987，Canc.Res.47999-1005；Wood et al.，1985，Nature314446-449；Shaw et al.，1988，J.Natl.Cancer Inst.801553-1559；Morrison，1985，Science 2291202-1207；Oi et al.，1986，Bio/Techniques4214；美國(guó)專(zhuān)利5,225,539；Jones et al.，1986，Nature 321552-525；Verhoeyan et al.，1988，Science 2391534和Beidler et al.，1988，J.Immunol.1414053-4060中的方法生成。
對(duì)于治療人類(lèi)患者來(lái)說(shuō)尤其需要完全的人抗體。舉例來(lái)說(shuō)，可以使用不能表達(dá)內(nèi)源性免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因、但能表達(dá)人重鏈和輕鏈基因的轉(zhuǎn)基因小鼠來(lái)生成這種抗體。使用選擇的抗原，如本發(fā)明多肽的全部或一部分，以正常的方式免疫轉(zhuǎn)基因小鼠。使用常規(guī)的雜交瘤技術(shù)獲得抗這種抗原的單克隆抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠攜帶的人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因在B細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)生重排，然后轉(zhuǎn)型和體細(xì)胞突變。因此，使用該技術(shù)，有可能產(chǎn)生有治療用途的IgG、IgA和IgE抗體。生成人抗體的這種技術(shù)的綜述參見(jiàn)Lonberg and Huszar，1995，Int.Rev.Immunol.1365-93。生成人抗體和人單克隆抗體的這種技術(shù)的詳細(xì)描述和生成這種抗體的方案參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016和5,545,806。另外，一些公司，如Abgenix公司(Fremont，CA)可以使用類(lèi)似上述的技術(shù)提供抗選擇的抗原的人抗體。
可以使用稱(chēng)作“指導(dǎo)篩選(guided selection)”的技術(shù)產(chǎn)生識(shí)別選擇表位的完全人抗體。在該方法中，選擇的非人類(lèi)單克隆抗體，如小鼠抗體用于指導(dǎo)識(shí)別同一表位的完全人抗體的選擇(Jespers et al.，1994，Bio/technology 12899-903)。
可替換方案是，可以將生成單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利No.4,946,778；Bird，1988，Science 242423-426；Huston et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883和Ward et al.，1989，Nature334544-546)加以變通，用于生成抗Ob和ObR基因產(chǎn)物的單鏈抗體。通過(guò)將Fv區(qū)的重鏈和輕鏈片段通過(guò)氨基酸橋相連接，產(chǎn)生單鏈多肽而形成單鏈抗體。
可以通過(guò)已知技術(shù)來(lái)產(chǎn)生識(shí)別特定表位的抗體片段。例如，這種片段包括但不局限于通過(guò)對(duì)抗體分子進(jìn)行胃蛋白酶消化產(chǎn)生的F(ab’)2片段和通過(guò)還原F(ab’)2片段的二硫橋產(chǎn)生的Fab片段?？商鎿Q的方案是，可以構(gòu)建Fab文庫(kù)(Huse et al.，1989，Science，2461275-1281)，從而快速、簡(jiǎn)便地堅(jiān)定具有所需特異性的單克隆Fab片段。
反之，使用本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，Ob、ObR或AR的抗體可以用于產(chǎn)生“模擬”O(jiān)b、ObR或AR的抗獨(dú)特型抗體(參見(jiàn)Greenspan&Bona，1993，F(xiàn)ASEB J 7(5)437-444和Nissinoff，1991，J.Immunol.1472427-2438)。例如，和ObR ECD相結(jié)合，并競(jìng)爭(zhēng)性地抑制Ob和ObR相結(jié)合的抗體可以用于產(chǎn)生“模擬”ECD的抗獨(dú)特型抗體，結(jié)合并中和Ob。這種中和性的抗獨(dú)特型抗體或這種抗獨(dú)特型抗體的Fab片段可用在治療中，中和Ob，從而治療和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)降低的骨病。
5.2診斷或預(yù)測(cè)骨病和化合物/患者監(jiān)測(cè)可以采用多種方法對(duì)骨病或狀態(tài)進(jìn)行診斷和預(yù)測(cè)，鑒定具有發(fā)生這種疾病或狀態(tài)傾向的受試者。這些疾病或狀態(tài)包括但不局限于骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)稀少、異常骨形成或吸收、佩吉特癥、骨折或斷骨、骨轉(zhuǎn)移、骨骼石化癥、骨硬化、骨軟骨病。
特別的是，可以根據(jù)本發(fā)明加以診斷或預(yù)測(cè)的骨病包括和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)降低的骨病，包括但不局限于骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)稀少和佩吉特癥。
本發(fā)明的一個(gè)目的是診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物骨病，該方法包括(a)測(cè)定可能具有骨病的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的交感神經(jīng)緊張性和瘦素活性；和(b)將步驟(a)中測(cè)得的值和相應(yīng)的對(duì)照值相比較。
因此，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，存在診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)骨病的方法，該方法包括(a)測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)血清中的瘦素水平；和(b)將步驟(a)中測(cè)得的值和對(duì)照血清中的瘦素水平相比較。
如果(a)中測(cè)得的水平高于對(duì)照水平，則預(yù)測(cè)或診斷哺乳動(dòng)物表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病的危險(xiǎn)性，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。
可替換的方案是，存在診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)骨病的方法，該方法包括(a)測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)腦脊液中的瘦素水平；和(b)將(a)中測(cè)得的水平和對(duì)照腦脊液中的瘦素水平相比較，如果(a)中測(cè)得的水平高于對(duì)照水平，則預(yù)測(cè)或診斷哺乳動(dòng)物表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病的危險(xiǎn)性，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。
另外，可以根據(jù)本發(fā)明加以診斷或預(yù)測(cè)的骨病包括和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病，包括但不局限于骨骼石化癥、骨硬化、骨軟骨病。
因此，根據(jù)本發(fā)明的這一方面，存在診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)骨病的方法，該方法包括(a)測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)血清中的瘦素水平；和
(b)將步驟(a)中測(cè)得的值和對(duì)照血清中的瘦素水平相比較。
如果(a)中測(cè)得的水平低于對(duì)照水平，則預(yù)測(cè)或診斷哺乳動(dòng)物表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病的危險(xiǎn)性，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。
可替換的方案是，存在診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)骨病的方法，該方法包括(a)測(cè)定哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的哺乳動(dòng)物體內(nèi)腦脊液中的瘦素水平；和(b)將(a)中測(cè)得的水平和對(duì)照腦脊液中的瘦素水平相比較，如果(a)中測(cè)得的水平低于對(duì)照水平，則預(yù)測(cè)或診斷哺乳動(dòng)物表現(xiàn)為骨病或具有發(fā)生骨病的危險(xiǎn)性，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。
另外，還提供了診斷性監(jiān)測(cè)處于骨病治療臨床評(píng)價(jià)中的患者、以及監(jiān)測(cè)化合物在臨床試驗(yàn)中效率的方法。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)方面中存在監(jiān)測(cè)化合物對(duì)哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)骨病治療效率的方法，該方法包括(a)向哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用化合物；(b)測(cè)定哺乳動(dòng)物血清中的瘦素水平；和(c)將(b)中測(cè)得的水平和施用化合物之前的哺乳動(dòng)物血清中的瘦素水平相比較，從而監(jiān)測(cè)化合物的效率，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。優(yōu)選的化合物是和施用前相比瘦素水平增加的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在監(jiān)測(cè)化合物對(duì)哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)骨病治療效率的方法，該方法包括(a)向哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用化合物；(b)測(cè)定哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平；和(c)將(b)中測(cè)得的水平和施用化合物之前的哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平相比較，從而監(jiān)測(cè)化合物的效率，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。優(yōu)選的化合物是和施用前相比瘦素水平增加的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在監(jiān)測(cè)化合物對(duì)哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)骨病治療效率的方法，該方法包括(a)向哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用化合物；(b)測(cè)定哺乳動(dòng)物血清中的瘦素水平；和(c)將(b)中測(cè)得的水平和施用化合物之前的哺乳動(dòng)物血清中的瘦素水平相比較，從而監(jiān)測(cè)化合物的效率，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。優(yōu)選的化合物是和施用前相比瘦素水平降低的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在監(jiān)測(cè)化合物對(duì)哺乳動(dòng)物，如人類(lèi)骨病治療效率的方法，該方法包括(a)向哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用化合物；(b)測(cè)定哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平；和(c)將(b)中測(cè)得的水平和施用化合物之前的哺乳動(dòng)物腦脊液中的瘦素水平相比較，從而監(jiān)測(cè)化合物的效率，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加的骨病。優(yōu)選的化合物是和施用前相比瘦素水平降低的化合物。
這些方法還可用于監(jiān)測(cè)處于骨病治療臨床評(píng)價(jià)中的患者。通常，這些方法進(jìn)一步包括檢測(cè)和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比的骨質(zhì)。
舉例來(lái)說(shuō)，這里所述的方法可以使用一些試劑，如上述的、本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的Ob和ObR核苷酸序列(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,972,621)和5.1.1節(jié)中所述的Ob和ObR抗體。Ob典型地在脂肪細(xì)胞中表達(dá)，在胃和淋巴細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有較低水平的Ob。ObR典型地在下丘腦部位的大腦中(Friedman & Hallaas，1998，Nature，395763-770)。舉例來(lái)說(shuō)，這些試劑可以用于(1)檢測(cè)Ob和ObR基因突變的存在，或檢測(cè)哺乳動(dòng)物血清或腦脊液中、和非骨病狀態(tài)相比Ob或ObR mRNA的超表達(dá)或低表達(dá)；(2)檢測(cè)哺乳動(dòng)物血清或腦脊液中、和非骨病狀態(tài)相比Ob或ObR基因產(chǎn)物的超表達(dá)或低表達(dá)；(3)檢測(cè)Ob或ObR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路中的紊亂或異常?？商鎿Q的方案是，檢測(cè)和相應(yīng)的對(duì)照樣品或哺乳動(dòng)物中觀測(cè)水平相比Stat3蛋白的磷酸化水平。Stat3磷酸化是瘦素和瘦素受體結(jié)合后發(fā)生的生化事件(Devos et al.，1997，J.Biol.Chem.27218304-18310)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，這里所述的方法還涉及檢測(cè)多巴胺β羥化酶(“DBH”)的活性，該酶是將多巴胺轉(zhuǎn)化為去甲腎上腺素所必需的。
這里所述的方法涉及測(cè)定哺乳動(dòng)物的交感神經(jīng)緊張性。交感神經(jīng)緊張性和交感神經(jīng)系統(tǒng)的活化或“張力”的相對(duì)狀態(tài)相關(guān)。交感神經(jīng)活性控制著多種功能，能夠以多種方式檢測(cè)，這些方式包括但不局限于直接測(cè)定神經(jīng)電頻率(參見(jiàn)Esler & Kay，2000，J.Cardiovasc.Pharmacol.35(7 Suppl 4)S1-7)、血漿兒茶酚胺水平(參見(jiàn)Urban et al.，1995，European Journal of Pharmacology，28229-37)、熱率變化(參見(jiàn)Boutouyrie et al.，1994，Am.J.Physiol.267(4 Pt 2)H1368-76)或腎交感神經(jīng)活性(參見(jiàn)Feng et al.，1992，Journal of Pharmacology andExperimental Therapeutics，2611129-1135)。這里所述的方法可以在測(cè)定骨質(zhì)技術(shù)之前或之后聯(lián)合使用。例如，鑒定到和相應(yīng)對(duì)照樣品相比瘦素水平(如血清或腦脊液中)升高或降低的哺乳動(dòng)物(如人)時(shí)，可以測(cè)定個(gè)體的骨質(zhì)，進(jìn)一步確認(rèn)哺乳動(dòng)物是否表現(xiàn)出和相應(yīng)非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加或降低。如果沒(méi)有觀察到異常骨質(zhì)，則認(rèn)為哺乳動(dòng)物具有發(fā)生疾病的危險(xiǎn)性；如果觀察到了異常骨質(zhì)，則說(shuō)明哺乳動(dòng)物患有骨病。
本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的用于測(cè)定骨質(zhì)的技術(shù)包括，但不局限于骨架X射線，示出骨的透明水平(透明水平越低，骨質(zhì)越高)；經(jīng)典的骨組織學(xué)分析(如骨體積、小梁/小梁形成的數(shù)目和方面、相對(duì)于對(duì)照和/或相對(duì)于破骨細(xì)胞的成骨細(xì)胞數(shù)目)和用于測(cè)定骨質(zhì)、通常用在測(cè)定骨質(zhì)疏松中的雙光子骨質(zhì)密度儀(DEXA)(Levis & Altman，1998，Arthritis and Rheumatism，41577-587)。
這里所述的方法還可進(jìn)一步用于診斷具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的個(gè)體。這些個(gè)體包括，但不局限于絕經(jīng)期周?chē)膵D女(這里所用的術(shù)語(yǔ)包括絕經(jīng)前約6個(gè)月至絕經(jīng)后約18個(gè)月的時(shí)間段)和正在接受皮質(zhì)激素治療，尤其是長(zhǎng)期皮質(zhì)激素治療的患者。
可以使用事先包裝好的診斷試劑盒實(shí)施這里所述的方法，其中試劑盒包含至少一種特異的Ob、ObR或AR核苷酸序列，或Ob、ObR或AR抗體試劑，便于在臨床上診斷具有骨病的患者。
對(duì)于檢測(cè)Ob、ObR或AR突變來(lái)說(shuō)，可以使用任意有核細(xì)胞作為基因組核酸的起始材料。對(duì)于檢測(cè)Ob、ObR或AR基因表達(dá)和基因產(chǎn)物來(lái)說(shuō)，可以使用表達(dá)Ob、ObR或AR基因的任意細(xì)胞類(lèi)型或組織，如對(duì)于ObR和AR來(lái)說(shuō)使用脈絡(luò)膜叢細(xì)胞。
基于核酸的檢測(cè)技術(shù)在下面的5.2.1節(jié)中作有介紹。下面的5.2.2節(jié)中介紹了肽檢測(cè)技術(shù)。
5.2.1.檢測(cè)Ob、ObR和AR基因和轉(zhuǎn)錄物可以使用多種技術(shù)來(lái)檢測(cè)Ob、ObR和AR基因中的突變。來(lái)源于任意有核細(xì)胞的核酸可以用作這種分析技術(shù)的起點(diǎn)，這些核酸可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)核酸制備方法進(jìn)行分離。
DNA可以用在生物樣品的雜交或擴(kuò)增分析中，檢測(cè)Ob、ObR或AR基因結(jié)構(gòu)的異常，包括點(diǎn)突變、插入、缺失和染色體重排。這些分析方法包括，但不局限于Southern分析、單鏈構(gòu)象多肽性分析(SSCP)和PCR分析。
舉例來(lái)說(shuō)，檢測(cè)Ob、ObR或AR基因特異性突變的這種診斷性方法涉及在有利于這些試劑特異性地分別和Ob、ObR或AR基因中的互補(bǔ)序列相退火的條件下，使核酸和一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的核酸試劑接觸并孵育，其中前面的核酸包括重組DNA分子、從樣品，如從患者樣品或其他適當(dāng)細(xì)胞來(lái)源獲得的克隆基因或其兼并變體，后面的標(biāo)記核酸試劑包括重組DNA分子、克隆的基因或其兼并變體。優(yōu)選的是，這些核酸試劑的長(zhǎng)度至少為15至30個(gè)核苷酸。孵育后，將所有的未退火核酸和核酸Ob/ObR/AR分子雜合體相分離。然后檢測(cè)雜交的核酸的存在，如果這種分子存在的話。使用這種檢測(cè)方案，可以將來(lái)源于目的細(xì)胞類(lèi)型或組織的核酸固定在固相支持物上，如膜或塑料表面，如微孔板或聚苯乙烯上的塑料表面。在這種情況下，孵育后，易于將未退火的標(biāo)記核酸試劑去除。使用本領(lǐng)域人員所熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成剩余的、退火的標(biāo)記核酸試劑的檢測(cè)。核酸試劑與之相退火的Ob、ObR或AR基因序列和正常Ob、ObR或AR基因序列的預(yù)期退火模式相比較，確定是否存在Ob、ObR或AR基因突變。
用于檢測(cè)患者樣品或其他適當(dāng)細(xì)胞來(lái)源中Ob、ObR或AR基因特異核酸分子的可替換診斷方法涉及通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增(U.S.Pat.No.4,683,202中提出的實(shí)驗(yàn)方案)，然后利用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的技術(shù)檢測(cè)擴(kuò)增的分子?？梢詫a(chǎn)生的擴(kuò)增序列和預(yù)期擴(kuò)增的核酸序列相比較，看擴(kuò)增的核酸是否包含正常拷貝Ob、ObR或AR基因，以確定是否存在Ob、ObR或AR基因突變。
另外，可以使用人們所熟知的表型鑒定技術(shù)來(lái)鑒定具有Ob、ObR或AR基因突變的個(gè)體。舉例來(lái)說(shuō)，這些技術(shù)包括使用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)，該分析實(shí)際所用特定限制性酶的一個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的序列改變。
另外，已介紹了利用位于兩個(gè)限制性酶位點(diǎn)之間的、不同數(shù)目的短串聯(lián)重復(fù)DNA序列的存在來(lái)鑒定Ob、ObR或AR基因突變的、分析多態(tài)性的改進(jìn)方法。例如，其整體在此引入作為參考的U.S.Pat.No.5,075,217中介紹了基于(dC-dA)n-(dG-dT)n短串聯(lián)重復(fù)段中長(zhǎng)度多態(tài)性的DNA標(biāo)記物。(dC-dA)n-(dG-dT)n短串聯(lián)重復(fù)段的平均分割約30,000～60,000bp。相隔如此近的標(biāo)記物表現(xiàn)出高頻率的協(xié)同遺傳性，在鑒定基因突變，如Ob或ObR基因中的突變及診斷與Ob或ObR突變相關(guān)的疾病或紊亂中尤其有用。
其整體在此引入作為參考的U.S.Pat.No.5,364,759中也介紹了用于檢測(cè)短的三核苷酸和四核苷酸的重復(fù)序列的DNA圖譜分析。該過(guò)程包括提取目的DNA，如Ob、ObR或AR基因，擴(kuò)增提取的DNA，標(biāo)記重復(fù)序列，以形成單一DNA的基因組圖譜。
還可以通過(guò)分別檢測(cè)和測(cè)定Ob、ObR或AR轉(zhuǎn)錄物來(lái)分析Ob、ObR或AR基因的表達(dá)水平。例如，從已知或懷疑表達(dá)Ob、ObR或AR基因的細(xì)胞類(lèi)型或組織——如大腦，具體對(duì)于Ob和ObR來(lái)說(shuō)是脈絡(luò)膜叢細(xì)胞——中分離RNA，并使用如上所述的雜交技術(shù)或PCR技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。分離的細(xì)胞可以來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物或來(lái)源于患者。在評(píng)估細(xì)胞用作以細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療技術(shù)一部分，或可替換的是，檢驗(yàn)化合物對(duì)Ob、ObR或AR基因表達(dá)的影響的過(guò)程中，對(duì)來(lái)自培養(yǎng)物的細(xì)胞進(jìn)行分析是必要步驟。這種分析可以對(duì)Ob、ObR或AR基因表達(dá)模式進(jìn)行定量和定性，其中基因表達(dá)模式包括Ob、ObR或AR基因表達(dá)的活化或失活。
在這種檢測(cè)策略的一個(gè)實(shí)施方案中，從目的RNA合成cDNA(如通過(guò)將RNA分子逆轉(zhuǎn)錄成cDNA)。然后，使用cDNA中的序列作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)，如PCR擴(kuò)增反應(yīng)等的模板。用作該方法中逆轉(zhuǎn)錄合成起始試劑(如引物)和核酸擴(kuò)增步驟的核酸試劑選自本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的Ob、ObR或AR核酸試劑。這種核酸試劑的優(yōu)選長(zhǎng)度至少為9～30個(gè)核苷酸。為了便于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，可以使用具有放射活性或非放射活性標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增。可替換的方案是，獲得足夠的擴(kuò)增產(chǎn)物，使產(chǎn)物能夠通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的溴化乙錠染色或其他適當(dāng)?shù)暮怂崛旧椒ǖ靡杂^察。
另外，有可能進(jìn)行“原位”O(jiān)b、ObR或AR基因表達(dá)分析，即直接在來(lái)源于活檢或切除的組織切片(固定的和/或冷凍的)或患者組織進(jìn)行分析，而不必對(duì)核酸進(jìn)行純化。可以使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的核酸試劑作為探針和/或引物進(jìn)行這種原位分析(參見(jiàn)Nuovo，1992，“PCR原位雜交方案和應(yīng)用”，Raven Press，NY)。
可替換的方案是，如果可以獲得足夠量的適當(dāng)細(xì)胞，可以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的Northern分析，測(cè)定Ob、ObR或AR基因的mRNA表達(dá)水平。
5.2.2.檢測(cè)Ob、ObR和AR基因產(chǎn)物如這里所述，還可以使用上面5.1.1節(jié)中所述的、直接針對(duì)野生型或突變型Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物或保守變體或其肽段的抗體來(lái)診斷或預(yù)測(cè)骨病。這種診斷方法可以用于檢測(cè)Ob、ObR或AR基因表達(dá)的異常，或者Ob、ObR或AR結(jié)構(gòu)和/或時(shí)間、組織、細(xì)胞或亞細(xì)胞定位的異常，可以在體內(nèi)或體內(nèi)進(jìn)行，如在活檢組織上進(jìn)行。
舉例來(lái)說(shuō)，可以在體內(nèi)使用直接針對(duì)AR ECD、ObR ECD或Ob的抗體來(lái)檢測(cè)體內(nèi)Ob、ObR或AR的表達(dá)模式和表達(dá)水平?？梢允褂貌煌干渚€的化合物或其他適當(dāng)化合物對(duì)這種抗體加以標(biāo)記，并注射到受試者中，使用X射線、CAT掃描或MRI之類(lèi)的方法來(lái)觀察和表達(dá)的Ob、ObR或AR的結(jié)合。優(yōu)選將標(biāo)記的抗體片段，如包含最小抗原結(jié)合區(qū)部分的Fab或單鏈抗體用于該目的，促進(jìn)穿透血腦屏障，并標(biāo)記腦中表達(dá)的ObR。
另外，可以得以檢測(cè)的任意Ob、ObR或AR融合蛋白或Ob、ObR或AR偶聯(lián)蛋白都可以施用。例如可以如上面對(duì)于標(biāo)記抗體所述的，在體內(nèi)施用不透射線的化合物或其他適當(dāng)化合物標(biāo)記的Ob、ObR或AR融合蛋白或偶聯(lián)蛋白，并進(jìn)行觀察。另外這種融合蛋白還可用于體外診斷。
可替換的方案是，上述的免疫分析或融合蛋白檢測(cè)分析可以用在體外活檢或自檢樣品上，評(píng)價(jià)Ob、ObR或AR的表達(dá)模式。這種分析不局限于使用限定Ob、ObR或AR特定表位的抗體。使用這些標(biāo)記抗體會(huì)產(chǎn)生Ob、ObR或AR的翻譯并向細(xì)胞表面的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)方面的有用信息，鑒定加工過(guò)程中的缺陷。
分析的組織或細(xì)胞類(lèi)型通常包括已知或懷疑能表達(dá)Ob、ObR或AR的組織或細(xì)胞類(lèi)型，例如對(duì)于ObR來(lái)說(shuō)是下丘腦和脈絡(luò)膜叢細(xì)胞；對(duì)于Ob來(lái)說(shuō)是脂肪組織。舉例來(lái)說(shuō)，這里采用的蛋白質(zhì)分離方法可以是Harlow & Lane，1988，“抗體實(shí)驗(yàn)指南”，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，N.Y.中介紹的方法，其整體在此引入作為參考。分離的細(xì)胞可以來(lái)源于細(xì)胞培養(yǎng)物或患者。在評(píng)估細(xì)胞用作以細(xì)胞為基礎(chǔ)的基因治療技術(shù)一部分，或可替換的是，檢驗(yàn)化合物對(duì)Ob、ObR或AR基因表達(dá)的影響的過(guò)程中，對(duì)來(lái)自培養(yǎng)物的細(xì)胞進(jìn)行分析是必要步驟。
舉例來(lái)說(shuō)，本發(fā)明中有用的、上面5.1.1節(jié)中所述的抗體或抗體片段可以用度定量或定性地檢測(cè)Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物或保守變體或其肽段的存在。例如，通過(guò)使用熒光標(biāo)記抗體(參見(jiàn)該節(jié)下文)的免疫熒光技術(shù)和光顯微鏡、流式細(xì)胞儀或熒光計(jì)檢測(cè)聯(lián)用來(lái)實(shí)現(xiàn)該目的。如果Ob或ObR基因產(chǎn)物表達(dá)在細(xì)胞表面上，則尤其優(yōu)選該技術(shù)。
本發(fā)明中有用的抗體或Ob、ObR或AR融合蛋白或偶聯(lián)蛋白還以組織學(xué)方式用在免疫熒光分析、免疫電鏡分析或非免疫分析，原位檢測(cè)Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物或保守變體或其肽段，或檢測(cè)Ob結(jié)合(標(biāo)記Ob融合蛋白的情況下)。
可以通過(guò)從患者體內(nèi)取出組織樣本，將其用到本發(fā)明的標(biāo)記抗體或融合蛋白上來(lái)實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè)。優(yōu)選將標(biāo)記抗體(或片段)覆蓋到生物樣品上來(lái)應(yīng)用抗體(或片段)或融合蛋白。通過(guò)使用該方法，不僅可能檢測(cè)到Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物，或保守變體或其肽段，或Ob結(jié)合或兒茶酚胺結(jié)合的存在，還有可能檢測(cè)到其在受檢驗(yàn)組織中的分布。使用本發(fā)明，普通的技術(shù)人員明白可以對(duì)許多組織學(xué)方法(如染色方法)加以改進(jìn)，以進(jìn)行這種原位檢測(cè)。
檢測(cè)Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物，或保守變體或其肽段的免疫分析和非免疫分析典型地包括在能夠鑒定Ob、ObR或AR產(chǎn)物，或保守變體或其肽段的可檢測(cè)標(biāo)記抗體存在的條件下孵育樣品，如生物液體(如血清或腦脊液)、組織提取物、新鮮收獲的細(xì)胞或在細(xì)胞培養(yǎng)中孵育的細(xì)胞裂解物；通過(guò)本領(lǐng)域人員所熟知的多種技術(shù)檢測(cè)結(jié)合態(tài)抗體。
使生物樣品和能夠固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇苄缘鞍踪|(zhì)的固相支持物或載體，如硝酸纖維素或其他固體支持物相接觸，并固定在上面。然后用適當(dāng)?shù)木彌_液洗支持物，用可檢測(cè)的標(biāo)記Ob、ObR或AR抗體或Ob、ObR或AR融合蛋白處理。使用緩沖液第二次洗固相支持物，去除非結(jié)合態(tài)的抗體或融合蛋白。通過(guò)常規(guī)手段檢測(cè)固相支持物上的結(jié)合態(tài)標(biāo)記量。
“固相支持物或載體”指能夠和抗原或抗體相結(jié)合的任意支持物。熟知的支持物或載體包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、天然和修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、輝長(zhǎng)巖和磁鐵礦。用于本發(fā)明目的的載體性質(zhì)可以是某種程度上可溶或不溶的。事實(shí)上，只要偶聯(lián)的分子能夠和抗原或抗體相結(jié)合，支持物可以具有任何可能的結(jié)構(gòu)構(gòu)型。因此，支持物構(gòu)型可以是球形的，如小珠；或圓柱形，位于試管的內(nèi)表面或柱的外表面。可替換的方案是，表面可以是平的，如薄片、測(cè)試帶等。優(yōu)選的支持物包括聚苯乙烯珠。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道可以使用許多其他結(jié)合抗體或抗原的適當(dāng)載體，能夠使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來(lái)確證這一點(diǎn)。
可以根據(jù)熟知的方法測(cè)定給定的許多Ob、ObR或AR抗體或Ob、ObR或AR融合蛋白的結(jié)合活性。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠采用常規(guī)的條件確定每次測(cè)定的有效的和最佳的分析條件。
對(duì)于抗體來(lái)說(shuō)，可檢測(cè)性標(biāo)記Ob、ObR或AR抗體的一種方式是將Ob、ObR或AR抗體和酶相連接，用于酶免分析(EIA)(Voller，“酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)”，1978，Diagnostic Horizons 21-7，Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md)；Voller et al.，1978，J.Clin.Pathol.31507-520；Butler，1981，Meth.Enzymol.73482-523；Maggio(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRCPress，Boca Raton，F(xiàn)la.，Ishikawa et al.，(eds)，1981，EnzymeImmunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo)。結(jié)合在抗體上的酶會(huì)和適當(dāng)?shù)牡孜?，?yōu)選顯色底物發(fā)生反應(yīng)，以這種方式產(chǎn)生能夠通過(guò)分光光度法、熒光測(cè)定法或可視手段得以檢測(cè)的化學(xué)基團(tuán)?？梢杂糜跈z測(cè)性標(biāo)記抗體的酶包括，但不局限于蘋(píng)果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-類(lèi)固醇異構(gòu)酶、酵母乙醇脫氫酶、α-甘油磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過(guò)氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。通過(guò)使用酶顯色底物的比色法進(jìn)行檢測(cè)。還可以通過(guò)對(duì)底物的酶反應(yīng)程度和類(lèi)似方法配制的標(biāo)準(zhǔn)品加以可視比較進(jìn)行檢測(cè)。
還可以使用任意的其他各種免疫分析進(jìn)行檢測(cè)。例如，通過(guò)放射性標(biāo)記抗體或抗體片段，有可能通過(guò)使用放免分析法(RIA)檢測(cè)Ob、ObR或AR(參見(jiàn)Weintraub，放免分析法原理，放射配體分析技術(shù)的第七次培訓(xùn)課程，The Endocrine Society，3月，1986，在此引入作為參考)。
還有可能使用熒光化合物來(lái)標(biāo)記抗體。當(dāng)熒光標(biāo)記的抗體暴露在適當(dāng)波長(zhǎng)的光下時(shí)，可以根據(jù)熒光檢測(cè)其存在。最常用的熒光標(biāo)記化合物有異硫氰酸熒光素、若丹明、藻紅蛋白、藻青蛋白、異藻青蛋白、對(duì)苯二醛和熒胺。
還可以使用發(fā)射熒光的金屬，如152Eu或其他鑭系列對(duì)抗體進(jìn)行可檢測(cè)性標(biāo)記。使用二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)之類(lèi)的金屬螯合劑使金屬吸附到抗體上。
還可以使抗體和化學(xué)發(fā)光化合物相偶聯(lián)將之進(jìn)行可檢測(cè)性標(biāo)記。通過(guò)檢測(cè)化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中發(fā)出的光來(lái)確定化學(xué)發(fā)光標(biāo)記抗體的存在。具體泳道的化學(xué)發(fā)光標(biāo)記化合物的例子有魯米諾、異魯米諾、theromatic acridinium酯、咪唑、acridinium鹽和草酸酯。
類(lèi)似的，使用生物發(fā)光化合物標(biāo)記本發(fā)明的抗體。生物發(fā)光是生物系統(tǒng)內(nèi)存在的一類(lèi)化學(xué)發(fā)光，其中催化性蛋白質(zhì)增加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的效率。通過(guò)檢測(cè)發(fā)光的存在而確定生物發(fā)光蛋白的存在。用于標(biāo)記的重要生物發(fā)光化合物有熒光素、熒光素酶和水母蛋白。
5.3用于治療、診斷和預(yù)防骨病的化合物的篩選分析本發(fā)明還提供了鑒定能夠影響骨病的篩選方法(如分析方法)。本發(fā)明進(jìn)一步包含瘦素和瘦素受體的激動(dòng)劑和拮抗劑、兒茶酚胺和腎上腺素能受體的激動(dòng)劑和拮抗劑，包括小分子、大分子和抗體，以及能夠用于抑制瘦素、瘦素受體和腎上腺素能受體基因表達(dá)的核苷酸序列(如反義序列和核酶分子)，增加瘦素、瘦素受體和腎上腺素能受體基因表達(dá)的基因或調(diào)控序列置換構(gòu)建體(如將瘦素、瘦素受體或腎上腺素收集基因置于強(qiáng)啟動(dòng)子系統(tǒng)控制之下的表達(dá)構(gòu)建體)。這些化合物可以用于治療骨病。
尤其介紹了能夠用來(lái)鑒定一些化合物的細(xì)胞和非細(xì)胞分析方法，這些化合物和瘦素、瘦素受體或腎上腺素能受體相互作用，如調(diào)節(jié)瘦素和瘦素受體或兒茶酚胺和腎上腺素能受體的活性和/或結(jié)合瘦素受體或腎上腺素能受體。基于細(xì)胞的分析方法可以用來(lái)鑒定能夠影響瘦素和瘦素受體和/或兒茶酚胺和腎上腺素能受體信號(hào)傳導(dǎo)活性的化合物或組合物，鑒定它們是與瘦素受體或兒茶酚胺受體相結(jié)合，還是作用在瘦素信號(hào)傳導(dǎo)通路或腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)因子上。本發(fā)明這種基于細(xì)胞的分析方法使用表達(dá)瘦素、瘦素受體或腎上腺素能受體的細(xì)胞、細(xì)胞系或人工改造的細(xì)胞或細(xì)胞系。可以進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞進(jìn)行改造，使之包括受體分子，該受體分子和活化的瘦素受體或腎上腺素能受體傳導(dǎo)的信號(hào)相連，有助于鑒定調(diào)節(jié)瘦素和瘦素受體信號(hào)傳導(dǎo)活性和/或腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)活性的化合物。
本發(fā)明還包含使用基于細(xì)胞的分析方法或細(xì)胞裂解物分析方法(如體外轉(zhuǎn)錄或翻譯分析)，篩選調(diào)節(jié)瘦素、瘦素受體和腎上腺素能受體基因表達(dá)的化合物或組合物。為了這一目的，將包含受體序列的構(gòu)建體用在人工改造的細(xì)胞或細(xì)胞裂解提取物中，篩選在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)受體基因產(chǎn)物表達(dá)的化合物，構(gòu)建體中的受體序列和瘦素或瘦素受體基因的調(diào)控元件相連接。舉例來(lái)說(shuō)，這種分析方法可以用于鑒定調(diào)節(jié)參與瘦素、瘦素受體和腎上腺素能受體基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)或活性，或者檢驗(yàn)三螺旋多聚核苷酸的活性?？商鎿Q的方案是，人工改造的細(xì)胞或翻譯提取物可用于篩選調(diào)節(jié)瘦素、瘦素受體和腎上腺素能受體從mRNA轉(zhuǎn)錄物翻譯、進(jìn)而影響瘦素受體和/或腎上腺素能受體表達(dá)的化合物(包括反義序列和核酶分子)。
下列分析方法可用于鑒定和Ob、ObR或AR(包括但不局限于ObR或AR的ECD或CD)相互作用(如與之結(jié)合)的化合物；和能夠與Ob、ObR或AR(包括但不局限于ObR或AR的TM和CD)相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用(如與之結(jié)合)的化合物；干擾Ob、ObR或AR和參與ObR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)或腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)的跨膜蛋白或細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用的化合物；調(diào)節(jié)Ob、ObR或AR基因表達(dá)活性或調(diào)節(jié)Ob、ObR或AR水平的化合物。還可以使用能夠堅(jiān)定于Ob、ObR或AR基因調(diào)控序列(如啟動(dòng)子序列)相結(jié)合、調(diào)節(jié)Ob、ObR或AR基因表達(dá)的化合物的分析方法(參見(jiàn)Plant，1994，J.Biol.Chem.26928558-28562)。鑒定中，還可以進(jìn)一步驗(yàn)證化合物在體外或體內(nèi)調(diào)節(jié)瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的能力，還可以進(jìn)一步驗(yàn)證化合物調(diào)節(jié)骨質(zhì)(增加或降低骨質(zhì))并治療和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)降低或增加的骨病的能力。
因此，根據(jù)本發(fā)明的這一個(gè)方面，存在鑒定能夠調(diào)節(jié)(增加或降低)哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)將受試化合物和多肽相接觸；(b)測(cè)定受試化合物是否和多肽相結(jié)合，如果受試化合物與多肽相結(jié)合，則說(shuō)明鑒定到了能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)的化合物，其中多肽選自瘦素多肽、瘦素受體多肽和腎上腺素能受體多肽。
可替換的是，存在鑒定能夠調(diào)節(jié)(增加或降低)哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和多肽相接觸；(b)鑒定能夠和多肽相結(jié)合的受試化合物；和(c)將(b)中的受試化合物施用到非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)，測(cè)定其骨質(zhì)，和未處理的對(duì)照非人類(lèi)哺乳動(dòng)物體內(nèi)的相應(yīng)骨相比，評(píng)價(jià)受試化合物是否能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)。其中多肽選自瘦素多肽、瘦素受體多肽和腎上腺素能受體多肽，如果化合物調(diào)節(jié)了骨質(zhì)，則鑒定到了能夠調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物體內(nèi)骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面和其他方面，這里所用的對(duì)照非人類(lèi)哺乳動(dòng)物指沒(méi)有施用受試化合物的相應(yīng)哺乳動(dòng)物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠調(diào)節(jié)(增加或降低)哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和瘦素多肽及瘦素受體多肽接觸一段時(shí)間，使能夠形成瘦素/瘦素受體復(fù)合物；和(b)測(cè)定瘦素/瘦素受體復(fù)合物水平，如果測(cè)得的水平和不存在受試化合物時(shí)測(cè)得的水平不同，則說(shuō)明鑒定到了能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠調(diào)節(jié)(增加或降低)哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和兒茶酚胺及腎上腺素能受體多肽接觸一段時(shí)間，使能夠形成瘦素/瘦素受體復(fù)合物；和(b)測(cè)定兒茶酚胺/腎上腺素能受體復(fù)合物水平，如果測(cè)得的水平和不存在受試化合物時(shí)測(cè)得的水平不同，則說(shuō)明鑒定到了能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面和其他方面，可以通過(guò)分離復(fù)合物，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的多種分析方法，如Western印跡法測(cè)定復(fù)合物形成量，測(cè)定瘦素/瘦素受體和/或兒茶酚胺/腎上腺素能受體復(fù)合物形成。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠降低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和表達(dá)功能性瘦素受體的細(xì)胞相接觸，和(b)測(cè)定受試化合物是否活化瘦素受體，如果化合物活化了瘦素受體，則說(shuō)明鑒定到了能夠降低骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面和其他方面，功能性瘦素受體是配體和受體的活性位點(diǎn)結(jié)合后能夠傳導(dǎo)信號(hào)的瘦素受體。這里所用的瘦素受體活化是指瘦素受體活性(信號(hào)傳導(dǎo))增加。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠降低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和表達(dá)功能性腎上腺素能受體的細(xì)胞相接觸，和(b)測(cè)定受試化合物是否活化腎上腺素能受體，如果化合物活化了腎上腺素能受體，則說(shuō)明鑒定到了能夠降低骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的這一方面和其他方面，功能性腎上腺素能受體是配體和受體的活性位點(diǎn)結(jié)合后能夠傳導(dǎo)信號(hào)的腎上腺素能受體。這里所用的腎上腺素能受體活化是指腎上腺素能受體活性(信號(hào)傳導(dǎo))增加。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠減低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和表達(dá)功能性瘦素受體的細(xì)胞相接觸，測(cè)定受試化合物是否活化瘦素受體；(b)將(a)中活化瘦素受體的受試化合物施用到非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如果受試化合物降低了骨質(zhì)，則說(shuō)明鑒定到了能夠降低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠減低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使受試化合物和表達(dá)功能性腎上腺素能受體的細(xì)胞相接觸，測(cè)定受試化合物是否活化腎上腺素能受體；(b)將(a)中活化腎上腺素能受體的受試化合物施用到非人類(lèi)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)，如果受試化合物降低了骨質(zhì)，則說(shuō)明鑒定到了能夠降低哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使瘦素多肽及受試化合物和表達(dá)功能性瘦素受體的細(xì)胞相接觸；和(b)測(cè)定其中瘦素受體的活化水平，和不存在受試化合物情況下測(cè)定的瘦素受體活化水平相比，評(píng)價(jià)受試化合物是否減弱瘦素受體的活化；其中能夠減弱瘦素受體活化的受試化合物是能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使兒茶酚胺及受試化合物和表達(dá)功能性腎上腺素能受體的細(xì)胞相接觸；和(b)測(cè)定其中腎上腺素能受體的活化水平，和不存在受試化合物情況下測(cè)定的腎上腺素能受體活化水平相比，評(píng)價(jià)受試化合物是否減弱腎上腺素能受體的活化；其中能夠減弱腎上腺素能受體活化的受試化合物是能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使瘦素多肽及受試化合物和表達(dá)功能性瘦素受體的細(xì)胞相接觸，測(cè)定受試化合物能否減弱瘦素受體的活化；和(b)將(a)中減弱瘦素受體活化的受試化合物施用到非人類(lèi)的動(dòng)物體內(nèi)，測(cè)定其骨質(zhì)，和對(duì)照非人類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的相應(yīng)骨相比，評(píng)價(jià)受試化合物是否增加骨質(zhì)；如果受試化合物增加了骨質(zhì)，則說(shuō)明鑒定到了能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在鑒定能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物的方法，該方法包括(a)使兒茶酚胺及受試化合物和表達(dá)功能性腎上腺素能受體的細(xì)胞相接觸，測(cè)定受試化合物能否減弱腎上腺素能受體的活化；和(b)將(a)中減弱瘦素受體活化的受試化合物施用到非人類(lèi)的動(dòng)物體內(nèi)，測(cè)定其骨質(zhì)，和對(duì)照非人類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的相應(yīng)骨相比，評(píng)價(jià)受試化合物是否增加骨質(zhì)；如果受試化合物增加了骨質(zhì)，則說(shuō)明鑒定到了能夠增加哺乳動(dòng)物骨質(zhì)的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方法，存在通過(guò)測(cè)定磷酸化Stat3多肽水平來(lái)確定瘦素受體的活化的方法。Stat3多肽是靶細(xì)胞中瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的下游效應(yīng)因子(Tartaglia et al.，1995，Cell，83，1263-1271；Baumann etal.，1996，Proc Natl Acad Sci USA 93，8374-8378；Ghilardi et al.，1996，Proc Natl Acad Sci USA 93，6231-6235；Vaisse et al.，1996，Nat Genet1495-97；)，它在瘦素受體被瘦素活化后得以磷酸化。
可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行篩選的化合物包括但不局限于肽、抗體和其片段，和其他能夠結(jié)合Ob、ObR或AR并模擬天然配體引發(fā)的活性(激動(dòng)劑)或抑制天然配體引發(fā)的活性(拮抗劑)的有機(jī)化合物(肽模擬物)；以及肽、抗體或其片段，和其他能夠模擬ObR或AR(或其部分)的ECD，與之結(jié)合并“中和”天然配體的有機(jī)化合物?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明進(jìn)行篩選的其他化合物包括但不局限于和Ob相互作用并防止Ob透過(guò)血腦屏障、進(jìn)而防止Ob活化ObR的化合物。
這些化合物包括但不局限于肽，例如可溶性肽，包括但不局限于隨機(jī)肽庫(kù)成員(參見(jiàn)Lam，K.S.et al.，1991，Nature 35482-84；Houghten，R.et al.，1991，Nature 35484-86)和由D-和/或L-構(gòu)型氨基酸組成的組合化學(xué)分子庫(kù)成員，磷酸肽(包括但不局限于隨機(jī)或部分兼并的磷酸肽庫(kù)，參見(jiàn)Songyang et al.，1993，Cell 72767-778)、抗體(包括但不局限于多克隆抗體、單克隆抗體、人抗體、人源化抗體、抗獨(dú)特型抗體、嵌合抗體或單鏈抗體、和Fab、F(ab’)2和Fab表達(dá)庫(kù)片段和其表位結(jié)合片段)和小的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子。
可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行篩選的化合物包括但不局限于小的有機(jī)分子，這些小的有機(jī)分子能夠透過(guò)血腦屏障，進(jìn)入適當(dāng)?shù)募?xì)胞(如脈絡(luò)膜叢或下丘腦中)并影響Ob、ObR或AR基因或參與ObR信號(hào)傳導(dǎo)通路或腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)通路的其他基因的表達(dá)(如通過(guò)和調(diào)控區(qū)及參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子相互作用)；或者影響ObR或AR活性(如通過(guò)抑制或增強(qiáng)CD的酶活性)或其他一些參與ObR信號(hào)傳導(dǎo)通路的細(xì)胞內(nèi)因子，如gp130活性的化合物。
計(jì)算機(jī)模型和檢索技術(shù)能夠鑒定能夠調(diào)節(jié)Ob、ObR或AR表達(dá)或活性的化合物，或?qū)σ谚b定的化合物加以改進(jìn)。鑒定了這種化合物或組合物后，即可鑒定活性位點(diǎn)或活性區(qū)。這些活性位點(diǎn)可以典型的是配體結(jié)合位點(diǎn)，例如和ObR相互作用的Ob區(qū)域。使用本領(lǐng)域的已知方法，包括，例如根據(jù)肽的氨基酸序列、核酸的核苷酸序列、相關(guān)性化合物或組合物和其天然配體形成的復(fù)合物研究來(lái)鑒定活性位點(diǎn)。在后一情況下，可以使用化學(xué)或X射線晶體衍射法，尋找復(fù)合配體所在的部位，從而尋找活性位點(diǎn)。然后，確定活性位點(diǎn)的三維幾何結(jié)構(gòu)?？梢酝ㄟ^(guò)已知的方法，包括能夠確定完整分子結(jié)構(gòu)的X射線結(jié)晶衍射來(lái)確定三維幾何結(jié)構(gòu)。另一方面，可以使用固相和液相NMR確定某些分子內(nèi)距離。還可以使用確定結(jié)構(gòu)的其他任意實(shí)驗(yàn)方法獲得部分或完整的幾何結(jié)構(gòu)。可以使用能夠增加確定活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)準(zhǔn)確性的天然或人工復(fù)合配體來(lái)測(cè)定幾何結(jié)構(gòu)。
如果測(cè)得了不完整或不夠準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)，可以使用基于計(jì)算機(jī)的數(shù)字化模型方法使結(jié)構(gòu)完整，或改進(jìn)其準(zhǔn)確性?？梢允褂萌魏喂J(rèn)的模型方法，包括對(duì)特定的生物多聚物，如蛋白質(zhì)或核酸特異的參數(shù)化模型、以計(jì)算機(jī)分子運(yùn)動(dòng)為基礎(chǔ)的分子動(dòng)力學(xué)模型、以熱信號(hào)群為基礎(chǔ)的統(tǒng)計(jì)學(xué)機(jī)械模型或組合的模型。對(duì)于大多數(shù)模型來(lái)說(shuō)，表示組成的原子和基團(tuán)之間力的標(biāo)準(zhǔn)分子力場(chǎng)是必要的，可以選自物理化學(xué)中已知的力場(chǎng)。對(duì)于通過(guò)這些模型方法計(jì)算的完整和更準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)，不完整或欠準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)性結(jié)構(gòu)可以作為限制因素。
最后，通過(guò)實(shí)驗(yàn)性模型或者其組合確定了活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)之后，可以通過(guò)對(duì)包含化合物及其分子結(jié)構(gòu)信息的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，鑒定候選的調(diào)節(jié)性化合物。這種檢索尋找結(jié)構(gòu)和確定的活性中心結(jié)構(gòu)相匹配、和限定活性中心的基團(tuán)相互作用的化合物。這種檢索可以是人工操作的，但優(yōu)選是計(jì)算機(jī)輔助的。這種檢索發(fā)現(xiàn)的化合物是潛在的Ob、ObR或AR調(diào)節(jié)性化合物。
可替換的方案是，這些方法可以用于鑒定從已知調(diào)節(jié)性化合物或配體改進(jìn)的調(diào)節(jié)性化合物。可以對(duì)已知化合物的組成加以改動(dòng)，使用上述用于新組合物的實(shí)驗(yàn)性和計(jì)算機(jī)模型方法來(lái)測(cè)定改動(dòng)的結(jié)構(gòu)效應(yīng)。將改變的結(jié)構(gòu)和化合物的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)相比較，確定是否有改進(jìn)的配合性或相互作用。通過(guò)這種方式，可以快速地評(píng)價(jià)組合物中的系統(tǒng)改變，如側(cè)鏈基團(tuán)的改變，從而獲得特異性或活性提高了的改動(dòng)的調(diào)節(jié)性化合物或配體。
用于在鑒定Ob、ObR或AR活性位點(diǎn)、相關(guān)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子的基礎(chǔ)上鑒定調(diào)節(jié)性化合物的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)性和計(jì)算機(jī)模型方法對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是顯而易見(jiàn)的。
舉例來(lái)說(shuō)，分子模型系統(tǒng)有CHARMm和QUANTA程序(PolygenCorporation，Waltham，Mass)。CHARMm行使能量最小化和分子動(dòng)力學(xué)功能。QUANTA行使構(gòu)建、圖模型和分子結(jié)構(gòu)分析。QUANTA能夠進(jìn)行相互作用性構(gòu)建、修飾、可視化和分子間行為分析。
許多文章都對(duì)和特定蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用之藥物的計(jì)算機(jī)模型進(jìn)行了評(píng)論。如Rotivinen et al.，1988，Acta Pharmaceutical Fennica97159-166；Pipka，New Scientist 54-57(Jun.16，1988)；Mckinaly andRossmann，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29111-122；Perry &Davies，OSAR藥物設(shè)計(jì)中的定量構(gòu)效關(guān)系pp189-193(Alan R.Liss，Inc.1989)；Lewis & Dean，1989，Proc.R.Soc.Lond.236125-140和141-162；至于核酸組分的模型受體，Askew，et al.，1989，J.Am.Chem.Soc.1111082-1090。其他篩選和圖解化合物的程序可以從公司獲得，如BioDesign公司(Pasadena，加里福尼亞)、Allelix公司(Mississuga，Ontario，加拿大)和Hypercube公司(Cambridge，Ontario)。雖然這些程序最初設(shè)計(jì)用于對(duì)特定蛋白質(zhì)特異的藥物，一旦鑒定到了DNA或RNA區(qū)，可以將這些程序加以變通，用于對(duì)DNA或RNA區(qū)特異的藥物。
雖然上述是用來(lái)設(shè)計(jì)并產(chǎn)生能夠改變結(jié)合的化合物，人們還可以篩選已知化合物的文庫(kù)，獲得作為抑制劑或活化劑的化合物。這些已知化合物包括天然產(chǎn)物或合成化合物和生物活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)。
舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)這里所述的分析方法鑒定到的化合物可以用于詳盡闡述Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物的生物功能，改善骨病。下面5.3.4節(jié)中討論了對(duì)通過(guò)5.3.1至5.3.3節(jié)中所述技術(shù)鑒定的化合物有效性進(jìn)行分析的方法。
5.3.1.結(jié)合Ob、ObR或AR的化合物的體外篩選方法可以設(shè)計(jì)體外系統(tǒng)來(lái)鑒定能夠和Ob、ObR或AR(包括但不局限于ObR和AR的ECD或CD)相互作用(與之結(jié)合)的化合物。舉例來(lái)說(shuō)，鑒定到的化合物可以用語(yǔ)調(diào)節(jié)野生型和/或突變型基因產(chǎn)物的活性；可以用語(yǔ)詳盡闡述Ob、ObR或AR的生物功能；可以用在篩選中來(lái)鑒定破壞正常Ob、ObR和AR相互作用的化合物；或其自身破壞這種相互作用。
用于鑒定結(jié)合Ob、ObR或AR的化合物的分析方法原理涉及在一定條件下配制Ob、ObR或AR和受試化合物的反應(yīng)混合物，反應(yīng)一段時(shí)間，使兩個(gè)組分能夠相互作用并結(jié)合，進(jìn)而形成能夠從反應(yīng)混合物中取出和/或在反應(yīng)混合物中得以檢測(cè)的復(fù)合物。Ob、ObR或AR種的使用根據(jù)篩選分析的目標(biāo)而定。例如，要尋找天然配體的激動(dòng)劑時(shí)，可以使用全長(zhǎng)ObR或可溶性截短的ObR，其分子中刪除了TM和/或CD；和ECD相對(duì)應(yīng)的肽或包含ObR ECD和蛋白質(zhì)或多肽相融合的融合蛋白。其中相融合的蛋白質(zhì)或多肽提供分析系統(tǒng)的優(yōu)越性(如產(chǎn)生的復(fù)合物的標(biāo)記、分離)。要鑒定和ObR胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相互作用的化合物的情況下，可以使用和ObR CD相對(duì)應(yīng)的肽以及包含ObR CD的融合蛋白。另外，要尋找能夠防止Ob透過(guò)血腦屏障的化合物的情況下，可以使用Ob或可溶形式的Ob。還可以采用利用全長(zhǎng)AR或可溶性截短AR的類(lèi)似方法。
可以通過(guò)多種方式進(jìn)行篩選分析。例如，進(jìn)行這種分析的一種方法涉及將Ob、ObR或AR蛋白、多肽、肽或融合蛋白或受試物質(zhì)錨定在固相上，在反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)錨定在固相上的Ob、ObR或AR/受試化合物。在這種方法的一個(gè)實(shí)施方案中，可以將Ob、ObR或AR反應(yīng)物錨定在固體表面上，直接或間接對(duì)沒(méi)有錨定的受試化合物加以標(biāo)記。
實(shí)際上，方便地使用微孔板作為固相。通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)吸附將錨定組分固定。通過(guò)簡(jiǎn)單地用蛋白質(zhì)溶液包被固體表面，并加以干燥來(lái)實(shí)現(xiàn)非共價(jià)西服?？商鎿Q的方案是，可以使用對(duì)要固定的蛋白質(zhì)特異的固定化抗體，優(yōu)選單克隆抗體將蛋白質(zhì)錨定在固體表面上?？梢蕴崆爸苽溥@種表面，并加以保存。
為了進(jìn)行分析，將非固定的組分加到包含錨定組分的包被表面上。反應(yīng)完成后，在一定條件下去除未反應(yīng)組分(如通過(guò)洗滌)，使形成的復(fù)合物仍固定在固體表面上。通過(guò)多種方式檢測(cè)錨定在固體表面上的復(fù)合物。之前的非固定化組分事先標(biāo)記的情況下，測(cè)定到固定在表面上的標(biāo)記，則說(shuō)明形成了復(fù)合物。之前的非固定化組分未事先標(biāo)記的情況下，使用間接標(biāo)記檢測(cè)錨定在表面上的復(fù)合物；如使用對(duì)之前的非固定化組分特異的標(biāo)記抗體(可以使用標(biāo)記的抗-Ig抗體對(duì)該抗體進(jìn)行直接或間接標(biāo)記)。
可替換的方案是，反應(yīng)在液相中進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物和未反應(yīng)的組分相分離，檢測(cè)復(fù)合物；如使用對(duì)Ob、ObR或AR蛋白、多肽、肽或融合蛋白或受試化合物特異的固定化抗體錨定溶液中形成的復(fù)合物，使用對(duì)可能性復(fù)合物的其他組分特異的標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)錨定的復(fù)合物。
可替換的方案是，可以使用基于細(xì)胞的分析方法來(lái)鑒定和Ob、ObR或AR相互作用的化合物。為了這一目的，可以使用表達(dá)Ob、ObR或AR的細(xì)胞系(如COS細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等)，或遺傳改造表達(dá)Ob、ObR或AR的細(xì)胞系(如通過(guò)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)Ob、ObR或AR DNA)。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)和天然Ob相比較或競(jìng)爭(zhēng)來(lái)檢測(cè)受試化合物和宿主細(xì)胞表達(dá)的ObR ECD的相互作用。
5.3.2.和Ob、ObR和AR相互作用的蛋白質(zhì)分析可以采用適于檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的任意方法來(lái)鑒定能夠和Ob、ObR或AR相互作用的跨膜蛋白或細(xì)胞內(nèi)蛋白?？梢圆捎玫膫鹘y(tǒng)方法是通過(guò)細(xì)胞裂解物，或來(lái)源于細(xì)胞裂解物的蛋白質(zhì)，和Ob、ObR或AR的梯度或?qū)游鲋M(jìn)行共免疫沉淀、交聯(lián)和共純化，鑒定裂解物中和Ob、ObR或AR相互作用的蛋白質(zhì)。對(duì)于這些分析來(lái)說(shuō)，所用的Ob、ObR或AR組分可以是全長(zhǎng)的、缺失膜錨定區(qū)的可溶性衍生物(如截短O(píng)bR或AR，其中刪除了TM，產(chǎn)生包含ECD和CD相融合的截短分子)、和CD相對(duì)應(yīng)的肽或包含Ob或ObR的CD或AR的融合蛋白。一旦分離，這種細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)就可以得以鑒定，并和標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)聯(lián)用來(lái)鑒定與之相互作用的蛋白質(zhì)。例如，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，如通過(guò)Edman降解技術(shù)(參見(jiàn)Creighton，1983，“蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理”，W.H.Freeman & Co.N.Y.，pp.34-49)可以確定和Ob、ObR或AR相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)中的至少一部分氨基酸序列。這樣獲得的氨基酸序列可以用來(lái)指導(dǎo)產(chǎn)色懷念感能夠用語(yǔ)篩選編碼這種細(xì)胞內(nèi)蛋白之基因序列的核苷酸混合物。舉例來(lái)說(shuō)，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的雜交或PCR技術(shù)來(lái)完成篩選。產(chǎn)生核苷酸混合物和篩選的技術(shù)是人們所熟知的(參見(jiàn)Ausubel，上文，和PCR方案方法指南和應(yīng)用，1990，Innis，M.et al.，eds.AcademicPress，Inc.，紐約)。
另外，還可以采用一些方法同時(shí)鑒定編碼和Ob、ObR或AR相互作用的跨膜蛋白或細(xì)胞內(nèi)的蛋白的基因。舉例來(lái)說(shuō)，這些方法包括使用標(biāo)記的Ob、ObR或AR蛋白，或Ob、ObR或AR多肽，肽或融合蛋白，如和標(biāo)記物(如酶、熒光蛋白、發(fā)光蛋白或染料)或Ig-Fc結(jié)構(gòu)域相融合的Ob、ObR或AR多肽或Ob、ObR或AR結(jié)構(gòu)域，和抗體探測(cè)λgt11文庫(kù)的熟知技術(shù)相類(lèi)似的方式探測(cè)表達(dá)文庫(kù)。
曾經(jīng)示例性、而非限制性地介紹了檢測(cè)體內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用的一種方法，即兩步雜交系統(tǒng)。已經(jīng)介紹了該系統(tǒng)的一個(gè)版本(Chien et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582)，它可以從Clontech購(gòu)得(Palo Alto，加里福尼亞)。
簡(jiǎn)要地說(shuō)，使用這種系統(tǒng)構(gòu)建編碼兩個(gè)雜合蛋白的質(zhì)粒一個(gè)質(zhì)粒由編碼和Ob、ObR或AR核苷酸序列相融合的轉(zhuǎn)錄活化因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的核苷酸組成，其中Ob、ObR或AR核苷酸序列編碼Ob、ObR或AR，Ob、ObR或AR多肽，肽或融合蛋白。另一個(gè)質(zhì)粒由編碼和未知蛋白cDNA相融合的轉(zhuǎn)錄活化因子的激活結(jié)構(gòu)域的核苷酸組成，其中未知蛋白cDNA重組到質(zhì)粒中形成cDNA文庫(kù)的一部分。將DNA結(jié)合蛋白融合質(zhì)粒和cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化到包含報(bào)道基因(如HBS或lacZ)的釀酒酵母株中，其中報(bào)道基因的調(diào)控區(qū)包含轉(zhuǎn)錄活化因子的結(jié)合位點(diǎn)。單獨(dú)的雜合蛋白并不能活化報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域雜合蛋白由于不能提供活化功能而不能活化報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄，激活結(jié)構(gòu)域雜合蛋白由于不能定位到活化因子結(jié)合位點(diǎn)而不能活化報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄。兩個(gè)雜合蛋白的相互作用重構(gòu)成功能性活化蛋白，引起報(bào)道基因的表達(dá)，通過(guò)對(duì)報(bào)道基因產(chǎn)物進(jìn)行分析加以檢測(cè)。
兩步雜交系統(tǒng)或相關(guān)方法可以用于篩選激活結(jié)構(gòu)域文庫(kù)，尋找和“餌(bait)”基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)。通過(guò)舉例，而非加以限制，Ob、ObR或AR可以用作餌基因化合物。總基因組和cDNA序列和編碼激活結(jié)構(gòu)域的DNA相融合。將該文庫(kù)和編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和餌Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物相融合的雜合蛋白的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到酵母報(bào)道株中，對(duì)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，尋找表達(dá)報(bào)道基因的轉(zhuǎn)化子。通過(guò)舉例，而非加以限制，餌Ob、ObR或AR基因序列，如Ob、ObR或AR的開(kāi)放閱讀框(或ObR或AR的結(jié)構(gòu)域)可以克隆到載體上，使之在翻譯水平上和編碼GAL4蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的DNA相融合。純化這些菌落，分離負(fù)責(zé)報(bào)道基因表達(dá)的文庫(kù)質(zhì)粒。進(jìn)行DNA測(cè)序，鑒定文庫(kù)質(zhì)粒所編碼的蛋白質(zhì)。
使用本領(lǐng)域中的常規(guī)方法制備細(xì)胞系cDNA文庫(kù)，從中檢測(cè)和餌Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物相互作用的蛋白質(zhì)。根據(jù)這里所述的具體系統(tǒng)，例如，cDNA片段可以插入到載體中，使之在翻譯水平上和GAL4的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域相融合。該文庫(kù)可以和餌Ob、ObR或AR基因-GAL4融合質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到包含lacZ基因的酵母株中，其中l(wèi)acZ基因受包含GAL4激活序列的啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)。和GAL4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域相融合的cDNA編碼的蛋白質(zhì)，和餌Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物相互作用，重構(gòu)成活化的GAL4蛋白，從而驅(qū)動(dòng)HIS3基因的表達(dá)。檢測(cè)在包含缺少組氨酸之半固體瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中能夠生長(zhǎng)的、表達(dá)HIS3的菌落。從這些菌株中純化cDNA，使用本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)生成和分離和餌Ob、ObR或AR相互作用的蛋白質(zhì)。
5.3.3.干擾和Ob和ObR或兒茶酚胺和AR大分子相互作用的化合物分析為了便于討論，和Ob或ObR或兒茶酚胺和AR相互作用的大分子稱(chēng)為“結(jié)合配偶物”。在骨病的調(diào)節(jié)中，這些結(jié)合配偶物可能參與ObR信號(hào)傳導(dǎo)通路或腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而參與Ob或ObR或兒茶酚胺或AR的作用。因此，需要鑒定干擾或破壞這種結(jié)合配偶物和Ob或兒茶酚胺相互作用、分別用于調(diào)節(jié)ObR或AR活性、控制和ObR或腎上腺素活性相關(guān)的骨病的化合物。
用于鑒定干擾Ob或ObR、兒茶酚胺和AR和其結(jié)合配偶物或配偶物之間相互作用的化合物的分析系統(tǒng)的基本原理是制備包含上述Ob、ObR、兒茶酚胺或AR蛋白、多肽、肽或融合蛋白和結(jié)合配偶物的反應(yīng)混合物，在一定條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使二者相互作用并結(jié)合，從而形成復(fù)合物。為了驗(yàn)證化合物的抑制活性，在存在或不存在受試化合物的條件下制備反應(yīng)混合物?？梢宰畛鯇⑹茉嚮衔锛拥椒磻?yīng)混合物中，或加入Ob或ObR基團(tuán)、兒茶酚胺或AR基團(tuán)和其相應(yīng)的結(jié)合配偶物之后加入受試化合物。在沒(méi)有受試化合物或加有安慰劑的條件下孵育對(duì)照反應(yīng)混合物。然后檢測(cè)Ob或ObR基團(tuán)、兒茶酚胺或AR基團(tuán)和其相應(yīng)的結(jié)合配偶物之間任意復(fù)合物的形成。在對(duì)照反應(yīng)中形成、而未在包含受試化合物的反應(yīng)混合物中形成復(fù)合物，說(shuō)明化合物干擾了Ob或ObR、兒茶酚胺或AR和反應(yīng)相互作用性結(jié)合配偶物之間的相互作用。另外，還可以將在包含受試化合物和正常Ob或ObR蛋白(或正常兒茶酚胺或AR蛋白)的反應(yīng)混合物中的復(fù)合物形成和在包含受試化合物和突變Ob或ObR蛋白(或兒茶酚胺或AR蛋白)的反應(yīng)混合物中的復(fù)合物形成相比較。需要鑒定破壞突變Ob或ObR蛋白(或兒茶酚胺或AR蛋白)相互作用、而不破壞正常Ob或ObR蛋白(或兒茶酚胺或AR蛋白)的化合物的情況下，這種比較是重要的。
可以以雜合或純合方式對(duì)干擾Ob或ObR蛋白、或兒茶酚胺或AR和結(jié)合配偶物之間相互作用的化合物進(jìn)行分析。雜合分析涉及將Ob或ObR基團(tuán)、兒茶酚胺或AR基團(tuán)、產(chǎn)物或結(jié)合配偶物錨定在固相上，反應(yīng)結(jié)束時(shí)檢測(cè)錨定在固相上的復(fù)合物。在純合分析中，在液相中進(jìn)行整個(gè)反應(yīng)。在兩種方法中，加入反應(yīng)物的順序可以改變，以獲得有關(guān)受試化合物的不同信息。例如，在存在受試化合物的條件下進(jìn)行反應(yīng)鑒定競(jìng)爭(zhēng)性干擾相互作用的受試化合物；即在加入Ob或ObR基團(tuán)、兒茶酚胺或AR基團(tuán)和反應(yīng)性結(jié)合配偶物之前或同時(shí)往反應(yīng)混合物中加入受試化合物。可替換的方案是，通過(guò)形成復(fù)合物之后往反應(yīng)混合物中加入受試化合物，驗(yàn)證干擾事先形成的復(fù)合物的化合物，如具有較高結(jié)合常數(shù)置換復(fù)合物中一個(gè)組分的化合物。下文中簡(jiǎn)要地介紹了各種格式。
在雜合分析系統(tǒng)中，將Ob或ObR基團(tuán)、兒茶酚胺或AR基團(tuán)、產(chǎn)物或結(jié)合配偶物錨定在固相上，對(duì)非錨定的物種加以直接或間接標(biāo)記。實(shí)際上，可以方便地使用微孔板。通過(guò)非共價(jià)或共價(jià)吸附將錨定物種加以固定?？梢允褂肙b、ObR或AR基因產(chǎn)物或結(jié)合配偶物的溶液包被固體表面，并加以干燥來(lái)實(shí)現(xiàn)非共價(jià)吸附?？商鎿Q的方案是，可以使用對(duì)待錨定物種特異的固定化抗體將物種錨定在固定表面上?？梢蕴崆爸苽溥@種表面，并加以保存。
為了進(jìn)行分析，在存在或不存在受試化合物的條件下，使固定化物種的配偶物和包被表面相接觸。反應(yīng)結(jié)束后，去除未反應(yīng)的組分(如通過(guò)洗滌)，所形成的復(fù)合物仍將固定在固體表面上。通過(guò)多種方式檢測(cè)錨定在固體表面上的復(fù)合物。之前的非固定化組分事先標(biāo)記的情況下，測(cè)定到固定在表面上的標(biāo)記，則說(shuō)明形成了復(fù)合物。之前的非固定化組分未事先標(biāo)記的情況下，使用間接標(biāo)記檢測(cè)錨定在表面上的復(fù)合物；如使用對(duì)之前的非固定化組分特異的標(biāo)記抗體(可以使用標(biāo)記的抗-Ig抗體對(duì)該抗體進(jìn)行直接或間接標(biāo)記)。根據(jù)加入反應(yīng)組分的順序，檢測(cè)抑制復(fù)合物形成或破壞事先形成之復(fù)合物的受試化合物。
可替換的方案是，在存在或不存在受試化合物的條件下，在液相中進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物和未反應(yīng)的組分相分離，檢測(cè)復(fù)合物；如使用對(duì)一種結(jié)合組分特異的固定化抗體錨定溶液中形成的復(fù)合物，使用對(duì)其他配偶物特異的標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)錨定的復(fù)合物。根據(jù)往液相中加入反應(yīng)組分的順序，檢測(cè)抑制復(fù)合物形成或破壞事先形成之復(fù)合物的受試化合物。
在本發(fā)明的可替換實(shí)施方案中，使用純合分析方法。在該方法中，制備Ob或ObR基團(tuán)、兒茶酚胺或AR基團(tuán)和相互作用的結(jié)合配偶物事先形成的復(fù)合物，其中Ob或ObR或其結(jié)合配偶物作有標(biāo)記，但復(fù)合物的形成猝滅該標(biāo)記所產(chǎn)生的信號(hào)(參見(jiàn)使用該方法進(jìn)行免疫分析的U.S.Pat.No.4,109,496)。和事先形成的復(fù)合物中一個(gè)物種競(jìng)爭(zhēng)并置換該物種的受試物質(zhì)的加入在上述背景的基礎(chǔ)上產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)。通過(guò)這種方式，可以鑒定到破壞Ob或ObR/細(xì)胞內(nèi)結(jié)合配偶物相互作用和/或兒茶酚胺或AR/細(xì)胞內(nèi)結(jié)合配偶物相互作用的受試物質(zhì)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，制備Ob、ObR或AR融合體用于固定化。例如，可以使用融合載體Pgex-5X-1使Ob、ObR或AR或肽段，如對(duì)應(yīng)于ObR CD的肽段和谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)基因相融合，并使產(chǎn)生的融合蛋白中保留有其活性。使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法來(lái)純化相互作用的結(jié)合配偶物，并用于產(chǎn)生單克隆抗體。使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法，用放射性同位素125I對(duì)該抗體進(jìn)行標(biāo)記。在雜合分析中，GST-ObR融合蛋白(或GST-AR融合蛋白)可以錨定在谷胱苷肽-瓊脂糖凝膠珠上。在存在或不存在受試化合物的條件下加入相互作用的結(jié)合配偶物，使發(fā)生相互作用并結(jié)合。在反應(yīng)期結(jié)束時(shí)，洗掉未結(jié)合的物質(zhì)，往系統(tǒng)中加入標(biāo)記的單克隆抗體，使之和復(fù)合組分相結(jié)合。通過(guò)測(cè)定和谷胱苷肽-瓊脂糖珠相結(jié)合的放射性，檢測(cè)Ob或ObR基因產(chǎn)物(或兒茶酚胺或AR基因產(chǎn)物)和反應(yīng)性結(jié)合配偶物之間的相互作用。受試化合物對(duì)相互作用的成功抑制會(huì)降低測(cè)得的放射性。
可替換的方案是，可以在不存在固體谷胱苷肽-瓊脂糖珠的溶液中，將GST-Ob/ObR融合蛋白和相互作用的結(jié)合配偶物混合在一起?？梢栽谑刮锓N相互作用的過(guò)程中或之后加入受試化合物。然后將該混合物加到谷胱苷肽-瓊脂糖珠上，并洗去未結(jié)合的物質(zhì)。進(jìn)而加入標(biāo)記的抗體，測(cè)定和谷胱苷肽-瓊脂糖珠相結(jié)合的放射性，從而檢測(cè)對(duì)Ob或ObR/結(jié)合配偶物相互作用的抑制程度。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，采用同樣的技術(shù)，使用相對(duì)應(yīng)于Ob、ObR或AR結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或相互作用或結(jié)合配偶物的肽段(結(jié)合配偶物是蛋白質(zhì)的情況下)代替一個(gè)或兩個(gè)全長(zhǎng)蛋白。使用本領(lǐng)域中的多種常規(guī)方法來(lái)鑒定和分離結(jié)合位點(diǎn)。這些方法包括但不局限于誘變編碼一種蛋白質(zhì)的基因，在共免疫沉淀分析中篩選對(duì)結(jié)合的破壞。然后選擇編碼復(fù)合物中第二個(gè)物種之基因中的補(bǔ)償性突變。對(duì)分別編碼兩個(gè)蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行測(cè)序分析，表明對(duì)應(yīng)于蛋白質(zhì)區(qū)的突變參與了相互作用性結(jié)合?？商鎿Q的方案是，使用上述方法將一種蛋白質(zhì)錨定在固體表面上，使之和標(biāo)記的結(jié)合配偶物相互作用并與之結(jié)合，其中結(jié)合配偶物預(yù)先用蛋白水解酶，如胰蛋白酶處理。洗滌后，包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的短的標(biāo)記肽仍和固體物質(zhì)相結(jié)合，可以加以分離，并通過(guò)氨基酸測(cè)序進(jìn)行鑒定。另外，一旦獲得了編碼細(xì)胞內(nèi)結(jié)合配偶物的基因，就可以構(gòu)建短的基因片段，使之表達(dá)蛋白質(zhì)肽段，進(jìn)而檢驗(yàn)其結(jié)合活性，純化或合成。
例如，但并非加以限制，制備GST-Ob、-ObR或-AR融合蛋白，使之和谷胱苷肽瓊脂糖珠相結(jié)合，如上所述將Ob、ObR或AR基因產(chǎn)物錨定在固體物質(zhì)上，使用放射性同位素，如35S對(duì)相互作用的結(jié)合配偶物加以標(biāo)記，使用蛋白水解酶，如胰蛋白酶進(jìn)行切割。切割產(chǎn)物加入到錨定的GST-Ob、-ObR或-AR融合蛋白中，使它們相結(jié)合。洗去未結(jié)合的肽后，通過(guò)已知方法對(duì)代表細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的標(biāo)記結(jié)合物質(zhì)加以洗脫，純化和氨基酸序列分析。這樣鑒定的肽可以合成，或使用重組DNA技術(shù)和適當(dāng)?shù)谋憷鞍紫嗳诤稀?br> 5.3.4.鑒定能夠改善骨病之化合物的分析檢驗(yàn)化合物治療骨病和改善骨病癥狀的能力，其中化合物包括但不局限于通過(guò)上面5.3.1至5.3.3中所述的分析技術(shù)鑒定到的化合物。上述的分析方法可以鑒定影響Ob、ObR或AR活性的化合物(如瘦素受體或腎上腺素能激動(dòng)劑或拮抗劑)；和結(jié)合ObR或AR天然配體并中和配體活性的化合物；影響Ob、ObR或AR基因活性的化合物(通過(guò)影響Ob、ObR或AR基因表達(dá)，包括影響剪接、從而調(diào)節(jié)全長(zhǎng)或截短形式Ob、ObR或AR表達(dá)的分子，如蛋白質(zhì)或小的有機(jī)分子)?？商鎿Q的是，所述的分析還可以鑒定調(diào)節(jié)Ob通過(guò)血腦屏障的化合物。影響有Ob或ObR基因和/或基因產(chǎn)物參與的Ob或ObR信號(hào)傳導(dǎo)通路中另一個(gè)步驟、并通過(guò)影響該途徑調(diào)節(jié)Ob或ObR對(duì)骨病發(fā)生的作用的化合物的鑒定和使用屬于本發(fā)明的范圍。類(lèi)似的，影響有AR基因和/或基因產(chǎn)物參與的腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)通路中另一個(gè)步驟、并通過(guò)影響該途徑調(diào)節(jié)兒茶酚胺對(duì)骨病發(fā)生的作用的化合物的鑒定和使用屬于本發(fā)明的范圍。這種化合物可以用作治療骨病的治療方法的一部分。
可以使用基于細(xì)胞的系統(tǒng)鑒定能夠改善骨病的化合物。舉例來(lái)說(shuō)，這種細(xì)胞系統(tǒng)包括重組或非重組細(xì)胞，如表達(dá)Ob、ObR或AR基因的細(xì)胞系，如NIH3T3L1細(xì)胞系。另外，舉例來(lái)說(shuō)，對(duì)于ObR可以使用脈絡(luò)膜叢細(xì)胞、下丘腦細(xì)胞、或來(lái)源于脈絡(luò)膜叢或下丘腦的細(xì)胞系。另外，基因改造使表達(dá)功能性O(shè)b或ObR并對(duì)天然Ob配體的活化產(chǎn)生應(yīng)答的表達(dá)宿主細(xì)胞(如COS細(xì)胞、CHO、成纖維細(xì)胞)可以用作分析終點(diǎn)，其中的應(yīng)答包括如測(cè)定到化學(xué)或表型改變、誘導(dǎo)另一個(gè)宿主細(xì)胞基因、離子流(如Ca++)改變、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化等。
使用這種細(xì)胞系統(tǒng)時(shí)，可以使細(xì)胞和足夠濃度的懷疑具有改善骨病的化合物接觸一段時(shí)間，使接觸的細(xì)胞中骨病得以改善。接觸后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，如通過(guò)分析細(xì)胞裂解物中的Ob、ObR或AR mRNA轉(zhuǎn)錄物(如通過(guò)Northern分析)或細(xì)胞中表達(dá)的Ob、ObR或AR蛋白來(lái)測(cè)定Ob或ObR基因表達(dá)的改變；調(diào)控或調(diào)節(jié)Ob、ObR或AR基因表達(dá)的化合物是治療的良好候選物?？商鎿Q的方案是，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢驗(yàn)，確定是否將一個(gè)或多個(gè)骨病樣細(xì)胞表型改變成了類(lèi)似較正?；蜉^野生的非骨病表型，或更有可能產(chǎn)生較低疾病癥狀發(fā)生率或嚴(yán)重性的表型。更進(jìn)一步的是，可以分析ObR或AR是其中一部分的信號(hào)傳導(dǎo)通路組分的表達(dá)和/或活性，ObR信號(hào)傳導(dǎo)通路和/或腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)通路自身的活性。
舉例來(lái)說(shuō)，接觸后，可以和來(lái)源于未接觸的對(duì)照細(xì)胞的裂解物相比，分析細(xì)胞裂解物中宿主細(xì)胞蛋白酪氨酸磷酸化的存在。這些分析系統(tǒng)中受試化合物抑制宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的能力說(shuō)明受試化合物能夠抑制ObR活化引發(fā)的信號(hào)傳導(dǎo)?？梢允褂肳estern印跡分析方便地對(duì)細(xì)胞裂解物進(jìn)行分析，即通過(guò)凝膠電泳分離宿主細(xì)胞蛋白，轉(zhuǎn)移并使用抗磷酸化酪氨酸檢測(cè)抗體(如用產(chǎn)生信號(hào)的化合物，如放射標(biāo)記、熒光、酶等標(biāo)記的抗磷酸化酪氨酸抗體)進(jìn)行探測(cè)(參見(jiàn)Glenney et al.，1988，J.Immunol.Methods 109277-285；Frackelton etal.，1983，Mol.Cell.Biol.31343-1352)?？商鎿Q的方案是，使用ELISA方法，其中使用對(duì)靶宿主細(xì)胞特異的錨定抗體將參與ObR信號(hào)傳導(dǎo)通路的特定宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)固定，使用標(biāo)記的抗磷酸酪氨酸抗體檢測(cè)固定化宿主細(xì)胞蛋白的磷酸化與否(參見(jiàn)King et al.，King et al.，1993，Life Sciences 531465-1472)。在另一種方法中，測(cè)定位于ObR刺激的信號(hào)傳導(dǎo)終點(diǎn)的離子流，如鈣離子流。
另外，可以使用包括Ob、db和ob/db小鼠的動(dòng)物骨病系統(tǒng)來(lái)鑒定能夠改善骨病樣癥狀的化合物。這種動(dòng)物模型可以用作有效治療骨病的藥物、藥劑、治療和介入的受試對(duì)象。舉例來(lái)說(shuō)，動(dòng)物模型和足夠濃度的、懷疑具有改善骨病癥狀能力的化合物接觸一段時(shí)間，使之能夠改善接觸動(dòng)物中的骨病癥狀。通過(guò)評(píng)價(jià)和骨病，如骨質(zhì)疏松相關(guān)的疾病的逆轉(zhuǎn)檢測(cè)動(dòng)物對(duì)化合物的應(yīng)答。至于介入，能夠逆轉(zhuǎn)骨病樣癥狀方面的任意處理都可以看作是人類(lèi)骨病治療性介入的候選物。通過(guò)下面討論的劑量效應(yīng)曲線確定受試試劑的劑量。
5.4調(diào)節(jié)Ob或ObR表達(dá)或活性的化合物和Ob或ObR(包括但不局限于ObR的ECD或CD)相互作用(如與之結(jié)合)的化合物、和與Ob或ObR(包括但不局限于ObR的ECD或CD)相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用(如與之結(jié)合)的化合物、干擾Ob或ObR和參與ObR介導(dǎo)之信號(hào)傳導(dǎo)的跨膜蛋白或細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生相互作用的化合物、調(diào)節(jié)Ob或ObR基因表達(dá)或調(diào)節(jié)Ob或ObR水平的化合物能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)水平。更具體地說(shuō)，降低Ob或ObR水平、抑制Ob透過(guò)血腦屏障或抑制Ob和ObR結(jié)合的化合物將引起骨質(zhì)增加。
這種化合物的例子包括瘦素和瘦素受體激動(dòng)劑和拮抗劑。這里所用的瘦素受體拮抗劑指能夠中和或妨礙或減弱瘦素受體作用或效應(yīng)的因子。這種拮抗劑包括能夠結(jié)合瘦素或結(jié)合瘦素受體的化合物。這種拮抗劑還包括中和、妨礙或減少瘦素受體輸出，瘦素受體信號(hào)輸出是瘦素與瘦素受體結(jié)合后瘦素信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響瘦素/瘦素受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。瘦素受體拮抗劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如乙酰苯酚類(lèi)化合物、特異性結(jié)合瘦素的抗體、特異性結(jié)合瘦素受體的抗體和包含可溶性瘦素受體多肽序列的化合物。
舉例來(lái)說(shuō)，瘦素拮抗劑還包括增加、抑制、阻斷、取消或干擾瘦素與其受體或其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑或藥物；作為驅(qū)動(dòng)瘦素生成或合成的拮抗劑的試劑和抑制瘦素和其受體相接觸，如抑制瘦素透過(guò)血腦屏障的試劑。這種試劑可以是抑制或防止瘦素和其受體相互作用或瘦素生成的有機(jī)分子(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,866,547)。瘦素受體拮抗劑包括但不局限于能夠特異性和瘦素相結(jié)合并防止瘦素和關(guān)聯(lián)性受體相結(jié)合的抗瘦素抗體、受體分子和衍生物。
這里所用的瘦素受體激動(dòng)劑指活化、誘導(dǎo)或增強(qiáng)瘦素受體作用或效應(yīng)的因子。這種激動(dòng)劑包括與瘦素結(jié)合或與瘦素受體結(jié)合的化合物。這種激動(dòng)劑還包括活化、誘導(dǎo)或增加瘦素受體信號(hào)輸出的化合物，瘦素受體信號(hào)輸出是瘦素與瘦素受體結(jié)合后瘦素信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響瘦素/瘦素受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。瘦素受體激動(dòng)劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如瘦素、瘦素類(lèi)似物、特異性結(jié)合并活化瘦素的抗體。
其他的Ob結(jié)合蛋白包括但不局限于內(nèi)-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈相關(guān)蛋白(IHRP)；α-2巨球蛋白；及特異性結(jié)合Ob并能夠防止Ob和ObR結(jié)合的OB-BP1。特異性O(shè)b結(jié)合蛋白進(jìn)一步使Ob水平得以調(diào)節(jié)、固定并對(duì)結(jié)合型/游離型瘦素進(jìn)行分析(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,919,902；Birkenmeier et al.，1998，Eur.J.Endocrin.，139224-230；和Patel et al.，1999，J.Biol.Chem.，3222729-22738)。美國(guó)專(zhuān)利No.5,830,450中還介紹了其他的Ob結(jié)合蛋白，如載脂蛋白。
ObR拮抗劑的例子有乙酰苯酚，已知它現(xiàn)在用作減肥藥和抗糖尿病化合物。既然乙酰苯酚是ObR的拮抗劑，他們能夠防止Ob和ObR的結(jié)合。因此，從本發(fā)明的角度考慮，化合物會(huì)有效地導(dǎo)致骨質(zhì)增加?？梢杂米鱋bR拮抗劑的乙酰苯酚特異結(jié)構(gòu)參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,859,051。
能夠用于骨病的診斷、藥物篩選、臨床試驗(yàn)監(jiān)測(cè)和/或治療的其他的ObR拮抗劑和激動(dòng)劑和調(diào)節(jié)ObR基因表達(dá)或ObR活性的其他化合物參見(jiàn)Nos.5,972,621；5,874,535和5,912,123。
5.5.調(diào)節(jié)兒茶酚胺或腎上腺素能受體表達(dá)或活性的化合物和兒茶酚胺或腎上腺素能受體(包括但不局限于腎上腺素能受體的ECD或CD)相互作用(如與之結(jié)合)的化合物、和與兒茶酚胺或腎上腺素能受體(包括但不局限于腎上腺素能受體的ECD或CD)相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用(如與之結(jié)合)的化合物、干擾兒茶酚胺或腎上腺素能受體和參與腎上腺素能受體介導(dǎo)之信號(hào)傳導(dǎo)的跨膜蛋白或細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生相互作用的化合物、調(diào)節(jié)兒茶酚胺或腎上腺素能受體基因表達(dá)或調(diào)節(jié)兒茶酚胺或腎上腺素能受體水平的化合物能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)水平。更具體地說(shuō)，降低兒茶酚胺或腎上腺素能受體水平、抑制兒茶酚胺透過(guò)血腦屏障或抑制兒茶酚胺和腎上腺素能受體結(jié)合的化合物將引起骨質(zhì)增加。
這種化合物的例子包括兒茶酚胺或腎上腺素能受體激動(dòng)劑和拮抗劑。這里所用的腎上腺素能受體拮抗劑指能夠中和或妨礙或減弱腎上腺素能受體作用或效應(yīng)的因子。這種拮抗劑包括能夠結(jié)合兒茶酚胺或腎上腺素能受體的化合物。這種拮抗劑還包括中和、妨礙或減少腎上腺素能受體輸出，腎上腺素能受體信號(hào)輸出是兒茶酚胺與腎上腺素能受體結(jié)合后兒茶酚胺信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響兒茶酚胺/腎上腺素能受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。腎上腺素能受體拮抗劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如特異性結(jié)合腎上腺素能受體的抗體和包含可溶性腎上腺素能受體多肽序列的化合物。
兒茶酚胺是兒茶酚(1，2-二羥基苯)的含胺衍生物，包括但不局限于去甲腎上腺素和其甲基化衍生物腎上腺素。去甲腎上腺素由腎上腺素能神經(jīng)末端產(chǎn)生，而腎上腺素由腎上腺髓質(zhì)產(chǎn)生。
如整體在此引入作為參考的美國(guó)專(zhuān)利No.6,313,172的背景部分中所述，人腎上腺素能受體是完整細(xì)胞膜蛋白質(zhì)，分為兩大類(lèi)，即α腎上腺素能受體和β腎上腺素能受體。這兩類(lèi)都能介導(dǎo)周?chē)桓猩窠?jīng)系統(tǒng)對(duì)兒茶酚胺結(jié)合的作用。腎上腺素能受體對(duì)于這些化合物的結(jié)合親和力是分類(lèi)的依據(jù)α受體和去甲腎上腺素的結(jié)合比和腎上腺素的結(jié)合強(qiáng)，更比和合成的化合物異丙腎上腺素的結(jié)合強(qiáng)。β-受體能夠逆轉(zhuǎn)這些激素的優(yōu)選結(jié)合親和力。在許多組織中，功能性應(yīng)答，如受體活化誘導(dǎo)的胃肌收縮就是由β-受體結(jié)合所誘導(dǎo)的應(yīng)答。
因而，對(duì)來(lái)源于不同動(dòng)物和組織的受體的藥理學(xué)分析進(jìn)一步突出并限定了α受體和β受體之間的功能性差異。結(jié)果，將α受體和β受體進(jìn)一步分為α1、α2、β1、β2、β3亞型。
例如，β-腎上腺素能受體拮抗劑包括但不局限于艾絲洛爾、美托洛爾、阿替洛爾或醋丁洛爾(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.6,303,573，其整體在此引入作為參考)?？梢杂米髂I上腺素能拮抗劑的試劑包括但不局限于(i)和α-腎上腺素能受體結(jié)合的交感神經(jīng)阻斷劑和(ii)耗盡遞質(zhì)的試劑。作為α受體拮抗劑的阻斷試劑包括酚妥拉明、妥拉唑啉、哌唑嗪、特拉唑嗪、多沙唑嗪、曲馬唑嗪、吲哚胺或不可逆的α受體拮抗劑，如苯氧芐胺或二苯扎明(dibenzamine)。作為遞質(zhì)耗竭劑的試劑包括胍乙啶、胍那決爾、利血平或甲基酪氨酸(metyrosine)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.6,009,875，其整體在此引入作為參考)。
這里所用的腎上腺素能受體激動(dòng)劑指活化、誘導(dǎo)或增強(qiáng)腎上腺素能受體作用或效應(yīng)的因子。這種激動(dòng)劑包括與兒茶酚胺結(jié)合或與腎上腺素能受體結(jié)合的化合物。這種激動(dòng)劑還包括活化、誘導(dǎo)或增加腎上腺素能受體信號(hào)輸出的化合物，腎上腺素能受體信號(hào)輸出是兒茶酚胺與腎上腺素能受體結(jié)合后腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響兒茶酚胺/腎上腺素能受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。腎上腺素能受體激動(dòng)劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如兒茶酚胺和兒茶酚胺類(lèi)似物。β腎上腺素能激動(dòng)劑的例子包括但不局限于異丙腎上腺素、多巴胺和多巴酚丁胺(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,713,367，其整體在此引入作為參考)。
5.6.調(diào)節(jié)NPY或NPY-R表達(dá)或活性的化合物本發(fā)明還提供了單獨(dú)NPY和NPY受體激動(dòng)劑和拮抗劑或和其他上述調(diào)節(jié)劑聯(lián)合來(lái)調(diào)節(jié)在骨上的瘦素效應(yīng)和/或交感神經(jīng)緊張性的用途。
和NPY或NPY-R(包括但不局限于NPY-R的ECD或CD)相互作用(如與之結(jié)合)的化合物、和與NPY或NPY-R(包括但不局限于NPY-R的ECD或CD)相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用(如與之結(jié)合)的化合物、干擾NPY或NPY-R和參與NPY-R介導(dǎo)之信號(hào)傳導(dǎo)的跨膜蛋白或細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生相互作用的化合物、調(diào)節(jié)NPY或NPY-R基因表達(dá)或調(diào)節(jié)NPY或NPY-R水平的化合物能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)水平。更具體地說(shuō)，降低NPY或NPY-R水平、抑制NPY胺透過(guò)血腦屏障或抑制NPY或NPY-R結(jié)合的化合物將引起骨質(zhì)增加。
這種化合物的例子包括NPY或NPY-R激動(dòng)劑和拮抗劑。這里所用的NPY受體拮抗劑指能夠中和或妨礙或減弱NPY受體作用或效應(yīng)的因子。這種拮抗劑包括能夠結(jié)合NPY或NPY受體的化合物。這種拮抗劑還包括中和、妨礙或減少NPY輸出的化合物，NPY受體信號(hào)輸出是NPY和NPY受體結(jié)合后NPY信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響NPY/NPY受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。NPY受體拮抗劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如乙酰苯酚類(lèi)化合物、特異性結(jié)合NPY的抗體、特異性結(jié)合NPY受體的抗體和包含可溶性NPY受體多肽序列的化合物。
舉例來(lái)說(shuō)，NPY拮抗劑還包括降低、抑制、阻斷、取消或干擾NPY與其受體或其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑或藥物；作為驅(qū)動(dòng)NPY生成或合成的拮抗劑的試劑和抑制NPY和其受體相接觸，如抑制NPY透過(guò)血腦屏障的試劑。這種試劑可以是抑制或防止NPY和其受體相互作用或NPY生成的任意有機(jī)分子。
這里所用的NPY受體激動(dòng)劑指活化、誘導(dǎo)或增強(qiáng)NPY受體作用或效應(yīng)的因子。這種激動(dòng)劑包括與NPY結(jié)合或與NPY受體結(jié)合的化合物。其他的NPY激動(dòng)劑和類(lèi)似物包括美國(guó)專(zhuān)利No.5,328,899中所述化合物。這種激動(dòng)劑還包括活化、誘導(dǎo)或增加NPY受體信號(hào)輸出的化合物，NPY受體信號(hào)輸出是NPY與NPY受體結(jié)合后NPY信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響NPY/NPY受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。NPY受體激動(dòng)劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如NPY、NPY類(lèi)似物、特異性結(jié)合并活化NPY的抗體。
已經(jīng)介紹了多種NPY拮抗劑。例如，美國(guó)專(zhuān)利No.5,972,888中介紹了作為NPY拮抗劑的多種化合物，這些化合物包括但并不局限于萘、苯并呋喃、苯并噻吩和吲哚；雷洛昔芬(raloxifene)；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯甲?；鵠-1，2-二氫萘，檸檬酸鹽；3-苯基-4-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯甲酰基]-7-甲氧基-1，2-二氫萘；3-苯基-4-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯甲?；鵠-1，2-二氫萘；1-[4-(2-吡咯烷-1-基乙氧基)苯甲?；鵠-2-苯基萘，檸檬酸鹽；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-哌啶-1-基)乙氧基]苯甲?；鵠-1，2-二氫萘，檸檬酸鹽；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-二甲基氨基乙氧基)苯甲酰基]-1，2-二氫萘，檸檬酸鹽；3-(4-羥基苯基)-4-[4-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]苯甲?；鵠-1，2-二氫萘，甲磺酸鹽；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-六亞甲基亞氨-1-基)苯甲?；鵠-1，2-二氫萘，甲磺酸鹽；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-哌啶-1-)乙氧基]苯甲?；鵠-1，2-二氫萘，甲磺酸鹽；3-(4-甲氧苯基)-4-(4-二乙氨基乙氧苯甲?；?-1，2-二氫萘，甲磺酸鹽；3-(4-甲氧苯基)-4-(4-二異丙氨基乙氧苯甲酰基)-1，2-二氫萘，甲磺酸鹽；3-羥基-4-[4-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]苯甲酰基]-1，2-二氫萘，鈉鹽；2-(4-甲氧苯基)-1-[4-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]苯甲?；鵠萘，甲磺酸鹽；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-哌啶-1-基)乙氧基]苯甲酰基]-7-甲氧基-1，2-二氫萘，甲磺酸鹽；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-二甲基氨基乙氧基)苯甲?；鵠-1，2-二氫萘，2-羥-1，2，3-丙烷三羧酸鹽；3-(4-甲氧苯基)-4-[4-[2-(N-甲基-1-吡咯烷鎓)乙氧基]苯甲酰基]-1，2-二氫萘，碘鹽；和3-(4-甲氧苯基)-4-[4-(2-吡咯烷-1-基)乙氧基]-苯甲?；鵠-1，2-二氫萘，甲磺酸鹽。
類(lèi)似地，已經(jīng)鑒定到了許多NPY-R拮抗劑。這些拮抗劑的例子包括但不局限于α-烷氧和α-硫烷氧酰胺組合物(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,939,462)；二氫吡啶化合物(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,554,621、6,001,836、5,668,151和5,635,503)；取代的芐胺衍生物(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,985,873、5,962,455和5,900,415)；二氫嘧啶酮衍生物(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,889,016)；naphthimidazolyl衍生物(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,776,931)；二甲磺酸鹽(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,914,329)；和取代的苯并呋喃、苯并噻吩或吲哚(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,663,192)。美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,567,714、5,504,094、5,670,482、5,989,920和5,827,853、5,985,616中還公開(kāi)了其他的NPY-R拮抗劑。
5.7.調(diào)節(jié)CNTF或CNTF受體表達(dá)或活性的化合物本發(fā)明還提供了單獨(dú)CNTF和CNTF受體激動(dòng)劑和拮抗劑或和其他上述調(diào)節(jié)劑聯(lián)合來(lái)調(diào)節(jié)在骨上的瘦素效應(yīng)和/或交感神經(jīng)緊張性的用途。
和CNTF或CNTF受體(包括但不局限于CNTF受體的ECD或CD)相互作用(如與之結(jié)合)的化合物、和與CNTF或CNTF受體(包括但不局限于CNTF受體的TM和CD)相互作用的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用(如與之結(jié)合)的化合物、干擾CNTF或CNTF受體和參與CNTF介導(dǎo)之信號(hào)傳導(dǎo)的跨膜蛋白或細(xì)胞內(nèi)蛋白發(fā)生相互作用的化合物、調(diào)節(jié)CNTF或CNTF受體基因表達(dá)或調(diào)節(jié)CNTF或CNTF受體水平的化合物能夠調(diào)節(jié)骨質(zhì)水平。更具體地說(shuō)，降低CNTF或CNTF受體水平、抑制CNTF或CNTF受體結(jié)合的化合物將引起骨質(zhì)增加。
這種化合物的例子包括CNTF或CNTF受體激動(dòng)劑和拮抗劑。這里所用的NPY受體拮抗劑指能夠中和或妨礙或減弱CNTF受體作用或效應(yīng)的因子。這種拮抗劑包括能夠結(jié)合CNTF或CNTF受體的化合物。這種拮抗劑還包括中和、妨礙或減少CNTF輸出的化合物，CNTF受體信號(hào)輸出是CNTF和CNTF受體結(jié)合后CNTF信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響CNTF/CNTF受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。CNTF受體拮抗劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如包括F152S突變型CNTF或K155A突變型CNTF的突變型CNTF分子、特異性結(jié)合CNTF的抗體、特異性結(jié)合CNTF受體的抗體和包含可溶性CNTF受體多肽序列的化合物。
舉例來(lái)說(shuō)，CNTF拮抗劑還包括降低、抑制、阻斷、取消或干擾NPY與其受體或其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的試劑或藥物；作為驅(qū)動(dòng)CNTF生成或合成的拮抗劑的試劑和抑制CNTF和其受體相接觸的試劑。這種試劑可以是抑制或防止CNTF和其受體相互作用或CNTF生成的任意有機(jī)分子。
CNTF受體拮抗劑還包括干擾CNTF受體功能的突變型CNTF分子(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,846,935)。例如CNTF原始序列的155位賴氨酸殘基的突變產(chǎn)生一種CNTF拮抗劑(參見(jiàn)Inoue et al.，1997，J.Neurochem.6995-101；DiMarco et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA939247-52)。美國(guó)專(zhuān)利No.5,723,120要求保護(hù)了在氨基酸154-163區(qū)域發(fā)生突變的CNTF分子。CNTF受體拮抗劑還包括特異性結(jié)合CNTF并抑制CNTF和其關(guān)聯(lián)性受體相結(jié)合的抗CNTF抗體、受體分子和衍生物。
CNTF受體拮抗劑包括同樣抑制CNTF受體功能的IL-6受體功能拮抗劑，如基于GM-CSF結(jié)構(gòu)的gp130抑制劑和/或基于IL-6結(jié)構(gòu)的gp130抑制劑(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,914,106、5,891,998、5,849,283、5,789,552、5,591,827和5,723,120)。CNTF受體拮抗劑包括和編碼CNTF受體多肽的多聚核苷酸互補(bǔ)的反義寡核苷酸(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,747,470、5,674,995和5,747,470)。其他的拮抗劑還包括來(lái)源于CNTF受體多肽的可溶性結(jié)構(gòu)域或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的拮抗劑(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,884,099和美國(guó)專(zhuān)利No.5,470,952)。最后，拮抗劑包括CNTF受體多肽的抗體(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,892,003、5,866,689和5,717,073)。
CNTF受體拮抗劑還包括抑制CNTF活化的下游信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)、影響CNTF活性的化合物。例如，絲氨酸激酶mTOR抑制劑雷帕霉素還抑制CNTF誘導(dǎo)的STAT3的磷酸化(參見(jiàn)Yokogami et al.，2000，Current Biology 1047-50)。SOCS-3是CNTF信號(hào)傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子。絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑H7抑制由CNTF誘導(dǎo)的、經(jīng)CyRE介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄(參見(jiàn)Symes et al.，1997，J.Biol.Chem.2729648-9654)。蛋白酶體抑制劑MG132和佛波酯調(diào)節(jié)磷酸化的STAT3水平(參見(jiàn)Malek et al.，1999，Cytokine 11192-199)。
CNTF受體拮抗劑還包括干擾和/或防止CNTF/CNTF受體復(fù)合物形成的分子。例如，結(jié)合CNTF的分子或結(jié)合CNTF受體的一個(gè)組分的分子也能夠防止CNTF/CNTF受體復(fù)合物形成。這種分子的例子包括但不局限于識(shí)別一個(gè)或多個(gè)CNTF受體亞基的抗體、美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,717,073和5,886,689中所述的分子和該領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的、防止CNTF/CNTF受體復(fù)合物形成的其他分子。
這里所用的CNTF受體激動(dòng)劑指活化、誘導(dǎo)或增強(qiáng)CNTF受體作用或效應(yīng)的因子。這種激動(dòng)劑包括與CNTF結(jié)合或與CNTF受體結(jié)合的化合物。這種激動(dòng)劑還包括活化、誘導(dǎo)或增加CNTF受體信號(hào)輸出的化合物，CNTF受體信號(hào)輸出是CNTF與CNTF受體結(jié)合后CNTF信號(hào)傳導(dǎo)通路中的細(xì)胞內(nèi)步驟，即影響CNTF/CNTF受體信號(hào)傳導(dǎo)、不發(fā)生在受體/配體相互作用水平上的下游事件。CNTF受體激動(dòng)劑包括，但不局限于蛋白質(zhì)、抗體、小的有機(jī)分子或碳水化合物，例如CNTF、CNTF類(lèi)似物、特異性結(jié)合并活化CNTF的抗體。另外，CNTF激動(dòng)劑包括增加CNTF活性的突變型CNTF分子，如DH-CNTF，它是CNTF的超激動(dòng)性變體，其中Ser166突變成了Asp，Gln167突變成了His(參見(jiàn)Saggio et al.，1995，EMBO J.143045-3054)。CNTF受體激動(dòng)劑還包括影響CNTF功能下游信號(hào)傳導(dǎo)事件的化合物。例如SOCS-3的抑制劑可以增強(qiáng)CNTF信號(hào)傳導(dǎo)(參見(jiàn)Bjorbaek，1999，Endocrinology 1402035-2043)。
其他的CNTF結(jié)合蛋白包括但不局限于特異性結(jié)合CNTF的抗體、可溶性CNTFRα(CNTFRα缺失CNTF的糖基化-磷酸肌醇錨定位點(diǎn))、結(jié)合CNTF的其他分子，如美國(guó)專(zhuān)利No.5,470,952中介紹的分子和本領(lǐng)域的技術(shù)人員所已知的、特異性結(jié)合CNTF、從而防止CNTF和CNTF受體相結(jié)合的分子。特異性CNTF結(jié)合蛋白進(jìn)一步使得游離CNTF水平調(diào)節(jié)、固定和結(jié)合態(tài)/游離態(tài)CNTF的分析成為可能。
能夠用于骨病的診斷、藥物篩選、臨床試驗(yàn)監(jiān)測(cè)和/或治療的其他CNTF受體的拮抗劑和激動(dòng)劑，以及能夠調(diào)節(jié)CNTF受體基因表達(dá)或CNTF受體活性的其他化合物參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,846,935；Inoueet al.，1997，J.Neurochem.6995-101；DiMarco et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 939247-52；美國(guó)專(zhuān)利No.5,723,120和Saggio，1995，EMBO J 143045-3054。
5.8.治療或預(yù)防骨病的方法可以根據(jù)本發(fā)明治療和/或預(yù)防的骨病包括和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病，包括但不局限于骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)稀少、佩吉特癥、骨軟化癥和腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良。可以根據(jù)本發(fā)明治療和/或預(yù)防的骨病還包括和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增多的骨病，包括但不局限于骨骼石化癥、骨硬化和骨軟骨病。
低骨質(zhì)疾病的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)是骨的易折性。由于不能夠直接測(cè)定骨的易折性，骨質(zhì)或骨礦物密度的測(cè)定可以作為骨易折程度的指標(biāo)。雖然低骨質(zhì)和骨易折性增加之間有聯(lián)系，但骨的幾何學(xué)和小梁構(gòu)造的改變有時(shí)也會(huì)導(dǎo)致二者之間的不一致性。通常來(lái)說(shuō)，使用骨質(zhì)(或骨密度或骨體積)和骨幾何學(xué)來(lái)獲得骨表觀的靜態(tài)圖，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以從該圖獲得骨的機(jī)制特征(如強(qiáng)度、剛度和硬度)，并預(yù)測(cè)發(fā)生骨折的危險(xiǎn)性。在動(dòng)物模型中，組織學(xué)分析可以分析骨質(zhì)、幾何學(xué)特征和骨形成速度。難以對(duì)骨吸收速度進(jìn)行分析，這是因?yàn)閷?duì)破骨細(xì)胞數(shù)目或表面面積進(jìn)行計(jì)數(shù)并不能代表破骨細(xì)胞活性?？梢灾苯訙y(cè)定骨的機(jī)械特征，包括但不局限于承受壓力和彎曲的強(qiáng)度、硬度和最大承重。使用包括但不局限于單光子和雙光子吸收測(cè)定法(SPA和DPA)、單X-射線和雙X-射線吸收測(cè)定法(SXA和DXA)、超聲(US)和磁共振成像(MRI)(參見(jiàn)Guglielmi et al.，1995，Eur Radiol.5(2)129-39)。
本發(fā)明和涉及不和骨質(zhì)相關(guān)的骨病。例如，本發(fā)明包括但不局限于改變礦物質(zhì)含量的疾病、異?；|(zhì)化合物(如膠原)的疾病或異常局部增生的疾病。
本發(fā)明的一個(gè)目的是通過(guò)調(diào)節(jié)交感神經(jīng)系統(tǒng)通路來(lái)治療、診斷和/或預(yù)防骨病。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，存在治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括施用β-腎上腺素能受體拮抗劑。該方面的一個(gè)具體實(shí)施方案包括但不局限于進(jìn)一步將瘦素受體拮抗劑和β-腎上腺素能受體拮抗劑聯(lián)用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在治療和預(yù)防骨骼石化癥和骨硬化的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括施用β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑。該方面的一個(gè)具體實(shí)施方案包括但不局限于進(jìn)一步將瘦素受體激動(dòng)劑和β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑聯(lián)用。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及調(diào)節(jié)瘦素對(duì)骨的作用的方法，該方法包括施用治療有效量的藥物組合物，使之改變交感神經(jīng)緊張性。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及調(diào)節(jié)骨質(zhì)的方法，該方法包括施用治療有效量的藥物組合物，使之改變交感神經(jīng)緊張性，從而調(diào)節(jié)骨質(zhì)。藥物組合物的具體實(shí)施方案包括，但不局限于瘦素拮抗劑、瘦素激動(dòng)劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑及其組合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松的一個(gè)或多個(gè)癥狀的方法，該方法包括施用治療有效量的藥物組合物，通過(guò)改變交感神經(jīng)緊張性調(diào)節(jié)瘦素效應(yīng)。藥物組合物的具體實(shí)施方案包括，但不局限于瘦素拮抗劑、瘦素激動(dòng)劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑及其組合。
本發(fā)明的一個(gè)方面是治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、能夠降低血清中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解的實(shí)施方案。這些化合物包括反義序列、核酶或瘦素編碼多肽的三聯(lián)螺旋序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、能夠降低腦脊液中瘦素水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解以及和血液中瘦素相結(jié)合之化合物的實(shí)施方案。
本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案包括，例如，治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病，其中的化合物選自能夠和血液中瘦素相結(jié)合的化合物，這些化合物包括但不局限于特異性結(jié)合瘦素的抗體、可溶性瘦素受體多肽、間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈相關(guān)蛋白和α2-巨球蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向所需所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、降低磷酸化Stat3多肽水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素合成或增加瘦素降解；和血液中瘦素相結(jié)合的化合物；瘦素受體拮抗性化合物，如乙酰苯酚化合物、特異性結(jié)合瘦素的抗體、特異性結(jié)合瘦素受體的抗體和包括可溶性瘦素受體多肽序列的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療或預(yù)防骨病的方法，該方法包括向所需所述治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、抑制多巴胺β羥化酶(“DBH”)的化合物，該酶是將多巴胺轉(zhuǎn)化為去甲腎上腺素所必需的。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制DBH酶活性、DBH基因表達(dá)、特異性結(jié)合DBH的抗體和參與去甲腎上腺素合成途徑的化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在治療骨病的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)施用治療有效量的、能夠降低下丘腦中瘦素受體水平的化合物，其中骨病是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減輕的骨病。一些化合物和方法的具體實(shí)施方案包括，但不局限于抑制或降低瘦素受體合成或增加瘦素受體降解的實(shí)施方案。這些化合物包括反義序列、核酶或瘦素編碼多肽的三聯(lián)螺旋序列。
降低血清或腦脊液中瘦素水平的化合物是下列分析中能夠降低瘦素水平的化合物使化合物和來(lái)源于瘦素表達(dá)細(xì)胞系，優(yōu)選NIH3T3L1細(xì)胞系的細(xì)胞相接觸，測(cè)定瘦素表達(dá)和/或合成和不存在化合物的條件下細(xì)胞系所表現(xiàn)的水平是否有所降低。使用標(biāo)準(zhǔn)分析方法，如Northern印跡分析來(lái)測(cè)定瘦素表達(dá)水平，使用Western印跡分析來(lái)測(cè)定瘦素合成水平?？商鎿Q的一種分析方法包括將施用化合物之前或之后、接受骨病治療的哺乳動(dòng)物體內(nèi)的瘦素水平相比較，如果瘦素水平降低，則化合物是能夠降低瘦素水平的化合物。類(lèi)似的，增加血清或腦脊液中瘦素水平的化合物是在這種分析中增加瘦素水平的化合物。
降低靶細(xì)胞中瘦素信號(hào)傳導(dǎo)下游效應(yīng)因子磷酸化Stat3多肽水平(Tartaglia et al.，1995，Cell 83，1263-1271；Baumann et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 938374-8378；Ghilardi et al.，1996，Proc Natl AcadSci USA 936231-6235；Vaisse et al.，1996，Nat Genet 14，95-97)的化合物是能夠在下列分析中降低磷酸化Stat3的化合物使瘦素多肽及化合物和表達(dá)功能性瘦素受體的細(xì)胞相接觸，測(cè)定細(xì)胞中磷酸化Stat3多肽的水平。為了測(cè)定磷酸化Stat3多肽的水平，可以將細(xì)胞裂解，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆治?如Western印跡分析)。如果磷酸化Stat3多肽水平和不存在化合物的條件下細(xì)胞系所表現(xiàn)的水平相比降低，則化合物是能夠降低磷酸化Stat3多肽水平的化合物。類(lèi)似的，增加血清或腦脊液中瘦素水平的化合物是在這種分析中增加磷酸化Stat3多肽水平的化合物。
本發(fā)明中還提供了抑制多巴胺β羥化酶(“DBH”)活性的化合物，該酶是將多巴胺轉(zhuǎn)化為去甲腎上腺素所必需的。使用本領(lǐng)域已知的體外分析方法，通過(guò)測(cè)定DBH將酪胺催化形成酚乙醇胺的活性及受試化合物的抑制作用，確定受試化合物的多巴胺β羥化酶抑制劑特性。還可以使用本領(lǐng)域已知的體外分析方法，通過(guò)測(cè)定多巴胺和去甲腎上腺素的組織濃度和受試化合物的效應(yīng)，確定受試化合物的多巴胺-羥化酶抑制劑特性(參見(jiàn)B.A.Berkowitz et al.，1988 J.Pharm.ExpEher.245850-857)。這些化合物和方法的特定實(shí)施方案包括但不局限于抑制DBH酶活性、DBH基因表達(dá)、特異性結(jié)合DBH的抗體和參與去甲腎上腺素合成途徑的化合物。已知的DBH抑制劑包括但不局限于鐮刀菌酸；雙硫侖(disulfiram)；3-苯丙精胺和5-(4’-氯丁基)-吡啶甲酸；氨基甲酸二乙基二硫酯；β-氯苯乙胺；4-羥苯氰；2-鹵-3-(對(duì)羥苯基)-1-丙烯；1-苯基-1-丙烯；2-苯基烯丙胺；2-(2-噻吩基)烯丙胺和其衍生物，如2-硫苯-2-(2-噻吩基)烯丙胺；3-苯丙精胺、1-苯基-1(氨乙基)乙烯和其衍生物，如N-(三氟乙?；?苯基-1(氨乙基)乙烯；和5-吡啶甲酸衍生物，如5-(4’-氯丁基)-吡啶甲酸和其他烷基或鹵烷基取代的吡啶甲酸，比如C1～C6烷基可選性被一個(gè)或多個(gè)鹵原子取代。這些化合物在美國(guó)專(zhuān)利No.5,741,503中作有介紹，其整體在此引入作為參考。
如果所施用的量使接受者哺乳動(dòng)物發(fā)生所需的生理變化，如增加或降低疾病狀態(tài)下相應(yīng)骨骨質(zhì)；也就是說(shuō)，能夠治療，即將骨質(zhì)調(diào)節(jié)至和非疾病狀態(tài)下相應(yīng)非發(fā)病骨(同一類(lèi)型的相應(yīng)骨，如長(zhǎng)骨、脊椎骨等)較為類(lèi)似的程度，則可以說(shuō)施用了“治療有效量”的試劑。這些方法中，相應(yīng)的非發(fā)病骨指和接受治療的骨類(lèi)型相同的骨(如相應(yīng)的脊椎骨和長(zhǎng)骨)，使用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的和上文所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)測(cè)定骨質(zhì)，這些技術(shù)包括X射線、DEXA和經(jīng)典的組織學(xué)分析和骨質(zhì)測(cè)定方法。
可用作本發(fā)明方法一部分的化合物是上述的化合物，例如各節(jié)和這里所給出的化合物，以及通過(guò)各節(jié)和這里所給出的技術(shù)鑒定到的化合物。
下文中詳述了能夠用作本發(fā)明治療和診斷方法一部分的特定技術(shù)和方法。
5.8.1.通過(guò)增加骨質(zhì)抑制Ob或ObR表達(dá)、水平或活性以治療骨病可以使用中和、減緩或抑制Ob或ObR表達(dá)(轉(zhuǎn)錄或翻譯)、水平或活性的任意方法使骨質(zhì)增加，來(lái)治療或預(yù)防骨病，其中骨病特征是和相應(yīng)的非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加。這些方法可用于治療或預(yù)防骨病，如骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)稀少、錯(cuò)誤骨形成或吸收、佩吉特病、骨轉(zhuǎn)移、軟骨病和腎性骨營(yíng)養(yǎng)不良。這些方法可用于治療涉及骨折和斷骨的疾病狀態(tài)。
例如，可以通過(guò)施用化合物，如可溶性肽、蛋白質(zhì)、融合蛋白或結(jié)合并“中和”循環(huán)Ob的抗體(包括抗獨(dú)特型抗體)、ObR的天然配體來(lái)增加骨質(zhì)。類(lèi)似的，可溶性肽、蛋白質(zhì)、融合蛋白或抗體(包括抗獨(dú)特型抗體)之類(lèi)的化合物可用于增加骨質(zhì)。為了這一目的，可以使用對(duì)應(yīng)于ObR的ECD的肽、ObR的可溶性缺失突變體或這些ObR結(jié)構(gòu)域之一或和其他多肽(如IgFc多肽)相融合的突變體。可替換的方案是，使用模擬ObR ECD并中和Ob的抗獨(dú)特型抗體或抗獨(dú)特型抗體的Fab片段?？商鎿Q的方案是，還可以使用能夠抑制ObR同源二聚化、從而降低對(duì)瘦素受體親和力的化合物(參見(jiàn)Devos et al.，1997，J.Biol.Chem.，27218304-18310)。對(duì)于治療來(lái)說(shuō)，這種ObR肽、蛋白質(zhì)、融合蛋白、抗獨(dú)特型抗體或Fab以治療有效水平施用到需要治療的受試者體內(nèi)。對(duì)于預(yù)防來(lái)說(shuō)，這種ObR肽、蛋白質(zhì)、融合蛋白、抗獨(dú)特型抗體或Fab以一定的濃度施用到具有發(fā)生骨病危險(xiǎn)性的受試者體內(nèi)一段時(shí)間，使之能夠預(yù)防骨病。
在中和循環(huán)Ob的一個(gè)可替換實(shí)施方案中，將經(jīng)過(guò)遺傳改造、能夠表達(dá)這種可溶性的或分泌形式的ObR的細(xì)胞施用到患者體內(nèi)，它們作為體內(nèi)的“生物反應(yīng)器”，持續(xù)性地供應(yīng)Ob中和性蛋白。這種細(xì)胞從患者體內(nèi)或MHC相容性的供體獲得，包括但不局限于成纖維細(xì)胞、血細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞)、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。使用重組DNA技術(shù)，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)(使用病毒載體，優(yōu)選將轉(zhuǎn)基因整合到細(xì)胞基因組中的載體)或轉(zhuǎn)染方法將ObR ECD或ObR-Ig融合蛋白的編碼序列導(dǎo)入細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行體外遺傳改造，其中轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染方法包括但不局限于使用質(zhì)粒、粘粒、YAC、電穿孔、脂質(zhì)體等。ObR編碼序列可以置于強(qiáng)組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的控制之下，以便獲得ObR肽或融合蛋白的表達(dá)和分泌。以系統(tǒng)施用方式施用，如使之進(jìn)入循環(huán)中、腹腔施用、脈絡(luò)膜叢或下丘腦部位施用將表達(dá)并分泌所需ObR產(chǎn)物的改造細(xì)胞導(dǎo)入患者體內(nèi)?？商鎿Q的方案是，細(xì)胞摻入基質(zhì)中并包埋在體內(nèi)，如遺傳改造的成纖維細(xì)胞可以作為皮膚移植物的一部分進(jìn)行包埋；遺傳改造的內(nèi)皮細(xì)胞可以作為血管移植物的一部分進(jìn)行包埋(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,399,349和5,460,959，其整體在此引入作為參考)。
當(dāng)要施用的細(xì)胞是非自身細(xì)胞時(shí)，使用防止發(fā)生抗導(dǎo)入細(xì)胞的宿主免疫應(yīng)答的熟知技術(shù)施用這些細(xì)胞。例如，以膠囊形式導(dǎo)入細(xì)胞，使組分和直接細(xì)胞外環(huán)境發(fā)生交換的同時(shí)，導(dǎo)入的細(xì)胞不能夠被宿主免疫系統(tǒng)所識(shí)別。
在一個(gè)可替換的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)骨病療法來(lái)降低內(nèi)源性O(shè)bR或ObR基因表達(dá)水平，如使用反義或核酶方法抑制并防止Ob或ObRmRNA轉(zhuǎn)錄物的翻譯；使用三聯(lián)螺旋方法抑制Ob或ObR基因的轉(zhuǎn)錄；或使用靶向同源重組方法滅活或“敲除”O(jiān)b或ObR基因或其內(nèi)源性啟動(dòng)子。因?yàn)镺bR基因在大腦，包括脈絡(luò)膜叢和下丘腦中表達(dá)，優(yōu)選能夠透過(guò)血腦屏障的傳送技術(shù)(參見(jiàn)PCT申請(qǐng)WO89/10134，其整體在此引入作為參考)。可替換的方案是，這里所述的反義、核酶或DNA構(gòu)建體可以直接施用到包含靶細(xì)胞的部位，如脈絡(luò)膜叢、下丘腦、脂肪組織等。
反義方法包括設(shè)計(jì)和Ob或ObR mRNA相互補(bǔ)的寡核苷酸(DNA或RNA)。反義寡核苷酸和互補(bǔ)性O(shè)b或ObR mRNA轉(zhuǎn)錄物相結(jié)合，阻止翻譯。雖然優(yōu)選絕對(duì)互補(bǔ)性，但并不是必須的。這里所述的、和RNA的一部分“互補(bǔ)”的序列指具有足夠互補(bǔ)性、能夠和RNA相雜交、形成穩(wěn)定二聯(lián)體的序列；在使用雙鏈反義核酸的情況下，檢驗(yàn)二聯(lián)體DNA中的一條鏈，或分析三聯(lián)體的形成。雜交能力依賴于互補(bǔ)程度和反義核酸的長(zhǎng)度。通常，雜交的核酸越長(zhǎng)，和RNA錯(cuò)配的堿基越多，但仍形成穩(wěn)定的二聯(lián)體(有時(shí)會(huì)形成三聯(lián)體)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過(guò)用來(lái)測(cè)定雜交復(fù)合物融解點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)確定錯(cuò)配的耐受程度。
熟練的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到可以通過(guò)設(shè)計(jì)瘦素或瘦素受體基因控制區(qū)，如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和內(nèi)含子的反義分子，以及這些基因編碼區(qū)的反義分子。這種序列在這里分別指編碼瘦素的多聚核苷酸或瘦編碼素受體的多聚核苷酸。
優(yōu)選來(lái)源于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，如先導(dǎo)序列-10和+10之間的區(qū)域。和信使的5’端互補(bǔ)的寡核苷酸通常能夠最有效地阻止翻譯，其中信使的5’端可以是到AUG起始密碼子位置并包括AUG起始密碼子的5’非翻譯序列。但是，最近研究表明，和mRNA的3’非翻譯序列互補(bǔ)的序列也能夠有效地抑制mRNA的翻譯(參見(jiàn)Wagner，1994，Nature372333-335)。和mRNA的5’非翻譯區(qū)互補(bǔ)的寡核苷酸包括AUG起始密碼子的互補(bǔ)物。和mRNA編碼區(qū)互補(bǔ)的反義寡核苷酸是翻譯的較弱抑制劑，但也可用于本發(fā)明。無(wú)論是和Ob或ObR mRNA的5’、3’還是編碼區(qū)雜交，反義核酸都應(yīng)至少長(zhǎng)為6個(gè)核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)6至約50個(gè)核苷酸。在特定的方面中，寡核苷酸是至少核苷酸，至少17個(gè)核苷酸，至少25個(gè)核苷酸或至少50個(gè)核苷酸。
不管靶序列如何，優(yōu)選首先進(jìn)行體外研究對(duì)反義寡核苷酸抑制基因表達(dá)的能力進(jìn)行定量。優(yōu)選的是，這些研究使用能夠區(qū)分反義基因抑制和寡核苷酸非特異性生物效應(yīng)的對(duì)照。還優(yōu)選的是，這些研究將靶RNA或蛋白質(zhì)的水平和內(nèi)部對(duì)照RNA或蛋白質(zhì)相比較。另外，還預(yù)想將使用反義寡核苷酸獲得的結(jié)果和使用對(duì)照寡核苷酸獲得的結(jié)果相比較。優(yōu)選的是，對(duì)照寡核苷酸長(zhǎng)度和受試寡核苷酸大致相同，寡核苷酸的核苷酸序列和反義序列不同，其中反義序列僅僅是阻止和靶序列的特異性雜交所必需的。
寡核苷酸可以是DNA或RNA或嵌合混合物或衍生物或其修飾版本，可以是單鏈的或雙鏈的。舉例來(lái)說(shuō)，可以在堿基、糖基或磷酸骨架上對(duì)寡核苷酸進(jìn)行修飾，以提高分子、雜交作用等的穩(wěn)定性。寡核苷酸可以包括其他附基，如肽(對(duì)于體內(nèi)靶向宿主細(xì)胞受體來(lái)說(shuō))或促進(jìn)跨過(guò)細(xì)胞膜(參見(jiàn)Letsinger et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.866553-6656和Lemaitre et al.，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84648-652；PCT申請(qǐng)No..WO88/09810)或血腦屏障(參見(jiàn)PCT申請(qǐng)WO89/10134)的試劑、引發(fā)雜交的切割試劑(參見(jiàn)Krol et al.，1988，BioTechniques 6958-976)或嵌入試劑(參見(jiàn)Zon，1988，Pharm.Res.5539-549)。為了這一目的，寡核苷酸可以和其他分子相偶聯(lián)，這些分子包括肽、雜交引發(fā)的交聯(lián)試劑、轉(zhuǎn)運(yùn)試劑、雜交引發(fā)的切割試劑等。
反義寡核苷酸可以包括至少一個(gè)修飾堿基，修飾堿基選自5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5(羧羥甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-胸腺嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥(niǎo)嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥(niǎo)嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥(niǎo)嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鳥(niǎo)嘌呤、5-甲基氨甲尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫-N6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(oxyacetic acid)(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp)w和2，6-二氨基嘌呤。
反義寡核苷酸可以包括至少一種修飾的糖基，選自但不局限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸包括至少一種修飾的磷酸骨架，選自硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺、磷酰胺、磷二酰胺、甲基磷酸酯、磷酸三烷基酯、formacetal或其類(lèi)似物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義核苷酸是α-氨基端基寡核苷酸。α-氨基端基寡核苷酸和互補(bǔ)RNA形成特異性的雙鏈雜合體，和通常的β-單位相反，兩條鏈彼此平行(Gautier et al.，1987，Nucl.Acids.Res.156625-6641)。寡核苷酸是2’-對(duì)甲基核糖核苷酸(Inoue et al.，1987，Nucl.Acid.Res.156131-6148)或嵌合RNA-DNA類(lèi)似物(Inoue et al.，1987，F(xiàn)EBS Lett.215327-330)。
可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的方法來(lái)合成本發(fā)明的寡核苷酸，如使用自動(dòng)化的DNA合成儀(如購(gòu)自Biosearch，Applied Biosystems等)。例如，可以通過(guò)Stein et al.，1988，Nucl.Acids Res.163206的方法來(lái)合成硫代磷酸酯的寡核苷酸。使用受控孔玻璃聚合物支持物來(lái)制備甲基化磷酸寡核苷酸(Sarin et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.857448-7451)。
當(dāng)可以使用和Ob或ObR編碼區(qū)序列互補(bǔ)的反義核苷酸時(shí)，最優(yōu)選使用和轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)相互補(bǔ)的反義核苷酸。例如，可以根據(jù)本發(fā)明使用具有以下序列的ObR編碼區(qū)反義寡核苷酸。
(a)5′-CATCTTACTTCAGAGAA-3′(SEQ ID NO1)(b)5′-CATCTTACTTCAGAGAAGTACAC-3′(SEQ ID NO2)(c)5′-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAA-3′(SEQ ID NO3)(d)5′-CATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCCTCT-3′(SEQ ID NO4)(e)5′-AATCATCTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3′(SEQ ID NO5)(f)5′-CTTACTTCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3′(SEQ ID NO6)(g)5′-TCAGAGAAGTACACCCATAATCC-3′(SEQ ID NO7)(h)5′-AAGTACACCCATAATCC-3′(SEQ ID NO8)可以在體內(nèi)將反義分子傳送到表達(dá)Ob或ObR的細(xì)胞中。已經(jīng)建立了許多方法將反義DNA或RNA傳送到細(xì)胞中；比如，可以直接將反義分子注射到組織部位，或系統(tǒng)施用靶向所需細(xì)胞的修飾反義分子(連接在特異性和靶細(xì)胞表面表達(dá)的受體或抗原相結(jié)合的肽或抗體上的反義分子)。
使細(xì)胞內(nèi)反義分子濃度足夠能抑制內(nèi)源性mRNA翻譯的優(yōu)選方法使用重組DNA構(gòu)建體，其中反義寡核苷酸位于強(qiáng)pol III或pol II啟動(dòng)子的控制之下。使用這種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染患者體內(nèi)的靶細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致足量的單鏈RNA轉(zhuǎn)錄，并和內(nèi)源性的Ob或ObR轉(zhuǎn)錄物形成互補(bǔ)堿基對(duì)，進(jìn)而抑制Ob或ObR mRNA的翻譯。例如，可以體內(nèi)導(dǎo)入載體，使之被細(xì)胞吸收，并指導(dǎo)反義RNA的轉(zhuǎn)錄。這種載體可以是游離的或染色體整合的，前提是它可以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生所需的反義RNA。可以通過(guò)本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)來(lái)構(gòu)建這種載體。載體可以是質(zhì)粒、病毒或本領(lǐng)域中已知的、能夠在哺乳動(dòng)物中復(fù)制并表達(dá)的其他載體。本領(lǐng)域中已知的、在哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人細(xì)胞中起作用的任意啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼反義RNA的序列的表達(dá)。這種啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型或組成型的。這種啟動(dòng)子包括但不局限于SV40早期啟動(dòng)子區(qū)域(Bernoist &Chambon，1981，Nature 290304-310)、Rous肉瘤病毒3’長(zhǎng)末端重復(fù)中包含的啟動(dòng)子(Yamamoto et al.，1980，Cell 22787-797)、皰疹胸苷激酶啟動(dòng)子(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.781441-1445)、金屬硫蛋白基因的調(diào)控序列(Brinster et al.，1982，Nature 29639-42)等?？梢允褂萌我忸?lèi)型的質(zhì)粒、粘粒、YAC或病毒載體來(lái)制備能夠直接導(dǎo)入組織部位，如脈絡(luò)膜叢或下丘腦的重組DNA構(gòu)建體?？商鎿Q的方案是，使用選擇性感染所需組織的病毒載體，(如對(duì)于大腦來(lái)說(shuō)，使用皰疹病毒載體)，在這種情況下通過(guò)另一種途徑施用(如系統(tǒng)性施用)。
還可使用催化切割Ob或ObR mRNA轉(zhuǎn)錄物的核酶分子來(lái)抑制Ob或ObR mRNA的翻譯和Ob或ObR的表達(dá)(參見(jiàn)PCT國(guó)際申請(qǐng)WO90/11364和Sarver et al.，1990，Science 2471222-1225)。當(dāng)使用能夠在特定識(shí)別序列部位切割mRNA的核酶來(lái)破壞Ob或ObR mRNA時(shí)，優(yōu)選使用錘頭狀核酶。錘頭狀核酶在和靶mRNA形成互補(bǔ)堿基對(duì)的旁側(cè)區(qū)部位切割mRNA。唯一的需要是靶mRNA具有下列兩個(gè)堿基的序列5’-UG-3’。錘頭狀核酶的構(gòu)建和生成是本領(lǐng)域中所熟知的，Haseloff & Gerlach，1988，Nature，334585-591對(duì)其進(jìn)行了更全面的描述。在人Ob和ObR cDNA的核苷酸序列中存在有上百個(gè)潛在的錘頭狀核酶切割位點(diǎn)(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.5,972,621)。優(yōu)選的是，對(duì)核酶進(jìn)行改造，使切割識(shí)別位點(diǎn)位于Ob或ObR mRNA 5’端附近；即增加效率，使非功能性mRNA轉(zhuǎn)錄物的細(xì)胞內(nèi)積累最小。
例如，本發(fā)明中針對(duì)ObR mRNA的錘頭狀核酶具有以下序列
(a)5′-ACAGAAUUUUUGACAAAUCAAAGCAGANNNNUCUGAGNAGUCCUUACUUCAGAGAA-3′(SEQ ID NO9)；(b)5′-GGCCCGGGCAGCCUGCCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCGCCAGACCGGCUCGUG-3′(SEQ ID NO10)；(c)5′-UGGCAUGCAAGACAAAGCAGGNNNNCCUGAGNAGUCCUUAAAUCUCCAAGGAGUAA-3′(SEQ ID NO11)；(d)5′-UAUAUGACAAAGCUGUNNNNACAGAGNAGUCCUUGUGUGGUAAAGACACG-3′(SEQ ID NO12)；(e)5′-AGCACCAAUUGAAUUGAUGGCCAAAGCGGGNNNNCCCGAGNAGUCAACCGUAACAGUAUGU-3′(SEQ ID NO13)；(f)5′-UGAAAUUGUUUCAGGCUCCAAAGCCGGNNNNCCGGAGNAGUCAAGAAGAGGACCACAUGUCACUGAUGC-3′(SEQ ID NO14)；(g)5′-GGUUUCUUCAGUGAAAUUACACAAAGCAGCNNNNGCUGAGNAGUCAGUUAGGUCACACAUC-3′(SEQ ID NO15)；(h)5′-ACCCAUUAUAACACAAAGCUGANNNNUCAGAGNAGUCAUCUGAAGGUUUCUUC-3′(SEQ ID NO16).
本發(fā)明的核酶還包括RNA內(nèi)核糖核酸酶(以后稱(chēng)為“Cech型核酶”)，如Tetrahymena thermophila中天然存在的核酶(已知稱(chēng)為IVS或L-19 IVS RNA)，該核酶已經(jīng)作有深入的介紹(Zaug et al.，1984，Science，224574-578；Zaug & Cech，1986，Science，231470-475；Zaug etal.，1986，Nature，324429-433；PCT申請(qǐng)No.WO/88/04300；Been &Cech，1986，1986，Cell，47207-216)。Cech型核酶具有八堿基對(duì)作用位點(diǎn)，該位點(diǎn)和靶RNA序列雜交，進(jìn)而切割靶RNA。本發(fā)明包括靶向Ob和ObR中存在的八堿基對(duì)活性位點(diǎn)序列的Cech型核酶。
反義方法中，核酶可以由修飾寡核苷酸(如提高穩(wěn)定性、靶向等)組成，并體內(nèi)傳送到表達(dá)Ob和ObR的細(xì)胞中。優(yōu)選的傳送方法涉及使用“編碼”核酶、位于強(qiáng)組成型pol III或pol II啟動(dòng)子控制之下的DNA構(gòu)建體，使轉(zhuǎn)染細(xì)胞能夠生成組量的核酶以破壞內(nèi)源性的Ob或ObR信使，并抑制翻譯。由于核酶和反義分子不同，它具有催化性，因此較低的細(xì)胞內(nèi)濃度就可以起效。
類(lèi)似的，使用“三聯(lián)(triple)螺旋”堿基配對(duì)方法也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)瘦素或瘦素受體的抑制。三聯(lián)螺旋配對(duì)包括雙螺旋足夠地開(kāi)放、供聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控分子結(jié)合的能力。使用三聯(lián)螺旋的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的(參見(jiàn)Helene，1991，Anticancer Drug Des.6(6)569-84；Helene，1992，Ann.N.Y.Acad.Sci.66027-36和Maher，1992，Bioassays 14(12)807-15)。
還可以使用靶向同源重組滅活或“敲除”O(jiān)b或ObR基因或其啟動(dòng)子來(lái)減少內(nèi)源性O(shè)b或ObR基因表達(dá)(通常參見(jiàn)Smithies et al.，1985，Nature 317230-234；Thomas & Capecchi，1987，Cell 51503-512和Thompson et al.，1989 Cell 5313-321，其整體在此引入作為參考)。例如，可以使用旁側(cè)帶有內(nèi)源性O(shè)b或ObR基因同源DNA的突變型、無(wú)功能的Ob或ObR(或完全非相關(guān)的DNA序列)和或不和選擇標(biāo)記和/或隱性選擇標(biāo)記一起體內(nèi)轉(zhuǎn)染表達(dá)Ob或ObR的細(xì)胞。通過(guò)靶向同源重組發(fā)生的DNA構(gòu)建體插入使Ob或ObR基因滅活。這種方法尤其使用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，在該領(lǐng)域，修飾ES(胚胎干)細(xì)胞以產(chǎn)生帶有失活ObR的動(dòng)物后代(參見(jiàn)Thomas & Capecchi 1987和Thompsonet al.1989，上文)。但是，可以將該方法加以變通，用于人類(lèi)，前提是直接施用重組DNA構(gòu)建體，或使用適當(dāng)?shù)牟《据d體將重組DNA構(gòu)建體靶向到體內(nèi)所需部位，如使用皰疹病毒載體傳送到大腦組織，如下丘腦、脈絡(luò)膜叢或脂肪組織。
可替換的方案是，將和Ob或ObR基因調(diào)控序列(啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子)互補(bǔ)的脫氧核糖核苷酸序列，使形成能夠阻止體內(nèi)靶細(xì)胞中Ob或ObR基因轉(zhuǎn)錄的三聯(lián)螺旋結(jié)構(gòu)(通常參見(jiàn)Helene，C.1991，Anticancer Drug Des.，6(6)569-84；Helene C.，er al，1992，Ann，N.Y.Accad.Sci.，66027-36和Maher，L.J.，1992，Bioassays 14(12)807-15)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用“顯性失活(dominantnegative)”方法降低Ob或ObR的活性，增加骨質(zhì)。為了這一目的，使用編碼缺陷型Ob或ObR的構(gòu)建體進(jìn)行基因治療，降低適當(dāng)靶細(xì)胞中Ob或ObR的活性。例如，將指導(dǎo)宿主細(xì)胞中缺失或突變了CD或CD一部分的ObR表達(dá)的核苷酸序列導(dǎo)入脈絡(luò)膜叢或下丘腦的細(xì)胞中(通過(guò)上述的體內(nèi)或離體基因治療方法)?？商鎿Q的方案是，使用靶向同源重組將這種缺失體或突變體導(dǎo)入到受試者下丘腦或脈絡(luò)膜叢的內(nèi)源ObR基因中。改造的細(xì)胞將表達(dá)無(wú)功能的受體(能夠和其天然配體相結(jié)合，但是不能進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的錨定受體)。存在于脈絡(luò)膜叢或下丘腦中的這種改造細(xì)胞對(duì)內(nèi)源性O(shè)b配體的反應(yīng)性降低，從而增加骨質(zhì)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)增加瘦素蛋白的降解來(lái)降低瘦素水平的方法，即通過(guò)抗體的結(jié)合來(lái)去除瘦素蛋白的方法。本發(fā)明的一個(gè)可替換實(shí)施方案是通過(guò)增加瘦素瘦素蛋白的降解來(lái)降低瘦素受體水平的方法，即通過(guò)抗體的結(jié)合來(lái)去除瘦素受體蛋白的方法。另一個(gè)實(shí)施方案是通過(guò)增加能夠與游離瘦素相結(jié)合的可溶性瘦素受體的合成來(lái)降低瘦素水平。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是施用能夠影響瘦素受體結(jié)構(gòu)、功能或二聚化特征的化合物的方法。這種化合物包括但不局限于蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物或其他分子，這些化合物在結(jié)合時(shí)改變瘦素受體結(jié)構(gòu)、功能或二聚化特征，從而使受體活性喪失。
5.8.2.恢復(fù)或增加Ob或ObR表達(dá)或活性，以減少骨質(zhì)關(guān)于增加正常Ob或ObR基因表達(dá)水平和/或基因產(chǎn)物，可以使用Ob或ObR核酸序列來(lái)治療骨病。但缺陷型Ob或ObR是疾病的誘因時(shí)，以基因置換療法進(jìn)行治療。具體地說(shuō)，將指導(dǎo)具有正常功能之Ob或ObR基因產(chǎn)物生成的一個(gè)或多個(gè)拷貝的正常Ob或ObR基因或Ob或ObR基因的一部分導(dǎo)入到患者或動(dòng)物受試者的適當(dāng)細(xì)胞中，所使用的載體包括但不局限于腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒載體，以及將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其他顆粒，如脂質(zhì)體。
由于ObR基因在大腦中表達(dá)，包括在脈絡(luò)膜叢和下丘腦中表達(dá)，因此ObR基因置換治療技術(shù)將能夠ObR基因序列傳送到患者的這些細(xì)胞類(lèi)型中。因而，傳送ObR基因序列的技術(shù)應(yīng)該易于透過(guò)血腦屏障，這些技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的(參見(jiàn)PCT申請(qǐng)No.WO89/10134，其整體在此引入作為參考)。或者可替換的是，將ObR基因序列直接施用到要表達(dá)ObR基因序列的細(xì)胞部位?？商鎿Q的是，使用靶向同源重組來(lái)糾正適當(dāng)組織中的缺陷型內(nèi)源Ob或ObR基因。在動(dòng)物中，可以使用靶向同源重組糾正ES細(xì)胞中的缺陷，產(chǎn)生具有正確特性的后代。
用來(lái)增加Ob或ObR基因表達(dá)的總體水平和/或活性的其他方法包括將適當(dāng)?shù)腛b或ObR表達(dá)細(xì)胞，優(yōu)選自身細(xì)胞以一定數(shù)目導(dǎo)入患者的一些部位，使能夠改善和骨質(zhì)增加相關(guān)的骨病癥狀。這種細(xì)胞可以是重組細(xì)胞，也可以是非重組細(xì)胞。在能夠施用來(lái)增加患者體內(nèi)Ob或ObR基因表達(dá)總體水平的細(xì)胞是正常的細(xì)胞，優(yōu)選表達(dá)ObR基因的脈絡(luò)膜叢細(xì)胞或下丘腦細(xì)胞，或表達(dá)Ob基因的脂肪細(xì)胞。細(xì)胞可以施用到大腦或脂肪組織的解剖部位，或作為組織移植物的一部分定位于身體的不同部位。這種基于細(xì)胞的基因治療技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,399,349和5,460,959)。
最后，可以使用上述分析中鑒定到的、通過(guò)活化ObR刺激或增強(qiáng)信號(hào)傳導(dǎo)的化合物來(lái)減少骨質(zhì)，這些化合物通過(guò)活化ObR級(jí)聯(lián)反應(yīng)中下游信號(hào)傳導(dǎo)蛋白、進(jìn)而繞過(guò)缺陷型ObR。制劑和施用模式取決于化合物的物理化學(xué)特性。施用方法包括能夠使化合物透過(guò)血腦屏障的已知技術(shù)。
5.8.3.控制Ob和ObR活性，治療或預(yù)防骨病的基因治療方法可以使用基因治療方法對(duì)Ob和ObR的表達(dá)進(jìn)行體內(nèi)控制(如在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯水平)，調(diào)節(jié)Ob和ObR活性，治療骨病。下面介紹了某些方法。
關(guān)于增加正常Ob或ObR基因表達(dá)水平和/或基因產(chǎn)物，可以使用Ob或ObR核酸序列來(lái)治療骨病。但缺陷型Ob或ObR是疾病的誘因時(shí)，以基因置換療法進(jìn)行治療。具體地說(shuō)，將指導(dǎo)具有正常功能之Ob或ObR基因產(chǎn)物生成的一個(gè)或多個(gè)拷貝的正常Ob或ObR基因或Ob或ObR基因的一部分導(dǎo)入到患者或動(dòng)物受試者的適當(dāng)細(xì)胞中，所使用的載體包括但不局限于腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒載體，以及將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其他顆粒，如脂質(zhì)體。
由于ObR基因在大腦中表達(dá)，包括在脈絡(luò)膜叢和下丘腦中表達(dá)，因此ObR基因置換治療技術(shù)能夠ObR基因序列傳送到患者的這些細(xì)胞類(lèi)型中。因而，傳送ObR基因序列的技術(shù)應(yīng)該易于透過(guò)血腦屏障，這些技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的(參見(jiàn)PCT申請(qǐng)No.WO89/10134，其整體在此引入作為參考)?；蛘呖商鎿Q的是，將ObR基因序列直接施用到要表達(dá)ObR基因序列的細(xì)胞部位。
可替換的是，使用靶向同源重組來(lái)糾正適當(dāng)組織，例如分別為脂肪組織和大腦組織中的缺陷型內(nèi)源Ob或ObR基因。在動(dòng)物中，可以使用靶向同源重組糾正ES細(xì)胞中的缺陷，產(chǎn)生具有正確特性的后代。
用來(lái)增加Ob或ObR基因表達(dá)的總體水平和/或活性的其他方法包括將適當(dāng)?shù)腛b或ObR表達(dá)細(xì)胞，優(yōu)選自身細(xì)胞以一定數(shù)目導(dǎo)入患者的一些部位，使能夠改善和骨質(zhì)增加相關(guān)的骨病癥狀，包括但不局限于骨質(zhì)疏松、骨硬化和骨軟骨病。這種細(xì)胞可以是重組細(xì)胞，也可以是非重組細(xì)胞。能夠施用來(lái)增加患者體內(nèi)Ob或ObR基因表達(dá)總體水平的細(xì)胞是正常的細(xì)胞，或分別表達(dá)Ob或ObR基因的脂肪細(xì)胞或下丘腦細(xì)胞。細(xì)胞可以施用到大腦或脂肪組織的解剖部位，或作為組織移植物的一部分定位于身體的不同部位。這種基于細(xì)胞的基因治療技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是熟知的，參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利Nos.5,399,349和5,460,959。
5.8.4.調(diào)節(jié)骨的聯(lián)合療法本發(fā)明的一個(gè)方面是治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松的方法，該方法包括施用β腎上腺素能拮抗劑，包括但不局限于β1、β2和β3拮抗劑。該方面的一個(gè)具體實(shí)施方案包括但不局限于進(jìn)一步將瘦素拮抗劑和β腎上腺素能拮抗劑聯(lián)合施用。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，存在治療和預(yù)防骨質(zhì)疏松或骨硬化的方法，該方法包括施用β腎上腺素能拮抗劑，包括但不局限于β1、β2和β3拮抗劑。一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案包括但不局限于進(jìn)一步將瘦素拮抗劑和β腎上腺素能拮抗劑聯(lián)合施用。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及調(diào)節(jié)瘦素對(duì)骨的效應(yīng)的方法，該方法包括施用能夠改變交感神經(jīng)緊張性的、治療有效量的藥物組合物。藥物組合物的具體實(shí)施方案包括但不局限于瘦素拮抗劑、瘦素激動(dòng)劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑和其組合。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及治療或預(yù)防骨病的方法，該方法包括施用能夠通過(guò)改變交感神經(jīng)緊張性來(lái)調(diào)節(jié)瘦素效應(yīng)的、治療有效量的藥物組合物。藥物組合物的具體實(shí)施方案包括但不局限于瘦素拮抗劑、瘦素激動(dòng)劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑、交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑和其組合。本發(fā)明包括聯(lián)合使用5.4、5.5、5.6和5.7節(jié)中所述的化合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，聯(lián)合使用化合物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。這里所用的術(shù)語(yǔ)“協(xié)同”指聯(lián)合使用比使用兩種或多種單一試劑的疊加效應(yīng)更為有效。根據(jù)如上文6.2節(jié)中所述進(jìn)行的X射線和組織形態(tài)分析結(jié)果，確定調(diào)節(jié)交感神經(jīng)緊張性的化合物，包括但不局限于β拮抗劑和另一種治療試劑之間的協(xié)同相互作用?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域已知的任意方法對(duì)這些分析結(jié)果進(jìn)行分析，這些方法包括Chou和Talalay的聯(lián)合方法，使用微機(jī)軟件進(jìn)行劑量-效應(yīng)分析，以獲得結(jié)合指數(shù)(Chou and Talalay，1984，Adv.Enzyme Regul.2227-55和Chou and Chou，1987，softwareand manual，Elsevier Biosoft，Cambridge，UK，pp.19-44)。結(jié)合指數(shù)值＜1說(shuō)明協(xié)同，值＞1說(shuō)明拮抗，值等于1說(shuō)明疊加效應(yīng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，依次施用5.4、5.5、5.6和5.7節(jié)中所述的任意化合物組合。舉例來(lái)說(shuō)，但不具有限制性，瘦素拮抗劑和腎上腺素能拮抗劑聯(lián)合施用，其中先施用瘦素拮抗劑，隨后施用腎上腺素能拮抗劑，或相反。類(lèi)似的，舉例來(lái)說(shuō)，但不具有限制性，瘦素激動(dòng)劑和腎上腺素能激動(dòng)劑聯(lián)合施用，其中先施用瘦素激動(dòng)劑，隨后施用腎上腺素能激動(dòng)劑，或相反。在另一個(gè)不具有限制性的例子中，DBH拮抗劑可以和瘦素拮抗劑和/或腎上腺素能拮抗劑聯(lián)合施用?；衔锏囊来渭尤肟梢陨婕皟蓚€(gè)或多個(gè)化合物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定獲得所需效應(yīng)的必要化合物順序。
5.9治療骨病的藥用制劑和方法配制本發(fā)明的化合物，通過(guò)使活性成分和哺乳動(dòng)物體內(nèi)的試劑作用部位相接觸的任意手段施用，從而抑制各種骨病狀態(tài)。通過(guò)任意傳統(tǒng)的用藥手段施用這些化合物，這些化合物作為單獨(dú)的治療性活性成分施用，或治療性活性成分聯(lián)用。它們可以單獨(dú)施用，但是通常和藥用載體一起施用，根據(jù)用藥途徑和標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)經(jīng)驗(yàn)選擇藥用載體。
用藥劑量應(yīng)是治療有效量的化合物，使能夠改善骨病的癥狀，該劑量取決于多種因素，如特定活性成分的藥代動(dòng)力學(xué)特征以及用藥模式和途徑；年齡、性別、健康狀況和接受者體重；癥狀的性質(zhì)和程度；目前治療種類(lèi)、治療頻率和所需效果。
5.9.1.確定劑量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法來(lái)測(cè)定這些化合物在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中的毒性和療效，如測(cè)定LD50(50％致死劑量)和ED50(50％有效計(jì)量)。毒性效應(yīng)和治療效應(yīng)之間的劑量比值為治療指數(shù)，表示為L(zhǎng)D50/ED50的比值。優(yōu)選具有較大治療指數(shù)的化合物。當(dāng)使用具有毒副作用的化合物時(shí)，應(yīng)慎重設(shè)計(jì)將化合物靶向受影響組織部位的傳送系統(tǒng)，使對(duì)未感染細(xì)胞的潛在損傷降至最低，從而減輕副作用。
可以使用從細(xì)胞培養(yǎng)物和動(dòng)物研究中獲得的數(shù)據(jù)來(lái)配制用于人類(lèi)的劑量范圍。這些化合物的劑量?jī)?yōu)選位于幾乎沒(méi)有或沒(méi)有毒性的、包括ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可以在該范圍內(nèi)變動(dòng)，這種變動(dòng)依賴于所用的劑量形式和用藥途徑。對(duì)于本發(fā)明方法中所用到的任意化合物來(lái)說(shuō)，可以從細(xì)胞培養(yǎng)物分析初步估算治療有效劑量。在動(dòng)物模型中配制一個(gè)劑量，獲得包括細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)得的IC50(對(duì)癥狀實(shí)現(xiàn)半數(shù)最大抑制的受試化合物濃度)在內(nèi)的循環(huán)血漿濃度范圍。該信息可用于更準(zhǔn)確地測(cè)定用于人類(lèi)的劑量。可以通過(guò)高效液相層析測(cè)定血漿中的化合物水平。
對(duì)于抗體來(lái)說(shuō)也可以使用特定劑量。典型地說(shuō)，優(yōu)選的劑量為0.1mg/kg體重至100mg/kg體重(通常為10mg/kg至20mg/kg)，如果抗體在大腦中起作用，則50mg/kg至100mg/kg的劑量通常是適當(dāng)?shù)?。如果抗體是部分人類(lèi)抗體或全部人類(lèi)抗體，則它在人體中的半衰期比其他抗體長(zhǎng)。相應(yīng)地，較低劑量的部分人類(lèi)抗體或全部人類(lèi)抗體經(jīng)常是有可能的?？梢酝ㄟ^(guò)其他的修飾來(lái)進(jìn)一步穩(wěn)定抗體。舉例來(lái)說(shuō)，通過(guò)脂化來(lái)穩(wěn)定抗體，增加吸收和組織通透性(如進(jìn)入大腦)。Cruikshanket al.，1997，J.獲得性免疫綜合征和人類(lèi)病毒學(xué)14193中介紹了脂化抗體的一種方法。
蛋白質(zhì)或多肽的治療有效量(有效劑量)在約0.001至30mg/kg體重的范圍內(nèi)，優(yōu)選約0.01至25mg/kg體重，較優(yōu)選約0.1至20mg/kg體重，更優(yōu)選約1至10mg/kg、2至9mg/kg、3至8mg/kg、4至7mg/kg或5至6mg/kg體重。
此外，使用治療有效量的蛋白質(zhì)、多肽或抗體的治療包括一次治療，優(yōu)選包括一些列治療。在優(yōu)選的實(shí)施例中，受試者接受約0.1至20mg/kg體重之間劑量范圍的抗體、蛋白質(zhì)或多肽，每周一次，持續(xù)1至10周，優(yōu)選2至8周，較優(yōu)選約3至7周，更優(yōu)選約4、5或6周。
本發(fā)明進(jìn)一步包括調(diào)節(jié)表達(dá)或活性的試劑。該試劑可以是一種小分子。例如，這種小分子包括但不局限于肽、肽類(lèi)似物、氨基酸、氨基酸類(lèi)似物、多聚核苷酸、多聚核苷酸類(lèi)似物、核苷酸、核苷酸類(lèi)似物、分子量小于約10,000克/摩爾的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子(包括立體有機(jī)化合物和有機(jī)金屬化合物)、分子量小于約5,000克/摩爾的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子、分子量小于約1,000克/摩爾的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子、分子量小于約500克/摩爾的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子和這些化合物的鹽、酯及其他藥學(xué)上可接受的形式。
人們認(rèn)為小分子試劑的適當(dāng)劑量取決于因子的數(shù)目，這些因子是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，如醫(yī)生所已知的。舉例來(lái)說(shuō)，小分子的劑量可以變動(dòng)，這種變動(dòng)依賴于受試者或受處理樣品的相同性、大小和情況，進(jìn)一步依賴于組合物的施用途徑、醫(yī)生期望小分子對(duì)本發(fā)明中核酸或多肽應(yīng)具有的作用。劑量包括每千克受試者或樣品重量施用毫克或微克量的小分子(如約1μg/kg至約500mg/kg，約100μg/kg至約5mg/kg，或約1μg/kg至約50μg/kg)。
5.9.2.制劑和用途使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體或賦形劑，以傳統(tǒng)方式配制根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物。
因此，可以化合物和其生理學(xué)上可接受的鹽及溶合物配制成一定的制劑，使之適于吸入或吹入(通過(guò)嘴或鼻)給藥或口服給藥、經(jīng)頰給藥、非腸道給藥或直腸給藥。
對(duì)于口服來(lái)說(shuō)，藥物組合物可以采用片劑或膠囊形式，使用藥學(xué)上可接受的賦形劑通過(guò)傳統(tǒng)的手段制備，這些賦形劑包括結(jié)合試劑(如預(yù)先凝膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯酮或羥丙基甲基纖維素)；填充物(如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(如土豆淀粉或羥乙酸鈉淀粉)；或潮濕劑(如十二烷基肌酸鈉)。通過(guò)本領(lǐng)域中所熟知的方法給片劑包膜。對(duì)于口服的液體制劑可以采用溶液、糖漿或懸浮劑，或以干燥產(chǎn)品形式提供，使用前用水或其他的適當(dāng)賦形劑重構(gòu)。使用藥學(xué)上可接受的添加劑通過(guò)傳統(tǒng)方法制備這種液體制劑，這些添加劑包括懸浮試劑(如山梨糖醇糖漿、纖維素衍生素或氫化的食用脂肪)；乳化劑(如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水賦形劑(如杏仁油、油狀酯、乙烯醇或分級(jí)分離的植物油)；和防腐劑(如對(duì)-羥苯甲酸甲酯或?qū)?羥苯甲酸丙酯或山梨酸)；制劑還可以適當(dāng)?shù)桨彌_的鹽、加味劑、色劑或甜味劑。
口服制劑可以適當(dāng)?shù)嘏渲瞥墒芸刂频蒯尫呕钚曰衔锏闹苿?br> 對(duì)于經(jīng)頰給藥來(lái)說(shuō)，組合物可以是通過(guò)傳統(tǒng)方式配制成的片劑或錠劑。
對(duì)于吸入給藥來(lái)說(shuō)，方便地將根據(jù)本發(fā)明使用的化合物通過(guò)加壓包裝或噴霧器以氣霧方式施用。使用加壓氣體的情況下，可以通過(guò)提供一個(gè)閥門(mén)來(lái)確定劑量單位，以便按規(guī)定量施用。吸入器或吸入器具中膠囊和明膠軟片的制劑中包含化合物的粉末混合物和適當(dāng)?shù)姆勰┲鲃缛樘腔虻矸邸?br> 可以將化合物配制成通過(guò)注射，如通過(guò)彈丸式注射或連續(xù)輸注進(jìn)行非腸道給藥的制劑。注射用制劑制劑以單劑量形式和添加的防腐劑一起存在于安瓶或多劑量容器中。組合物可以采用油或水賦形劑中的懸浮液、溶液或乳化液，可以包含諸如懸浮、穩(wěn)定和/或分散試劑之類(lèi)的制劑試劑?？商鎿Q的方案是，活性成分以粉末形式提供，使用前用適當(dāng)?shù)馁x形劑，如無(wú)菌、無(wú)致熱源的水進(jìn)行重構(gòu)。通常來(lái)說(shuō)，水、適當(dāng)?shù)挠?、鹽、葡糖糖(葡萄糖)水溶液和相關(guān)糖溶液和二元醇，如丙二醇或聚乙二醇是非腸道溶液的適當(dāng)載體。非腸道給藥的溶液優(yōu)選包含活性成分的水溶性鹽、適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑，如果需要的話還包括緩沖物質(zhì)?？寡趸瘎?，如硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或山梨酸。還可以使用檸檬酸和其鹽以及乙二胺四乙酸鈉(EDTA)。另外，非腸道溶液還包括防腐劑，如氯卡銨、對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯和氯丁醇。適當(dāng)?shù)乃帉W(xué)載體在《Remington制藥學(xué)》中作了介紹，該書(shū)是本領(lǐng)域的一本標(biāo)準(zhǔn)參考書(shū)。
化合物還可以配制成直腸組合物，如包含可可脂或其他甘油脂之類(lèi)傳統(tǒng)栓劑主劑的栓劑或滯留灌腸劑。
除了前面所述的制劑制劑外，化合物還可以配制成貯存庫(kù)制劑。通過(guò)包埋(例如皮下或肌肉包埋)或肌肉注射使用這種長(zhǎng)效的制劑制劑。因此，舉例來(lái)說(shuō)，可以使用適當(dāng)?shù)亩嗑畚锘蚴杷镔|(zhì)(例如存在于可接受油中的乳劑)或離子交換樹(shù)脂，或者以少量可溶性衍生物的形式，例如少量可溶性鹽的形式來(lái)配制化合物。
另外，可以采用標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法控制作用持續(xù)時(shí)間。這些方法是本領(lǐng)域已知的，包括控釋制劑，可以包括適當(dāng)?shù)拇蠓肿?，例如多聚物、聚酯、多聚氨基酸、聚乙烯、吡咯烷酮、乙酸乙烯酯、甲基纖維素、羧甲基纖維素或硫酸魚(yú)精蛋白?？梢哉{(diào)整大分子的濃度和摻入方法，從而達(dá)到控制釋放的目的。另外，試劑還可以摻入到多聚物質(zhì)顆粒中，這些多聚物質(zhì)包括聚酯、多聚氨基酸、水化凝膠、聚(乳酸)或乙酸乙烯酯共聚物。除了摻入外，這些試劑還可用于誘捕微膠囊中的化合物。
如果需要，組合物可以裝在包含一個(gè)或多個(gè)單位劑量的包裝袋或分藥器中，劑量制劑包括活性成分。舉例來(lái)說(shuō)，包裝可以是金屬或塑料箔，如發(fā)泡(blister)藥袋。包裝袋或分藥器可以附帶有使用說(shuō)明。
下面說(shuō)明了如何使用藥劑形式來(lái)施用本發(fā)明的化合物膠囊往標(biāo)準(zhǔn)的兩半硬明膠膠囊中裝入所需量的粉末狀活性成分、175mg乳糖、24mg滑石粉和6mg硬脂酸鎂，制備膠囊。
軟明膠膠囊制備活性成分和大豆油的混合物，通過(guò)正置換泵注射到明膠中形成包含所需量的活性成分的軟明膠膠囊。洗滌膠囊，并加以干燥。
片劑通過(guò)傳統(tǒng)方法制備片劑，使劑量單位是所需量的活性成分。0.2mg二氧化硅膠體、5mg硬脂酸鎂、275mg微晶纖維素、11mg玉米淀粉和98.8mg乳糖。適當(dāng)?shù)陌驴梢栽黾涌煽谛曰蜓舆t吸收。
針劑將1.5％重量的活性成分和10％體積的聚乙二醇混合在水中，制備適于注射給藥的非腸道組合物。用氯化鈉使溶液等滲，并除菌。
懸浮劑制備口服的懸浮水溶液，使每mL包含100mg細(xì)小活性成分、200mg羧甲基纖維素鈉、5mg苯甲酸鈉、1.0g山梨糖醇U.S.P.和0.025mL香草醛。
基因治療給藥適當(dāng)情況下，通過(guò)常用方式將基因治療載體配制成固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)制劑，包括片劑、膠囊、粉末、顆粒、藥膏、溶液、栓劑、針劑、吸入劑、氣霧劑中，使適用于相應(yīng)的給藥途徑。可以使用本領(lǐng)域中已知的手段使組合物到達(dá)靶器官才釋放并得以吸收，或組合物能夠定時(shí)釋放。應(yīng)使用不導(dǎo)致本發(fā)明組合物失效的藥學(xué)上可接受形式。在藥劑中，組合物可以單獨(dú)使用，或適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合，以及聯(lián)合其他的藥用活性化合物使用。
相應(yīng)地，本發(fā)明的藥用組分可以通過(guò)多種途徑傳送到動(dòng)物體的多個(gè)部位，以產(chǎn)生特定的效應(yīng)(參見(jiàn)Rosenfeld et al.，1991，上文；Rosenfeld et al.，1991，Clin.Res.，39(2)，311A；Jaffe et al.，上文和Berkner，supra)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到雖然可以采用多種形式給藥，但一種特定的給藥途徑將比其他的途徑產(chǎn)生更直接、更有效的反應(yīng)。通過(guò)將制劑制劑應(yīng)用或滴注到體腔中、吸入或吹入氣霧劑或非腸道導(dǎo)入，包括肌肉給藥、靜脈給藥、腹腔給藥、皮下給藥、真皮內(nèi)給藥以及局部給藥，實(shí)現(xiàn)局部或系統(tǒng)傳送。
本發(fā)明的組合物可以以單位劑量形式提供，其中每個(gè)劑量單位，如一茶匙、一個(gè)藥片、一份溶液或一個(gè)栓劑包含包含定量的組合物，該組合物單獨(dú)使用或適當(dāng)?shù)睾推渌钚栽噭┞?lián)用。這里所用的術(shù)語(yǔ)“單位劑量形式”指適于用作人和動(dòng)物受試者單位劑量的物質(zhì)上相獨(dú)立的單位，每個(gè)單位包含定量的組合物，該組合物單獨(dú)使用或和其他活性試劑聯(lián)用，其含量足以產(chǎn)生所需的效應(yīng)，適當(dāng)情況下，結(jié)合藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑使用。本發(fā)明中單位劑量形式的規(guī)格取決于要達(dá)到的特定效應(yīng)，以及特定宿主中與藥物組合物相關(guān)的特定藥代動(dòng)力學(xué)。
本發(fā)明的組合物還配制成持續(xù)或定時(shí)釋放的制劑制劑?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員所熟知的持續(xù)釋放手段或傳送裝置來(lái)制備這種持續(xù)或定時(shí)釋放的制劑制劑，這些手段和傳送裝置在美國(guó)專(zhuān)利Nos3,845,770、3,916,899、3,536,809、3,598,123、4,008,719、4,710,384、5,674,533、5,059,595、5,591,767、5,120,548、5,073,543、5,639,476、5,354,556和5,733,566中作有介紹，其內(nèi)容在此引入作為參考。本發(fā)明的藥物組合物還可用于提供一個(gè)或多個(gè)成分的緩慢或持續(xù)釋放，例如使用水合丙甲基纖維素、其他聚合物基質(zhì)、凝膠、通透膜、滲透系統(tǒng)、多層包衣、微粒、脂質(zhì)體、微球等或其組合提供所需的各種比例的釋放?？梢赃x擇本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所已知的適當(dāng)持續(xù)釋放制劑制劑，包括這里所述的制劑制劑配合本發(fā)明的藥物組合物使用。因此，適于口服的單一的單位劑量形式包括但不局限于片劑、膠囊、柔軟膠囊、薄膜衣片、粉末等，改進(jìn)為持續(xù)釋放的片劑、膠囊、柔軟膠囊、薄膜衣片、粉末等也屬于本發(fā)明的范圍。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了將基因轉(zhuǎn)移到宿主體內(nèi)的方法，該方法包括使用任意的上述給藥途徑和本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員已知的、適于特定應(yīng)用的其他給藥途徑，施用本發(fā)明的載體，優(yōu)選將本發(fā)明的載體作為組合物的一部分。組合物的“有效量”是在宿主體內(nèi)能夠產(chǎn)生所需效應(yīng)的量，該效應(yīng)可以使用本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員已知的幾個(gè)端點(diǎn)加以監(jiān)測(cè)?？梢愿鶕?jù)治療效應(yīng)(如改善和待治療的特定疾病相關(guān)的一些癥狀)或進(jìn)一步通過(guò)宿主體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移或基因表達(dá)的證據(jù)(如使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)合測(cè)序、Northern雜交或Southern雜交或轉(zhuǎn)錄分析來(lái)檢測(cè)宿主中的核酸，或使用免疫印跡分析、抗體介導(dǎo)的檢測(cè)、mRNA或蛋白質(zhì)半衰期研究或特化的分析來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)移的核酸所編碼的蛋白質(zhì)或多肽，或由于轉(zhuǎn)移所導(dǎo)致的對(duì)水平和功能的影響)來(lái)監(jiān)測(cè)本發(fā)明中載體向宿主細(xì)胞中的有效基因轉(zhuǎn)移。
這里所述的這些方法并沒(méi)有全部列出，普通的技術(shù)人員還能夠使用適于特定應(yīng)用的其他方法。另外，通過(guò)和已知具有所需效應(yīng)的化合物相類(lèi)比，推測(cè)組合物的有效量。
另外，確切劑量和方案的變動(dòng)依賴于組合物是否和其他藥物組合物聯(lián)合施用，或依賴于個(gè)體之間藥代動(dòng)力學(xué)、藥物儲(chǔ)存和代謝的差異。類(lèi)似的，體外應(yīng)用中量的變動(dòng)依賴于所用的特定細(xì)胞系(如根據(jù)細(xì)胞表面存在的腺病毒受體的數(shù)目，或用于基因轉(zhuǎn)移的特定載體在細(xì)胞系中復(fù)制的能力)。另外，每個(gè)細(xì)胞中加入的載體量隨插入載體中的治療性基因的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性，以及序列的性質(zhì)而變動(dòng)，它尤其是需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定的一個(gè)參數(shù)，由于這些因素不是本發(fā)明方法所固有的，可以加以改變(例如，和合成相關(guān)的費(fèi)用)。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以根據(jù)特定情況的迫切需要來(lái)簡(jiǎn)單地進(jìn)行必要的調(diào)整。
下面的實(shí)施例是例舉性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍作任何限制。
6.實(shí)施例瘦素和骨質(zhì)之間的關(guān)系6.1.動(dòng)物的產(chǎn)生、表征以及治療繁殖的小鼠和突變的小鼠(C57BL/6J Lepob、C57BL/6J Leprdb、C57BL/6J Ay/a)購(gòu)自Jackson實(shí)驗(yàn)室。以前曾經(jīng)報(bào)道了A-ZIP/F-I轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生(Moitra et al.，1998，Genes Dev 12，3168-3181)。根據(jù)已經(jīng)建立的方案進(jìn)行基因型分析(Chua et al.，1997，Genomics 45，264-270；Moitra et al.，1998，Genes Dev 12，3168-3181；和Namae et al.，1998，Lab Animal Sci 48，103-104)。動(dòng)物喂以常規(guī)的飲食(Purina#5001)或指明情況下的高脂/高糖飲食(Bio-serv #3282)。骨樣本根據(jù)報(bào)道進(jìn)行加工(Ducy et al.，1999，Genes Dev 13，1025-1036)。
6.2.ob/ob和db/db小鼠中骨質(zhì)表型的表現(xiàn)性腺功能減退誘導(dǎo)破骨細(xì)胞數(shù)目增加和導(dǎo)致低骨質(zhì)表型的骨吸收增加(Riggs&Melton，1986，N Engl J Med 314，1676-1678)。因此，下丘腦源性性腺功能減退的ob/ob小鼠比野生型同窩小鼠具有較低的骨質(zhì)(Ahima et al.，1996.，Nature 382，250-252；Cheheb et al.，1996，NatGenet 12，318-320；Ahima et al.，1997，J Clin Invest 99，391-395)。為了確定ob/ob小鼠的肥胖是否影響其預(yù)期的低骨質(zhì)表型，使用Faxitron(Phillips)進(jìn)行6月齡野生型和ob/ob小鼠脊椎骨和長(zhǎng)骨的X射線分析。令人奇怪的是，ob/ob小鼠的骨比野生型同窩小鼠更為致密(圖1A)，說(shuō)明其具有更高量的礦物化骨基質(zhì)。考慮到用X射線定量骨質(zhì)異常的低靈敏性，骨密度的增加表示為骨構(gòu)造的主要變化(即影響大于30％骨基質(zhì))。
對(duì)未脫鈣的切片用von Kossa試劑染色進(jìn)行組織學(xué)分析。3月齡和6月齡小鼠中，ob/ob小鼠骨和野生型骨相比存在有更致密的骨小梁(圖1B)。皮質(zhì)骨未受影響。使用骨測(cè)定分析系統(tǒng)(骨測(cè)定儀，Atlanta)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)組織形態(tài)測(cè)定進(jìn)行定量(Parfitt et al.，1987，J Bone Min Res 2，595-610)。使用學(xué)生檢驗(yàn)評(píng)價(jià)組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(n＝4至6)。實(shí)驗(yàn)表明ob/ob小鼠和野生型同窩小鼠相比，長(zhǎng)骨和脊椎骨中骨小梁體積增加了近2倍(圖1C)。在兩種性別中均觀察到了該表型。通過(guò)將6月齡ob/ob小鼠、野生型小鼠和卵巢切除了4個(gè)月、模擬ob/ob小鼠性腺功能減退狀態(tài)的野生型小鼠(wild-type-ovx)長(zhǎng)骨的生物機(jī)械特性進(jìn)行比較，分析了這種骨質(zhì)增加所導(dǎo)致的功能性結(jié)果。通過(guò)在servo-hydrolic測(cè)試儀(Zwich GmbH & Co.)上、使用10mm/min的恒定置換速度進(jìn)行三點(diǎn)彎曲來(lái)檢驗(yàn)股骨的分析方法測(cè)定作為骨強(qiáng)度的檢測(cè)指標(biāo)之一的最大負(fù)荷。野生型小鼠和ob/ob小鼠骨的最大負(fù)荷沒(méi)有區(qū)別，但是顯著比wild-type-ovx小鼠骨的最大負(fù)荷高(圖1D)。該結(jié)果說(shuō)明瘦素缺陷對(duì)于骨的生物機(jī)械特征是有益的。還分析了瘦素受體發(fā)生了滅活突變的db/db小鼠骨(Tartagliaet al.，1995，Cell 83，1263-1271)。和ob/ob小鼠類(lèi)似，db/db小鼠肥胖且性腺功能減退。和ob/ob小鼠的觀察結(jié)果類(lèi)似，長(zhǎng)骨和脊椎骨中的骨小梁數(shù)目增加(圖1E)，使骨體積和野生型小鼠骨體積相比增加3倍(圖1F)。后一結(jié)果從遺傳上說(shuō)明了瘦素信號(hào)通過(guò)其已知的受體影響骨質(zhì)。
6.3.ob/ob小鼠和db/db小鼠的高骨質(zhì)表型是缺失瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的次級(jí)效應(yīng)，而非肥胖的次級(jí)效應(yīng)ob/ob小鼠和db/db小鼠的高骨質(zhì)表型可以是這些小鼠缺失瘦素信號(hào)傳導(dǎo)或肥胖的次級(jí)效應(yīng)。為了區(qū)分這兩種可能性，如實(shí)施例6.2所述分析了額外的幾組突變型小鼠的高骨質(zhì)表型。首先，給ob/ob小鼠食用能夠推遲肥胖發(fā)生的低脂飲食，它們?cè)?月齡時(shí)具有正常的體重。但是，該階段小鼠已經(jīng)具有高骨質(zhì)表型(圖2A)。其次，分析了不肥胖的雜合型瘦素缺陷小鼠(ob/+)。這些動(dòng)物也具有高骨質(zhì)表型(圖2B)。其三，觀察了最初和瘦素信號(hào)傳導(dǎo)不相關(guān)的其他肥胖小鼠模型。另一個(gè)遺傳性肥胖模型，Agouti yellow(Ay/a)小鼠(Herbergand Coleman，1977，metabolism 26，59-99)和食用高脂飲食的野生型小鼠一樣具有正常的骨質(zhì)(圖2C和2D)。
因此，發(fā)生肥胖之前的ob/ob小鼠和不發(fā)生的ob/+小鼠中高骨質(zhì)表型的存在，以及瘦素非相關(guān)肥胖模型中高骨質(zhì)表型的不存在說(shuō)明是瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的缺失，而非肥胖導(dǎo)致了高骨質(zhì)表型。
6.4.ob/ob和db/db小鼠中成骨細(xì)胞功能增加骨質(zhì)的增加可能緣于成骨細(xì)胞骨形成增加、破骨細(xì)胞骨吸收降低或二者兼而有之。為了研究成骨細(xì)胞的體內(nèi)功能，如前所述用新骨形成標(biāo)記物鈣黃綠素雙標(biāo)記(圖3A)后對(duì)骨形成速度進(jìn)行定量(Ducy etal.，1999，Genes Dev 131025-1036)。以8天的間隔給動(dòng)物注射鈣黃綠素兩次，兩天后將動(dòng)物處死。和野生型同窩小鼠的骨形成速度相比，3月齡和6月齡ob/ob小鼠骨形成速度分別增加了70％和60％(圖3B)。該結(jié)果表明ob/ob小鼠的高骨質(zhì)表型至少部分緣于骨形成活性的增加。明顯的，考慮到ob/ob小鼠中骨形成速度大幅度增加，成骨細(xì)胞的表面和成骨細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有增加，說(shuō)明瘦素缺陷影響成骨細(xì)胞的功能，而不影響出生后的分化(圖3C)。類(lèi)似的，對(duì)db/db小鼠進(jìn)行鈣黃綠素標(biāo)記表明即使成骨細(xì)胞數(shù)目正常，長(zhǎng)骨和脊椎骨中骨形成速度也是增加的(圖3D和3E)。性腺功能減退條件下，兩個(gè)突變型小鼠株系中的破骨細(xì)胞都增加，說(shuō)明雖然骨吸收增加，但也可以ob/ob小鼠和db/db小鼠的高骨質(zhì)表型(圖3F)。
使用同樣的對(duì)照組動(dòng)物如上所述測(cè)定了瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的缺失對(duì)于破骨細(xì)胞功能的特異效應(yīng)。食用低脂飲食的1月齡ob/ob動(dòng)物和雜合瘦素缺陷型小鼠都是瘦的，其骨形成速度也顯著增加(圖3G)。相比之下，兩個(gè)瘦素非相關(guān)的肥胖模型Ay/a突變型小鼠和食用高脂飲食的野生型小鼠具有正常的骨形成參數(shù)(圖3H)。
6.5.ob/ob小鼠中破骨細(xì)胞功能的分析高骨質(zhì)表型和性腺功能減退的共存如此例外，因此提出假設(shè)這些小鼠中的骨吸收可能是有缺陷的。ob/ob小鼠中，作為骨吸收的生化標(biāo)記物之一的脫氧吡咯烷酮交聯(lián)物(Dpd)(Eyre et al.，1988，Biochem252，494-500)的尿排除增加對(duì)質(zhì)疑了該假設(shè)(野生型10.5±2.5nMDpd/mM肌酸；ob/ob24.0b±4.0nM Dpd/mM肌酸)。使用Pyrilinks-D免疫分析試劑盒(Metra Biosystem)測(cè)定晨尿中的脫氧吡咯烷酮交聯(lián)物。使用肌酸的值對(duì)各樣片進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(肌酸試劑盒，MetraBiosystem)。分別使用第三代雌二醇試劑盒(Diagnostic kit，MetraBiosystem)和小鼠瘦素RIA試劑盒(Linco)，通過(guò)放免法對(duì)17β-雌二醇和瘦素的循環(huán)濃度進(jìn)行定量。雌二醇是雌激素類(lèi)似物，還是選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERM)。將雌激素類(lèi)似物和Ob或ObR抑制劑同時(shí)施用會(huì)進(jìn)一步增加骨質(zhì)表型。
進(jìn)而，為了更徹底地說(shuō)明這一點(diǎn)，研究了ob/ob小鼠的性腺功能減退。正常情況下，性腺功能減退使破骨細(xì)胞數(shù)目增加，骨吸收活性增加。因此，如果ob/ob小鼠的破骨細(xì)胞是有功能的，糾正這些小鼠的性腺功能減退應(yīng)該能通過(guò)減少破骨細(xì)胞數(shù)目來(lái)降低其骨吸收速度，從而進(jìn)一步增加骨質(zhì)。另一方面，如果ob/ob小鼠的破骨細(xì)胞不能正確發(fā)揮功能，則糾正它們的性腺功能減退不會(huì)影響其高骨質(zhì)表型的嚴(yán)重程度。為了確定這兩個(gè)可能性哪個(gè)是正確的，將17β-雌二醇或安慰劑小丸(Innovative Research of America)皮下植入2月齡雌性ob/ob小鼠中，使血清濃度為250pg/mL。3個(gè)月的處理期后對(duì)這些動(dòng)物進(jìn)行分析。
與預(yù)期結(jié)果相同，通過(guò)其子宮特征和血液中雌二醇(圖4A)水平判斷雌二醇處理糾正了它們的性腺功能減退(圖4C)。和安慰劑處理的ob/ob小鼠相比，雌二醇還進(jìn)一步增加了這些小鼠的高骨質(zhì)表型，因此消除了ob/ob小鼠中作為高骨質(zhì)表型原由的骨吸收缺陷(圖4B)。處理結(jié)束時(shí)，雌二醇處理的ob/ob小鼠和雌二醇處理的野生型小鼠相比骨體積增加了50％，和未處理的野生型小鼠相比骨體積增加了3倍。用睪酮植入物處理的雄性ob/ob小鼠也獲得了類(lèi)似的結(jié)果。最后，在使用來(lái)源于野生型小鼠、ob/ob小鼠或db/db小鼠的造血遠(yuǎn)祖細(xì)胞和已知能誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化成功能性破骨細(xì)胞的生長(zhǎng)因子進(jìn)行的分析中，體外研究了ob/ob小鼠和db/db小鼠的破骨細(xì)胞功能。根據(jù)以前報(bào)道的方案體外產(chǎn)生小鼠破骨細(xì)胞(Simonet et al.，1997，Cell 89，309-319；Quinn et al.，1998，Endocrinology 139，4424-4427)。將wt、ob/ob和db/db小鼠的骨髓細(xì)胞以106細(xì)胞/孔的起始密度培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板或牙質(zhì)片上，培養(yǎng)基為包含10％FBS(Hiclone)、小鼠M-CSF40ng/mL(Sigma)、RANKL/ODF 25ng/mL(Peprotech)、10-8M地塞米松(Sigma)和10-81，25-二羥維生素D3的α-MEM(Sigma)。隔天更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)6天后，用3.7％的甲醛固定細(xì)胞。對(duì)塑料板上所形成的破骨細(xì)胞進(jìn)行酒石酸抗酸性磷酸酶染色。使用次氯酸鈉溶液處理以去除牙質(zhì)片上的細(xì)胞。用甲苯胺藍(lán)對(duì)牙質(zhì)片進(jìn)行染色，觀察吸收率。
如圖4E所示，野生型、ob/ob和db/db造血遠(yuǎn)祖細(xì)胞具有分化成能夠吸收基質(zhì)的破骨細(xì)胞的同等能力。
因此，這些實(shí)驗(yàn)表明ob/ob和db/db小鼠的破骨細(xì)胞沒(méi)有可檢測(cè)的功能缺陷，這些突變株系高骨質(zhì)表型的形成只能是由于瘦素信號(hào)傳導(dǎo)缺失所導(dǎo)致的骨形成增加。
5.5.成骨細(xì)胞中瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的缺失本發(fā)明說(shuō)明瘦素是成骨性骨形成的抑制因子。另外，db/db小鼠中高骨質(zhì)表型的存在說(shuō)明瘦素必須和其已知受體相結(jié)合以行使其功能。理論上，瘦素可以直接作用于成骨細(xì)胞，或和控制體重一樣，使用下丘腦途徑間接通過(guò)脂肪中存在的第二個(gè)因子的釋放作用于成骨細(xì)胞。
在未長(zhǎng)滿的原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中研究成骨細(xì)胞中瘦素的表達(dá)。細(xì)胞在10％FBS礦物化培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，并轉(zhuǎn)到0.5％FBS的礦物化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，每天換液。更換培養(yǎng)基2小時(shí)后，用80ng/mL瘦素(Sigma)或40ng/mL抑瘤素M(R&D Doagnostic)或賦形劑處理20分鐘。使用Triazol(Gibco)提取RNA。根據(jù)本領(lǐng)域所熟知的方法，使用15μg總RNA進(jìn)行Northern雜交。
即使在長(zhǎng)時(shí)間的膠片曝光后也檢測(cè)不到成骨細(xì)胞中瘦素的表達(dá)，說(shuō)明自分泌調(diào)控是沒(méi)有可能的(圖5A)。在整個(gè)骨樣品中都檢測(cè)不到瘦素的表達(dá)，對(duì)瘦素通過(guò)旁分泌調(diào)控成骨細(xì)胞的功能提出了間接的非議(圖5A)。在任何情況下，瘦素對(duì)成骨細(xì)胞功能的旁分泌和/或自分泌調(diào)控都需要功能性瘦素受體存在于成骨細(xì)胞上。存在有數(shù)種瘦素受體的轉(zhuǎn)錄物，但人們認(rèn)為只有一種，即Ob-Rb具有信號(hào)傳導(dǎo)能力(Tartaglia et al.，1995，Cell 83，1263-1271；Chen et al.，1996，Cell 84，491-495；Lee et al.，1996，Nature 379，632-635)。瘦素受體轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)雖然不是嚴(yán)格的下丘腦特異性的，但也是高度下丘腦特異性的。進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，搜索原代成骨細(xì)胞和完整骨樣品中的Ob-Rb轉(zhuǎn)錄物。在隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA上進(jìn)行Ob-Rb表達(dá)的RT-PCR分析(27個(gè)循環(huán))，使用引物如下5’-TGGATAAACCCTTGCTCTTCA-3’(SEQ ID NO17)和5’-ACACTGTTAATTTCACACCAGAG-3’(SEQID NO18)(Friedman & Halaas，1998，Nature 395，763-770)。Hprt的擴(kuò)增作為cDNA質(zhì)量的內(nèi)部參照，使用引物如下5’-GTTGAGAGATCATCTCCACC-3’(SEQ ID NO19)和5’-AGCGATGATGAACCAGGTTA-3’(SEQ ID NO20)。
在使用檢測(cè)下丘腦中Ob-Rb轉(zhuǎn)錄物所必需的許多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)進(jìn)行的多次實(shí)驗(yàn)中，在顱蓋骨、長(zhǎng)骨和原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中都沒(méi)有檢測(cè)到Ob-Rb的表達(dá)(圖5B)。
為了確定瘦素是否能在成骨細(xì)胞中傳導(dǎo)信號(hào)，用瘦素處理來(lái)源于野生型小鼠的、血清饑餓的原代成骨細(xì)胞。如以前方法所述建立來(lái)源于新生野生型或db/db小鼠的原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物(Ducy et al.，1999，Genes Dev 13，1025-1036)，并在添加有10％PBS的礦物化培養(yǎng)基(αMEMI 0.1mg/mL抗壞血酸；5mMα-甘油磷酸)中培養(yǎng)。突變細(xì)胞的培養(yǎng)物在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)15天后進(jìn)行分析。來(lái)源于野生型小鼠的培養(yǎng)物在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天，然后血清降至0.5％，培養(yǎng)基添加有1.2μg/mL瘦素(Sigma)或賦形劑，繼續(xù)培養(yǎng)5天。
除了發(fā)現(xiàn)瘦素處理靶細(xì)胞后轉(zhuǎn)錄水平增加的兩個(gè)即早基因表達(dá)之外(Elmquist et al.，1997，Endocrinology 138，839-842)，還監(jiān)測(cè)瘦素靶細(xì)胞中瘦素信號(hào)傳導(dǎo)下游效應(yīng)因子Stat3的磷酸化(Tartaglia et al.，1995，Cell 83，1263-1271；Baumann et al.，1996，Proc Natl Acad Sci USA93，8374-8378；Ghilardi et al.，1996，Proc Natl Acad Sci USA 93，6231-6235；Vaisse et al.，1996，Nat Genet 14，95-97)。使用了能夠誘導(dǎo)Stat3磷酸化、活化成骨細(xì)胞中同樣兩個(gè)即早基因表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照抑瘤素M(Lery et al.，1996，Endocrinology 137，1159-1165)。如下所述進(jìn)行Western印跡分析來(lái)確定Stat3的磷酸化。使用本領(lǐng)域中所熟知的方法裂解細(xì)胞，蛋白質(zhì)提取物在7.5％SDS-PAGE上進(jìn)行分離，印到硝酸纖維素膜(Biorad)上進(jìn)行免疫印跡分析。使用PhosphoPlus Stat3(Tyr7O5)抗體試劑盒(New England Biolabs)，根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明分析Stat3磷酸化。
如圖5C所示，抑瘤素M處理成骨細(xì)胞誘導(dǎo)Stat3磷酸化，而瘦素處理則不能。該實(shí)驗(yàn)中使用了多個(gè)劑量的、生理性或超生理性的瘦素，但所有這些都不能誘導(dǎo)Stat3磷酸化。類(lèi)似的，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Northern分析方法發(fā)現(xiàn)抑瘤素M可以迅速、瞬間活化Tisll和c-fos的表達(dá)，而瘦素則不能(圖5D)。最后，測(cè)定了長(zhǎng)期瘦素處理來(lái)源于野生型小鼠的原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)合成以及骨基質(zhì)礦物化的影響。分別通過(guò)van Gieson和von Kossa試劑對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行全量染色，評(píng)價(jià)富含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)和礦物化結(jié)節(jié)的存在。在對(duì)照培養(yǎng)物和瘦素處理的培養(yǎng)物之間，膠原合成和礦物化結(jié)節(jié)形成沒(méi)有差異(圖5E)。
最后，如果成骨細(xì)胞上沒(méi)有功能性瘦素受體，則在離體培養(yǎng)物中野生型成骨細(xì)胞和db/db成骨細(xì)胞沒(méi)有區(qū)別。分析來(lái)源于db/db小鼠和野生型小鼠的原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生真正的骨細(xì)胞外基質(zhì)并使之礦物化的能力。對(duì)于分析的所有參數(shù)，即堿性磷酸酶染色、I型膠原生成和礦物化結(jié)節(jié)來(lái)說(shuō)，野生型和db/db原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物之間沒(méi)有差別(圖5F)。總的說(shuō)來(lái)，這些結(jié)果說(shuō)明瘦素在整個(gè)動(dòng)物中作用于骨形成不需要瘦素和成骨細(xì)胞上的受體相結(jié)合。
6.7.不存在脂肪組織條件下的高骨質(zhì)為了說(shuō)明瘦素的這種作用需要脂肪的存在，使用了僅在脂肪細(xì)胞中表達(dá)顯性失活蛋白A-ZIP的轉(zhuǎn)基因小鼠模型(Moitra et al.，1998，Genes Dev 12，3168-3181)。該顯性失活蛋白不具有多數(shù)B-ZIP轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力，其中B-ZIP轉(zhuǎn)錄因子是對(duì)于脂肪細(xì)胞分化關(guān)鍵的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果是，A-ZIP/F-1轉(zhuǎn)基因小鼠沒(méi)有白色脂肪組織，而白色脂肪組織是受瘦素信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控的脂肪類(lèi)型，無(wú)活性褐色脂肪組織的量急劇減少。其瘦素合成也減少了20倍(Moitra et al.，1998，Genes Dev 12，3168-3181)。在A-ZIP/F-1轉(zhuǎn)基因小鼠中，觀察到了緣于成骨細(xì)胞功能增加的高骨質(zhì)表型，該表型和ob/ob和db/db小鼠相同。
該實(shí)驗(yàn)具有兩種意思。其一，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了瘦素缺陷，而非高脂肪指數(shù)負(fù)責(zé)ob/ob和db/db小鼠高骨質(zhì)表型。其二，該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明脂肪組織不是瘦素作用于骨形成的必需中繼站。
6.8.腦室灌注瘦素糾正ob/ob小鼠的高骨質(zhì)表型最后，說(shuō)明了瘦素和其下丘腦受體的結(jié)合是否能在逆轉(zhuǎn)ob/ob小鼠肥胖表型的同時(shí)糾正其高骨質(zhì)表型。為了該目的，如下所述插入在ob/ob小鼠第三腦室中運(yùn)送PBS或瘦素(8ng/hr)的泵。用阿佛丁將動(dòng)物麻醉，置于立體定位儀(Stoelting)上。使Calabria暴露，在前顱上鉆一個(gè)0.7mm的孔。根據(jù)坐標(biāo)中線、AP-0.3、腹側(cè)3mm(前顱0點(diǎn))將一個(gè)28號(hào)套管(大腦灌注試劑盒U，Alza)包埋到第三腦室。用氰基丙烯酸脂將套管固定在顱骨上，通過(guò)Tygon和置于動(dòng)物背部皮下的滲透泵(Alza)。運(yùn)送速度為0.25μL/小時(shí)(8ng/hr瘦素(Sigma)或PBS，持續(xù)28天)。以前的研究已經(jīng)表明該劑量在系統(tǒng)施用時(shí)沒(méi)有作用(Hallas et al.，1997，Proc Natl Acad Sci USA 948878-8883)。為了盡可能接近ob/ob小鼠的生物情況，對(duì)插入了泵的動(dòng)物進(jìn)行卵巢切除術(shù)，以避免糾正其性腺功能減退時(shí)所導(dǎo)致的人為性骨質(zhì)增加。泵置于體內(nèi)28天，用鈣黃綠素進(jìn)行雙標(biāo)記來(lái)測(cè)定骨形成參數(shù)。
經(jīng)典的組織學(xué)分析表明瘦素處理小鼠骨重新獲得正常的表型，而PBS處理小鼠骨則沒(méi)有(圖7A)。瘦素處理小鼠中具有較少的骨小梁，這些骨小梁比PBS處理的ob/ob小鼠骨小梁看起來(lái)更為規(guī)則。瘦素處理小鼠中骨體積、小梁密度和骨形成速度都顯著減小(圖7A)。使用特異的放免分析法測(cè)得這些動(dòng)物的血清中沒(méi)有瘦素。瘦素腦室灌注對(duì)骨表型的挽救(rescue)，以及循環(huán)瘦素的不存在說(shuō)明對(duì)骨形成的控制是神經(jīng)內(nèi)分泌瘦素依賴性的功能。
7.實(shí)施例瘦素、骨質(zhì)和交感神經(jīng)緊張性之間的關(guān)系瘦素抑制了骨形成，以及瘦素缺陷型(ob/ob)小鼠腦室(ICV)灌注瘦素糾正了其高骨質(zhì)(HBM)表型，說(shuō)明了這種調(diào)控的中心性質(zhì)。對(duì)一對(duì)動(dòng)物的其中一只ICV灌注瘦素后ob/ob小鼠的交互循環(huán)分析說(shuō)明該調(diào)控環(huán)中的輸出信號(hào)不具有體液特征。對(duì)瘦素作用于體重的中介因子黑素皮質(zhì)素缺失的突變型小鼠進(jìn)行分析，并沒(méi)有鑒定到骨異常，說(shuō)明其他的途徑可以介導(dǎo)瘦素對(duì)骨形成的調(diào)控作用。瘦素缺失降低交感神經(jīng)系統(tǒng)的活性，缺失兒茶酚胺合成所需酶的小鼠表現(xiàn)出HBM表型。另外，用類(lèi)交感神經(jīng)作用劑處理ob/ob小鼠能夠糾正其HBM表型。該實(shí)施例描述將交感神經(jīng)系統(tǒng)鑒定為瘦素調(diào)控骨形成的效應(yīng)因子的過(guò)程，并說(shuō)明交感神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑可用于治療骨病。
免疫細(xì)胞化學(xué).解剖3日齡C57BL6小鼠的脛骨，直接凍在OCT化合物中。使用Micron恒冷切片機(jī)切割成12個(gè)微米切片。將切片固定，在5％血清中封閉，并和針對(duì)β1、β2和β3腎上腺素能受體的一抗(Santa Cruz Biotechnology)一起孵育。洗后，和偶聯(lián)有便于觀察的過(guò)氧化物酶的二抗相孵育，檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物。
交互循環(huán)(聯(lián)體)方法.通過(guò)常規(guī)方法麻醉后，充分麻醉?xiàng)l件性，使用無(wú)菌操作技術(shù)進(jìn)行手術(shù)。沿著各小鼠的一側(cè)進(jìn)行豎切，將皮膚和結(jié)締組織分開(kāi)。用縫線將切割的腹側(cè)邊緣縫合。打開(kāi)各小鼠腹腔，連接使腹部吻合。最后，將皮膚切口的背部邊緣縫合。然后將聯(lián)體小鼠飼養(yǎng)在單獨(dú)的籠子中。用于該方法的小鼠是同系小鼠，不至于發(fā)生免疫反應(yīng)。在處理期結(jié)束時(shí)進(jìn)行骨組織學(xué)和組織形態(tài)學(xué)分析，以測(cè)定骨質(zhì)。
給4周齡ob/ob小鼠腹腔注射β激動(dòng)劑異丙腎上腺素，劑量為30mg/kg/天。處理6周后，解剖小鼠，如6.2節(jié)中所述對(duì)骨進(jìn)行X射線和組織形態(tài)學(xué)分析。
在體內(nèi)，瘦素抑制成骨細(xì)胞的骨形成，因此，缺少或缺失瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的ob/ob、db/db和脂肪代謝障礙的小鼠和人無(wú)論其體重如何，都具有高骨質(zhì)(HBM)表型。ob/ob小鼠和db/db小鼠的HBM表型和性腺功能減退共存，且瘦素缺失是至今已知能導(dǎo)致高骨質(zhì)和性腺功能減退共存的唯一條件。后一特征強(qiáng)調(diào)了這種調(diào)控在骨生物學(xué)中的重要性。中樞灌注瘦素降低瘦素缺陷型和野生型小鼠的骨質(zhì)以及骨形成參數(shù)，從而顯示了骨形成調(diào)控中中樞物質(zhì)的存在。
為了確定發(fā)源于大腦并控制骨形成的信號(hào)是否具有體液特征，在ob/ob小鼠之間進(jìn)行交互循環(huán)(聯(lián)體)實(shí)驗(yàn)。建立并證實(shí)交互循環(huán)4周后，在每個(gè)聯(lián)體對(duì)的一只小鼠中裝入ICV運(yùn)送瘦素(8ng/h)的泵。如果這些動(dòng)物的血漿中檢測(cè)不到瘦素，則證明沒(méi)有漏過(guò)血腦屏障。4周后分析每對(duì)聯(lián)體的同側(cè)和對(duì)側(cè)小鼠的體重和骨組織學(xué)，如果瘦素使用體液手段來(lái)控制體重和骨質(zhì)，則每對(duì)聯(lián)體中的兩只小鼠對(duì)瘦素灌注的應(yīng)答是等同的。如以前所示，在接受ICV瘦素的ob/ob小鼠體重和骨體積明顯減小。相反，所有聯(lián)體對(duì)中對(duì)側(cè)小鼠體重和骨體積均沒(méi)有減小。這些結(jié)果說(shuō)明瘦素依賴環(huán)中的輸出信號(hào)不具有體液特征。
瘦素對(duì)前阿黑皮素(POMC)神經(jīng)元的活化和其調(diào)控食欲和體重的功能相關(guān)。為了確定POMC神經(jīng)元是否也涉及涉及對(duì)骨形成的調(diào)控作用，我們研究了致死性瘦素agouti(Ay)小鼠，該小鼠的大腦中缺失POMC信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致遲發(fā)性肥胖，抵抗瘦素的致厭食作用。Ay小鼠具有異常的骨質(zhì)，往這些小鼠中ICV灌注瘦素導(dǎo)致骨質(zhì)顯著下降，而不影響其體重。該結(jié)果說(shuō)明瘦素可以在不存在阿黑皮素信號(hào)傳導(dǎo)的條件下影響骨質(zhì)。接著研究了阿黑皮素的大腦特異受體，即阿黑皮素4受體(MC4-R)缺陷型小鼠。肥胖以及性腺功能減退的MC4-R缺陷型小鼠在1月齡和3月齡時(shí)具有正常的骨質(zhì)和正常的骨形成參數(shù)?？偟膩?lái)說(shuō)，兩種突變型小鼠株系的分析說(shuō)明瘦素對(duì)骨形成的調(diào)控中POMC神經(jīng)元不是主要的中繼站，說(shuō)明有其他介質(zhì)參與控制骨質(zhì)。這些突變型小鼠的分析還說(shuō)明的骨形成中樞調(diào)控的另一個(gè)方面。事實(shí)上，缺失瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的條件下HBM表型的存在提出了一個(gè)合理的觀點(diǎn)，即通過(guò)這些動(dòng)物中觀察到的高胰島素血癥來(lái)解釋HBM表型的存在。而Ay和MC-4R缺陷型小鼠的研究表明這種解釋是不可能的，這是因?yàn)檫@兩種突變型小鼠模型的特征是存在嚴(yán)重的高胰島素血癥，但具有正常骨質(zhì)。
為了確定交感神經(jīng)元是否參與調(diào)控骨形成，研究了缺失將多巴胺轉(zhuǎn)化為去甲腎上腺素所必需的酶，即多巴胺羥化酶(DBH)的小鼠。如圖8所示，DBH缺陷型小鼠具有HBM表型。在缺失瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的條件下觀察到的類(lèi)似，隨著時(shí)間的推移給表型逐漸加重，且發(fā)生在骨形成參數(shù)增加之后。骨吸收的生物標(biāo)記物脫氧吡咯烷酮的尿排泄在DBH缺陷型小鼠中是正常的，說(shuō)明骨吸收的缺陷正引發(fā)其HBM表型。
8.實(shí)施例交感神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)骨形成的神經(jīng)元調(diào)控該實(shí)施例中，瘦素依賴的抗骨生成的下丘腦網(wǎng)絡(luò)顯示介導(dǎo)瘦素致厭食作用的神經(jīng)肽不影響骨形成，瘦素抗骨生成作用的外周介質(zhì)可能是神經(jīng)元性的。瘦素缺失導(dǎo)致低的交感神經(jīng)緊張性，通過(guò)遺傳學(xué)方法或藥理學(xué)方法去除小鼠中的腎上腺素信號(hào)傳導(dǎo)導(dǎo)致瘦素抵抗性的高骨質(zhì)，成骨細(xì)胞上調(diào)節(jié)其增殖和功能的β-腎上腺素能受體。相應(yīng)地，β-腎上腺素能受體激動(dòng)劑降低瘦素缺陷型和野生型小鼠的骨質(zhì)，而β-腎上腺素能受體拮抗劑增加野生型和卵巢切除小鼠的骨質(zhì)。這些操作都不影響體重。該項(xiàng)研究說(shuō)明了對(duì)骨形成的瘦素依賴的神經(jīng)元調(diào)控，這種調(diào)控對(duì)骨質(zhì)疏松具有治療意義。
8.1.引言脊椎動(dòng)物中，通過(guò)2個(gè)作用的相互制約來(lái)維持骨質(zhì)恒定。這兩個(gè)作用是破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成。這兩種細(xì)胞類(lèi)型的協(xié)調(diào)作用限制了骨的重塑。最常見(jiàn)的骨重塑疾病——骨質(zhì)疏松也是發(fā)達(dá)國(guó)家中最常發(fā)生的退行性病變(參見(jiàn)Cooper & Melton，1996，骨質(zhì)疏松，R.Marcus，D.Feldman，and J.Kelsey，eds.，San Diego，Academic Press，pp.419-434)，說(shuō)明了鑒定骨重塑過(guò)程中的調(diào)控分子是骨生物學(xué)中的一個(gè)重要問(wèn)題。
成年小鼠中誘導(dǎo)去除成骨細(xì)胞后治愈的精確性使人們推測(cè)存在對(duì)骨形成的系統(tǒng)控制(參見(jiàn)Corral et al.，1998，Proc Natl Acad Sci USA9513835-13840)。根據(jù)性腺衰竭后骨質(zhì)疏松的高發(fā)性(參見(jiàn)Riggs etal.，1998，J Bone Miner Res 13763-773)以及肥胖人群中骨質(zhì)疏松的低發(fā)性(參見(jiàn)Felson et al.，1993，J Bone Miner Res 8567-573和Tremollieres et al.，1993，J Clin Endocrinol Metab 77683-686)提出了一個(gè)假設(shè)骨質(zhì)、體重和生育受同一種激素的控制。檢驗(yàn)該假設(shè)，表明調(diào)節(jié)體重和性腺功能的激素——瘦素還是骨形成的強(qiáng)抑制劑，即是一個(gè)抗骨生成的因子(參見(jiàn)Ducy et al.，2000，Cell 100197-207)。瘦素信號(hào)傳導(dǎo)水平都降低的瘦素缺陷型(ob/ob)小鼠、瘦素受體缺陷型小鼠和脂肪代謝障礙的小鼠具有相同的高骨質(zhì)(HBM)表型。具有相同骨表型的這三種突變型小鼠株系的體重相差很大，說(shuō)明是瘦素信號(hào)傳導(dǎo)控制骨質(zhì)，而非體重控制骨質(zhì)。往ob/ob小鼠或野生型(wt)小鼠的第三腦室灌注(ICV)瘦素降低了骨質(zhì)和骨形成參數(shù)，說(shuō)明在骨形成的控制過(guò)程中存在有中樞神經(jīng)組分(參見(jiàn)Ducy et al.，2000，Cell197-207)。這些結(jié)果和最初的假設(shè)是一致的，因?yàn)椴灰装l(fā)生骨質(zhì)疏松的肥胖人群對(duì)瘦素的中樞作用有抵抗性(參見(jiàn)Ahima & Flier，2000，Annu Rev Physiol 62413-437)。瘦素缺失是僅有的已知能使HBM和性腺功能減退共存的條件，瘦素存在會(huì)導(dǎo)致骨流失，這一點(diǎn)說(shuō)明了瘦素抗骨生成作用的重要性。
在瘦素行使致厭食作用的機(jī)制探討上已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展。小鼠突變株系的化學(xué)損傷、分子闡明以及神經(jīng)肽缺陷型小鼠的產(chǎn)生使人們鑒定到了合成開(kāi)胃分子和厭食分子的神經(jīng)元，該神經(jīng)元是瘦素致厭食作用的靶點(diǎn)(參見(jiàn)Elias et al.，1999，Neuron 23775-786；Cowley et al.，2001，Nature 411480-484和DeFalco et al.，2001，Science 2912608-2613)。相比之下，瘦素致厭食作用的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)尚不清楚。
為了闡明瘦素抗骨生成作用的理論基礎(chǔ)，進(jìn)行了化學(xué)損傷分析、遺傳學(xué)分析、勝利學(xué)分析和分子分析。該實(shí)施例中的研究表明瘦素的致厭食作用模式和抗骨生成作用模式是不同的，鑒定到了調(diào)節(jié)骨生成的神經(jīng)元，找到了通過(guò)調(diào)節(jié)該通路進(jìn)行治療的切入點(diǎn)。
8.2.實(shí)驗(yàn)方法8.2.1.動(dòng)物、處理和手術(shù)方法野生型(C57BL/6J)和突變型(C57BL/6J Ay/a，C57BL/6J ob/ob)小鼠來(lái)自Jackson實(shí)驗(yàn)室，腎上腺髓質(zhì)切除的小鼠來(lái)自Harlan Tecklad實(shí)驗(yàn)室。如前所述挽救Dbh-/-小鼠。每天腹腔注射(ip)異丙腎上腺素30mg/kg(wt)或3mg/kg(ob/ob)，持續(xù)6周。普萘洛爾(Sigma)以0.5g/L的濃度加入到飲用水中。對(duì)于ICV灌注來(lái)說(shuō)，如前所述將28號(hào)套管(大腦灌注試劑盒II，Alza)包埋在第三腦室，以8ng/hr的速度灌注人瘦素，或以125ng/hr的速度灌注MT-II(PhoenixPharmaceuticals)，持續(xù)28天(參見(jiàn)Ducy et al.，2000，Cell 100197-207)。套管和置于動(dòng)物背部皮下的滲透泵(Alza)相連接。對(duì)于聯(lián)體來(lái)說(shuō)，沿著每只小鼠的一側(cè)縱向切開(kāi)皮膚和腹腔。用縫線將切割邊緣縫合，誘導(dǎo)腹部吻合。往聯(lián)體對(duì)的一只小鼠尾靜脈中注射1mg/kg0.25％伊文思藍(lán)對(duì)交互循環(huán)進(jìn)行定量。30min后，通過(guò)眶后采血，從兩只小鼠收集血液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)計(jì)算血液交換速度(參見(jiàn)Harris &Martinm，1984，Am J Physiol 247R380-386)。所有聯(lián)體對(duì)每小時(shí)的交換速度都在2％以上。聯(lián)體2周后，包埋一個(gè)在聯(lián)體對(duì)的一只動(dòng)物中ICV運(yùn)送瘦素的泵。對(duì)于GTG損傷來(lái)說(shuō)，4周齡的C57BL/6J小鼠ip注射一次PBS或GTG(0.5mg/g)。對(duì)于MSG損傷來(lái)說(shuō)，2日齡C57BL/6J幼鼠每天皮下注射PBS或MSG(2mg/g)，持續(xù)10天。
8.2.2.轉(zhuǎn)基因小鼠的產(chǎn)生和分子研究克隆2.3kb的成骨細(xì)胞特異性片段αI(I)膠原啟動(dòng)子下游的小鼠瘦素cDNA，產(chǎn)生αI(I)瘦素轉(zhuǎn)基因。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因建立者(參見(jiàn)Ausubel，1995，分子生物學(xué)當(dāng)前方案，紐約)。通過(guò)PCR確定基因型。對(duì)表達(dá)轉(zhuǎn)基因的兩個(gè)株系的子代進(jìn)行分析。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案使用RNA或polyA+RNA進(jìn)行Northern印跡分析。在隨機(jī)引物引導(dǎo)的cDNA上進(jìn)行RT-PCR 27個(gè)循環(huán)，分析腎上腺素能受體的表達(dá)。
8.2.3.組織學(xué)方法、免疫細(xì)胞化學(xué)和增殖樣本包埋在石蠟中，制成6μm的切片。用0.1％cresyl紫對(duì)大腦染色。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析(參見(jiàn)Ausubel，1995，分子生物學(xué)當(dāng)前方案，紐約)。對(duì)用40μg異丙腎上腺素、4μg地塞米松或賦形劑處理5天的新生小鼠進(jìn)行體內(nèi)成骨細(xì)胞增殖分析。第5天ip注射BrdU(0.4mg)，2小時(shí)后將小鼠處死。使用Zymed BrdU染色試劑盒(Zymed實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行免疫組化分析，檢測(cè)BrdU摻入。對(duì)每種處理的4只幼鼠進(jìn)行分析，每只動(dòng)物對(duì)10個(gè)顱骨切片進(jìn)行計(jì)數(shù)。NovaRED用作顯色性的過(guò)氧化物酶底物。用蘇木精對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染。
對(duì)未脫鈣的切片用von Kossa染色，用von Gieson復(fù)染來(lái)進(jìn)行組織學(xué)分析(參見(jiàn)Ducy et al.，2000，Cell 100197-207)。使用骨測(cè)定分析系統(tǒng)(骨測(cè)定儀，Atlanta)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行靜態(tài)和動(dòng)態(tài)組織形態(tài)學(xué)分析(參見(jiàn)Parfitt et al.，1987，J Bone Miner Res 6595-610)。每組分析6至12只動(dòng)物。通過(guò)學(xué)生檢驗(yàn)評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。
8.2.4.細(xì)胞培養(yǎng)和生物分析如前所述獲得原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)物(參見(jiàn)Ducy et al.，2000，Cell100197-207)，在添加10％FBS的αMEM/0.1mg/mL抗壞血酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。OaOS-2在MEM/10％FBS中培養(yǎng)。對(duì)于cAMP分析來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)滿的細(xì)胞培養(yǎng)物和含有0.1μM IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤，Sigma)的無(wú)血清孵育8min，然后加入PBS、PTH(1～34)(Bachem)、異丙腎上腺素、去甲腎上腺素、去氧腎上腺素(Sigma)或普萘洛爾處理5min。通過(guò)免疫分析(R&D System)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度。對(duì)于基因表達(dá)分析來(lái)說(shuō)，于0.1％FBS中用適當(dāng)?shù)乃幬锾幚碓晒羌?xì)胞72小時(shí)。Peninsula實(shí)驗(yàn)室(胰島素)或Alpco Diagnostics(瘦素)的免疫分析試劑盒對(duì)激素血清水平進(jìn)行定量。使用Quidel試劑盒測(cè)定晨尿中的脫氧吡咯烷酮交聯(lián)物和計(jì)算。用STAT3反應(yīng)性luc報(bào)道構(gòu)建體、pSVβ-gal質(zhì)粒和αI(I)瘦素表達(dá)質(zhì)粒或模擬質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染表達(dá)ObRb的293細(xì)胞，證實(shí)αI(I)瘦素的生物活性。24小時(shí)后測(cè)定熒光素酶和β-半乳糖苷酶的活性。數(shù)據(jù)表示為熒光素酶/β-半乳糖苷酶活性比，所得的值是6個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的中間值。
8.3.結(jié)果8.3.1.鑒定下丘腦抗骨生成區(qū)域兩個(gè)下丘腦核——腹外側(cè)下丘腦核(VMH)和弓形核(ARC)具有最高密度的、表達(dá)能夠進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)的瘦素ObRb的神經(jīng)元；兩個(gè)核都在介導(dǎo)瘦素的致厭食作用中發(fā)揮關(guān)鍵的作用(參見(jiàn)Tartaglia etal.，1995，Cell 831263-1271和Fei et al.，1997，Proc Natl Acad Sci USA947001-7005)。首先通過(guò)化學(xué)損傷，隨后進(jìn)行或不進(jìn)行瘦素ICV灌注評(píng)價(jià)了這些核的神經(jīng)元參與瘦素抗骨生成作用的可能性。
新生的幼鼠首先用損傷表達(dá)谷氨酸受體之腦室周?chē)窠?jīng)元的谷氨酸鈉(MSG)處理(參見(jiàn)Olney，1969，Science 164719-721)。MSG處理顯著影響ARC結(jié)構(gòu)，幾乎不存在合成神經(jīng)肽Y(NPY)的神經(jīng)元(圖9A)。相比之下，VMH神經(jīng)元的標(biāo)記物——產(chǎn)類(lèi)固醇因子1(SF1)(參見(jiàn)Ikeda et al.，1995，Mol Endocrinol 9478-486和Dellovadeet al.，2000，J Comp Neurol 423579-589)的表達(dá)不變，說(shuō)明這些神經(jīng)元多數(shù)都不受MSG處理的影響。在下丘腦外部沒(méi)有觀察到損傷。通過(guò)測(cè)定固體積進(jìn)行組織學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)12周齡的MSG處理小鼠具有正常的骨質(zhì)(圖9B)。為了進(jìn)一步說(shuō)明MSG敏感的神經(jīng)元在瘦素抗骨生成中的作用，對(duì)MSG處理的ob/ob小鼠進(jìn)行瘦素ICV灌注。MSG處理阻斷了瘦素ICV灌注減輕體重的活性，但是沒(méi)有阻斷其減少骨質(zhì)的活性(圖9C)。盡管ob/ob小鼠中存在有MSG誘導(dǎo)的損傷，但MSG處理小鼠骨質(zhì)正常且瘦素ICV灌注有效，這些結(jié)果說(shuō)明MSG敏感性神經(jīng)元對(duì)于瘦素的抗骨生成作用不是必需的。
繼而，4周齡wt小鼠用硫代葡萄糖金(GTG)處理，GTG是破壞VMH神經(jīng)元和更靠近背側(cè)的ARC神經(jīng)元的化合物，也影響其他神經(jīng)元(參見(jiàn)Debons et al.，1962，Am J Physiol 4743-750)。在進(jìn)行分析的各個(gè)小鼠中，密集的疤痕使腹側(cè)下丘腦的解剖形態(tài)變形，說(shuō)明GTG處理VMH的有害效應(yīng)。GTG處理小鼠的免疫組化研究表明表達(dá)SF1的VMH神經(jīng)元明顯紊亂，而位于ARC中的、表達(dá)NPY的神經(jīng)元未受影響(圖9D)。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明GTG和MSG分別影響ARC和VMH神經(jīng)元。骨組織學(xué)分析表明12周齡的GTG處理小鼠表現(xiàn)出HBM，其嚴(yán)重程度和ob/ob小鼠近似相同(圖9E)。和ob/ob小鼠一樣，這種HBM緣于骨形成增加，表現(xiàn)為骨形成速度增加(圖9E)。指示破骨細(xì)胞活性的膠原降解產(chǎn)物——脫氧吡咯烷酮(dpd)的尿清除，以及破骨細(xì)胞數(shù)目正常說(shuō)明骨吸收不受GTG的影響(數(shù)據(jù)未列出)。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明對(duì)GTG敏感的神經(jīng)元參與控制骨質(zhì)。
為了確定GTG敏感性神經(jīng)元是否參與瘦素的抗骨生成作用，在GTG處理的ob/ob小鼠中進(jìn)行瘦素ICV灌注。瘦素ICV灌注減輕了這些動(dòng)物的體重，說(shuō)明瘦素ICV灌注是有效的(圖9F)。雖然ob/ob小鼠對(duì)瘦素極為敏感，但是這種灌注沒(méi)有減少骨質(zhì)(圖9F)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明GTG敏感性神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)對(duì)于瘦素的抗骨生成作用是必需的。另外，GTG或MSG分別影響瘦素的抗骨生成作用和致厭食作用，說(shuō)明這兩種作用至少部分由不同的神經(jīng)元通路所介導(dǎo)。
8.3.2.瘦素的抗骨生成作用不需要已知的致厭食性神經(jīng)肽為了超越化學(xué)損傷法，使用了遺傳學(xué)方法。研究表明ARC產(chǎn)生的α-黑素細(xì)胞刺激激素(αMSH)和表達(dá)黑素皮質(zhì)素4受體(MC4-R)及黑素皮質(zhì)素受體(MC3-R)的神經(jīng)元相結(jié)合是瘦素的致厭食作用所必需的(參見(jiàn)Huszar et al.，1997；Vaisse et al.，1998；Yeo et al.，1998；Cowley et al.，2001，Nature 411480-484)。為了研究黑素皮質(zhì)素信號(hào)傳導(dǎo)在瘦素抗骨生成作用中的功能，通過(guò)破壞黑素皮質(zhì)素信號(hào)傳導(dǎo)和黑素皮質(zhì)素受體激動(dòng)劑處理的ob/ob小鼠對(duì)突變型小鼠株系進(jìn)行分析。
Ay/a小鼠中，由于agouti蛋白和黑素皮質(zhì)素受體結(jié)合，黑素皮質(zhì)素信號(hào)傳導(dǎo)水平下降。其中agouti蛋白是黑素皮質(zhì)素受體信號(hào)傳導(dǎo)的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，對(duì)MC4-R有高親和力(參見(jiàn)Miller et al.，1993；Lu etal.，1994；Fan et al.，1997)。結(jié)果Ay/a小鼠發(fā)生遲發(fā)性肥胖，并伴隨有對(duì)瘦素致厭食作用的中樞抵抗(參見(jiàn)Halaas et al.，1997，Proc NatlAcad Sci USA 948878-8883)，和Mc4-r缺陷型小鼠中觀察到的表型相類(lèi)似(參見(jiàn)Huszar et al.，1997，Cell 88131-141)。相比之下，多個(gè)證據(jù)表明黑素皮質(zhì)素信號(hào)傳導(dǎo)受到破壞時(shí)不發(fā)生瘦素的抗骨生成作用。首先，Ay/a小鼠具有正常骨質(zhì)(參見(jiàn)Ducy et al.，2000，Cell100197-207)。其次，Ay/a小鼠不抵抗瘦素的抗骨生成作用，表現(xiàn)為長(zhǎng)期ICV瘦素灌注降低骨形成速度，減小Ay/a小鼠和wt小鼠的骨體積(圖10A)。其三，Mc4-r缺陷型小鼠具有正常的骨質(zhì)(圖10B)。其四，往ob/ob小鼠中ICV灌注MC4-R/MC3-R激動(dòng)劑MTII不影響其骨質(zhì)，但顯著減輕其體重(圖10C和10D)。
表達(dá)受瘦素調(diào)控的另一個(gè)致厭食多肽是可卡因安非他明相關(guān)轉(zhuǎn)錄物(CART)(參見(jiàn)Kristensen et al.，1998，Nature 39372-76)。雖然CART調(diào)節(jié)小鼠的體重(參見(jiàn)Asnicar et al.，2001，Endocrinology1424394-4400)，但cart缺陷型小鼠不表現(xiàn)出HBM(數(shù)據(jù)未列出)?？傊?，這些實(shí)驗(yàn)表明對(duì)于瘦素致厭食作用關(guān)鍵的黑素皮質(zhì)素和CART信號(hào)傳導(dǎo)通路不是其抗骨生成作用所必需的。這些結(jié)果和MSG敏感性神經(jīng)元的觀察結(jié)果相一致，MSG敏感性神經(jīng)元是αMSH的主要下丘腦性發(fā)源地，負(fù)責(zé)瘦素的抗骨生成作用。
Mc4-r缺陷型小鼠的分析說(shuō)明了在缺失瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的小鼠中不能研究的另一個(gè)問(wèn)題。不存在瘦素信號(hào)傳導(dǎo)的條件下觀察到HBM，說(shuō)明HBM可能該條件下產(chǎn)生的高胰島素血癥的次級(jí)效應(yīng)。而Mc4-r缺陷型小鼠血漿胰島素水平升高，但骨質(zhì)正常，證明了高胰島素血癥并不導(dǎo)致HBM(表1)。下面提供的其他三個(gè)證據(jù)進(jìn)一步說(shuō)明了血漿胰島素水平和骨質(zhì)調(diào)控的不相關(guān)性。
8.3.3.瘦素抗骨生成作用的外周介導(dǎo)下一個(gè)問(wèn)題是下丘腦抗骨生成網(wǎng)絡(luò)所產(chǎn)生的信號(hào)是體液性的還是神經(jīng)元性的。需要借助ob/ob動(dòng)物(沒(méi)有循環(huán)瘦素)之間的交互循環(huán)(聯(lián)體)實(shí)驗(yàn)來(lái)解決該問(wèn)題。如實(shí)驗(yàn)方法所述進(jìn)行聯(lián)體實(shí)驗(yàn)，染料注射證實(shí)2小時(shí)后聯(lián)體動(dòng)物之間的有效交互循環(huán)＞95％。聯(lián)體2周后，每個(gè)聯(lián)體對(duì)中包埋ICV灌注瘦素的泵。在進(jìn)行分析的所有動(dòng)物血清中都檢測(cè)不到瘦素，排除了瘦素向血液循環(huán)中滲露的可能性(數(shù)據(jù)未列出)。4周后，將動(dòng)物處死，進(jìn)行分析。和預(yù)期相同，接受瘦素ICV的ob/ob小鼠骨質(zhì)顯著減少；相比之下，對(duì)側(cè)小鼠的骨質(zhì)為發(fā)生變化(圖11A)。雖然不能排除短壽命體液介質(zhì)的存在，該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明了在瘦素的抗骨生成作用中存在神經(jīng)元性介質(zhì)的可能性。
上述的實(shí)驗(yàn)都不能排除瘦素通過(guò)局部作用影響成骨細(xì)胞功能的可能性。為了驗(yàn)證該假設(shè)，使用成骨細(xì)胞特異性的αI(I)膠原啟動(dòng)子片段(參見(jiàn)Rossert et al.，1995，J Cell Biol 1291421-1432)驅(qū)動(dòng)瘦素在成骨細(xì)胞[αI(I)瘦素]的表達(dá)，產(chǎn)生了兩個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠株系。Northern印跡分析和免疫細(xì)胞化學(xué)分析表明成骨細(xì)胞合成了高水平的瘦素(圖11B、11C)，使血漿瘦素水平輕微增加，但還維持在正常范圍內(nèi)(wt3.2ng/mL±0.4，αI(I)瘦素5.6±0.8，每個(gè)基因型n＝7)。DNA轉(zhuǎn)染后瘦素增加Stat3依賴的熒光素酶報(bào)道構(gòu)建體在表達(dá)ObRb的293細(xì)胞中的活性，從而確認(rèn)了該轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)錄的瘦素生物活性(圖11D)。雖然具有生物活性的瘦素存在高的局部水平，在1年內(nèi)的任何階段中轉(zhuǎn)基因小鼠的骨質(zhì)和野生型小鼠的骨質(zhì)沒(méi)有區(qū)別(圖11E)。該結(jié)果說(shuō)明瘦素抗骨形成作用的理論依據(jù)不是直接作用于成骨細(xì)胞。
8.3.4.骨形成的交感神經(jīng)調(diào)節(jié)已經(jīng)分析透徹的瘦素缺失后果是交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)的活性降低(參見(jiàn)Bray & York，1998，Recent Prog Horm Res 53，95-117)。另外，人們?cè)O(shè)想VMH介導(dǎo)瘦素誘導(dǎo)的兒茶酚胺分泌增加(參見(jiàn)Ruffin &Nicolaidis，1999，Brain Res 84623-29和Satoh et al.，1999，Diabetes481787-1793)。這些觀察結(jié)果以及這里所給出的研究發(fā)現(xiàn)探討了SNS在控制骨形成中的作用。
由于SNS功能是通過(guò)腎上腺素能受體介導(dǎo)的，因此研究了缺失產(chǎn)生腎上腺素能受體的兒茶酚胺配體——去甲腎上腺素和腎上腺素所需酶多巴胺β羥化酶(DBH)的突變型小鼠。組織學(xué)分析表明Dbh缺陷型小鼠中存在HBM，盡管其程度沒(méi)有ob/ob小鼠中的嚴(yán)重(圖12A)。由于Dbh缺陷型小鼠中，有利于低骨質(zhì)的兩個(gè)條件——血清皮質(zhì)酮和多巴胺水平增加(參見(jiàn)Adachi et al.，1993，Semin ArthritisRheum 22375--384；Alaniz et al.，1999，Proc Natl Acad Sci USA962274-2278和et al.，2000，Bone，2615-19)，因此該發(fā)現(xiàn)具有重大意義(參見(jiàn)Alaniz et al.，1999，Proc Natl Acad Sci USA 962274-2278)。這種HBM是骨形成速度和成骨細(xì)胞數(shù)增加、而骨吸收標(biāo)記物正常的次級(jí)效應(yīng)(圖12A-12D，數(shù)據(jù)未列出)。除了高皮質(zhì)酮水平外，Dbh缺陷型小鼠中觀察到的HBM和高胰島素血癥或其他激素紊亂不相關(guān)(表1，未列出)。兒茶酚胺的釋放主要有兩個(gè)來(lái)源交感神經(jīng)和腎上腺。為了確定腎上腺產(chǎn)生的兒茶酚胺是否參與骨質(zhì)的調(diào)節(jié)，分析了提前4周手術(shù)切除了作為循環(huán)腎上腺素主要來(lái)源的腎上腺髓質(zhì)(參見(jiàn)Young & Landsberg，1998，The Adrenal.Williams內(nèi)分泌教材，J.D.Wilson，D.W.Foster，H.Kronenberg，and P.R.Larsen，eds.(Philadelphia，W.B.Saunders Co.)，pp.665-682)的野生型小鼠。組織學(xué)分析表明切除腎上腺髓質(zhì)不影響骨質(zhì)(圖12E)。該結(jié)果確認(rèn)了存在對(duì)骨形成的神經(jīng)元調(diào)節(jié)。
另一個(gè)問(wèn)題是瘦素中樞抗骨生成作用和骨形成的SNS調(diào)節(jié)之間是否存在直接的聯(lián)系。為了解決該問(wèn)題，往Dbh缺陷型小鼠中ICV灌注了瘦素ICV。這種灌注使所有處理了的Dbh缺陷型小鼠中性腺脂肪幾乎消失，說(shuō)明在不存在去甲腎上腺素和腎上腺素的條件下中樞運(yùn)送瘦素影響體重調(diào)節(jié)(圖12F)。但是，瘦素不能減少Dbh缺陷型小鼠的骨質(zhì)(圖12G)，說(shuō)明瘦素的抗骨生成作用依賴于SNS功能。
表1.血清胰島素水平和骨質(zhì)胰島素 骨體積(ng/mL)野生型 0.8±0.3 正常MC4-R-/-23.0±6.0*正常Dbh-/-1.0±0.4 高ob/ob19.6±0.8 高ob/ob+異丙腎上腺素 4.4±0.4 低野生型+普萘洛爾 0.8±0.1 高*(Huszar et al.，1997，Cell 88131-141)8.3.5.成骨細(xì)胞上的功能性腎上腺素能受體交感神經(jīng)調(diào)節(jié)骨形成應(yīng)該具備幾個(gè)條件。其一是成骨細(xì)胞上存在有功能性腎上腺素能受體。通過(guò)RT-PCR進(jìn)行的基因表達(dá)分析和Northen印跡分析表明原代小鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)物中存在β2腎上腺素能受體轉(zhuǎn)錄物，但是不存在其他的腎上腺素能受體轉(zhuǎn)錄物(圖13A)。對(duì)來(lái)源于表達(dá)LacZ的轉(zhuǎn)基因小鼠長(zhǎng)骨進(jìn)行免疫組化分析證實(shí)了成骨細(xì)胞上β2腎上腺素能受體的存在(圖13B)，其中LacZ位于成骨細(xì)胞特異性αI(I)膠原啟動(dòng)子片段控制之下。不能夠檢測(cè)到其他的腎上腺素能受體亞型。此外，用抗神經(jīng)纖維抗體和抗酪氨酸羥化酶抗體在成骨細(xì)胞周?chē)^察到軸突免疫反應(yīng)性(圖13C和13D)。電子顯微鏡證實(shí)無(wú)髓鞘的周?chē)窠?jīng)軸突經(jīng)過(guò)骨小梁和成骨細(xì)胞附近的骨髓(圖13E)。β腎上腺素能受體是G蛋白偶聯(lián)的受體，通過(guò)cAMP通路傳導(dǎo)信號(hào)(參見(jiàn)Benovic et al.，1998，Annu Rev Cell Biol 4405-428)。因此，為了評(píng)價(jià)成骨細(xì)胞上存在β2腎上腺素能受體的生物相關(guān)性，單獨(dú)使用β腎上腺素能激動(dòng)劑異丙腎上腺素，或在β腎上腺素能受體拮抗劑普萘洛爾存在的條件下使用β腎上腺素能激動(dòng)劑異丙腎上腺素；使用β腎上腺素能受體的天然配體去甲腎上腺素；α腎上腺素能激動(dòng)劑去氧腎上腺素或使用賦形劑來(lái)處理這些細(xì)胞，測(cè)定cAMP的生成。使用和成骨細(xì)胞中另一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體相結(jié)合的甲狀旁腺激素(PTH)作為陽(yáng)性對(duì)照(Gardella & Juppner，2001，Trends EndocrinolMetab 12210-217)。異丙腎上腺素或去甲腎上腺素處理使cAMP生成增加至PTH的類(lèi)似程度，而去氧腎上腺素則沒(méi)有這種作用。普萘洛爾處理能夠抵消這些作用。是小鼠和人成骨細(xì)胞也獲得了同樣的結(jié)果(圖13F)。
8.3.6.類(lèi)交感神經(jīng)刺激劑處理的ob/ob小鼠骨質(zhì)減少，但仍保持肥胖第二個(gè)條件是用類(lèi)交感神經(jīng)刺激劑處理應(yīng)減少其骨質(zhì)。為了說(shuō)明這一點(diǎn)，用β腎上腺素能受體激動(dòng)劑異丙腎上腺素或賦形劑處理1月齡ob/ob小鼠6周。如圖14A所示，長(zhǎng)期異丙腎上腺素處理(3mg/kg/天)導(dǎo)致ob/ob小鼠脊椎骨和長(zhǎng)骨中大量骨流失。這是由于骨形成速度下降，單位骨面積上的成骨細(xì)胞數(shù)減少(圖14B)，而骨吸收參數(shù)未受影響(數(shù)據(jù)未列出)。利用10mg/kg/天的異丙腎上腺素獲得了相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未列出)。該實(shí)驗(yàn)有兩個(gè)方面是特別重要的。其一，形成低骨質(zhì)、而ob/ob小鼠仍具有高胰島素血癥進(jìn)一步說(shuō)明了高胰島素血癥和骨質(zhì)調(diào)節(jié)的不相關(guān)性(表1)。其二，在這兩個(gè)劑量下，異丙腎上腺素減少骨質(zhì)，而不影響體重，說(shuō)明存在異丙腎上腺素選擇性影響骨質(zhì)的劑量范圍(圖14A和14C)。為了確定沒(méi)有缺失瘦素所導(dǎo)致的代謝和神經(jīng)異常的動(dòng)物體內(nèi)SNS的作用，在野生型小鼠中重復(fù)了該實(shí)驗(yàn)。異丙腎上腺素還是顯著減少骨質(zhì)、骨形成速度和成骨細(xì)胞數(shù)目，而不影響其體重(圖14D-14F)。褐色脂肪組織中非偶聯(lián)蛋白1(Ucpl)表達(dá)的增加說(shuō)明異丙腎上腺素能夠模擬ob/ob及野生型小鼠中交感神經(jīng)活性的增加(Scarpace & Matheny，1998，Am J Physiol275E259-264)(圖14G)?？傊@些數(shù)據(jù)鑒定了不依賴于其對(duì)體重的作用，通過(guò)作用于β2腎上腺素能受體作為骨形成調(diào)節(jié)劑的SNS。
為了闡明異丙腎上腺素體內(nèi)抗骨生成作用的機(jī)制，研究了成骨細(xì)胞增殖、基因表達(dá)和凋亡。體內(nèi)溴化脫氧尿嘧啶(BrdU)標(biāo)記后，經(jīng)異丙腎上腺素處理的野生型小鼠顱骨中陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目和對(duì)照小鼠顱骨中陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目相比減少2倍，說(shuō)明異丙腎上腺素抑制成骨細(xì)胞增殖(圖14H)。使用嚴(yán)重抑制成骨細(xì)胞增殖的地塞米松作為對(duì)照。成骨細(xì)胞基因表達(dá)研究表明異丙腎上腺素處理降低控制成骨細(xì)胞功能的轉(zhuǎn)錄因子Dbfal(參見(jiàn)Ducy et al.，1999，Genes Dev 131025-1036)和編碼骨細(xì)胞外基質(zhì)主要成分的基因αI(I)膠原的表達(dá)(圖14I)。用β腎上腺素能拮抗劑普萘洛爾處理逆轉(zhuǎn)異丙腎上腺素對(duì)基因表達(dá)的抑制作用(圖14I)。為了研究凋亡，分析了Caspase 3表達(dá)和Annexin-V染色水平，沒(méi)有觀察到異丙腎上腺素處理和對(duì)照成骨細(xì)胞相比的改變(數(shù)據(jù)未列出)。這些結(jié)果SNS的抗骨生成作用是出于對(duì)成骨細(xì)胞增殖和功能的抑制。
8.3.7.β腎上腺素能拮抗劑增加wt和卵巢切除小鼠的骨質(zhì)SNSA調(diào)節(jié)骨形成的最重要生物醫(yī)學(xué)條件是β腎上腺素能拮抗劑(β阻斷劑)應(yīng)該通過(guò)增加骨形成來(lái)增加骨質(zhì)。為了說(shuō)明這一點(diǎn)，wt小鼠用普萘洛爾(0.4mg/天)處理5周。這種處理導(dǎo)致脊椎骨和長(zhǎng)骨的骨質(zhì)顯著增加(圖15A)。在一些普萘洛爾處理的小鼠中，骨體積可以和ob/ob小鼠中的觀察結(jié)果相匹配。這種骨質(zhì)的增加緣于骨形成速度的增加和成骨細(xì)胞數(shù)目的增加(圖15B)。普萘洛爾誘導(dǎo)的骨質(zhì)變化同時(shí)，動(dòng)物的體重和脂肪墊重量保持正常(圖15C，數(shù)據(jù)未列出)。普萘洛爾不導(dǎo)致高胰島素血癥或其他的激素變化(表1，數(shù)據(jù)未列出)。隨后，研究了瘦素抗骨生成作用和β阻斷劑對(duì)骨質(zhì)效應(yīng)之間的可能聯(lián)系。為了該目的，對(duì)普萘洛爾處理的小鼠進(jìn)行了瘦素ICV灌注。中樞運(yùn)送瘦素導(dǎo)致普萘洛爾處理的小鼠脂肪墊消失，但是不影響其骨質(zhì)(圖15D、15E)。該實(shí)驗(yàn)是支持瘦素的抗骨生成作用需要交感神經(jīng)活性的第二個(gè)有力證據(jù)。
普萘洛爾對(duì)wt小鼠骨形成的作用表明普萘洛爾可能會(huì)緩和雌激素耗竭后觀察到的骨質(zhì)疏松。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，將6周齡的wt小鼠卵巢切除，小鼠用普萘洛爾或賦形劑處理7周。卵巢切除耗竭雌激素減少賦形劑處理小鼠中的骨質(zhì)。相比之下，普萘洛爾處理的卵巢切除小鼠具有正常的骨質(zhì)(圖15F)。普萘洛爾處理的這種預(yù)防效應(yīng)是由于骨形成速度和成骨細(xì)胞數(shù)目的明顯增加，二者水平均比對(duì)照的卵巢切除小鼠高(圖15G)。后一結(jié)果強(qiáng)調(diào)了骨形成過(guò)程中交感神經(jīng)調(diào)節(jié)的生理和治療重要性。
8.4.討論已經(jīng)鑒定到了瘦素抗骨生成作用所需的神經(jīng)元通路，表明SNS是骨形成的負(fù)調(diào)控因子?？梢哉{(diào)節(jié)SNS對(duì)骨形成的這種抑制作用，而不影響體重。除了為瘦素的抗骨生成作用提供了分子基礎(chǔ)外，這些發(fā)現(xiàn)還確認(rèn)了對(duì)骨重塑的神經(jīng)元調(diào)節(jié)。β腎上腺素能拮抗劑能夠克服卵巢切除對(duì)骨的有害作用，而不影響體重，這一點(diǎn)對(duì)骨質(zhì)疏松的治療具有重要意義。
8.4.1.瘦素抗骨生成作用的特異性這些結(jié)果說(shuō)明了下丘腦在瘦素抗骨生成作用中的重要性，帶有損傷研究所固有的局限性，說(shuō)明VMH是該通路中的瘦素作用位點(diǎn)。但是，這些化學(xué)損傷研究沒(méi)有鑒定到下丘腦中瘦素抗骨生成作用所需的確切神經(jīng)元亞型，也沒(méi)有排除大腦中其他部位存在的其他神經(jīng)元群體參與該作用。為了有力地說(shuō)明這些問(wèn)題，需要區(qū)域特異性滅活大腦中的瘦素受體，進(jìn)行進(jìn)一步研究(參見(jiàn)Cohen et al.，2001，J.Clin.Invest1081113-1121)。
使用遺傳修飾的小鼠株系說(shuō)明瘦素抗骨生成作用的特異性。參與瘦素抗骨生成作用的一個(gè)神經(jīng)肽是αMSH，該神經(jīng)肽由ARC神經(jīng)元產(chǎn)生，與黑素皮質(zhì)素受體相結(jié)合。在不表現(xiàn)出骨質(zhì)異常的Ay/a小鼠和Mc4-r缺陷型小鼠中該信號(hào)傳導(dǎo)通路遭到破壞。另外，Ay/a小鼠對(duì)瘦素的抗骨生成作用沒(méi)有抗性，而用黑素皮質(zhì)素受體激動(dòng)劑處理ob/ob小鼠減輕其體重，但不影響其骨質(zhì)。這些結(jié)果說(shuō)明黑素皮質(zhì)素不是骨形成的主要調(diào)控因子，和MSG誘導(dǎo)的損傷對(duì)瘦素抗骨生成功能不具有明顯的作用相一致。CART是另一個(gè)致厭食的神經(jīng)肽，其在下丘腦中的表達(dá)受瘦素的調(diào)控(參見(jiàn)Kristersen et al.，1998，Nature 39372-76)。高脂飲食的Cart缺陷型小鼠發(fā)生輕度肥胖(參見(jiàn)Asnicar et al.，2001，Endocrinology，1424394-4400)，但不具有HBM。MSG或GTG處理的小鼠和突變型小鼠株系的下丘腦中能夠差異性調(diào)節(jié)瘦素致厭食作用和抗骨生成作用，說(shuō)明這兩種功能至少部分由不同的神經(jīng)元群體所介導(dǎo)。
8.4.2.交感神經(jīng)活性和對(duì)骨形成的調(diào)節(jié)多個(gè)證據(jù)，包括聯(lián)體實(shí)驗(yàn)、Dbh缺陷型小鼠的分析、用交感神經(jīng)激動(dòng)劑或拮抗劑處理ob/ob、野生型或卵巢切除小鼠的結(jié)果都確認(rèn)了SNS是骨形成的主要調(diào)節(jié)因子。β阻斷劑對(duì)骨形成的這種合成代謝作用解釋了其對(duì)大鼠骨折的有益作用(參見(jiàn)Minkowitz et al.，1991，JOrthop Res 9869-875)。在這些實(shí)驗(yàn)中，SNS對(duì)骨質(zhì)的作用不依賴于體重或脂肪重的變化。而且，瘦素ICV灌注不能減輕Dbh缺陷型小鼠和經(jīng)普萘洛爾處理的小鼠中的骨質(zhì)，揭示了瘦素抗骨生成作用和交感神經(jīng)活性之間的功能聯(lián)系。
其他的小鼠遺傳學(xué)觀察也支持存在有對(duì)骨形成的交感神經(jīng)調(diào)節(jié)。多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷的小鼠中不發(fā)生突觸前末端對(duì)多巴胺的快速吸收，因此骨質(zhì)減少(參見(jiàn)Bliziotes et al.，2000，Bone 2615-19)。后一發(fā)現(xiàn)說(shuō)明Dbh缺陷型小鼠中循環(huán)多巴胺水平的增加(參見(jiàn)Alaniz etal.，1999，Proc Natl Acad Sci USA 962274-2278)限制其骨表型，而非產(chǎn)生或放大其骨表型。在聯(lián)體小鼠中的交互循環(huán)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有排除瘦素抗骨形成作用中存在短壽命體液介質(zhì)的可能性。但是，腎上腺切除實(shí)驗(yàn)的結(jié)果推翻了這種機(jī)制。類(lèi)似的，全垂體功能減退患者的低骨質(zhì)也不支持這一說(shuō)法(參見(jiàn)Kaufman et al.，1992，J Clin Endocrinol Metab74118-123)。
8.4.3.瘦素作為控制激素(master hormone)包括控制體重、生育和骨形成的瘦素多效性功能使人聯(lián)想到氫化可的松、雌激素、甲狀腺素和胰島素等激素的許多功能。根據(jù)發(fā)育過(guò)程中控制基因協(xié)調(diào)細(xì)胞分化程序的說(shuō)法進(jìn)行類(lèi)推，提出瘦素和其他激素定義為參與協(xié)調(diào)控制重要體內(nèi)平衡功能的一組控制激素。控制激素的這些功能可以采用不同的作用模式。事實(shí)上，對(duì)糖皮質(zhì)激素受體突變體的分析表明和其受體結(jié)合的氫化考的松使用不同的方式產(chǎn)生不同的功能(參見(jiàn)Reichardt et al.，1998，Cell 93531-541和Karst et al.，2000，Nat Neurosci 3977-978)。這里的證據(jù)區(qū)分了瘦素致厭食作用模式和抗骨生成作用模式，說(shuō)明對(duì)于瘦素來(lái)說(shuō)情況也是如此。脊椎動(dòng)物中控制激素通過(guò)不同的通路發(fā)揮多種功能的能力可能是進(jìn)化過(guò)程中大型動(dòng)物將逐漸增加的體內(nèi)平衡復(fù)雜性進(jìn)行整合的方式。
8.4.3.生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用有一個(gè)證據(jù)說(shuō)明對(duì)骨質(zhì)的交感神經(jīng)調(diào)節(jié)存在于人類(lèi)中并發(fā)揮重要作用。反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良是以高腎上腺素活性為特征的人類(lèi)疾病，其表現(xiàn)包括骨質(zhì)疏松。用β阻斷劑治療受這些疾病影響的患者能夠糾正大多數(shù)表現(xiàn)，包括骨質(zhì)疏松(參見(jiàn)Schwartzman，2000，N Engl JMed 343654-656)。以過(guò)量交感神經(jīng)活性為特征的人類(lèi)疾病中骨質(zhì)疏松的存在，以及用β阻斷劑治療后骨質(zhì)疏松的消失和該實(shí)施例中的發(fā)現(xiàn)是一致的。雖然許多藥物能夠有效地阻斷該疾病中的骨損壞，還需要能夠促進(jìn)骨形成的藥物。這里所觀察到的廣泛使用的、沒(méi)有主要有害效應(yīng)的普萘洛爾能夠顯著促進(jìn)骨形成和骨質(zhì)，而不影響體重，說(shuō)明β腎上腺素能拮抗劑或其衍生物可以用語(yǔ)治療骨質(zhì)疏松。
發(fā)明書(shū)中所提到的所有專(zhuān)利和其他出版物代表本發(fā)明所屬領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員水平。所有專(zhuān)利和其他出版物在此引入作為參考，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物具體、單獨(dú)引入作為參考一樣。
本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到本發(fā)明適于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)，獲得所提到的終產(chǎn)品和優(yōu)勢(shì)，以及其中固有的優(yōu)勢(shì)。這里所述的瘦素、瘦素受體、瘦素抗體、瘦素類(lèi)似物、瘦素激動(dòng)劑和拮抗劑、激動(dòng)劑和拮抗劑、藥物組合物、治療、方法、程序和技術(shù)代表優(yōu)選的實(shí)施方案，是示例性的，并不對(duì)范圍作任何限制。其中的變化以及其他用途對(duì)于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是存在的，屬于下面權(quán)利要求書(shū)所定義的范圍。
序列表<110>KARSENTY，GerardSHU，TakedaELEFTERIOU，F(xiàn)lorent<120>通過(guò)調(diào)節(jié)交感神經(jīng)緊張性控制骨形成的方法和組合物<130>AUXT-PCN-006<140>
<141>
<150>PCT/US02/34920<151>2002-10-31<150>60/337,054<151>2001-12-05<160>20<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>17
<212>DNA<213>人<400>1catcttactt cagagaa17<210>2<211>24<212>DNA<213>人<400>2catcttactt cagagaaagt acac24<210>3<211>29<212>DNA<213>人<400>3catcttactt cagagaagta cacccataa 29<210>4<211>35<212>DNA
<213>人<400>4catcttactt cagagaagta cacccataat cctct35<210>5<211>35<212>DNA<213>人<400>5aatcatctta cttcagagaa gtacacccat aatcc35<210>6<211>29<212>DNA<213>人<400>6cttacttcag agaagtacac ccataatcc 29<210>7<211>23<212>DNA<213>人
<400>7tcagagaagt acacccataa tcc 23<210>8<211>17<212>DNA<213>人<400>8aagtacaccc ataatcc17<210>9<211>56<212>RNA<213>人<220>
<221>misc_特性<223>n＝a，u，g，或c<400>9acagaauuuu ugacaaauca aagcagannn nucugagnag uccuuacuuc agagaa 56<210>10
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<221>misc_特性<223>n＝a，u，g，或c<400>10ggcccgggca gccugcccaa agccggnnnn ccggagnagu cgccagaccg gcucgug57<210>11<211>56<212>RNA<213>人<220>
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<221>misc_特性<223>n＝a，u，g，或c<400>12uauaugacaa agcugunnnn acagagnagu ccuugugugg uaaagacacg50<210>13<211>61<212>RNA<213>人<220>
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<210>14<211>69<212>RNA<213>人<220>
<221>misc_特性<223>n＝a，u，g，或c<400>14ugaaauuguu ucaggcucca aagccggnnn nccggagnag ucaagaagag gaccacaugu 60cacugaugc 69<210>15<211>61<212>RNA<213>人<220>
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c 61<210>16<211>53<212>RNA<213>人<220>
<221>misc_特性<223>n＝a，u，g或c<400>16acccauuaua acacaaagcu gannnnucag agnagucauc ugaagguuuc uuc53<210>17<211>21<212>DNA<213>人<400>17tggataaacc cttgctcttc a21<210>18<211>23
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權(quán)利要求
1.治療骨質(zhì)疏松癥狀的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的β腎上腺素能拮抗劑。
2.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括施用治療有效量的瘦素拮抗劑。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中β腎上腺素能拮抗劑選自β1、β2和β3拮抗劑。
4.權(quán)利要求2的方法，其中瘦素拮抗劑選自乙酰苯酚、結(jié)合瘦素的抗體和結(jié)合瘦素受體的抗體。
5.預(yù)防骨質(zhì)疏松癥狀的方法，該方法包括施用能夠有效預(yù)防所述癥狀的一定量的β腎上腺素能拮抗劑。
6.權(quán)利要求5的方法，進(jìn)一步包括施用瘦素拮抗劑。
7.權(quán)利要求5或6的方法，其中β腎上腺素能拮抗劑選自β1、β2和β3拮抗劑。
8.權(quán)利要求6的方法，其中瘦素拮抗劑選自乙酰苯酚、結(jié)合瘦素的抗體和結(jié)合瘦素受體的抗體。
9.治療骨硬化或骨骼石化癥癥狀的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的β腎上腺素能激動(dòng)劑。
10.權(quán)利要求9的方法，進(jìn)一步包括施用治療有效量的瘦素激動(dòng)劑。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中β腎上腺素能激動(dòng)劑選自β1、β2和β3激動(dòng)劑。
12.預(yù)防骨硬化或骨骼石化癥的方法，該方法包括施用β腎上腺素能激動(dòng)劑。
13.權(quán)利要求12的方法，進(jìn)一步包括施用瘦素激動(dòng)劑。
14.權(quán)利要求12或13的方法，其中β腎上腺素能激動(dòng)劑選自β1、β2和β3激動(dòng)劑。
15.調(diào)節(jié)瘦素對(duì)骨的作用的方法，該方法包括向需要所述調(diào)節(jié)的哺乳動(dòng)物施用能夠改變所述哺乳動(dòng)物交感神經(jīng)緊張性的、治療有效量的藥物組合物。
16.調(diào)節(jié)骨質(zhì)的方法，該方法包括向需要所述調(diào)節(jié)的哺乳動(dòng)物施用能夠改變所述哺乳動(dòng)物交感神經(jīng)緊張性的、治療有效量的藥物組合物，使所述哺乳動(dòng)物的骨質(zhì)得以調(diào)節(jié)。
17.治療骨病癥狀的方法，該方法包括向需要所述治療的哺乳動(dòng)物施用能夠改變所述哺乳動(dòng)物交感神經(jīng)緊張性的、治療有效量的藥物組合物。
18.預(yù)防骨病癥狀的方法，該方法包括向需要所述預(yù)防的哺乳動(dòng)物施用能夠改變所述哺乳動(dòng)物交感神經(jīng)緊張性的、有效量的藥物組合物。
19.權(quán)利要求15、16、17或18的方法，其中的藥物組合物包含瘦素激動(dòng)劑。
20.權(quán)利要求15、16、17或18的方法，其中的藥物組合物包含瘦素拮抗劑。
21.權(quán)利要求20的方法，其中的瘦素拮抗劑選自乙酰苯酚、結(jié)合瘦素的抗體和結(jié)合瘦素受體的抗體。
22.權(quán)利要求15、16、17或18的方法，其中的藥物組合物包含交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑。
23.權(quán)利要求22的方法，其中交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑是β腎上腺素能激動(dòng)劑。
24.權(quán)利要求22的方法，其中交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑選自腎上腺素、異丙腎上腺素、多巴胺和杜丁胺。
25.權(quán)利要求15、16、17或18的方法，其中的藥物組合物包含交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑。
26.權(quán)利要求25的方法，其中交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑是β腎上腺素能拮抗劑。
27.權(quán)利要求25的方法，其中交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑選自普萘洛爾、艾司洛爾、美托洛爾、阿替洛爾、醋丁洛爾、酚妥拉明、妥拉唑啉、哌唑嗪、特拉唑嗪、多沙唑嗪、曲馬唑嗪、吲哚胺、苯氧芐胺、二苯扎明、胍乙啶、胍那決爾、利血平和甲基酪氨酸。
28.權(quán)利要求15、16、17或18的方法，其中的藥物組合物包含瘦素激動(dòng)劑和交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑。
29.權(quán)利要求15、16、17或18的方法，其中的藥物組合物包含瘦素拮抗劑和交感神經(jīng)系統(tǒng)拮抗劑的組合。
30.權(quán)利要求16的方法，其中骨質(zhì)增加。
31.權(quán)利要求16的方法，其中骨質(zhì)減少。
32.權(quán)利要求17或18的方法，其中骨病特征是和非發(fā)病骨相比骨質(zhì)減少。
33.權(quán)利要求32的方法，其中的骨病選自骨質(zhì)疏松、骨質(zhì)稀少和佩吉特病。
34.權(quán)利要求17或18的方法，其中骨病特征是和非發(fā)病骨相比骨質(zhì)增加。
35.權(quán)利要求34的方法，其中的骨病選自骨骼石化癥、骨硬化、骨軟骨病和pynchodisostosis。
36.診斷或預(yù)測(cè)哺乳動(dòng)物中骨病的方法，該方法包括(a)測(cè)定懷疑具有骨病的哺乳動(dòng)物的交感神經(jīng)緊張性和瘦素活性；和(b)將步驟(a)中測(cè)得的值和相應(yīng)的對(duì)照值相比較。
37.用于哺乳動(dòng)物的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的β腎上腺素能拮抗劑和瘦素拮抗劑。
38.用于哺乳動(dòng)物的藥物組合物，該組合物包含治療有效量的β腎上腺素能激動(dòng)劑和瘦素激動(dòng)劑。
39.用于哺乳動(dòng)物的藥物組合物，該組合物包括治療有效量的多巴胺β羥化酶和瘦素拮抗劑。
40.權(quán)利要求37、38或39的方法，進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療、診斷和預(yù)防骨病的方法，包括測(cè)定和調(diào)節(jié)交感神經(jīng)緊張性和瘦素活性的方法。通過(guò)降低或增加瘦素合成、瘦素受體合成、瘦素與瘦素受體的結(jié)合以及瘦素受體活性來(lái)改變骨病中的交感神經(jīng)緊張性。還可以將上述方式和傳統(tǒng)的交感神經(jīng)系統(tǒng)激動(dòng)劑和/或拮抗劑聯(lián)用來(lái)改變骨病中的交感神經(jīng)緊張性，這些交感神經(jīng)激動(dòng)劑和/或拮抗劑包括，但不局限于用來(lái)治療或預(yù)防骨質(zhì)疏松的多巴胺β羥化酶拮抗劑或β腎上腺素能拮抗劑。
文檔編號(hào)A61P43/00GK1630514SQ02827858
公開(kāi)日2005年6月22日 申請(qǐng)日期2002年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月5日
發(fā)明者G·卡森蒂, S·塔克達(dá), F·埃勒夫特里歐 申請(qǐng)人:貝勒醫(yī)學(xué)院