專利名稱：具有固定的血小板結合劑的血管閉塞固相試劑的制作方法
(B)對相關申請的交叉參考不適用(C)聯邦贊助不適用(D)發(fā)明背景(D1)發(fā)明領域本發(fā)明涉及通過使用血小板激活作為起始事件產生血管閉塞來產生治療益處的組合物和方法。本發(fā)明的組合物和方法涉及將固相血小板-結合劑遞送到靶位點，使血小板結合和激活從而形成局部血栓。通過局部血栓閉塞靶組織的脈管系統(tǒng)導致必需的氧和營養(yǎng)的喪失，再導致組織退化和最終組織死亡。
(D2)相關技術描述血小板在體內起在血管損傷事件中限制失血的作用。通常，血小板與血液的其它細胞組分一起在身體中循環(huán)，浸浴在各種血漿蛋白質的混合物中，所述血漿蛋白質中許多在凝固過程中起關鍵作用。在血管內皮下膜暴露以后，發(fā)生一系列復雜事件來限制血液從損傷的脈管喪失。與暴露的內皮下膜的組分接觸的循環(huán)的血小板1)結合和粘附，2)擴散越過暴露的表面，3)激活，如由顆粒組分的釋放證明，4)聚集并從血流中補充其它循環(huán)的血小板，和5)形成有效的栓塞，凝塊，和/或血栓，其堵塞來自脈管的血流。
與凝固級聯形成對比，凝固級聯為一個部分由血纖蛋白原至血纖蛋白轉化所定義的過程，血小板在損傷區(qū)域周圍聚結并由與血小板表面特異受體結合的橋連分子結合在一起。血小板和內皮下膜之間的起始橋連依賴于血小板表面的糖蛋白Ib(GPIb)受體和內皮下膜中的von Willebrand因子(VWF)(即固定的VWF)之間的相互作用。該相互作用本身是獨特的，因為在血液中循環(huán)的正常血小板經常與可溶性VWF接觸，但不被激活，它們也不與可溶性VWF結合。體外實驗已經證實將可溶性VWF固定到表面促進血小板的結合和激活。經激活血小板后，另一個受體，糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)被改變，使其能夠結合幾種血漿蛋白質，由此促進血小板/血小板結合。除血纖蛋白原以外，可溶性VWF與活化的GPIIb/IIIa受體結合，再通過GPIb和GPIIb/IIIa變得被固定和能夠結合其它血小板。
在不合適的時間活動過強的血小板可以誘導血栓形成，導致對各種器官和組織的血液供給減少。主要的實例是由血液流經供應心臟的狹窄(窄)脈管誘導的血栓形成。向心肌血流的減少導致梗塞和最終心臟病發(fā)作(心臟細胞死亡)。當栓子或血栓堵塞供給腦的血管時發(fā)生腦局部缺血(短暫性缺血發(fā)作(TIA)；中風)。
存在由血小板激活導致的其它病變，所述血小板激活是不適當的抗體介導的過程的結果。肝素誘導的血小板減少癥(HIT)特征是血小板數量的顯著減少和在預先存在的病理位點形成血栓。接受未分次的、作為促進血流的抗凝劑的肝素的所有患者中的1％-5％產生與肝素結合的抗體，所述肝素與血小板顆粒蛋白復合?？贵w與血小板表面上的肝素/蛋白質復合體的結合誘導血小板迅速激活和局部血栓形成。這又導致被影響區(qū)域的梗塞。
血栓是充分描述的癌的后果。關于高可凝固狀態(tài)是否是癌的預示存在爭論。已經進行許多研究，證明與大部分瘤形成或腫瘤一起的促血栓趨勢。已經提示血栓是外顯惡性病患者最頻繁的并發(fā)癥。
開發(fā)成功的抗腫瘤劑的關鍵是設計將選擇性殺死腫瘤細胞，而對正常組織施加相對很小的，若有的話，副作用的制劑的能力。該目標已經是難以捉摸的因為在腫瘤和正常組織之間存在很少的定性差異。因此，這些年來許多研究已經集中在鑒定可以作為化學療法和診斷的免疫目標的腫瘤特異“標記抗原”。已經鑒定許多腫瘤特異或準腫瘤特異(腫瘤相關)的標記，其是可以被特異性抗體識別的腫瘤細胞抗原。
不幸地，通常情形是腫瘤特異抗體本身和自動將不發(fā)揮足以使它們在癌癥治療中有效的抗腫瘤作用。與它們在淋巴瘤中的功效形成對比，免疫毒素已經證明在實體瘤如癌的治療中相對無效。關于這的主要原因是實體瘤對于抗體大小的分子通常是不滲透的每克腫瘤小于注射劑量的0.001％的比吸收值在人的研究中是常見的。另外，由于幾個原因進入腫瘤塊的抗體分布不均勻。首先，腫瘤細胞和纖維狀腫瘤基質的緊密堆積產生對于大分子遞送難以克服的物理屏障，與淋巴引流的缺少結合在腫瘤中心產生升高的間隙壓力，其減少外滲和流體對流。第二，大部分腫瘤中的血管分布是無組織的和不均勻的。結果一些腫瘤細胞與毛細管大距離分開以致外滲的抗體必須在大體積范圍內擴散以便到達和與遙遠的腫瘤細胞結合。第三，所有進入腫瘤的抗體可能變得被最先遇到的腫瘤細胞吸收在血管周圍區(qū)域，沒留下任何一個到達在更遠位點的腫瘤細胞。
使用抗體克服靶腫瘤的缺點的一種方法是將誘導血栓的試劑靶向腫瘤的脈管系統(tǒng)而不是腫瘤。
本發(fā)明人提出該方法將提供幾個優(yōu)于直接靶向腫瘤細胞的優(yōu)勢。首先，靶細胞能夠直接接近脈管施用的治療劑，允許高百分率的注射劑量的迅速局部化。第二，因為每個毛細管為在它周圍腫瘤帶中的數千細胞提供氧和營養(yǎng)，即使對腫瘤脈管系統(tǒng)有限的損傷也產生大量腫瘤細胞死亡。
本發(fā)明還涉及治療異常組織生長，異常出血(在外科手術期間或之后，產后)，異位妊娠，胎盤前置(placenta previa)，胎盤粘連(placenta accrteta)和子宮肌瘤的組合物和方法。
在某些臨床情形下，理想的是通過閉塞它相關的脈管系統(tǒng)抑制向組織的血流。實例包括出血性中風，在隱靜脈旁路移植外科手術中隱靜脈側支的存在，主動脈瘤的治療，血管畸形的矯正，和實體瘤的治療。
已經使用包括栓塞治療(embolotherapy)的多種技術和材料進行血管閉塞。栓塞治療的實例包括由多種材料組成的顆粒，由膠原組成的物理栓塞(Conston等，US 5,456,693)和線圈(coil)(Mariant，US 5,639,277)的應用，所述材料包括聚乙烯醇(Boschetti，PCT WO0023054)，丙烯酰胺(Boschetti等，US 5,635,215；Boschetti等，US 5,648,100)，聚甲基丙烯酸甲酯(Lemperle，US 5,344,452)。栓塞治療包括通過導管將這些材料遞送到靶脈管系統(tǒng)。因為在任何給定區(qū)域的脈管系統(tǒng)從較大的動脈開始至小動脈至后小動脈至毛細管，每個具有漸小的脈管直徑，遞送的材料(栓塞)繼續(xù)在流動的血液中行進直至它變得進入并固定在較小的血管中，從而阻礙血液流向依附的組織。
本發(fā)明是新穎的和通過使用包被哺乳動物來源的von Willebrand因子(VWF)的固相材料，如微?；蚓€圈或斯坦特固定模(stent)致力于未滿足的醫(yī)療需要。這樣通過將固相血小板-結合試劑遞送到靶位點和引發(fā)有效的導致相關脈管系統(tǒng)閉塞的血栓形成來取得治療益處。
(E)發(fā)明概述本發(fā)明涉及使用通過局部血小板激活誘導血栓形成的固相試劑用于靶組織和/或器官，和相關脈管系統(tǒng)的治療方法和組合物，所述靶組織和/或器官，和相關脈管系統(tǒng)實質上是增生性的或腫瘤的，或具有動靜脈畸形，或正在出血。組合物包含將血小板捕獲在固相試劑如線圈或斯坦特固定?；蝾w粒上的試劑。在本發(fā)明的一些實施方案中，固相試劑不但捕捉而且激活血小板。方法利用在固相顆粒上局部化血小板集合和激活血小板來產生隨后的血栓形成，由此限制向靶區(qū)域的血液供應，而未誘導全身性的或系統(tǒng)的前血栓形成狀態(tài)。
有目的的在患者中誘導血栓形成初看起來似乎是反直覺的，因為眾所周知血栓形成顯著有助于患者的發(fā)病率和死亡率。本發(fā)明固相血小板介導的閉塞是基于利用身體響應固定的von Willebrand因子(VWF)或其它局部作用的血小板激活劑產生血栓的天然能力而位點特異性誘導血栓形成。盡管VWF以可溶性形式在血流中循環(huán)，直至分子作為內皮下膜的一部分被暴露或與暴露的來自內皮下膜的膠原結合它才能夠捕獲血小板和誘導血小板激活。
固相血小板-結合劑與來自患者的血液(體外)或血流中的血液(體內)接觸誘導血小板結合和局部激活，導致固相試劑周圍的血小板增加，其導致血栓形成和向由閉塞的血管供應的組織的血流的中斷。細胞，包括腫瘤細胞或增生組織，由于局部血流的喪失而減小或死亡。該方法避免全身的血小板激活和血栓形成；依賴于固定的VWF(但不是可溶性VWF)與循環(huán)的血小板結合并將其激活的事實。因此，本發(fā)明的方法和組合物是間接的治療病理疾病如癌，增生性細胞，大出血或動靜脈(AV)畸形的方法。
本發(fā)明在現有的用于治療實體瘤，增生組織，大出血和AV-畸形和其中血小板(靜止的和/或活化的)可能起治療作用的其它任何疾病或狀況的方法上改善。
以類似于現有病理狀況(即肝素誘導的血小板減少癥[HIT])的方式，通過將人Fc片段包括或結合到固相試劑上的Fc-介導的方法，或通過將選擇抗體導向靶區(qū)域可以增強局部的血小板激活。在HIT綜合癥中的血小板激活導致局部的血栓形成和向受侵襲區(qū)域的血流的中斷。這導致受侵襲組織的死亡。
位點特異性的血栓形成的范圍或程度可以以各種方法控制。通過使用抗血小板試劑(例如GPIIb/IIIa抑制劑，阿斯匹林，潘生丁等)抑制血小板激活以確定的、可滴定的方式減小了誘導血栓的趨勢。改變局部血流，血壓和組織溫度還可以作為控制局部血小板激活至刺激的方法。
典型的血管化腫瘤是實體瘤，特別是癌，其需要豐富的脈管血液供應。本發(fā)明涉及的典型實體瘤包括，但不限于肺，乳房，卵巢，胃，胰，喉，食管，睪丸，肝，腮腺，膽道，結腸，直腸，子宮頸，子宮，子宮內膜，腎，膀胱，前列腺，甲狀腺，頭和頸的原發(fā)惡性腫瘤，黑素瘤，神經膠質瘤，成神經細胞瘤，神經內分泌腫瘤等。本發(fā)明涉及的其它病癥包括但不限于上述腫瘤類型的繼發(fā)性(轉移)瘤，癌性疼痛，AV-畸形，子宮肌瘤，骨盆充血，經痛，精索靜脈曲張，咯血，動脈瘤，內臟動脈動脈瘤，假動脈瘤和內漏(endoleak)。
本發(fā)明優(yōu)選方法包括制備包被重組或哺乳動物來源的VWF的線圈或斯坦特固定模和將VWF-包被的試劑導入動物如人類患者，動物患者，或試驗動物的血流中；然后將VWF遞送或匯集在期望的靶位點。線圈或斯坦特固定模可以由任何適當的材料構造，該材料能夠將VWF保持在線圈或斯坦特固定模內部或在線圈或斯坦特固定模的表面上不定的或變化長度的時間。
針對實體瘤無限制生長的問題的解決方案是攻擊腫瘤中的血管。該方法提供幾個優(yōu)于直接靶向腫瘤細胞的方法的優(yōu)勢。首先，腫瘤脈管能夠直接接近脈管施用的治療劑，因此允許高百分率的注射劑量的迅速局部化，第二，因為每個毛細管為在它周圍腫瘤帶中的數千細胞提供氧和營養(yǎng)，即使對腫瘤脈管系統(tǒng)有限的損傷也可產生大量腫瘤細胞死亡。最后，血管在不同腫瘤中是類似的，使開發(fā)治療多種類型的癌的單一試劑是可行的。
(F)附圖
描述不適用(G)發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于將血小板捕獲在預定位點，激活血小板，和利用血小板的天然功能來取得有益的治療結果的組合物和方法。按照本發(fā)明，血小板可以是循環(huán)的血小板或者可以是從外源獲得的血小板。按照本發(fā)明，可以將血小板靶向特異性位點，然后可以利用血小板誘導血栓形成的天然能力來阻止，中斷，或減少該位點的血流。減少的血流伴隨著減少對疾病或病癥體(condition agent)如腫瘤的營養(yǎng)供應，因此疾病體(disease agent)的尺寸減小。減小腫瘤大小是明顯的治療益處，這一點是清楚的。在一些情形中減少對靶區(qū)域的血液供應減輕疼痛。
本發(fā)明還包括使用能夠結合和激活血小板的固相試劑將血小板靶向能夠被選擇性靶向的預定組織，例如增生組織。在本發(fā)明的這些實施方案中，靶向是指包含與預定位點或組織特異性結合的靶向部分例如配體等的固相。在本發(fā)明的其它實施方案中，靶向可以包括例如通過導管，斯坦特固定模，或線圈將本發(fā)明的組合物遞送到或接近腫瘤位點。在預選的位點激活血小板通過減少對組織或位點的營養(yǎng)供應導致治療益處。
本發(fā)明提供通過將血小板捕獲在固相試劑上誘導血栓形成，誘導血小板激活，和使血栓形成的組合物和方法。靶脈管系統(tǒng)的血栓形成減少對下游組織的血液供應。通過將血小板捕獲在包含VWF的固相(例如包被的顆粒)上，本發(fā)明的組合物和方法可以用于治療癌，增生，子宮肌瘤，骨盆充血，經痛，AV-畸形，神經栓塞，精索靜脈曲張，咯血，內臟動脈動脈瘤，動脈動脈瘤，內漏等。另外，本發(fā)明的組合物和方法為組合物的受者提供治療益處。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，VWF是哺乳動物來源。在本發(fā)明最優(yōu)選實施方案中，VWF是人源的。在本發(fā)明另一最優(yōu)選實施方案中，VWF是豬源的。
VWF可以是天然的，合成的，重組的，或符合VWF生物活性部分的肽序列。在本發(fā)明的另一最優(yōu)選實施方案中，VWF是重組來源。
本發(fā)明還提供將血小板結合劑(例如VWF)與固相直接或通過間隔物間接結合的組合物，只要血小板結合劑結合血小板的能力不受損害。間隔物在本文中是指在物理上將血小板結合劑從固相試劑的表面分開的一組惰性或活性分子。例舉的間隔物在下面描述。直接結合可以共價或非共價地發(fā)生。間接結合可以通過間隔物發(fā)生，所述間隔物包括但不限于肽間隔臂，抗體間隔物，抗體片段間隔物，融合蛋白間隔物或糖間隔物。這些間隔物通常只作為顆粒和VWF之間的橋；然而，間隔物還可以用于改變血小板激活的程度。例如，Fc組分可以用作間隔物，由此在固相試劑上和周圍實現增強的血小板激活。使用本領域技術人員已知的方法可以發(fā)生VWF與固相試劑的偶聯。偶聯劑的實例包括但不限于戊二醛和碳二亞胺。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，不含活性靶向試劑的組合物在哺乳動物脈管系統(tǒng)中的定位將通過在通過高度選擇性微型導管遞送后定向定位的血流選擇。
按照本發(fā)明的組合物還可以包括能夠與靶抗原或在脈管內皮或靶組織上的位點結合的靶向試劑或部分，由此使固相試劑能夠定位在所選位點。例舉的靶向試劑或部分對于本領域的技術人員是眾所周知的，包括但不限于抗體，配體，受體，激素，植物血凝素，和鈣粘著蛋白，或其部分或片段。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，靶向試劑將包括具有生物素，生物素模擬物(mimetic)和/或肽組分的抗體或抗體樣分子。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，抗體或抗體樣分子將指向生長因子/受體復合體。
按照本發(fā)明的組合物還可以包括下列的一種或多種一種或多種血小板結合調制劑(例如抑制劑或增強劑)，一種或多種血栓形成控制劑或一種或多種補體級聯組分。
按照本發(fā)明的方法還可以包括施用能夠在預定位點結合血小板的固相試劑；還可包括誘導捕捉的血小板的激活；施用具有抗原決定簇和血小板結合位點的雙功能結合劑；通過改變本發(fā)明一種或多種組合物的溫度，或通過改變預選位點處的溫度控制血栓產生。
按照本發(fā)明的方法可以另外包括以下的一項或多項施用一種或多種血小板結合調制劑，施用一種或多種血栓形成調制劑；施用一種或多種補體級聯組分；施用一種或多種配體和/或抗-配體，其用于將固相結合到預定位點，和/或用于將血小板結合部分或組分與固相結合。
本發(fā)明還包括試劑盒，其可以包含但不限于任何或所有的以下組分，組分包括用于將血小板靶向內皮膜元件的固相試劑用于結合血小板的結合劑；用于結合內皮膜元件的配體；配體偶聯物；用于結合配體或配體偶聯物的抗配體；血小板結合調制劑(增強劑和/或抑制劑)；血栓形成調制劑；補體級聯組分；補體級聯組分誘導物；和包括抗配體的用于結合血小板的結合劑。試劑盒可以包括雙功能結合劑，和/或結合劑-配體偶聯物，和/或血小板結合劑-抗配體偶聯物。
本發(fā)明的組合物和方法包括將組合物遞送到預選位點的任何機理，所述遞送包括但不限于全身地，局部地，口服地，或表面地(topically)。
按照本發(fā)明的一些實施方案，將結合劑用于在預定位點捕捉血小板。定義在本文中，固相試劑是指適合用于結合，包含，或保留血小板結合劑的任何固體材料。血小板結合劑可以被吸附到固相試劑以使血小板結合活性被保留，例如在靶位點或在靶位點內部。固相試劑可以是線圈，斯坦特固定模，或顆粒，例如珠或類似物，所有這些對于本領域技術人員是眾所周知的。
在本文中，顆粒是指能夠包含或保留血小板結合劑的固相材料的分離部分或一部分。本發(fā)明的優(yōu)選方法包括制備包被重組或哺乳動物來源的VWF的顆粒和將包被VWF的顆粒導入動物如人類患者，動物患者，或試驗動物的血流中。在本文中，術語“顆粒”是指能夠直接或間接(例如通過配體)結合血小板的任何固相材料。關于尺寸，顆?？梢允蔷鶆蚧虿痪鶆虻?。具體地，顆粒可以是球形(包括橢圓形)或不規(guī)則形?？梢杂萌魏芜m當的材料構建顆粒，該材料能夠將VWF保留在顆粒內部或顆粒表面上不確定的或變化長度的時間。例舉的材料包括聚乙烯醇(PVA)，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚交酯，聚乙醇酸交酯，丙交酯-乙交酯共聚物，聚己酸內酯，丙交酯-己內酯共聚物，聚羥基丁酸酯，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚酐，聚原酸酯，清蛋白，膠原，明膠，多糖，葡聚糖，淀粉，甲基丙烯酸酯，甲基丙烯酸，丙烯酸羥烷基酯，甲基丙烯酸羥烷基酯，亞甲基二醇二甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，基于纖維素的聚合物，乙二醇聚合物和共聚物，氧化乙烯和氧化丙烯聚合物，聚乙酸乙烯酯，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡啶，磁性顆粒，熒光顆粒，動物細胞，植物細胞，大顆粒聚清蛋白和小顆粒聚清蛋白(micro-aggregated albumin)，變性蛋白聚集體和脂質體，單獨或結合使用。適用于本發(fā)明的固相材料對于本領域技術人員是眾所周知的，應當不限于上述列舉的那些例證性材料。
形成斯坦特固定模或線圈的例舉材料包括但不限于聚乙烯醇(PVA)，聚苯乙烯，聚碳酸酯，聚交酯，聚乙交酯，丙交酯-乙交酯共聚物，聚己酸內酯，丙交酯-己內酯共聚物，聚羥基丁酸酯，聚烷基氰基丙烯酸酯，聚酐，聚原酸酯，多糖，葡聚糖，淀粉，甲基丙烯酸甲酯，甲基丙烯酸，丙烯酸羥烷基酯，甲基丙烯酸羥烷基酯，亞甲基二醇二甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，雙丙烯酰胺，基于纖維素的聚合物，乙二醇聚合物和共聚物，氧化乙烯和氧化丙烯聚合物，聚乙酸乙烯酯，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯吡啶；磁性材料，熒光材料；金，鉑，鈀，錸，銠，釕，不銹鋼，鎢，鈦，鎳及其合金；單獨或結合使用。
固相材料的優(yōu)選尺寸取決于所用材料的類型。例如，本領域技術人員將認識到如果固相是斯坦特固定?；蚓€圈，大小優(yōu)選為在血管如動脈范圍內的直徑。典型地直徑可達約15mm或更大。如果固相是顆粒，如珠，直徑可達約7mm，優(yōu)選約1μm至約5mm，甚至更優(yōu)選約20μm至約300μm。適用于本發(fā)明的固相材料的尺寸對于本領域的技術人員是眾所周知的，并應當不限于以上列舉的例證性大小。
在本文中，結合劑或靶向部分是指用于將一種物質與另一種結合的一種或多種固相化學或生物分子或構件。具體地，結合劑，或固相試劑與在限定細胞群體，典型地增生組織和/或相關脈管系統(tǒng)，或癌細胞和/或相關脈管系統(tǒng)上的配體，受體或配體/受體復合體結合。分子作為結合劑的功能不應當受限于附著的結構機理。例如，結合劑可以結合受體，抗原決定簇或表位，酶底物，或將結合劑與靶細胞或細胞群體連接的其它生物構件。結合劑可以是偶聯物，包括但不限于免疫偶聯物，化學偶聯物(共價或非共價)，融合蛋白等。
在本文中，配體結合劑是指顯示彼此特異性結合的互補的一組分子。配體/抗配體對通常以相對高的親和力結合，為此，對于本發(fā)明的應用可能是高度理想的。非常著名的配體/抗配體對是生物素和抗生物素蛋白。在本文中，抗生物素蛋白是指抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素蛋白，中性抗生物素蛋白，其衍生物和類似物，及其功能等價物?？股锼氐鞍卓梢砸远鄡r或單價方式與生物素結合。其它例舉的配體/抗配體對包括但不限于同源肽，異源肽，“亮氨酸拉鏈”，鋅指蛋白/雙鏈DNA片段，酶/酶抑制劑，半抗原/抗體，配體/配體受體，和生長因子/生長因子受體。
在本文中，所選位點，預定位點，靶向，和預先靶向全都指其中在固相試劑周圍的血小板累積將提供治療有益的結果的位點。典型地，這涉及靶向部分的靶位點定位。該位點包括但不限于實體瘤的脈管系統(tǒng)，良性瘤的脈管系統(tǒng)，增生組織的脈管系統(tǒng)，AV畸形，脈管動脈瘤和內漏。
在本文中，使用導管，微型導管或通過針和注射器可以發(fā)生包含血小板結合劑的固體試劑的遞送。最經常通過動脈循環(huán)進入來實現通過導管或微型導管的遞送，然而通過靜脈循環(huán)遞送固體試劑也是理想的。例如，利用動脈或靜脈循環(huán)通過對靶位點的導管可以遞送顆粒，線圈或斯坦特固定模形式的固體試劑。利用動脈循環(huán)的固體試劑的遞送是有利的，因為在靶組織中施用試劑下游的毛細血管床作為捕捉試劑的工具，由此防止試劑進入體循環(huán)。還可以使用與固體試劑有關的靶向試劑將固體試劑定位在動脈循環(huán)內部。利用靜脈系統(tǒng)的固體試劑的遞送也是理想的?？梢酝ㄟ^使用與固體試劑有關的靶向試劑將固體試劑與靶位點結合來完成固體試劑在靜脈系統(tǒng)中的定位遞送。還可以在外科手術過程中將固體試劑遞送到靶位點。例如，通過注射器和針可以將顆粒形式的固體試劑遞送到靶位點。作為另一實施例，在外科手術過程中可以手工地將線圈或斯坦特固定模形式的固體試劑放置在靶位點。
在本文中，血栓是指陷于血纖蛋白中的血細胞的任何半固體聚集體和來源于血小板與固相試劑活性結合的血小板的凝塊。按照本發(fā)明，作為活化的血小板在預定位置累積的直接結果形成血栓。血栓形成是指血栓的形成，典型地在血管中。形成血栓的是指易于導致血塞形成，或血栓形成的物質。
在本文中，栓塞是指血管內的團塊，其通過血流，和通過大小約束最終變成進入并固定在血管或毛細管中，遠離血管內團塊的起始位點。栓塞形成不意味著主動過程，而是指被動過程，由此通過血管內團塊穿過血流，在那它們變得進入并固定在小血管和毛細管中而發(fā)生血管閉塞。
相反，本發(fā)明涉及固相材料至靶脈管系統(tǒng)的遞送，因此通過使用血小板結合劑將血小板活性補充在固相表面。與包括在此作為參考的引用的專利中所述的栓塞材料形成對比，由于血小板在固相材料周圍的迅速累積，必須將本發(fā)明的試劑遞送到接近靶脈管系統(tǒng)。
例如，由Draximage(Kirkland，Quebec，Canada)提供的大分子聚清蛋白(macro-aggregated albumin)(MAA)，例如被用作栓塞顯象劑。MAA由大小為10μm-70μm，最大尺寸為150μm的顆粒組成，所述顆粒用高锝酸鈉Tc 99m放射性標記以使閃爍照相術成像。將MAA顆粒靜脈內注射，并作為栓塞穿過血流，其中它們被捕獲在肺的肺泡毛細血管床中。使用本發(fā)明的方法，將VWF固定在MAA上，隨后將顆粒注射到血管系統(tǒng)中導致血小板與顆粒立即結合和接近注射位置的脈管系統(tǒng)的閉塞。
本發(fā)明在現有的產生血管閉合的方法上改善，通過使用血小板結合劑將血小板固定在固相材料的表面，由此增加固相材料的有效尺寸。例如，被注射到血流中的包被或含有VWF的顆粒將在它的表面上迅速累積血小板，在接近注射位置有效產生分層的，活化的血小板的“洋蔥-效應”。因此本發(fā)明能夠將最少量的小顆粒遞送到血流中，因此顆粒由與顆粒上或內部的血小板結合劑活性結合的血小板的增加而在尺寸上迅速增加。此外，顆粒結合的血小板將彼此相互作用，由此形成增加尺寸的聚集體，其產生緊密的基質和引起靶脈管系統(tǒng)的閉塞。
本發(fā)明另外在現有的產生血管閉塞的方法上改善，通過血小板結合劑將血小板固定在固相材料的表面。本發(fā)明的試劑因此將具有下列體內效應a)模塑它滯留的血管或毛細管的輪廓，b)產生固體，不滲透的三維基質；這又在脈管中產生緊密的，不滲透的密封，由此最大地抑制血液向下游血管和組織的遞送。
例如，將血小板結合顆粒導入血流將進行經過下列順序的事件a)在顆粒表面上將形成單層血小板，由此形成(i)增加直徑的顆粒和(ii)包被活化血小板的顆粒，其有結合和激活懸浮液中附近的血小板的傾向，此處定義為‘單層的表面活化的血小板’顆粒(S-SAP顆粒)，(b)在血流中流動的血小板將與結合形成‘洋蔥樣’層的S-SAP顆粒的血小板相互作用，此處定義為‘多層的表面活化的血小板顆粒(M-SAP顆粒)，c)M-SAP將通過形成較大聚集體的血小板/血小板相互作用而彼此相互作用，此處定義為‘M-SAP基質’。
作為另一個實例，通過下述事件將進行將包含或具有表面結合的血小板結合劑(如VWF)的無定形血小板結合顆粒(如MAA)引入到血流中；a)單純的(single)血小板將結合到顆粒的基質上或內部，從而形成(i)具有增加的直徑和剛性的顆粒，(ii)包被以并包含活化的血小板的顆粒，所述血小板具有結合和活化懸浮液中附近血小板的傾向；b)在血流中流動的血小板將與結合到和/或結合入顆粒的血小板相互作用，從而在顆粒內部和/或顆粒上形成聚集體，c)包含和/或具有表面結合的血小板的顆粒將彼此相互作用以形成大的顆粒聚集體。
在本文中，提供治療益處等等的治療有益的是指受體動物的生理的理想變化。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，變化是可以檢測的。按照本發(fā)明，可以使用或利用涉及活化血小板或血小板調節(jié)的任何生物機理來取得有益的治療結果。按照本發(fā)明產生的例舉的治療益處包括但不限于形成血栓，形成血小板介導的閉塞，消除增生組織或細胞，消除腫瘤和/或腫瘤細胞，減小增生組織的尺寸，減小腫瘤的尺寸，使增生組織或腫瘤變得對另外的治療如化學療法和/或放射療法等等敏感，缺乏或減少對增生組織或癌的營養(yǎng)供應，修復AV-畸形，減少或防止血液從內漏中損失和修復脈管動脈瘤。
在本文中，“施用”是指導致包含固相試劑的組合物遞送到預定細胞，多種細胞，或組織，典型地哺乳動物的任何行為。施用可以體內，體外，或離體進行。例如，可以通過注射或通過內鏡或導管施用組合物。施用還可以包括直接將按照本發(fā)明的組合物施用到細胞。例如，在外科手術期間，腫瘤或增生組織的脈管系統(tǒng)可能被暴露。按照本發(fā)明的實施方案，例如通過洗滌或沖洗外科手術部位，脈管系統(tǒng)，和/或細胞可以將暴露的細胞或脈管系統(tǒng)直接暴露于本發(fā)明的組合物。
使用結合或靶向試劑可以將固相血小板結合劑定位在特定的靶位點。例舉的結合或靶向試劑包括但不限于單克隆抗體；多克隆抗體；嵌合單克隆抗體；人源化抗體；遺傳工程抗體；抗體片段，其選自F(ab)2，F(ab’)2，Fab，F(ab’)，Dab，Fv，sFv，scFv，Fc，和最小識別單位；表示單克隆抗體活性部分的單鏈(SC-Mab)；腫瘤結合肽；蛋白質，包括受體蛋白質；肽；多肽；糖蛋白；脂蛋白等等，例如生長因子；淋巴因子和細胞因子；酶，免疫調制劑；激素，例如促生長素抑制素；配體(與它的互補抗配體配對)；寡核苷酸；與介導效應子功能的分子結合的上述任何一種；和上述任何一種的模擬物或片段。保持與確定靶細胞群體結合能力的以上所列靶向部分的類似物也可以用于所要求的本發(fā)明中。另外，可以設計合成的靶向部分。
用于本發(fā)明的實施中的單克隆抗體包括完整的抗體及其片段。該單克隆抗體和片段可以按照常規(guī)技術，如雜交瘤合成，重組DNA技術和蛋白質合成來生產。有效的單克隆抗體和片段可以衍生于任何物種(包括人類)或可以作為利用來自多于1種物種的序列的嵌合蛋白形成。通常參見Kohler和Milstein，Nature，256495-97，1975；Eur.J.Immunol.，6511-19，1976。優(yōu)選的能夠將固相試劑定位在靶位點的結合和/或靶向試劑是抗體或抗體樣分子，優(yōu)選單克隆抗體。更優(yōu)選的結合劑是結合配體/受體復合體的抗體，所述配體/受體復合體在增生組織或細胞(例如腫瘤)或與增生組織或細胞有關的脈管系統(tǒng)上。最優(yōu)選的結合劑是抗體或抗體樣分子，其與腫瘤塊如腫瘤脈管系統(tǒng)上或附近的生長因子/生長因子受體復合體結合。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，結合劑(即抗體或抗體樣分子)將與VEGF/VEGF受體復合體結合。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，抗體或抗體樣分子結合將識別由于配體/受體(即生長因子/生長因子受體)相互作用形成的新表位(隱蔽的或先前不可用的表位)。在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方案中，抗體或抗體樣分子與生長因子/生長因子受體復合體的結合將不影響生長因子或生長因子受體的功能。
在本發(fā)明的實施中寡核苷酸，例如與靶細胞核酸(DNA或RNA)的部分互補的反義寡核苷酸也有效用作靶向部分。與細胞表面結合的寡核苷酸也有效。
上述分子的功能等價物也有效用作本發(fā)明的靶向部分。一種靶向部分功能等價物是“模擬”化合物，一種設計來模擬用于靶向部分-靶細胞結合的適當構象和/或定向的有機化學構建體。另一靶向部分功能等價物是稱為“最小”多肽，使用計算機輔助分子模型和具有改變的結合親和力的突變體構建的短多肽，該最小多肽顯示靶向部分的結合親和力。
免疫球蛋白的Fv片段對于定向腫瘤治療來說具有許多優(yōu)于完整免疫球蛋白的顯著的優(yōu)勢，包括在實體瘤組織上更好的損傷穿透和更迅速的血液清除，以及可能更低的Fc介導的免疫原性。典型的單鏈Fv(scFv)結合劑可以從分離自識別配體/受體復合體的抗體的可變區(qū)的基因來設計。
本發(fā)明的實施方案涉及與正常非腫瘤相關脈管系統(tǒng)相比，具有對標記的結合親和力的靶向試劑，該標記被發(fā)現，表達，易于結合，或另外定位在腫瘤相關脈管內皮細胞的細胞表面上。另外，靶向試劑具有結合親和力的某些標記可以與腫瘤相關脈管系統(tǒng)的組分有關而不是在腫瘤相關內皮細胞本身上。例如，該標記可以位于基底膜或腫瘤相關結締組織上。
制備和使用如通過組織切片的免疫染色評估具有對腫瘤脈管系統(tǒng)相對高程度的選擇性，和與正常內皮細胞的細胞表面的很小或無反應性的抗體或其它結合劑或部分可能是理想的。制備和使用能夠結合所有脈管系統(tǒng)共有的表位的抗體或其它結合劑或部分也可能是理想的。
可以使用按照本發(fā)明的含有或不含靶向試劑的包括固相血小板-結合劑的任何組合物來引發(fā)體內治療益處，血栓形成，和/或細胞致死或退化。組合物可以包括一種或多種佐劑，一種或多種載體，一種或多種賦形劑，一種或多種穩(wěn)定劑，一種或多種滲透劑(例如，調節(jié)穿過細胞膜運動的試劑)，一種或多種顯像劑，一種或多種效應物；和/或生理可接受的鹽水和緩沖劑。通常，佐劑是與免疫原混合以便引發(fā)更顯著免疫應答的物質。組合物還可以包括藥用載體。藥用載體包括但不限于鹽水，無菌水，磷酸鹽緩沖鹽水等。在本發(fā)明的組合物中可以包括適于遞送給患者的其它緩沖劑，分散劑，和惰性非毒性物質。組合物可以是適于給藥的溶液，典型地是無菌的，非熱源性的和不含不希望有的顆粒物質。通過常規(guī)滅菌技術可以將組合物滅菌。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，適當的組合物包括與配體/受體復合體結合的結合劑或靶向試劑。按照本發(fā)明用作靶子的示例性抗原包括但不限于癌相關抗原，所述癌包括肺，結腸，直腸，乳房，卵巢，前列腺，頭，頸，骨，免疫系統(tǒng)，血液，或其它任何解剖位置。示例性抗原和/或預定位點包括但不限于VEGF/VEGF受體復合體，FGF/FGF受體復合體，或TGF.β/TGF.β受體復合體，p-選擇蛋白，唾液酸-路易斯X(sialy-lewis X)，內皮縮血管肽，內皮縮血管肽受體，內皮縮血管肽/內皮縮血管肽受體復合體，AFP甲胎蛋白，血小板-內皮細胞粘附分子(PECAM)，CD31，CD34，CD36，糖蛋白Ib(GPIb)，endoglin，凝血調節(jié)蛋白，內皮白細胞粘附分子(ELAM)，胞間粘附分子1(ICAM-1)，MHC-1，和MHC-II。受試者可以是人或動物受試者。
如上所述，本發(fā)明的組合物或方法包括血小板結合劑或組分。示例性血小板結合劑或組分包括但不限于von Willebrand因子(VWF)，骨橋蛋白，血纖蛋白原，血纖蛋白，纖連蛋白，玻連蛋白，膠原，血小板反應蛋白，層粘連蛋白，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，磷脂酶A2(PLA2)，基質金屬蛋白酶(MMPs)，凝血酶，玻璃，唾液酸-路易斯X，fibulin-1，血小板-內皮細胞粘附分子(PECAM)，胞間粘附分子1(ICAM-1)，胞間粘附分子2(ICAM-2)，CD11b/CD18(MAC-1)，CD11a/CD18(LFA-1)，p-選擇蛋白糖蛋白配體1(PSGL-1)，單獨地或組合。
如上所述，本發(fā)明的組合物或方法可以包括血小板介導的閉塞增強劑。血小板介導的閉塞增強劑可以是形成以上所述雙功能分子一部分的部分，可以是按照本發(fā)明的組合物中的成分，和/或可以與按照本發(fā)明的組合物分開施用。
示例性的血小板-介導的閉塞增強劑包括但不限于瑞斯托菌素，凝血酶，肝素誘導的血小板減少癥(HIT)抗體或其部分，抗磷脂抗體(APA)或其部分，通過Fc-介導機理的全抗體分子，抗LIBS抗體，抗CD9抗體，腎上腺素，凝血酶受體激活肽(TRAP)，蛋白酶(proteinase)活化的受體(也稱為蛋白酶(protease)活化的受體，PAR)拮抗劑，組織蛋白酶G，彈性蛋白酶，花生四烯酸酯，血小板活化因子(PAF)，血栓烷A2(TxA2)，TxA2模擬物，磷脂酶A2(PLA2)，蛋白激酶C(PKC)的激活劑，腺苷二磷酸(ADP)，環(huán)加氧酶1(COX-1)的誘導物，環(huán)加氧酶2(COX-2)的誘導物，膠原，von Willebrand因子(VWF)，基質金屬蛋白酶(MMPs)，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，離子載體，補體級聯組分(例如C5b-9)血小板微粒，血小板膜級分。
如上所述，本發(fā)明的組合物或方法可以包括血小板介導的閉塞阻滯劑等。血小板介導的閉塞阻滯劑可以是形成如上所述的雙功能分子一部分的部分，可以是按照本發(fā)明的組合物中的成分，和/或可以與按照本發(fā)明的組合物分開施用。
示例性的血小板介導的閉塞阻滯劑包括但不限于阿斯匹林，布洛芬，對乙酰氨基酚，酮洛芬，噻氯匹定，氯吡格雷，吲哚美辛，雙嘧達莫，ω-3脂肪酸，前列環(huán)素，氧化氮，氧化氮的誘導物，氧化氮合成酶的誘導物，基質金屬蛋白酶抑制劑(MMPIs，TIMPs)，抗GPIIb/IIIa試劑，抗αvβ3試劑，抗α2β1試劑，抗CD36試劑，抗GPVI試劑，金精三羧酸，凝血酶受體拮抗物，血栓烷受體拮抗物，鏈激酶，尿激酶，組織纖溶酶原激活物(tPA)。
另外，已知已經被冷卻至低于它們膜相變溫度(即＜15℃)的血小板變得不可逆地活化。盡管如果灌輸到患者中的血小板正常起作用，血小板也被迅速清除出身體(即，在約24小時內，和7-10天的正常循環(huán)血小板的壽命形成對比)。盡管這些血小板被迅速清除，它們以高親力合與固定的VWF結合。因此，冷卻的血小板的灌輸提供另外的增強在靶位點血栓形成的方法。因此，本發(fā)明的一個實施方案包括通過施用如上所述冷卻的血小板控制血小板介導的閉塞。
如上所述，靶向部分可以是，或可以結合至結合對的一個成員。按照本發(fā)明的方法可能要求足夠的時期來在固定位點累積靶向部分，對非目標累積的最佳靶向，累積和結合結合對的第二個成員，和/或清除未結合的物質。
按照本發(fā)明，可能使用兩步，三步或更多靶向或定位步驟。這些方案中許多在本領域是眾所周知的(參見，例如，使用生物素/抗生物素蛋白方案的美國專利5,578,287)。示例性的多步方案包括但不限于施用結合劑-配體，施用抗-配體以清除未結合的結合劑和局部化結合的結合劑-配體，和施用活化劑-配體。在本文中，活化劑是指任何活性或變成活性和導致治療益處的治療劑。
按照本發(fā)明的方法，結合劑必須能夠結合配體/受體復合體，并可以通過任何在免疫學上適當的路線施用于患者。例如，可以通過靜脈內，動脈內，皮下，腹膜內，鞘內，膀胱內，真皮內，肌內，或淋巴管內(intralymphatic)途徑將結合劑導入患者。組合物可以是固體，溶液，片劑，氣溶膠，或多相制劑形式。脂質體，長期循環(huán)脂質體，免疫脂質體，生物可降解微球體，微團等也可以用作載體，賦形劑，或遞送系統(tǒng)。另外，使用本領域眾所周知的離體方法，可以將血液，血漿或血清從患者中取出；任選地，純化患者血液中的抗原可能是理想的；血液或血清然后可以與組合物混合，所述組合物包括按照本發(fā)明的結合劑或固相試劑；將處理過的血液或血清返回至患者。臨床醫(yī)師可以比較與這些不同的途徑相關應答來確定最有效的給藥途徑。本發(fā)明不應當限制于任何具體的將結合劑導入患者的方法。
給藥可以是一次，多次，或持續(xù)延長的時期。因為本發(fā)明的組合物可以用于處于嚴重疾病狀態(tài)，即生命危險或可能生命危險的患者，如果需要可以施用過量的固相試劑。用于施用藥物組合物的實際方法和方案，包括注射本發(fā)明組合物的稀釋技術，是眾所周知的或對本領域的技術人員將是明顯的。這些方法和方案中的一些在Remington’s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Co.(1982)中描述。
固相試劑可以與其它結合劑結合給藥，或可以結合其它治療方案或試劑，例如化學治療劑，栓塞劑如明膠海綿或聚乙烯醇(PVA)顆粒等給藥。
如在本領域眾所周知，與體內施用治療劑或治療劑偶聯物相關的缺點包括非目標或不希望有的目標結合。因此最小化非目標結合，最小化非目標暴露于治療劑或活化劑，和/或最大化清除未結合的結合劑，配體，或活化劑是任何施用的組合物的理想屬性。此外，最優(yōu)化這些屬性典型地允許施用更高劑量的活化劑，治療劑，或激活先前未激活試劑的方法的成分。本領域的技術人員精通于選擇施用最高可能的劑量而安全地保持在毒性閾值以下的最佳參數。
因此，按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，未活化的血小板通過與固相試劑結合累積或被誘導累積在預定位點，然后適當固定的血小板被選擇性地激活。
按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，激活的血小板通過與固相試劑結合或通過與固相試劑結合的血小板累積或被誘導累積在預定位點。
本發(fā)明的有效性可以通過測定血栓形成，血栓形成的形態(tài)測量研究，腫瘤壞死，腫瘤大小，腫瘤形態(tài)學，和/或導致腫瘤壞死的血栓形成，血流研究(例如血管造影術，多普勒超聲，放射顯影，CT掃描，MRI)，或疼痛癥狀的減輕的常規(guī)試驗來監(jiān)視。本領域的技術人員將認識到可以進行其它試驗來評估或監(jiān)視治療益處。
本領域的技術人員將認識到對于某些先天性和病理學癥狀，其中一些所列如下，理想的是改進本發(fā)明的組合物或方法來補償患者過度流血或形成血栓的體質。在這些情形下，可以利用增強或抑制本發(fā)明的方法或組合物的改良劑的應用。這些改良劑的應用預計最小化流血或凝固事件。此外，改良劑的應用能夠在正常情形(即正常止血)下控制給藥按照本發(fā)明的組合物。
可以許可使用控制劑(controller)，阻滯劑，或減弱本發(fā)明的方法或組合物的試劑的示例性的促血栓形成或促凝結癥狀包括但不限于，因子VLeiden缺乏，抗磷脂綜合癥(APS)，蛋白C和/或蛋白S和/或抗凝血酶III缺乏，深靜脈血栓形成(DVT)，假von Willebrands病，IIb類von Willebrands病，周圍性血管疾病(PVD)，和高血壓，這只是其中之一。示例性的包括出血風險、可以許可使用增強劑或增加本發(fā)明方法或組合物的試劑的癥狀包括但不限于任何包括出血風險的癥狀，其包括但不限于凝固因子缺乏，血友病，血小板減少癥，和抗凝治療，這只是其中之一?？刂蒲óa生包括改變預定位點溫度，改變預定位點血流速率，和改變預定位點血壓中的至少一種。
作為前述的實例，本領域的技術人員將認識到在血管閉塞過程開始后，相關促血栓形成癥狀的逆轉或抑制可能是必需的。在該情形中，降低血小板反應性的試劑的給藥將又減小對血管閉塞引發(fā)劑的應答。該試劑容易被本領域技術人員知道和包括但不限于阿斯匹林或類阿斯匹林化合物，布洛芬，對乙酰氨基酚，酮洛芬，噻氯匹定，氯吡格雷，吲哚美辛，ω-3脂肪酸，前列環(huán)素，氧化氮，氧化氮的誘導物，氧化氮合成酶的誘導物，基質金屬蛋白酶抑制劑(MMPIs，TIMPs)，抗GPIb試劑，抗GPIIb/IIIa試劑，抗αvβ3試劑，抗α2β1試劑，抗CD36試劑，金精三羧酸，凝血酶受體拮抗物，血栓烷受體拮抗物，鏈激酶，尿激酶，組織纖溶酶原激活物(tPA)。
其中增強或增加血小板閉塞過程是理想的示例性過程包括血小板減少(低血小板量)患者。這些個體將受益于伴隨或預先給藥(灌輸)血小板產品以提供足夠來源的血小板來實現血小板閉塞。本領域的技術人員將認識到在該情形下可以使用所有可灌輸的模擬或近似正常血小板功能的產品。該試劑包括但不限于隨機供體血小板，單采血液成分術血小板，自身血小板，洗滌的血小板，血小板膜級分，冷卻的血小板，冷凍血小板，包含或表達血小板膜組分的顆粒，血小板代用品和全血。
作為另外的實例，一旦靶向治療位點可以使用特定的血小板功能增強劑來提高或增強初始的血小板反應性。已經證明本領域的技術人員已知的試劑增強現有的血小板反應性和/或降低限制充分血小板反應性的閾值以促進在現有血栓周圍的不可逆血小板附著和/或血小板脫粒和/或血小板/血小板結合和/或血小板增加。這些試劑包括但不限于瑞斯托菌素，凝血酶，肝素誘導的血小板減少癥(HIT)抗體或其部分，抗磷脂抗體(APA)或其部分，通過Fc-介導機理的全抗體分子，抗配體誘導的結合位點(抗-LIBS)抗體或其部分，抗CD9抗體或其部分，腎上腺素，凝血酶受體激活肽(TRAP)，PAR拮抗劑，組織蛋白酶G，彈性蛋白酶，花生四烯酸酯，血栓烷A2(TxA2)模擬物，TxA2，磷脂酶A2(PLA2)，蛋白激酶C(PKC)的激活劑，腺苷二磷酸(ADP)，膠原，von Willebrand因子(VWF)，基質金屬蛋白酶(MMPs)，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，離子載體，血小板微粒，血小板膜級分。
一旦導入患有腫瘤，增生組織，AV-畸形，動脈瘤或內漏的動物的血流中，固相試劑將定位在靶脈管系統(tǒng)中；結合或固定血小板，由此固定激活血小板；激活的血小板又結合和激活其它血小板直至形成閉塞。血小板激活和結合促進白細胞與活化的血小板結合，進一步增強靶脈管系統(tǒng)的閉塞。
實施例實施例1針對抗原細胞表面標記制備單克隆抗體的技術是非常簡單的并且可以使用本領域技術人員眾所周知的技術，如Kohler和Milstein(1975)的技術所舉例說明，來容易地進行。一般地說，使用受激的內皮細胞制備單克隆抗體涉及下列程序。在組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)衍生于人腫瘤的細胞或細胞系4天或更多天。將組織培養(yǎng)物的上清液(“腫瘤條件培養(yǎng)基”)從腫瘤細胞培養(yǎng)物中移取并以50％(v/v)的終濃度加入人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的培養(yǎng)物中。在2天培養(yǎng)后，非酶方式收獲HUVEC并將1-2×106個細胞腹膜內注射到小鼠中。以2周間隔重復該過程3次，最后的免疫是通過靜脈內途徑。3天后，收獲脾細胞并通過標準方案(Kohler和Milstein，1975)與SP2/0骨髓瘤細胞融合。通過有限稀釋克隆產生具有適當反應性的抗體的雜交瘤。
從產生的雜交瘤收集物，將選擇一種或多種雜交瘤，其產生比它識別非活化脈管內皮更大程度上識別活化脈管內皮的抗體。最終目標是鑒定實質上不具有對正常內皮的結合親和力的抗體。通過使用例如針對一種或多種類型的腫瘤活化內皮細胞的ELISA，RIA，IRMA，IEF，或類似的免疫測定篩選來鑒定適當的產生抗體的雜交瘤。一旦已經鑒定候選物，將檢驗針對非活化或“正常”內皮或其它正常組織或細胞類型的反應性的缺少。這樣，可以排除產生具有對特定應用不希望有的高水平正常交叉反應性的抗體的雜交瘤。
實施例2使用制備特異性地識別配體/受體復合體，特別地生長因子/生長因子受體復合體的單鏈抗體技術，由此產生的抗體分子識別生長因子/生長因子受體復合體，但不與生長因子或生長因子受體單獨結合。通過用純化的配體和受體，如VECF和VEGF受體的復合體免疫小鼠可以形成這些抗體，將產生的V基因用于在絲狀噬菌體中構建抗體文庫。抗體片段的噬菌體展示允許針對活化的內皮細胞抗原，特別地配體/受體復合體生產重組抗體分子。噬菌體系統(tǒng)模擬脊椎動物免疫系統(tǒng)。
在佐劑如Quil A的存在下用HPLC-純化的重組VEGF和VEGF受體(例如可溶性VEGF/FLT-1受體或VEGF/KDR受體)復合體免疫雌性BALB/c小鼠。在達到適當的抗體效價后(通常在第4次加強后)，殺死小鼠和分離脾。從脾中分離信使RNA(mRNA)并轉錄成cDNA。擴增cDNA的V基因并裝配為“單鏈Fv”(scFv)。在用適當的限制酶消化后，將scFv連接到噬菌粒載體中。然后用這些噬菌粒文庫轉化感受態(tài)大腸桿菌細胞，在用輔助噬菌體(例如M13K07，Pharmacia)感染后，制備展示scFv的噬菌體顆粒。篩選表達與配體/受體復合體結合，但不與配體或受體單獨結合的可溶性scFv的選擇的克隆。分別將配體/受體復合體，配體和受體用作固相抗原，使用標準ELISA技術完成該篩選。
實施例3已知多種對于本發(fā)明這個方面的實施能夠用作現有的或可誘導的靶的內皮細胞標記，包括VEGF/VPF(血管內皮生長因子/血管通透因子)，內皮-白細胞粘附分子(ELAM-1；Bevilacqua等，1987)；脈管細胞粘附分子-1(VCAM-1；Dustin等；1986)胞間粘附分子-1(ICAM-1；Osborn等，1989)；試劑白細胞粘附分子-1(LAM-1試劑)乃至主要組織相容性復合體(MHC)II類抗原，如HLA-DR，HLA-DP，或HLA-DQ(Collins等，1984)。在這些之中，可能優(yōu)選靶向VEGF/VEGF受體復合體。可以將識別上述內皮細胞抗原的單克隆抗體或特異的肽與固相試劑如包被VWF的顆粒結合，并通過導管或類似遞送裝置遞送至靶脈管系統(tǒng)。顆粒由此與靶脈管系統(tǒng)中的內皮細胞結合，導致在顆粒上血小板結合和血小板激活，其又導致顆粒周圍的血小板聚集和最終血栓形成。形成的血栓閉塞靶脈管系統(tǒng)，由此防止氧和營養(yǎng)遞送到下游組織。
實施例4將血小板靶向特定位點可以采取血小板通過固定在固相試劑上的VWF直接與固相試劑結合的形式。例如，通過各種方法如通過導管可以將固定在1μm-5mm近似直徑的顆粒上的重組和/或人和/或豬VWF遞送到靶位點。在將VWF-顆粒遞送到靶脈管系統(tǒng)后可以發(fā)生血小板結合，由此在血流中流動的血小板與顆粒接觸，與顆粒結合，擴散越過顆粒，激活，結合其它血小板和最終形成閉塞血管的血栓。還可以離體引發(fā)血小板與VWF顆粒結合，由此在身體外血小板與脈管中的顆粒接觸，隨后通過導管或類似的試劑遞送裝置遞送到靶位點。選擇顆粒大小以使在用顆粒引發(fā)血小板反應性(即血小板與顆粒結合)后不發(fā)生顆粒超過毛細血管床的前進，由于尺寸限制或因為結合顆粒的血小板和/或結合的凝固蛋白與血管壁受體相互作用。因此，VWF的顆粒大小可以為直徑約1μm-約5mm。最優(yōu)選顆粒直徑將為5μm-2mm。甚至更優(yōu)選顆粒直徑將為20μm-300μm。
實施例5-顆粒對于本發(fā)明來說可以將各種組合物的顆粒用作固相試劑。對于它們與結合血小板的試劑的結合能力已經檢驗了下列顆粒。聚苯乙烯微球粒購自Polysciences公司，(Warrington，PA)并通過被動吸附過程(溫育在0.2M碳酸鹽緩沖液，pH9.0-9.6中)或通過使用碳二亞胺或戊二醛與衍生的球粒共價鍵合包被人von Willebrand因子。檢驗幾類球粒，包括普通聚苯乙烯微球粒(目錄號07310，17134，17135，07312，07313，07314)，聚珠氨基微球粒(目錄號19118)，聚珠羧酸酯微球粒(目錄號17141)，fluoresbrite微球粒(目錄號17155，17156)，聚苯乙烯染色的微球粒(目錄號15715，15714，15716)，和順磁顆粒(目錄號19829)。所有球粒結合von Willebrand因子，在隨后檢驗時結合血小板。通過聚集測量法(aggregometry)和相差顯微術證實血小板與球粒的結合。
其它檢驗的顆粒包括聚乙烯醇(PVA)顆粒(Cook，Bloomington，Indiana)和大分子聚清蛋白(MAA)顆粒(Edmonton RadiopharmaceuticalCentre，Edmonton，Alberta，Canada)。在分開的實驗中，von Willebrand因子被動地(碳酸鹽緩沖液，如上)和共價地(戊二醛鍵合，如上)與顆粒結合。然后使用聚集測量法，相差顯微術和熒光顯微術(用FITC標記的抗-CD61抗體)證實血小板與顆粒的結合。
實施例6-哺乳動物VWF的比較使用兩種方法將豬VWF，牛VWF，和人VWF固定在聚苯乙烯顆粒上。第一種方法(直接結合)利用在0.2M碳酸酯(pH9.35)的存在下材料被動吸收到固相顆粒上。第二種方法(間接結合)包括使用已經固定在固相顆粒表面的抗VWF抗體分別從豬，牛，和人血漿中分離VWF。在后一種方法中，所用抗體(兔源)購自Dako(Mississauga，Ontario；目錄號A0082)，按照制造廠商提供的信息，證實與人，牛和豬von Willebrand因子結合。通過在碳酸鹽緩沖液(0.2M，pH9.35)中被動吸收將抗體固定到聚苯乙烯球粒(直徑4.5μm)并與各種來源的血漿在室溫下溫育60分鐘。洗滌球粒使其不含未結合的蛋白，并用于激發(fā)來自人和豬的全血和富含血小板的血漿。類似地，通過如上所述的被動吸收單獨地將人，豬和牛VWF直接與球粒連接(即無連接抗體)，并用于激發(fā)人和豬血小板(全血和富含血小板的血漿[PRP])。在一些實驗中，將豬和人PRP混合在一起和用各種試劑(參見以下)激發(fā)。
+弱血小板反應，++中等弱血小板反應，+++中等血小板反應，++++強血小板反應，+++++極強血小板反應實施例7-白細胞相互作用與豬或人VWF結合的顆粒特性上與人或豬血小板結合，其取決于血的來源。另外，觀察到包括單核細胞，粒細胞和淋巴細胞的白細胞與結合到顆粒的血小板相互作用(通過鑒別染色法和顯微鏡檢查證實)。
血小板在靶位點激活誘導可以增強減小或殺死靶組織的二次效應。通過活化的血小板如血小板因子4(PF4)的試劑的釋放抑制血管發(fā)生。激活后化學引誘物如RANTES的血小板釋放增強白細胞(例如嗜酸性粒細胞，單核細胞)對靶組織的效應。通過顆粒組分如CD62血小板的激活后表達將誘導單核細胞和多形核白細胞(PMNs)的結合，其導致組織因子表達(單核細胞；前凝血劑)和細胞激活和攻擊(PMNs)。另外，在靶位點通過活化的血小板的CD40配體(CD40L)的釋放誘導由單核細胞的組織因子表達，其導致局部的高可凝固狀態(tài)。
實施例8固相試劑還可以采取線圈或斯坦特固定模的形式。重組或哺乳動物來源的VWF可以與這些固相試劑結合并通過包括外科手術和/或通過導管的各種方法遞送到靶脈管系統(tǒng)。使用特殊的導管和相關的導線通過血流可以到達靶位點，如動脈瘤。通過進入位點如股動脈將導線導入血管系統(tǒng)并輕輕擠過主要血管至靶位點。在導線上將導管引至靶位點，于是移去導線。然后將固相血小板結合線圈擠過導管的腔至使用它的動脈瘤。與線圈結合的VWF特異性地結合在血流中流動的血小板。血小板在線圈周圍迅速激活和累積，由此形成局部的固定血栓，而又降低動脈瘤破裂的危險。實施例9-顆粒固定的VWF在豬模型中的急性作用本研究是設計來評估包被人VWF的顆粒在豬腎的脈管系統(tǒng)中誘導血栓形成的有效性。在該過程中，使用20-22規(guī)格的血管導管將導管插入腎動脈。通過外科手術暴露腎脈管并將多普勒流量探針(Doppler flow probe)附著于腎脈管以監(jiān)測血液流進和流出靶器官。在從腎動脈和靜脈采取的流量讀數之間未發(fā)現顯著的差異；因此，從腎靜脈進一步采取所有的讀數以顯示通過靶腎的血流量。通過與戊二醛過夜溫育將人VWF與人MAA共價結合。改變基于每重量蛋白質基礎上的、與MAA結合的VWF的量的先前滴定研究已經確定1∶5-1∶80(MAA∶VWF)的比率提供足夠的固定的VWF以誘導血小板結合和激活。在這個基礎上，選擇1∶20(MAA∶VWF)的比率用于體內研究。通過相差顯微鏡術的顆粒分析證明最終制劑中的顆粒大小為30μm-250μm(如通過使用測微計/血細胞計數器通過光學顯微鏡估計)。
注射MAANWF(500μl或1ml)接著人PRP(500μl，包含約200-400×106個血小板)于豬的腎動脈導致血流量的顯著減少。在檢驗試劑后將人血小板注射至人體內盡可能接近近似的狀況。另外，注意到豬血小板與人VWF的結合非常弱(參見實施例6，上面)。在注射檢驗試劑的10分鐘內，血流量已經降低至小于基線水平的一半。在注射檢驗試劑的15分鐘內，血流量已經降低至小于基線值的20％。在90分鐘的監(jiān)視期內向器官的血流量未增加。
相反，注射于對側腎的腎動脈之中的對照試劑(僅MAA；相同蛋白質濃度)顯示血流量瞬時減小。血流量開始減小50％，但迅速恢復至接近基線水平，即在15分鐘內＞80％的最初血流量和在30分鐘內＞90％的最初血流量。
靶脈管系統(tǒng)的組織學檢查顯示在檢驗器官的腎動脈的最接近的分支中的大血栓，和在對照腎中的腎脈管系統(tǒng)的較小血栓形成。在對照或檢驗動物的肝臟，肺，脾，腦，心臟和眼中未發(fā)現血栓。
實施例10-顆粒固定的VWF在豬模型中的慢性作用以類似于在實施例9中概述的方法的方式，使用20-22規(guī)格的血管導管將導管插入2頭檢驗和2頭對照豬的腎動脈。將多普勒流量探針通過外科手術放置在每只動物的腎靜脈上，在閉合最初的切口后將導線暴露在動物的外皮上。在建立流過受侵襲的腎的血液的基線后，將1ml MAA∶VWF顆粒(11mg總蛋白)接著1mL富含人血小板的血漿(約460×106個血小板(血小板量458×109/升)注射到檢驗動物的腎動脈中，將等量的MAA注射到對照動物中。將動物轉移至代謝板條箱(crate)并在7天期間在不同時間間隔監(jiān)視。下表表示來自這些研究的血流量結果。
豬多普勒血流量(毫升每分鐘)
組織學檢查對照和檢驗動物的主要器官和組織以證明血栓形成和其它治療相關損傷。除了在靶腎的腎脈管系統(tǒng)中以外未觀察到血栓形成。
實施例11-用高锝酸鈉Tc 99m標記MAA/VWF通過使用戊二醛(0.0625％v/v，最終)將人VWF(來源Alphanate，Alpha Therapeutics Corp.)與MAA顆粒(11mg蛋白質；來源注射用MAA，Edmonton Radiopharmaceutical Centre)結合來制備MAA/VWF顆粒。蛋白質比率為40∶1-20∶1(MAA∶VWF)。通過在500rpm下攪拌10分鐘用MAA/VWF顆粒激發(fā)來自健康的未用藥治療的(大于2周)志愿者的檸檬酸鹽富含血小板的血漿和檸檬酸鹽全血來檢驗顆粒的功能性(10μl顆粒+100μl血小板來源)。通過相差顯微術觀察反應證實顆粒結合和激活血小板，形成大團血小板和MAA/VWF顆粒的能力。
然后使用88MBq-300MBq的活性用高锝酸鈉Tc 99m標記MAA/VWF顆粒。在室溫下將等體積鹽水中的顆粒和高锝酸鈉Tc 99m溫育10分鐘。使用薄層層析測定標記效率，發(fā)現超過95％。
然后檢驗Tc 99m標記的MAA/VWF顆粒以評估標記對顆粒功能性的影響。相差顯微術證實Tc 99m標記的MAA/VWF顆粒能夠結合和激活血小板。在標記顆粒的功能活性方面沒有明顯減小。
實施例12-豬腎脈管系統(tǒng)的MAA/VWF血栓形成的熒光鏡透射研究使用股動脈方法將MAA/VWF遞送到豬腎脈管系統(tǒng)。在全身麻醉(氟烷)后將5-Fr的鞘導管插入18-20kg小豬的股動脈中并通過熒光鏡透視引導至左腎動脈。將導管定位以使在對比染料遞送后，僅顯現腎脈管系統(tǒng)的下極(lowerpole)。在時間零點，將1ml MAA/VWF顆粒(30-250微米大小)緩慢(10秒以上)遞送至腎脈管系統(tǒng)。十(10)秒后遞送1ml人PRP(420×109每升)，用1ml鹽水沖洗導管。將導管保持在原位，在二十(20)分鐘等待期后再次將造影劑(contrast agent)遞送到靶脈管系統(tǒng)。觀察到造影劑在導管末端匯集，然后迅速移動至腎上極(upper pole)的脈管系統(tǒng)中。腎下極的脈管系統(tǒng)緩慢累積未消散的(大于20分鐘)造影劑，而上極脈管系統(tǒng)迅速失去造影劑(小于5秒)。在動物麻醉和導管仍在原位的同時，將受侵襲的腎通過外科手術暴露，正好鄰近導管夾緊腎脈管系統(tǒng)，摘除受侵襲的腎。通過縱向切口將腎動脈打開并朝腎的方向解剖。在延伸至腎下極脈管系統(tǒng)內部深處的導管尖端的遠端注意到大的血栓。在腎上極的脈管系統(tǒng)中未注意到凝固。另外，受侵襲的腎的下極顯著地變白，顯示缺乏血流，而腎的上極顯示正常紅色。
在接著上述步驟的分開的實驗中將導管導至靶腎下極的脈管系統(tǒng)和用來遞送1ml MAA/VWF顆粒，接著1ml人PRP。在20分鐘后向腎下極的血流明顯地被阻止，如通過熒光鏡透視所確定。如上，在導管尖端匯集后對比染料迅速移動到上極脈管系統(tǒng)。然后將導管再定位和將MAA/VWF接著人PRP遞送到上極脈管系統(tǒng)。在20分鐘等待期后再次注射對比染料。熒光鏡透視顯示向上極脈管系統(tǒng)的血流被阻斷。對比染料未進入下極脈管系統(tǒng)。然后在殺死動物之前通過外科手術摘除具有相關腎脈管的靶腎。腎的立即解剖顯示在腎的上極和下極中血管大量的血栓形成。
盡管已經依據具體的優(yōu)選實施方案描述本發(fā)明，它不限于那些實施方案。特別是按照前面的教導，本領域的技術人員可以完成備選的實施方案，實施例，和變體，其仍將被包括在本發(fā)明的范圍內。
權利要求
1.一種治療血管化腫瘤或增生組織的方法，其包含向具有血管化腫瘤或增生組織的哺乳動物施用包含結合劑的固相試劑，所述結合劑能夠結合血小板，和隨后體內誘導血栓，其包含通過血小板與固定在所述固相試劑上或內部的血小板結合劑結合來捕捉血小板，誘導血小板的激活，和使血栓形成。
2.權利要求1的方法，其中所述固相試劑是顆粒。
3.權利要求1的方法，其中所述固相試劑是線圈。
4.權利要求1的方法，其中所述固相試劑是斯坦特固定模。
5.權利要求1的方法，其中所述血小板結合劑是重組VWF。
6.權利要求1的方法，其中所述血小板結合劑是哺乳動物VWF。
7.權利要求6的方法，其中所述VWF是人源的。
8.權利要求6的方法，其中所述VWF是豬源的。
9.權利要求1的方法，其中所述固相試劑包括靶向部分。
10.權利要求9的方法，其中所述靶向部分是針對靶脈管系統(tǒng)上的抗原。
11.權利要求1的方法，其中所述固相試劑包含生物素或抗生物素蛋白或其模擬物或衍生物。
12.權利要求1的方法，其中所述固相試劑包含能夠結合血小板的血小板特異性組分。
13.權利要求12的方法，其中所述血小板特異性組分包含選自天然的或合成的von Willebrand因子，骨橋蛋白，血纖蛋白原，血纖蛋白，纖連蛋白，玻連蛋白，膠原，血小板反應蛋白，層粘連蛋白，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，磷脂酶A2，基質金屬蛋白酶，凝血酶，玻璃，唾液酸-路易斯X，fibulin-1，PECAM，ICAM-1，ICAM-2，p-選擇蛋白配體，MAC-1，LFA-1，上述任何一項的部分，和上述任何一項的功能等價物的組分中的至少一種。
14.權利要求13的方法，其中所列組分偶聯或包含單獨或組合的例如生物素模擬物，肽，人Fc片段的部分。
15.一種用于體內誘導血栓形成的組合物，其包含固相試劑，所述固相試劑包含血小板特異性組分；其中經遞送到靶脈管系統(tǒng)，所述血小板結合組分結合血小板到所述固相試劑，誘導血小板激活并使血栓形成。
16.權利要求15的組合物，其中所述固相試劑是顆粒。
17.權利要求16的組合物，其中所述顆粒是微球粒。
18.權利要求16的組合物，其中所述顆粒是大分子聚清蛋白。
19.權利要求18的組合物，其中所述顆粒大小為約5-約500微米。
20.權利要求18的組合物，其中所述顆粒大小為約30-約150微米。
21.權利要求15的組合物，其中所述固相試劑是線圈。
22.權利要求15的組合物，其中所述固相試劑是斯坦特固定模。
23.權利要求15的組合物，其中所述血小板特異性組分包含選自天然的或合成的von Willebrand因子，骨橋蛋白，血纖蛋白原，血纖蛋白，纖連蛋白，玻連蛋白，膠原，血小板反應蛋白，層粘連蛋白，肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸軟骨素，磷脂酶A2，基質金屬蛋白酶，凝血酶，玻璃，唾液酸-路易斯X，fibulin-1，PECAM，ICAM-1，ICAM-2，p-選擇蛋白配體，MAC-1，LFA-1，上述任何一項的部分，和上述任何一項的功能等價物的組分中的至少一種。
24.權利要求15的組合物，其中所述血小板特異性組分是重組VWF。
25.權利要求15的組合物，其中所述血小板特異性組分是哺乳動物的VWF。
26.權利要求15的組合物，其中所述血小板特異性組分是人源的。
27.權利要求15的組合物，其中所述血小板特異性組分是豬源的。
28.權利要求15的組合物，其中所述固相試劑包含靶向部分。
29.權利要求15的組合物，其中所述靶向部分是針對靶脈管系統(tǒng)上的至少一種抗原。
30.權利要求15的組合物，其中所述固相試劑另外包含用于將血小板與所述固相試劑結合的配體。
31.
32.權利要求15的組合物，其中所述固相試劑是用高锝酸鈉Tc 99m放射性標記。
33.一種用于誘導血栓形成的組合物，其包含固相血小板結合試劑，所述固相血小板結合試劑具有第一結合組分和第二結合組分，所述第一結合組分包含將所述固相試劑與配體/受體復合體結合而不與單獨的所述配體或受體結合的結合區(qū)；所述第二結合組分包含用于血小板的結合區(qū)。
34.一種用于誘導血栓形成的組合物，其包含固相血小板結合試劑，所述固相血小板結合試劑聚第一結合組分和第二結合組分，所述第一結合組分包含將所述結合組分與預定位點上的表位結合的結合區(qū)；所述第二結合組分包含用于血小板的結合區(qū)。
35.一種用于體內誘導血栓形成的試劑盒，其包含固相試劑和下列各項中的至少一種用于結合血小板的結合劑；具有血小板特異性組分的固相試劑；用于結合所述結合劑的配體；配體偶聯物；用于結合所述配體或所述配體偶聯物的抗-配體；血小板結合增強劑；血栓形成調制劑；補體級聯組分；補體級聯組分誘導物；和包括抗-配體的用于結合血小板的結合劑；放射性核素；造影劑；及其組合。
全文摘要
本發(fā)明通常涉及用于靶向和遞送固相血小板依賴型血管閉塞試劑的方法和組合物。特別是，將包被血小板結合劑的顆?；蚓€圈或斯坦特固定模導至靶脈管系統(tǒng)，如實體瘤塊或AV－畸形或動脈瘤或內漏的脈管系統(tǒng)；固相試劑然后結合和激活血小板，其又結合和激活其它血小板。該過程導致在固相試劑周圍迅速形成血小板介導的血栓，致使血管閉塞。
文檔編號A61L24/10GK1612724SQ02822461
公開日2005年5月4日 申請日期2002年9月11日 優(yōu)先權日2001年9月12日
發(fā)明者邁克爾·W·斯圖爾特, 羅蘭·亨里克·珀森, 安托萬·A·努杰姆 申請人:維日克斯醫(yī)藥公司