專利名稱：組織再生用的基底材料、移植用材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于體內(nèi)外培養(yǎng)細(xì)胞或使之再生的組織再生用基底材料及利用該材料的移植用材料。
背景技術(shù)：
近年報道了許多有關(guān)體外(in vitro)培養(yǎng)細(xì)胞，將培養(yǎng)的組織用予患者的技術(shù)。細(xì)胞不僅可單獨培養(yǎng)，許多情況下，將細(xì)胞接種、培養(yǎng)到成為細(xì)胞增殖支架(Scaffold)的載體(組織再生用基底材料)上。特別是，載體對制備具有一定高度和厚度的三維形狀的組織起著重要的作用。另外，將成為組織再生支架的載體作為組織再生用基底材料進(jìn)行埋植，通過自身治愈能力建立起體內(nèi)(in vivo)組織再生的技術(shù)。該技術(shù)被稱作再生醫(yī)療或組織工程學(xué)(Tissue Engineering)，倍受矚目。
作為這樣的載體或組織再生用基底材料，可使用具有良好生物適應(yīng)性的材料和生物吸收性的材料。例如，膠原、透明質(zhì)酸、聚輪烷(ポリロタキサン)、明膠、纖粘連蛋白、肝素、殼多糖、脫乙酰殼多糖、層粘連蛋白、藻酸鈣、聚輪烷水凝膠。
但是，這些材料構(gòu)成的組織再生用基底材料強(qiáng)度弱，對于具有高度、大的、細(xì)長的等很難保持充分的形狀。并且，由于組織再生用基底材料沒有足夠的強(qiáng)度，在培養(yǎng)和移植時很難操作，操作性差，給操作者和技術(shù)人員帶來負(fù)擔(dān)。
鑒于上述技術(shù)的問題點，本發(fā)明的目的是提供易于操作的組織再生用基底材料和移植用材料。本發(fā)明的目的還在于提供該移植用材料的制備方法。
發(fā)明公開第一，本發(fā)明提供組織再生用基底材料，其具備能形成三維形狀的多孔載體和圍繞該多孔載體所形成的、以與外部連通的狀態(tài)支持該多孔載體的支持體。
該組織再生用基底材料中，即便能形成三維形狀的多孔載體自身難以維持其形狀時，由于該支持體是圍繞該多孔載體的，所以通過該支持體可維持多孔載體的三維形狀。因此，組織再生用基底材料的操作容易。另外，由于支持體以與外部連通的狀態(tài)支持該多孔載體，將組織再生用基底材料移植到活體時，周圍的活體組織可通過支持體而進(jìn)入多孔載體，增加其生物適應(yīng)性。因此，適于用于組織再生。
該組織再生用基底材料可直接移植到活體組織中，亦可將細(xì)胞保持在多孔載體中后作為后述的移植材料移植到活體組織中。前者的情況下，移植后，周圍的活體組織的細(xì)胞通過支持體進(jìn)入多孔載體進(jìn)行增殖，使移植體存活。后者的情況下，根據(jù)移植目的地的活體組織確定保持在多孔載體中的細(xì)胞種類，將該細(xì)胞保持在多孔載體中，移植后，周圍的活體組織和保持在多孔載體中的細(xì)胞通過支持體而進(jìn)入，以比較快的速度生存。后者的情況下，既可使一部分多孔載體保持細(xì)胞，亦可使全部多孔載體保持細(xì)胞，既可保持一種細(xì)胞，亦可保持多種細(xì)胞。另外，使多孔載體保持細(xì)胞后，可進(jìn)行培養(yǎng)。
該組織再生用基底材料中的多孔載體指具有多個小孔(空隙)形狀的載體，具體而言，包括海綿狀、蜂窩狀、或其同等物，但優(yōu)選海綿狀。對其孔徑?jīng)]特殊限制，只要是其大小能保持細(xì)胞即可。另外，多孔載體能形成三維形狀，所謂三維形狀指圓柱、多角柱、圓錐、多角錐、截錐體、多角截錐體、球形等立體結(jié)構(gòu)，此外，還包括聽囊(耳殻)等活體部位的形狀等。
該組織再生用基底材料中的支持體沒必要包圍整個多孔載體，可包圍其一部分，只要是能維持上述多孔載體的三維形狀即可。上述支持體優(yōu)選網(wǎng)狀支持體、柵狀支持體或帶孔的板狀支持體。這種情況下可很好地發(fā)揮以與外部連通的狀態(tài)支持多孔載體的功能。
該組織再生用基底材料中，所述多孔載體和支持體優(yōu)選其中至少一方是由生物親和性材料或生物吸收性材料構(gòu)成的，更優(yōu)選多孔載體和支持體二者均由這樣的材料形成。因為這樣的話，移植后活體組織不會把組織再生用基底材料當(dāng)作異物識別，適于組織再生。應(yīng)用生物吸收性材料時，移植后可被分解吸收，所以特別適于組織再生。
對這樣的生物親和性材料或生物吸收性材料沒有特殊限制，例如，上述多孔載體優(yōu)選是選自膠原、膠原衍生物、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸衍生物、脫乙酰殼多糖、脫乙酰殼多糖衍生物、聚輪烷、聚輪烷衍生物、殼多糖、殼多糖衍生物、明膠、纖粘連蛋白、肝素、層粘連蛋白、藻酸鈣中的1種或2種以上的物質(zhì)；支持體優(yōu)選是選自聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物、聚乙醇酸-聚己內(nèi)酯共聚物的1種或2種以上的物質(zhì)。另外，鈦、鈦合金、不銹鋼、鈷-鉻合金、鈷-鉻-鉬合金等金屬材料，及氧化鋁陶瓷、碳陶瓷、氧化鋯陶瓷、碳化硅陶瓷、氮化硅陶瓷、玻璃陶瓷等陶瓷材料等生物惰性材料均可作為支持體材料使用。另外，羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣、生物玻璃等具有生物活性的基質(zhì)材料也可作為支持體材料利用。
該組織再生用基底材料中，所述支持體優(yōu)選至少有一條縫合線。這樣，可利用該縫合線可固定到移植目的地的活體組織中。優(yōu)選該縫合線由前述的生物親和性材料或生物吸收性材料形成，因為這樣利于組織再生，優(yōu)選用與支持體相同的材質(zhì)構(gòu)成，因為這樣易于制備。
該組織再生用基底材料，可在切開移植目的地的活體組織周邊后移植，若考慮患者的負(fù)擔(dān)，優(yōu)選進(jìn)行內(nèi)窺鏡手術(shù)，因此優(yōu)選形成可在內(nèi)窺鏡手術(shù)中使用的形狀，例如，優(yōu)選柱狀，截面的直徑為2-15mm。
第二，本發(fā)明提供移植用材料，具備能保持細(xì)胞的三維形狀的細(xì)胞保持載體和圍繞該細(xì)胞保持載體所形成的、以與外部連通的狀態(tài)支持該細(xì)胞保持載體的支持體。
該移植用材料，例如經(jīng)細(xì)胞懸液和培養(yǎng)基等濕潤后，即便三維形狀的細(xì)胞保持載體自身難以維持其形狀，但是由于支持體是圍繞該細(xì)胞保持載體的，所以外觀形狀不崩解。因此，移植用材料的操作容易。另外，由于支持體以與外部連通的狀態(tài)支持該細(xì)胞保持載體，將移植用材料移植到活體時，周圍的活體組織可通過支持體而進(jìn)入細(xì)胞保持載體，周圍的營養(yǎng)成分可通過支持體供給細(xì)胞保持載體中所保持的細(xì)胞，所以生物組織的適應(yīng)性良好。因此，適用于組織再生。
本發(fā)明的第2移植用材料中，上述細(xì)胞保持載體既可是三維形狀的多孔載體(例如，具有多個小孔(空隙)的載體)，亦可應(yīng)用包埋細(xì)胞的膠狀物或其等同物。作為多孔載體，可舉出海綿狀、蜂窩狀或其等同物等，其中優(yōu)選海綿狀，其孔徑無特殊限制，只要是其大小能保持細(xì)胞即可。
本發(fā)明的第2移植用材料，可以具備鄰接細(xì)胞保持載體的有三維形狀的人工移植材料。這里人工移植材料是沒有細(xì)胞的人工材料，無特殊限制，可是任何種類的材料，例如鈦等金屬材料和氧化鋁陶瓷等陶瓷材料等生物惰性材料，及羥基磷灰石、磷酸鈣、碳酸鈣等生物活性材料等人工骨和人工關(guān)節(jié)等植入物中可利用的材料，根據(jù)所希望的形狀和強(qiáng)度適當(dāng)選擇。優(yōu)選，支持體在圍繞細(xì)胞保持載體的同時還圍繞人工移植材料，此時，優(yōu)選以與外部連通的狀態(tài)支持該細(xì)胞保持載體和人工移植材料。另外，人工移植材料與支持體可以是同一材料所組成的同一體。
本發(fā)明的第2移植用材料中，所述細(xì)胞優(yōu)選至少包括表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞及這些細(xì)胞的前體細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中的一種，更優(yōu)選至少包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中的一種。由于間質(zhì)干細(xì)胞和ES細(xì)胞屬于未分化細(xì)胞，所以可以預(yù)測移植后它們分化成與移植目的地的活體組織相適應(yīng)的細(xì)胞，優(yōu)選移植前，預(yù)先在體外分化成與移植目的地的活體組織相適應(yīng)的細(xì)胞。
本發(fā)明的第2移植用材料中，所述細(xì)胞可以是保持在單側(cè)一半(片側(cè)半分)細(xì)胞保持載體中的軟骨細(xì)胞和保持在另一單側(cè)一半細(xì)胞保持載體中的成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞。該情況下，在關(guān)節(jié)等中，上層是軟骨組織，下層是骨組織，所以適于骨·軟骨缺損部分的移植用。所謂“單側(cè)一半”不一定必須是一半，保持軟骨細(xì)胞的部分和保持成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞的部分可以任何比例分割，也可有若干重疊部分。
本發(fā)明的第2移植用材料，具有鄰接細(xì)胞保持載體的有三維形狀的人工移植材料時，所述人工移植材料可以是人工骨，所述細(xì)胞可以是軟骨細(xì)胞。該情況下，在關(guān)節(jié)等中，上層是軟骨組織，下層是骨組織，所以適于骨·軟骨缺損部分的移植用。
本發(fā)明的第2移植用材料，其支持體沒必要包圍整個細(xì)胞保持載體，可包圍其一部分，只要是能維持上述細(xì)胞保持載體的三維形狀即可。上述支持體優(yōu)選網(wǎng)狀支持體、柵狀支持體或帶孔的板狀支持體。這種情況下可很好地發(fā)揮以與外部連通的狀態(tài)支持細(xì)胞保持載體的功能。再者，細(xì)胞保持載體和支持體優(yōu)選其中至少一方是由生物親和性材料或生物吸收性材料構(gòu)成的，更優(yōu)選二者均由這樣的材料形成。因為這樣的話，移植后活體組織不會把組織再生用基底材料當(dāng)作異物識別，適于組織再生。應(yīng)用生物吸收性材料時，移植后可被分解吸收，所以特別適于組織再生。此類生物親和性材料或生物吸收性材料的示例如前所述。再者，支持體優(yōu)選至少有一條縫合線。這樣，可利用該縫合線固定到移植目的地的活體組織中。優(yōu)選該縫合線與支持體用相同的材質(zhì)構(gòu)成。
本發(fā)明的第2移植用材料，可在切開移植目的地的活體組織周邊后移植，若考慮患者的負(fù)擔(dān)，優(yōu)選進(jìn)行內(nèi)窺鏡手術(shù)，因此優(yōu)選形成可在內(nèi)窺鏡手術(shù)中使用的形狀，例如，優(yōu)選柱狀，截面的直徑為2-15mm。
第三，本發(fā)明提供制備本發(fā)明第二的移植用材料的方法，其中在獲得上述細(xì)胞保持載體時，(1)將間質(zhì)干細(xì)胞分化成目的細(xì)胞，制備所得細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將所得細(xì)胞懸液供給到能保持細(xì)胞的三維形狀的預(yù)備載體中，得到所述細(xì)胞保持載體，或者(2)將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供給到能保持細(xì)胞的三維形狀的預(yù)備載體中，在該預(yù)備載體上使間質(zhì)干細(xì)胞分化成目的細(xì)胞，從而獲得所述細(xì)胞保持載體。
這樣的話，可減輕移植時的患者負(fù)擔(dān)。也就是說，作為移植用材料的制備方法，從移植目的地的活體組織周邊采取組織，培養(yǎng)其細(xì)胞，保持到預(yù)備載體中，該情況下，患者負(fù)擔(dān)大，所以不優(yōu)選。例如關(guān)節(jié)軟骨部位的治療時，為了得到供予培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞，有必要在非荷重部位采取健康部位的軟骨組織。為了避免這些操作，優(yōu)選采取患者的骨髓細(xì)胞，從中得到未分化的間質(zhì)干細(xì)胞，使之分化成目的細(xì)胞(適合移植目的地活體組織的細(xì)胞)。另外，分化間質(zhì)干細(xì)胞而得到目的細(xì)胞后，可以將該供給預(yù)備載體，也可將間質(zhì)干細(xì)胞供予預(yù)備載體，在預(yù)備載體上分化成目的細(xì)胞。后者的情況下，由于可以預(yù)測移植后間質(zhì)干細(xì)胞分化成與周圍的活體組織相對應(yīng)的細(xì)胞，所以可以將間質(zhì)干細(xì)胞供予預(yù)備載體，然后移植到活體組織中，使之在體內(nèi)分化。
所謂預(yù)備載體既可是能保持細(xì)胞的多孔載體(例如本發(fā)明第一中的組織再生用基底材料中的多孔載體)，亦可是可包埋細(xì)胞的膠狀物或其等同物等。
下面列舉在單側(cè)一半保持軟骨細(xì)胞，另一單側(cè)一半保持成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞的細(xì)胞保持載體的制備方法(1)將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供給到預(yù)備載體的單側(cè)一半中，在該預(yù)備載體上進(jìn)行培養(yǎng)，使之分化成軟骨細(xì)胞，然后將預(yù)先分化間質(zhì)干細(xì)胞而得到的成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞供予到預(yù)備載體的另一單側(cè)一半的方法；
(2)將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供給到預(yù)備載體的單側(cè)一半中，在該預(yù)備載體上進(jìn)行培養(yǎng)，使之分化成軟骨細(xì)胞，然后將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供予到預(yù)備載體的另一單側(cè)一半，在載體上進(jìn)行培養(yǎng)，使之分化成成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞的方法；(3)將預(yù)先分化間質(zhì)干細(xì)胞而得到的軟骨細(xì)胞供予到預(yù)備載體的單側(cè)一半，然后將預(yù)先分化間質(zhì)干細(xì)胞而得到的成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞供予預(yù)備載體的另一單側(cè)一半的方法；(4)將預(yù)先分化間質(zhì)干細(xì)胞而得到的軟骨細(xì)胞供予到預(yù)備載體的單側(cè)一半，然后將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供予到預(yù)備載體的另一單側(cè)一半，在該載體上進(jìn)行培養(yǎng)，使之分化成成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞的方法；或者，上述(1)-(4)中制備軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的順序交換的方法等。
但是，從間質(zhì)干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞一般比從間質(zhì)干細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞難，所以優(yōu)選先分化成軟骨細(xì)胞的方法。另外，在移植用材料中，具有與在移植部位產(chǎn)生的基質(zhì)(細(xì)胞外基質(zhì))等同的基質(zhì)對促進(jìn)治療非常重要。鑒于此，將預(yù)先從間質(zhì)干細(xì)胞分化而得的軟骨細(xì)胞供予載體時，供給細(xì)胞后，為了產(chǎn)生基質(zhì)，有必要進(jìn)一步進(jìn)行培養(yǎng)。再者，關(guān)節(jié)部位的軟骨組織有透明樣軟骨的特性，為了通過培養(yǎng)操作使軟骨組織保持透明樣軟骨的特性，有必要將細(xì)胞供予到預(yù)備載體進(jìn)行三維的培養(yǎng)?？傊@種情況下，除從間質(zhì)干細(xì)胞獲得軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)工程之外，還有必要進(jìn)行使軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)、形成透明樣軟骨的培養(yǎng)工程(2階段培養(yǎng)工程)。與此相對，將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供予預(yù)備載體，在該載體上進(jìn)行培養(yǎng)時，在載體上間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖，分化成透明樣軟骨，產(chǎn)生基質(zhì)，所以用1階段的培養(yǎng)工程就能完成。因此，優(yōu)選后者。上述(1)-(4)中，(1)、(2)比(3)、(4)更優(yōu)選。
作為制備具備保持細(xì)胞的三維形狀的細(xì)胞保持載體和圍繞該細(xì)胞保持載體所形成的、以與外部連通的狀態(tài)支持該細(xì)胞保持載體的支持體、及與上述細(xì)胞保持載體鄰接的三維形狀的人工移植材料，上述人工移植材料為人工骨，上述細(xì)胞為軟骨細(xì)胞的這樣的移植材料的方法，優(yōu)選用人工骨材料制成上述人工骨后，制備保持軟骨細(xì)胞的細(xì)胞保持載體，使其與人工骨鄰接且包圍上述支持體。此時，優(yōu)選在人工骨和細(xì)胞保持載體間存在纖粘連蛋白等粘接因子。
附圖簡述

圖1是實施例1中組織再生用基底材料的概略斜視圖。
圖2是實施例2中移植用材料(骨·軟骨柱)的概略斜視圖。
圖3是表示制備實施例2中移植用材料(骨·軟骨柱)的順序的概略圖。
圖4是實施例3中移植用材料(骨·軟骨柱)的概略斜視圖。
圖5是表示制備實施例3中移植用材料(骨·軟骨柱)的順序的概略圖。
實施發(fā)明的最佳狀態(tài)[實施例1]組織再生用基底材料圖1是組織再生用基底材料的概略斜視圖。組織再生用基底材料10具備圓柱狀的膠原海綿11和圍繞該膠原海綿11的外周而形成的網(wǎng)狀支持體12。網(wǎng)狀支持體12是用PLGA(聚乳酸-聚乙醇酸共聚物)制備的，通過網(wǎng)眼以與外部連通的狀態(tài)支持膠原海綿11。該組織再生用基底材料10的大小是外徑6mm，高15mm。
移植用材料-1圖2是本實施例的移植用材料的概略斜視圖，圖3是表示制備本實施例的移植用材料的順序的概略圖。本實施例中，如圖2所示，以實施例1的組織再生用基底材料10作為細(xì)胞增殖的支架，膠原海綿11的一半?yún)^(qū)域11a保持軟骨細(xì)胞，另一半?yún)^(qū)域11b保持成骨細(xì)胞，如此制備出移植用材料(以下稱作骨·軟骨柱)20。以下，以圖3為基礎(chǔ)對其制備順序進(jìn)行說明。
首先，用含有少量肝素的注射器從日本白色家兔的脛骨抽吸出骨髓細(xì)胞(參照圖3(a))。用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco改良法的Eagle培養(yǎng)基)將其稀釋10倍，制備出細(xì)胞懸液。此時，DMEM使用添加有抗生素的。將10ml該細(xì)胞懸液接種到10cm平皿中，37℃、5％CO2下培養(yǎng)1周。1周培養(yǎng)后換培養(yǎng)基。骨髓細(xì)胞由血細(xì)胞和間質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)成，通過換培養(yǎng)基可僅去除浮游型的血細(xì)胞，而只得到附著在平皿底部的附著依賴型間質(zhì)干細(xì)胞。最初交換培養(yǎng)基后，每3-4天換一次培養(yǎng)基，使間質(zhì)干細(xì)胞增殖(參照圖3(b))。另外，直到得到足量的細(xì)胞數(shù)，必要時可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。這樣，通過傳代培養(yǎng)可得到足量的間質(zhì)干細(xì)胞，但，由于間質(zhì)干細(xì)胞增殖直到達(dá)到整個平皿的培養(yǎng)面(匯合)時開始分化，所以避免細(xì)胞增殖到匯合狀態(tài)，保持間質(zhì)干細(xì)胞的未分化狀態(tài)。
獲得足量的間質(zhì)干細(xì)胞后，用胰蛋白酶處理5分鐘，使間質(zhì)干細(xì)胞從平皿底面剝離。剝離處理之后，1500rpm，離心處理5分鐘，將間質(zhì)干細(xì)胞小片懸浮到軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，制備出細(xì)胞密度達(dá)4×107細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。使用在DMEM中添加了10-8M地塞米松(Dexamethasone)、10-5Mβ-磷酸甘油(β-Glycerophosphate)、0.05mg/ml抗壞血酸-2磷酸鹽(Ascorbic Acid 2-Phosphate)及抗生素的無血清培養(yǎng)基作為軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
將滅菌的硅管(外徑10mm，內(nèi)徑6mm，高7mm)放置到24孔板中，將上述組織再生用基底材料10插入到硅管中，通過硅管將組織再生用基底材料10以直立狀態(tài)支持(參照圖3(c))。用Eppendorf管將如上制備的細(xì)胞懸液(間質(zhì)干細(xì)胞+軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基)從組織再生用基底材料10的膠原海綿11的上方滴下100μl。滴下100μl后，細(xì)胞懸液僅浸透膠原海綿11的上部分，間質(zhì)干細(xì)胞粘附在該部分，而下半部分不存在細(xì)胞。將該狀態(tài)下的組織再生用基底材料10倒置，讓細(xì)胞接種部分朝下，與倒置前同樣用硅管支持成直立狀態(tài)。倒置后1小時，間質(zhì)干細(xì)胞粘附到組織再生用基底材料10以后，注入1.5ml由上述同樣成分構(gòu)成的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2周。期間，隔日換培養(yǎng)基。培養(yǎng)后，用福爾馬林固定組織再生用基底材料10，石蠟包埋后制作組織切片，通過Alcian Blue染色法對軟骨基質(zhì)染色，作成斷面的染色像。觀察該斷面的染色像后發(fā)現(xiàn)由軟骨細(xì)胞特異性產(chǎn)生的酸性粘多糖染色，可以確定從間質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞的分化適宜地進(jìn)行著。
另一方面，在一部分10cm的平皿中，將間質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)直到達(dá)到匯合狀態(tài)。間質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)后，將培養(yǎng)基從細(xì)胞增殖用的物質(zhì)轉(zhuǎn)換成骨分化培養(yǎng)基，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2周，使之分化成成骨細(xì)胞(參照圖3(d))。使用在含10％的DMEM培養(yǎng)基中添加了10-7M地塞米松、0.15mM抗壞血酸-2磷酸鹽、1mM丙酮酸、10ng/ml的rh TGF-β1(recombinant human TGF-β)及1/100vol(相當(dāng)于培養(yǎng)基量的1/100量)的ITS premix(ITS premix，日本Becton Dickinson公司)的作為骨分化培養(yǎng)基。
用胰蛋白酶及膠原酶從平皿底面剝離分化成的成骨細(xì)胞，在抗生素+10％FBS/DMEM中制備細(xì)胞密度達(dá)2×107細(xì)胞/ml的成骨細(xì)胞懸液。將該成骨細(xì)胞懸液滴到在膠原海綿11的一半?yún)^(qū)域形成有軟骨細(xì)胞的組織再生用基底材料10中。此時，從與保持有軟骨細(xì)胞側(cè)相反的側(cè)的端部滴下成骨細(xì)胞懸液(參照圖3(e))。滴下后靜置1小時，使成骨細(xì)胞保持在膠原海綿11中。如圖2所示，如此膠原海綿11的一半?yún)^(qū)域11a保持了軟骨細(xì)胞，而另一半?yún)^(qū)域11b則保持了成骨細(xì)胞，得到了骨·軟骨柱20。
另外，接種成骨細(xì)胞后，用添加了抗生素的含10％FBS的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，由于從成骨細(xì)胞可產(chǎn)生基質(zhì)，所以可制備膠原海綿11的一半?yún)^(qū)域11a保持了軟骨細(xì)胞，而另一半?yún)^(qū)域11b則保持了骨細(xì)胞的骨·軟骨柱20。
移植用材料-2圖4是本實施例中移植用材料的概略斜視圖。圖5是表示制備本實施例中移植的順序的概略圖。本實施例中，如圖4所示，制備移植用材料骨·軟骨30，它備有保持了軟骨細(xì)胞的膠原膠31和在膠原膠31上疊層的人工骨33，和圍繞它們形成的網(wǎng)狀支持體32。以下，以圖5為例對其制備順序進(jìn)行說明。
首先，將滅菌的硅管(外徑10mm，內(nèi)徑6mm，高7mm)放置到24孔板中，將用PLGA(聚乳酸-聚乙醇酸共聚物)形成的網(wǎng)狀支持體32(直徑6mm，高15mm)插入到硅管中，通過硅管將網(wǎng)狀支持體32以直立狀態(tài)支持(參照圖5(a))。
然后，以磷酸鈣化合物為主要成分的膏狀骨充填物(商品名Biopex，三菱Materials公司)200μl填充到周圍圍繞有硅管的網(wǎng)狀支持體32內(nèi)。此時的骨填充材料的高度為7mm。填充骨填充材料后，靜置約10分鐘，骨填充材料硬化，形成羥基磷灰石即人工骨33參照圖5(b))。
另一方面，從日本白家兔的關(guān)節(jié)部位采取軟骨組織，用胰蛋白EDTA溶液及膠原酶溶液進(jìn)行酶處理，分離·回收軟骨細(xì)胞。洗滌所得軟骨細(xì)胞，然后加入含10％FBS的DMEM，制備成細(xì)胞密度達(dá)4×106細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。將該細(xì)胞懸液與3％組織修復(fù)用蛋白質(zhì)填補(bǔ)劑(高研社)以1∶1的比例混合，制備軟骨細(xì)胞膠原混合液。通過該混合步驟，將4×106個/ml的細(xì)胞密度稀釋成2×106個/ml。將200μl該細(xì)胞-膠原混合液填充到上述的網(wǎng)狀支持體32中的人工骨33上。填充該細(xì)胞-膠原混合液時，在人工骨33上放置纖粘連蛋白等粘接因子。
其后，37℃、5％CO2條件下靜置1小時，使軟骨細(xì)胞-膠原混合液膠體化，添加使軟骨細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)的培養(yǎng)基，培養(yǎng)3周，得到骨·軟骨柱。此時的培養(yǎng)基使用含有50μg/ml抗壞血酸的含10％ FBS-DMEM培養(yǎng)基。
骨·軟骨柱的評價將實施例2中得到的骨·軟骨柱(一半為軟骨組織，另一半為成骨組織)實際移植到兔的骨·軟骨缺損部位，評價其修復(fù)程度。即，麻醉日本白家兔(27周齡)后，切開其膝關(guān)節(jié)部分，使膝蓋骨脫臼。然后露出大腿骨，用鉆在膝蓋溝中央制作直徑5mm深8mm的全層缺損。切割實施例2中得到的骨·軟骨柱20使之適于該缺損部位的深度，將之埋到骨·軟骨缺損部位，用相同的PLGA制作的縫合線將PLGA制備的網(wǎng)狀支持體12的網(wǎng)眼部分與周圍的健康軟骨部分縫合固定。對照組將未接種細(xì)胞的組織再生用基底材料10埋入骨·軟骨缺損部位，同樣與周圍的健康軟骨部分縫合固定。均用含抗生素的生理鹽水洗滌手術(shù)部位周邊部位，然后縫合切開部位。另外，任一種均具有足夠的強(qiáng)度，容易操作而無形狀的崩解。
飼養(yǎng)84天后，在麻醉下殺死這些兔子，切離包括移植部的大腿骨膝關(guān)節(jié)部位，制作組織標(biāo)本，用福爾馬林固定組織標(biāo)本，制備組織切片，通過alcian blue和番紅O進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果，骨·軟骨柱移植組中，缺損部位用alcian blue和番紅O染色后有陽性著染，可以看到由骨·軟骨柱再生成骨組織和軟骨組織。對照組中未看到明顯再生?？紤]進(jìn)行更長時間的飼養(yǎng)時，對照組中也可從周圍健康部位產(chǎn)生細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)。
與上面一樣，將實施例3中得到的骨·軟骨柱30(一半為軟骨組織，另一半為人工骨)實際移植到兔的骨·軟骨缺損部位，評價其修復(fù)程度時發(fā)現(xiàn)，移植后84天兔的骨·軟骨柱移植部位的缺損部位修復(fù)。
本發(fā)明不限定于上述實施例，在不脫離本發(fā)明技術(shù)領(lǐng)域的范圍內(nèi)，當(dāng)然可以多種狀態(tài)實施。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的組織再生用基底材料及利用它的移植用材料可用于在活體內(nèi)外的細(xì)胞培養(yǎng)或再生。
權(quán)利要求
1.組織再生用基底材料，其具備形成三維形狀的多孔載體和圍繞該多孔載體而形成的、以與外部連通的狀態(tài)支持該多孔載體的支持體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組織再生用基底材料，其中支持體為網(wǎng)狀支持體、柵狀支持體或帶孔的板狀支持體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的組織再生用基底材料，其中，多孔載體及支持體中至少有一方是由生物親和性材料或生物吸收性材料形成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的組織再生用基底材料，其中，多孔載體由選自膠原、膠原衍生物、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸衍生物、脫乙酰殼多糖、脫乙酰殼多糖衍生物、聚輪烷、聚輪烷衍生物、殼多糖、殼多糖衍生物、明膠、纖粘連蛋白、肝素、層粘連蛋白、藻酸鈣中的1種或2種以上的物質(zhì)形成；支持體由選自聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物、聚乙醇酸-聚己內(nèi)酯共聚物中的1種或2種以上的物質(zhì)形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的組織再生用基底材料，其中支持體至少有一條縫合線。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組織再生用基底材料，其中縫合線由生物親和性材料或生物吸收性材料形成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的組織再生用基底材料，其形成可以在內(nèi)窺鏡下的手術(shù)中使用的形狀。
8.移植用材料，其具備保持有細(xì)胞的三維形狀的細(xì)胞保持載體、和圍繞該細(xì)胞保持載體所形成的、以與外部連通的狀態(tài)支持該細(xì)胞保持載體的支持體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的移植用材料，其中細(xì)胞保持載體為在三維形狀的多孔載體中保持有細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9或10的移植用材料，其還具備與細(xì)胞保持載體鄰接的三維形狀的人工移植材料。
11.根據(jù)權(quán)利要求8-10中任一項的移植用材料，其中所述細(xì)胞包括軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞、以及間質(zhì)干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)中的至少一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求8或9的移植用材料，其中所述細(xì)胞是保持在細(xì)胞保持載體的單側(cè)一半中的軟骨細(xì)胞和保持在前述細(xì)胞保持載體的另一單側(cè)一半中的成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求10的移植用材料，其中人工移植材料為人工骨，所述細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13的移植用材料，其用于治療關(guān)節(jié)中的骨·軟骨缺損部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求8-14中任一項的移植用材料，其中支持體為網(wǎng)狀支持體、柵狀支持體或帶孔的板狀支持體。
16.根據(jù)權(quán)利要求8-15中任一項的組織再生用基底材料，其中，載體及支持體中至少有一方是由生物親和性材料或生物吸收性材料形成。
17.根據(jù)權(quán)利要求8-16中任一項的移植用材料，其中載體由選自膠原、膠原衍生物、透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸衍生物、脫乙酰殼多糖、脫乙酰殼多糖衍生物、聚輪烷、聚輪烷衍生物、殼多糖、殼多糖衍生物、明膠、纖粘連蛋白、肝素、層粘連蛋白、藻酸鈣中的1種或2種以上的物質(zhì)形成；支持體由選自聚乳酸、聚乙醇酸、聚己內(nèi)酯、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物、聚乙醇酸-聚己內(nèi)酯共聚物中的1種或2種以上的物質(zhì)形成。
18.根據(jù)權(quán)利要求8-17中任一項的移植用材料，其中支持體至少有一條縫合線。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的移植用材料，其縫合線由生物親和性材料或生物吸收性材料形成。
20.根據(jù)權(quán)利要求8-19中任一項的移植用材料，其形成可以在內(nèi)窺鏡下的手術(shù)中使用的形狀。
21.制備權(quán)利要求8-20中任一項的移植用材料的方法，其中，在獲得上述細(xì)胞保持載體時，(1)將間質(zhì)干細(xì)胞分化成目的細(xì)胞，制備所得細(xì)胞的細(xì)胞懸液，將所得細(xì)胞懸液供給到能保持細(xì)胞的三維形狀的預(yù)備載體中，得到細(xì)胞保持載體，或者(2)將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供給到能保持細(xì)胞的三維形狀的預(yù)備載體中，在該預(yù)備載體上使間質(zhì)干細(xì)胞分化成目的細(xì)胞，從而獲得所述細(xì)胞保持載體。
22.制備權(quán)利要求12中的移植用材料的方法，其中，在獲得上述細(xì)胞保持載體時，(1)將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供給到能保持細(xì)胞的三維形狀的預(yù)備載體的單側(cè)一半中，然后通過培養(yǎng)、分化使軟骨細(xì)胞保持在前述單側(cè)一半中，然后將預(yù)先分化間質(zhì)干細(xì)胞而得到的成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞供予到預(yù)備載體的另一單側(cè)一半，從而得到細(xì)胞保持載體，或者，(2)將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供給到能保持細(xì)胞的三維形狀的預(yù)備載體的單側(cè)一半中，然后通過培養(yǎng)、分化使軟骨細(xì)胞保持在前述單側(cè)一半中，然后將包含間質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞懸液供予預(yù)備載體的另一單側(cè)一半，在該預(yù)備載體上進(jìn)行培養(yǎng)，使之分化成成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞，從而得到細(xì)胞保持載體。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的制備移植用材料的方法，其中預(yù)備載體為權(quán)利要求1-7中任一項所述的組織再生用基底材料的多孔載體。
24.制備權(quán)利要求13的移植用材料的方法，其中用人工骨材料作成人工骨后，制備保持有前述軟骨細(xì)胞的細(xì)胞保持載體，使該載體鄰接該人工骨且被前述支持體所圍繞。
全文摘要
組織再生用基底材料(10)，其具備形成三維形狀的膠原海綿(11)和以與外部連通的狀態(tài)支持膠原海綿(11)的網(wǎng)狀支持體(12)。該組織再生用基底材料(10)，即便在形成三維形狀的膠原海綿(11)難以維持自身形狀的情況下，由于網(wǎng)狀支持體(12)是圍繞膠原海綿(11)而形成的，所以通過網(wǎng)狀支持體(12)可維持其三維形狀。
文檔編號A61L27/56GK1537020SQ0281504
公開日2004年10月13日 申請日期2002年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月30日
發(fā)明者越智光夫, 筏義人, 菅原桂 申請人:株式會社日本組織工程, 越智光夫, 筏義人