專利名稱：被dna和抗原組合增效的疫苗制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥學領(lǐng)域的分支，具體來說是一種新的疫苗抗原制劑。本發(fā)明的技術(shù)目標是開發(fā)一種新的疫苗制劑，使成分的數(shù)目最小化，其中所述成分能通過相互作用引起加強和多樣的免疫應(yīng)答。另外，開發(fā)了組合疫苗制劑以增強其誘導的針對共同施用抗原的免疫應(yīng)答。
現(xiàn)有技術(shù)有效的抗HCV疫苗的獲得還存在一些障礙。由于HCV的RNA特性，HCV能夠快速突變以適應(yīng)環(huán)境。這導致在世界各地多種已被鑒定的病毒種群的序列存在著高度多變性。在HCV中，最重要的異種性區(qū)域是其E2蛋白質(zhì)的超變區(qū)I，在此區(qū)可能存在一個中和抗原表位。即使存在活躍的免疫應(yīng)答，HCV也能引起持續(xù)的感染(見Lechmann等人，SeminLiver Dis 2000，20，211-226)。目前并沒有病毒有效復制的動物模型和體外培養(yǎng)系統(tǒng)，以及關(guān)于中和抗體的研究。與疾病進程和保護相關(guān)的免疫模式還沒有被定義。對于感染的消退而言，有效的、多特異性的(multispecific)和長效的體液和細胞免疫應(yīng)答很可能是必需的(見Lechmann等人，Semin Liver Dis 2000，20，211-226)。
人們已經(jīng)用幾種方法去研制抗HCV疫苗，目前最普遍被研究的是重組蛋白質(zhì)、合成肽、病毒樣顆粒、DNA疫苗和活病毒載體。
對于HCV來說，基于蛋白質(zhì)亞基來研發(fā)疫苗是最初被應(yīng)用的策略之一，因為對幾種黃病毒而言，抗表面蛋白質(zhì)的抗體能夠起到保護作用。幾種基于HCV結(jié)構(gòu)抗原的變體已經(jīng)在動物體內(nèi)起到了有限的抗病毒作用。例如用E1-E2的異二聚體免疫黑猩猩，在7只被免疫的黑猩猩中，5只產(chǎn)生了保護作用而另外2只感染了自限性疾病(見Choo等人，PROC NATL ACAD SCI USES 1994，91，1294-1298)。這種保護作用與能夠抑制E2同人細胞結(jié)合的抗體(Abs)的存在有關(guān)(見Rosa等人，PROC NATL ACAD SCI USES 1996，93，1759-1763)。
來源于基因型1b種群的E1重組蛋白質(zhì)已經(jīng)被純化，是一種直徑大約為9納米的自連接同二聚體顆粒(見Maertens等人，RecordsGastroenterol Belg 2000，63，203)。用50μg的E1重組蛋白質(zhì)免疫9個劑量后，兩只黑猩猩感染慢性HCV。接種疫苗提高了肝臟的組織學功能，使肝臟中的病毒抗原消失。并且接種E1重組蛋白質(zhì)也降低了丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的水平。盡管在治療期間血清中的病毒RNA濃度并沒有改變，但是在治療后肝臟炎癥反應(yīng)和病毒抗原的水平都增加了。病情的改善與高水平的抗E1抗體相關(guān)(見Maertens等人，Records Gastroenterol Belg 2000，63，203)。
特別是，由重組蛋白質(zhì)形成病毒樣顆粒及它們作為疫苗使用都是非常有吸引力的，因為這些結(jié)構(gòu)常常具有類似病毒的特性。用一種包含HCV結(jié)構(gòu)抗原序列的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞得到了這種顆粒，它能夠同時產(chǎn)生抗這些抗原的體液和細胞免疫應(yīng)答(見Baumert等人，Gastroenterology 1999，117，1397-1407和Lechmann等人，Hepatology 1999，30，423-429)。盡管對基于蛋白質(zhì)亞基研制的疫苗的測試結(jié)果是令人鼓舞的，但是通過這些變體誘導的免疫應(yīng)答主要為短期的、種群特異性的體液免疫。
另一方面，對不同重組病毒載體進行研究以用于開發(fā)抗HCV的重組疫苗。特別是，由于腺病毒有肝臟趨向性，能夠同時誘導體液和細胞免疫，且易于口服或全身給藥，使得重組腺病毒載體成為令人感興趣的候選者。包含編碼HCV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的DNA序列的腺病毒誘導出抗每種此類蛋白質(zhì)的抗體反應(yīng)(見Makimura等人，Vaccine 1996，14，28-36)。此外，用C和E1的重組腺病毒免疫小鼠以后，產(chǎn)生了一種抗這些抗原的特異的CTL反應(yīng)(見Bruna-Romero等人，Hepatology1997，25，470-477)。盡管這些結(jié)果是激動人心的，但是近來重組腺病毒用于基因治療方面產(chǎn)生了問題，它們是否可以在人體中使用受到質(zhì)疑。其它包含不同HCV基因的重組病毒(如牛痘、金絲雀痘和雞痘病毒)在小鼠體內(nèi)可以誘導強的CTL和T-輔助細胞免疫應(yīng)答(見Shirai等人，J Virol 1994，68，3334-3342和Large等人，J Immunol 1999，162，931-938)。然而這些重組病毒和其它α病毒的變種(如塞姆利基森林病毒)也由于它們使用時的監(jiān)管問題和安全問題受到了影響。
在HCV聚蛋白中鑒定出來的幾個CD4+和CD8+T細胞的抗原表位對清除病毒是十分重要的，這一鑒定結(jié)果支持了把合成肽作為抗這種病原體的候選疫苗的評測。包含C、NS4和NS5抗原表位的不同肽，不管是否脂質(zhì)化，都可在小鼠體內(nèi)誘導出強的CTL反應(yīng)(見Shirai等人，J Infect Dis 1996，173，24-31；Hiranuma等人，Hiranuma等人，J Gene Virol 1999，80，187-193；Oseroff等人，Vaccine 1998，16，823-833)。
另一個用于研制抗HCV疫苗的策略基于產(chǎn)生抗線性抗原表位抗體的可能性。這種可供選擇的辦法主要用于產(chǎn)生抗HCV的HVR-1的抗體，而且在對兔子和黑猩猩的實驗中已經(jīng)有了一些令人鼓舞的結(jié)果(見Esumi等人，Arch Virol 1999，144，973-980和Shang等人，Virology1999，258，396-405)。對于選擇HVR-1作為抗HCV的疫苗的靶標而言，準種(quasi-species)是一個主要問題。
肽疫苗的主要障礙在于，沒有T輔助細胞抗原表位的肽的免疫原性很差。而且，疫苗的效率常常根據(jù)誘導出針對大范圍不同抗原的特異免疫應(yīng)答來判斷的。這些限制是此種策略的主要缺陷。
DNA免疫是最近在疫苗研制中常用的策略之一。DNA疫苗由純化的質(zhì)粒組成，該質(zhì)粒包含編碼目的抗原的序列，該序列位于真核細胞的功能轉(zhuǎn)錄單位調(diào)控之下。將質(zhì)粒注射入肌肉或者皮膚以后，質(zhì)粒被宿主細胞吸收同時在其細胞內(nèi)表達抗原。在宿主細胞內(nèi)表達所編碼的抗原是此方法的主要優(yōu)點，因為這與病毒的天然感染類似。DNA的處理簡易性及其穩(wěn)定性是DNA免疫的另一些優(yōu)點，其中DNA的穩(wěn)定性使DNA可以被相對便宜的大規(guī)模生產(chǎn)。
用編碼共同刺激分子(如細胞因子)的分子或者基因共免疫可以調(diào)節(jié)此類疫苗誘導的免疫應(yīng)答。遺傳構(gòu)建體可以通過以下方式被修飾插入或者缺失跨膜區(qū)、分泌信號序列或影響抗原細胞內(nèi)運輸和加工的其它類型殘基。
特別地，在研制抗HCV疫苗過程中，DNA免疫已經(jīng)被廣泛研究。編碼HCV衣殼蛋白的全長或截短變體的不同表達載體已經(jīng)被構(gòu)建(見Lagging等人，J Virol 1995，69，5859-5863；Chen等人，VaccineRes 1995，4，135-144)。還有包含HCV的5非轉(zhuǎn)錄區(qū)的構(gòu)建體(見Tokushige等人，Hepatology 1996，24，14-20)。表達乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原或者其它HBV衣殼抗原的融合變體的構(gòu)建體也已經(jīng)被研究(見Major等人，J VIROL 1995，69，5798-5805)。用這些質(zhì)粒來免疫通常能誘導出陽性CTL和淋巴細胞增殖反應(yīng)。
HCV的包膜蛋白同樣也已成為此類技術(shù)的靶標。在HCV E2的情況下，體液免疫應(yīng)答好像主要針對HVR-1(見Lee等人，Mol Cells 1998，8，444-451)。用表達E1和E2蛋白質(zhì)的細胞內(nèi)或者分泌型變體的質(zhì)粒免疫可以產(chǎn)生類似的免疫應(yīng)答(見Lee等人，J VIROL 1998，72，8430-8436)。用表達GM-CSF和HCV E1或E2蛋白質(zhì)的雙順反子質(zhì)粒接種免疫增加了體液和細胞免疫應(yīng)答。最近，應(yīng)用表達E1和E2蛋白質(zhì)的雙順反子質(zhì)粒，研究了在體內(nèi)這兩種蛋白質(zhì)的異二聚體形成對DNA免疫后誘導的免疫應(yīng)答的影響。當形成異二聚體時，沒有得到抗HCV E1和E2蛋白質(zhì)的抗體反應(yīng)。明顯相反的是，當用表達E1和E2的截短變體的質(zhì)粒免疫以后，獲得了針對線性及構(gòu)象抗原表位的高水平的抗體滴度。因此，當評估包含這些抗原的構(gòu)建體時，為了獲得強的抗體反應(yīng)，避免異二聚體的形成似乎是必要的(見Fournillier等人，J VIROL1999，73，497-504)。
一些非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)也用此技術(shù)評測。在一種載體中插入編碼NS3蛋白質(zhì)的C-末端結(jié)構(gòu)域的區(qū)域，并且這個載體允許此結(jié)構(gòu)域和IL-2的表達同時且相互獨立的進行，當用這個構(gòu)建體免疫時，獲得了比較好的結(jié)果(見Papa等人，Res Virol 1998，149，315-319)。用這種免疫策略，NS4和NS5蛋白質(zhì)也產(chǎn)生了抗體和CTL反應(yīng)(見Encke等人，J IMMUNOL 1998，161，4917-4923)。最近，人們用編碼GM-CSF和病毒非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)(NS3、NS4和NS5)的構(gòu)建體誘導出抗每一個非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的有效抗體反應(yīng)和加強的淋巴增殖反應(yīng)(見Cho等人，Vaccine 1999，17，1136-1144)。
對于不同的DNA構(gòu)建體，已經(jīng)報道了不同HCV抗原的有效表達，以及根據(jù)研究中的組合產(chǎn)生1∶100到1∶100000的抗HCV抗體水平(見Inchauspe等人，Vaccine 1997，15，853-856)。另外，特異的CTL和淋巴細胞增殖反應(yīng)已經(jīng)被證實(見Inchauspe等人，DNA AND CELLBIOLOGY 1997，16，185-195)。然而，為了產(chǎn)生更強的抗不同HCV蛋白質(zhì)的體液和細胞免疫應(yīng)答，需要更多的努力改善此方法。因此，研究了一些變體，比如脂質(zhì)體(見Gramzinski等人，Mol Medicine1998，4，109-118)和皂苷QS-21(見Sasaki等人，J Virol 1998，72，4931-4939)，對DNA免疫后誘導的免疫應(yīng)答的增強作用。并且也研究了在DNA免疫過程中作為生物佐劑的樹突細胞。通過使用病毒載體(見Specht等人，J Exp Med 1997，186，1213-1221；Brossart等人，J Immunol 1997，158，3270-3276；Song等人，J Exp Med 1997，186，1247-1256)或者RNA(見Boczkowski等人，J Exp Med 1996，184，465-472)，證明了來源于遺傳修飾大鼠骨髓并且表達腫瘤抗原的樹突細胞(CD)能夠促進T細胞針對腫瘤抗原的特異性反應(yīng)和在大鼠中由細胞介導的抗腫瘤預(yù)防免疫。
目前，DNA免疫載體的改良，包括插入CpG基元來增加對所表達抗原的免疫應(yīng)答(見Hasan等人，J Immunol Meth 1999，229，1-22)，以及DNA的遞送體系對于克服此類技術(shù)的局限性是極其重要的。由于HCV感染難于闡明，而且關(guān)于針對病原體的保護的免疫學參數(shù)缺乏一個清晰的定義，所以一種對于HCV有效的疫苗可能需要能夠刺激免疫應(yīng)答的多個方面的多特異性途徑。這一問題的解決依賴于迄今所用的幾種疫苗策略的組合。特別是，用DNA疫苗的初次免疫和用重組蛋白或病毒載體的加強免疫相組合的免疫方案已經(jīng)得到了研究(見Hu等人，Vaccine 1999，17，3160-3170；Pancholi等人，J Infect Dis2000，182，18-27)，盡管這種免疫策略的結(jié)果是陽性的，但是，若要證明這種初次免疫-加強免疫策略是否真能誘導針對HCV的保護性免疫，仍需要進一步的研究。
另外，對于乙型肝炎模型，已經(jīng)對一種疫苗進行了研究，此疫苗包含乙型肝炎表面抗原、此抗原的特異性抗體和表達此種抗原的DNA形成的復合物(見Wen等人，US622 1664，1998)。此制劑允許抗原以不同的方法呈遞，并且快速誘導免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答的效果優(yōu)于由單個變體所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明描述了一種疫苗制劑，其只包含一種抗原蛋白及表達一個或幾個蛋白質(zhì)的質(zhì)粒作為組分，其中它們中的至少一種作為另一種的佐劑。特別是，還對丙型或乙型肝炎病毒的衣殼抗原和表達單獨HCV E1蛋白質(zhì)或其聚蛋白變體的質(zhì)粒進行了研究。與前面描述的針對乙型肝炎模型的組合物相反，制劑中的抗體對于免疫應(yīng)答的增強并不是必需的，因此減少了所需的組分數(shù)量。另外，疫苗組合物的極大靈活性也允許對不同抗原的有效免疫應(yīng)答得以同時產(chǎn)生。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了預(yù)防或治療HCV和HBV及其組合的組合物以及個體免疫方法。首次報道了含有如下組分的疫苗制劑(a)DNA，其表達包括HCV包膜E1抗原區(qū)的蛋白質(zhì)變體；(b)適當比例的HCV或者HBV的蛋白質(zhì)抗原。本發(fā)明的新穎性在于至少一種組分對另一種組分所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答起輔助作用。對于產(chǎn)生抗HCV和HBV的免疫應(yīng)答來說，疫苗制劑中由遺傳構(gòu)建體編碼并由宿主細胞表達的抗原和蛋白質(zhì)抗原都是令人感興趣的靶標。從而，免疫應(yīng)答能夠針對大量的重要抗原。
疫苗制劑包括DNA，該DNA能增強針對與其混合的抗原的免疫應(yīng)答；這一作用依賴于在被免疫宿主體內(nèi)DNA編碼的一種或幾種蛋白質(zhì)的表達。該DNA來源于細菌菌株并按照傳統(tǒng)步驟純化(見Horn等人，H GeneTher 1995，6，565-573)。
在優(yōu)選實施方案中，疫苗制劑包括至少下列質(zhì)粒中的至少一種pIDKE1S、pIDKE2和pAEC-ME，其編碼所表達的蛋白質(zhì)變體的DNA序列分別同序列2-4相一致。
pIDKE1S質(zhì)粒表達包含HCV E1的176-363氨基酸的蛋白質(zhì)(Sec.Id.No.2)。另一方面，pIDKE2質(zhì)粒表達包含病毒聚蛋白最初650個氨基酸(C、E1和E2的一部分)的蛋白質(zhì)(Sec.Id.No.3)。pAEC-ME質(zhì)粒表達一個嵌合蛋白質(zhì)(Sec.Id.No.4)，其包含不同HCV抗原的B細胞和T細胞的抗原表位。在這些質(zhì)粒中，病毒抗原的編碼序列由一個古巴HCV病毒株的cDNA得到(見Morales等人，1998，WO 98/25960)。pIDKE1S、pIDKE2和pAEC-ME質(zhì)粒包含插入到pAEC-K6質(zhì)粒的多克隆位點當中的HCV抗原編碼序列(見Herrera等人，Biochem Biophys ResCommun.2000，279，548-551)。本發(fā)明中所用的質(zhì)粒含有能夠在人體細胞內(nèi)調(diào)控抗原表達的調(diào)控元件，這些調(diào)控元件包括在哺乳動物體內(nèi)有功能的轉(zhuǎn)錄單位，其例如通過人類巨細胞病毒的啟動子和猴病毒40的多聚腺苷酸化信號而整合。這些質(zhì)粒還包括細菌的復制起點和抗卡那霉素的篩選標記。
本制劑的蛋白質(zhì)組分可以是能夠形成顆粒的可溶病毒抗原，其純度超過90％。在優(yōu)選實施方案中，疫苗制劑的蛋白質(zhì)成分是HCV和HBV的衣殼抗原，它們可以增強針對與它們混合在一起的DNA所表達的蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。
本發(fā)明還涉及制備所述DNA和抗原混合物的工藝流程。混合物的制備是將要添加的組分(DNA和抗原)溶解在合適的緩沖液中來完成的。在優(yōu)選實施方案中，兩種成分以10/1(w/w)的比例溶解在磷酸鹽溶液中而制備制劑。在對個體施用之前，該混合物要在26-30℃之間至少搖動孵育2小時。此制劑可以通過肌肉內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、粘膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、舌下或者其它的方式給藥。免疫接種可以借助于注射器、基因槍、噴霧器或者其它遞送設(shè)備。根據(jù)動物的種類和使用的免疫方法不同，每個個體所接受的每一種組分的劑量為每體積0.001毫克到10毫克。
當疫苗制劑的組分是DNA和蛋白質(zhì)抗原的混合物時，所得到的產(chǎn)品優(yōu)于各自的單個組分，原因如下
-可能產(chǎn)生針對大量抗原的比較強和多樣的體液和細胞免疫應(yīng)答。
-因為抗原2同時又是佐劑，這就減少了由佐劑的注射所產(chǎn)生的毒性作用。
-可以將這些制劑用作組合疫苗的核心。
-疫苗制劑的生產(chǎn)方法不需要抗原的吸附作用。
在制劑包含DNA和HCV衣殼蛋白質(zhì)的情況下，其中所述DNA表達包含HCV E1蛋白質(zhì)區(qū)域的蛋白質(zhì)變體，所得到的產(chǎn)品優(yōu)于各自的單個組分，原因如下-可能產(chǎn)生針對大量抗原表位的比較強和多樣的體液和細胞免疫應(yīng)答。
-因為抗原2同時又是佐劑，這就減少了由佐劑的注射所產(chǎn)生的毒性作用。
--可以將DNA和衣殼蛋白質(zhì)一起作為組合或者多價疫苗的核心。
另一方面，用表達包含HCV E1蛋白區(qū)域的蛋白質(zhì)變體的DNA免疫，提高了制劑中存在的HBV蛋白質(zhì)抗原的免疫原性。尤其是，同HBsAg或者HBcAg混合得到的混合物，其結(jié)果比用這一抗原得到的更好，原因如下a)誘導出的抗HBsAg的IgG水平要優(yōu)于用氫氧化鋁和HbsAg接種所得到的IgG水平。
b)組成一個有力的HBV-HCV組合疫苗。
c)疫苗制劑的生產(chǎn)方法不需要抗原的吸附作用。
附圖簡述

圖1質(zhì)粒pAEC-ME、pIDKE1S和pIDKE2的示意圖。
圖2此圖為電子顯微鏡成像結(jié)果，其中(A)為HCV衣殼顆粒；(B)為HBV的表面抗原；(C)為HBV衣殼顆粒。
圖3此圖顯示pIDKE2質(zhì)粒和核心蛋白質(zhì)的免疫圖，動物通過肌肉內(nèi)注射免疫，劑量為50μg的DNA和5μg蛋白質(zhì)。
圖4此圖顯示由接種不同質(zhì)粒和HBcAg蛋白質(zhì)產(chǎn)生的免疫作用，動物通過肌肉內(nèi)注射免疫，劑量為50μg的DNA和5μg蛋白質(zhì)。
圖5此圖顯示由接種不同質(zhì)粒和HBcAg蛋白質(zhì)產(chǎn)生的免疫作用，動物通過肌肉內(nèi)注射免疫，劑量為50μg的DNA和5μg蛋白質(zhì)。
實施例實施例1含有表達HCV的聚蛋白Capsid-E1-E2的DNA和HCV衣殼蛋白質(zhì)抗原作為組分的制劑的免疫原性為了證明接種pIDKE2質(zhì)粒(圖1)和重組HCV衣殼顆粒(圖2A)的混合物后抗HCV結(jié)構(gòu)抗原的免疫應(yīng)答的增強，通過肌肉內(nèi)注射免疫了每組10只8周大的BALB/c雌性小鼠。除了其中一組只研究了在0天單次接種的影響，其余均在0天和21天兩次接種。初次免疫后14周采血樣。免疫原溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中施用。第1組用50μg的pIDKE2質(zhì)粒(圖1，質(zhì)粒包含編碼病毒聚蛋白最初650個氨基酸的序列，Sec.Id.No3)接種。第2組用5μg的核心蛋白質(zhì)(包含HCV衣殼蛋白質(zhì)的最初173個氨基酸)接種。第3組先用5μg的核心蛋白質(zhì)接種，然后再用50μg的pIDKE2質(zhì)粒接種(核心蛋白質(zhì)/pIDKE2)。第4組接種的條件同第三組的一樣，只是顛倒了次序(pIDKE2/核心蛋白質(zhì))。第5組在0天和21天用50μg pIDKE2和5μg核心蛋白質(zhì)的混合物接種(核心蛋白質(zhì)-pIDKE2)。第6組同第5組的接種方式一樣，但僅在0天接種(核心蛋白質(zhì)-pIDKE2(1))。另外第7組為陰性對照，用50μg的pAEC-K6質(zhì)粒(它不包含編碼HCV抗原的序列)免疫。
通過ELISA來檢測針對HCV結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的抗體免疫反應(yīng)。實驗結(jié)果用Student T檢驗，p＜0.05時認為具有統(tǒng)計學差異。
圖3顯示，同使用單個組分相比，兩次施用pIDKE2和核心蛋白質(zhì)的混合物能夠提高抗HCV結(jié)構(gòu)抗原的免疫應(yīng)答。此制劑(兩次接種)誘導的抗HCV E1和E2包膜蛋白質(zhì)的抗體效價，在統(tǒng)計學上高于在其它組中所獲得的抗體效價(圖3A)。這些抗體效價也高于單次接種pIDKE2和核心蛋白質(zhì)的混合物獲得的抗HCV衣殼蛋白質(zhì)的抗體效價(圖3A)。單次接種混合物通常比其它免疫組誘導的抗體效價要低。
抗HCV結(jié)構(gòu)抗原的淋巴細胞增殖反應(yīng)檢測顯示(圖3B)，兩次接種pIDKE2-核心蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的抗衣殼的反應(yīng)顯著優(yōu)于其它組。結(jié)果以被免疫動物脾細胞刺激指數(shù)的形式給出。刺激指數(shù)由(H3)胸腺嘧啶脫氧核苷的攝取測定?？梢缘贸鼋Y(jié)論，pIDKE2和核心蛋白質(zhì)混合物對針對HCV結(jié)構(gòu)抗原的免疫應(yīng)答產(chǎn)生協(xié)同刺激。
實施例2含有表達HCV的聚蛋白Capsid-E1-E2的DNA和HBV衣殼蛋白質(zhì)抗原作為組分的制劑的免疫原性為了研究pIDKE2質(zhì)粒和其他病原體蛋白質(zhì)抗原的混合物誘導的免疫應(yīng)答，用pIDKE2質(zhì)粒與HBV衣殼重組顆粒(HBcAg，圖2C)的混合物，通過肌肉內(nèi)注射免疫每組10只8周大的BALB/c雌性小鼠。在0天和21天兩次接種，初次免疫后9周和19周采血樣。免疫原溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中而制備。質(zhì)粒施用劑量為50μg，HBV衣殼蛋白質(zhì)施用劑量為5μg。第1組用pAEC-K6質(zhì)粒(陰性對照)接種。第2組用HBcAg蛋白質(zhì)免疫。第3組用pIDKE2質(zhì)粒接種。第4組和第5組分別用pIDKE2和pAEC-K6與HBcAg的混合物接種。實驗結(jié)果用Student T檢驗進行統(tǒng)計分析，p＜0.05時認為有顯著性差異。
圖4顯示初次免疫后19周在小鼠中誘導的抗體反應(yīng)。由圖4A可見，pIDKE2和HbcAg的混合物誘導的抗HBcAg的抗體效價，在統(tǒng)計學上高于其它免疫動物得到的抗體效價。單獨免疫HbcAg或與pAEC-K6混合免疫的組之間并沒有統(tǒng)計學上的差異。因此可以得出結(jié)論，pIDKE2質(zhì)粒能夠增強抗HBcAg的免疫應(yīng)答。
另一方面，由圖4B可見，pIDKE2和HbcAg的混合物誘導的抗HCV結(jié)構(gòu)抗原的抗體效價，比用pIDKE2單獨免疫要高。因此，HBcAg也能夠增強pIDKE2施用后誘導的抗HCV結(jié)構(gòu)抗原的免疫應(yīng)答。
實施例3含有表達HCV和HBV變體的質(zhì)粒以及HBV表面抗原的蛋白質(zhì)變體作為組分的制劑的免疫原性為證明在聯(lián)合施用pIDKE2質(zhì)粒后，產(chǎn)生的抗其它蛋白質(zhì)抗原的免疫應(yīng)答的增強，并研究具有相似佐劑特性的其它質(zhì)粒，用質(zhì)粒與HBsAg重組顆粒(圖2B)的混合物，通過肌肉內(nèi)注射免疫每組10只8周大的BALB/c雌性小鼠。在0天、21天和50天三次接種，初次免疫后16周采血樣。除一組免疫原用氫氧化鋁配制外，其他免疫原均溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中制備。第1組用50μg的pIDKCo質(zhì)粒和5μg HbsAg的混合物(pIDKCo-HBsAg)接種，其中pIDKCo質(zhì)粒包含編碼HCV衣殼蛋白質(zhì)前176個氨基酸的序列，(見Duenas-Carrera等人，Vaccine2000；19(7)992-997)。第2組到第7組接種相同量的HBsAg與DNA的混合物，但使用下列質(zhì)粒第2組(pIDKE1S-HBsAg)，pIDKE1S質(zhì)粒(圖1，包括編碼HCV聚蛋白176-363氨基酸的序列，Sec.Id.No2)；第3組(pAEC-ME-HBsAg)，pAEC-ME質(zhì)粒(圖1，包括編碼含有HCV抗原不同抗原表位的蛋白質(zhì)的序列，Sec.Id.No4)；第4組(pIDKE2-HBsAg)，pIDKE2質(zhì)粒(圖1，包括編碼HCV聚蛋白1-650氨基酸的序列，Sec.Id.No3)；第5組(pIDKE1Sm-HBsAg)，pIDKE1Sm質(zhì)粒，其與pIDKE1S相同，但在HCV E1編碼區(qū)插入2個核苷酸片段，從而改變了開放閱讀框并阻礙了該蛋白質(zhì)表達(Sec.Id.No5)；第6組(pAEC-d2-HBsAg-HBsAg)，pAEC-d2-HBsAg質(zhì)粒，其包含編碼HBVHBsAg的序列(見Musacchio等人，Biochem Bioph Res Commun 2001，282，442-446)；第7組(pAEC-K6-HBsAg)，pAEC-K6質(zhì)粒(為陰性對照，在轉(zhuǎn)錄單位控制下沒有編碼序列)。最后第8組和第9組分別接種5μg用氫氧化鋁配制的或者單獨的HBsAg。實驗結(jié)果用Student T檢驗進行統(tǒng)計分析，p＜0.05時認為有顯著性差異。
圖5顯示初次免疫16周后，產(chǎn)生的抗HBsAg的抗體效價。由單獨用溶解在PBS中的HBsAg誘導產(chǎn)生的抗體水平，在統(tǒng)計學上低于除pAEC-K6和HbsAg的混合物外的其它變體所產(chǎn)生的抗體水平。另一方面，質(zhì)粒pIDKCo、pIDKE1S、pAEC-ME和pIDKE2與HBsAg的混合物誘導的抗HBsAg的抗體效價，在統(tǒng)計學上高于配制在氫氧化鋁中的HBsAg或者同質(zhì)粒pAEC-K6混合的HBsAg制劑。用氫氧化鋁配制的或者同pAEC-K6、pIDKE1Sm和pAEC-d2-HBsAg混合的HBsAg制劑來免疫，得到相近的抗HBsAg的抗體效價水平?？梢宰鞒鲆粋€結(jié)論，在宿主細胞中，包含HCV E1抗原的氨基酸區(qū)域的蛋白質(zhì)變體從所施用的質(zhì)粒中的表達增強了抗蛋白質(zhì)抗原(同DNA構(gòu)建體混合的)的免疫應(yīng)答。
序列表序列表<110>Center for Genetic Engineering and Biotechnology<120>被DNA和抗原組合增效的疫苗制劑<130>HCV List<140>
<141>
<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>531<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>基因<222>(1)..(528)<223>包括編碼HCV核心蛋白質(zhì)的1-176位氨基酸的序列<220>
<223>人工序列描述pIDKCo<400>1atgagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120ggccccaggt tgggtgtgcg cgcaactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga 180aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccgg cccgagggca ggtcctgggc ccagcccggg 240tacccttggc ccctctatgg taacgagggc atgggatggg caggatggct cctgtcaccc 300cgtggctctc ggcctagttg gggccccact gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ctggcgcatg gcgtccgggt tctggaggac 480ggcgtgaatt atgcaacagg gaatctgccc ggttgctctt tctctctcta a 531<210>2<211>567<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>基因<222>(1)..(564)<223>包括編碼HCV聚蛋白的173-363位氨基酸的核苷酸序列，該核苷酸序列主要對應(yīng)于E1蛋白質(zhì)
<220>
<223>人工序列描述pIDKE1S<400>2atgttccttt tggctttgct gtcctgtttg accatcccag tttccgccta tgaagtgcgc 60aacgcgtccg gggtgtacca tgtcacgaac gactgctcca actcaagcat tgtgtatgag 120gcagacgaca tgatcatgca cacccccgga tgcgtgccct gcgttcggga ggacaacacc 180tcccgctgct gggtagcgct cacccccaca ctcgcggcca ggaatgccag cgtccccacc 240acgacaatac gacgccacgt cgatttgctc gttggggcgg ctgctctctg ctccgctatg 300tacgtggggg atctctgcgg atctgttttc ctcgtttccc agctgttcac cttctcgcct 360cgccggcatg agacagcaca ggactgcaac tgctcaatct atcccggcca cgtatcaggt 420caccgcatgg cctgggatat gatgatgaac tggtcacctt caacagccct agtggtatcg 480cagttactcc ggatcccaca agccgtcgtg gacatggtag cgggggccca ctggggagtc 540ctagcgggcc ttgcctacta ctcctaa 567<210>3<211>1953<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>基因<222>(1)..(1950)<223>包括編碼HCV聚蛋白的1-650位氨基酸的核苷酸序列，該段氨基酸序列包括殼、E1和E2蛋白質(zhì)的一部分。
<220>
<223>人工序列描述pIDKE2<400>3atgagcacga atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120ggccccaggt tgggtgtgcg cgcaactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga 180aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccgg cccgagggca ggtcctgggc ccagcccggg 240tacccttggc ccctctatgg taacgagggc atgggatggg caggatggct cctgtcaccc 300cgtggctctc ggcctagttg gggccccact gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgctcgtc 420ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ctggcgcatg gcgtccgggt tctggaggac 480ggcgtgaatt atgcaacagg gaatctgccc ggttgctctt tctctctctt ccttttggct 540ttgctgtcct gtttgaccat cccagtttcc gcctatgaag tgcgcaacgc gtccggggtg 600taccatgtca cgaacgactg ctccaactca agcattgtgt atgaggcaga cgacatgatc 660atgcacaccc ccggatgcgt gccctgcgtt cgggaggaca acacctcccg ctgctgggta 720gcgctcaccc ccacactcgc ggccaggaat gccagcgtcc ccaccacgac aatacgacgc 780cacgtcgatt tgctcgttgg ggcggctgct ctctgctccg ctatgtacgt gggggatctc 840tgcggatctg ttttcctcgt ttcccagctg ttcaccttct cgcctcgccg gcatgagaca 900gcacaggact gcaactgctc aatctatccc ggccacgtat caggtcaccg catggcctgg 960gatatgatga tgaactggtc accttcaaca gccctagtgg tatcgcagtt actccggatc 1020ccacaagccg tcgtggacat ggtagcgggg gcccactggg gagtcctagc gggccttgcc 1080tactactcca tggtggggaa ctgggccaag gttttgattg tgatgctact ctttgccggc 1140
gttgacggga cgggaaccta cgtgacaggg gggacggcag cccgcggcgt cagccagttt 1200acgggcctct ttacatctgg gccgagtcag aaaatccagc ttgtaaatac caacggcagc 1260tggcatatta accggactgc cctgaactgc aacgactccc tccagaccgg gttccttgct 1320gcgttgtttt acgtgcacag gttcaactcg tccggatgct cagatcgcat ggccagctgc 1380cgccccattg atacgttcga ccaggggtgg ggccccatta cttacgctga gccgcgcagc 1440ttggaccaga ggccctattg ctggcactac gcacctcaac cgtgtggtat cgtacccgcg 1500gcggaggtgt gtggtccagt gtattgtttc actccaagcc ccgttgtcgt ggggaccacc 1560gatcgttccg gcgtccctac gtataactgg ggggagaatg agacggacgt gctgctcctt 1620aacaacacgc ggccgccgct gggcaactgg tttggctgta catggatgaa tagcactggg 1680ttcaccaaga cgtgcggggg ccctccgtat aacatcggag gggtcggtaa caacaccttg 1740acctgcccta cggattgctt ccgcaagcac cccgaggcca cttacaccaa atgtggtttg 1800gggccttggt tgacacctag gtgcttggtc gactacccat acaggctttg gcattacccc 1860tgcactgtca actttaccat cttcaaggtt cggatgtatg tggggggcgt ggagcacagg 1920cttaccgctg catgcaactg gactcgagga taa 1953<210>4<211>1194<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>基因<222>(1)..(1191)<223>包括編碼HCV蛋白質(zhì)的不同抗原表位的核苷酸序列<220>
<223>人工序列描述pAEC-ME<400>4atgacgggaa cctacgtgac aggggggacg gcagcccgcg gcgtcagcca gtttacgggc 60ctctttacat ctgggccgag tcagaaaatc cagcttgtaa ataccaacgg cagctggcat 120attaaccgga ctgccctgaa ctgcaacgac tccctccaga ccgggttcct tgctgcgttg 180ttttacgtgc acaggttcaa ctcgtccgga tgctcagatc gcatggccag ctgccgcccc 240attgatacgt tcgaccaggg gtggggcccc attacttacg ctgagccgcg cagcttggac 300cagaggccct attgctggca ctacgcacct caaccgtgtg gtatcgtacc cgcggcggag 360gtgtgtggtc cagtgtattg tttcactcca agccccgttg tcgtggggac caccgatcgt 420tccggcgtcc ctacgtataa ctggggggag aatgagacgg acgtgctgct ccttaacaac 480acgcggccgc cgctgggcaa ctggtttggc tgtacatgga tgaatagcac tgggttcacc 540aagacgtgcg ggggccctcc gtataacatc ggaggggtcg gtaacaacac cttgacctgc 600cctacggatt gcttccgcaa gcacggatcc acccacgtga ccggcggcag ccaggcccgc 660accacccaca gcttcacctc cctgctgcgc cagggcgcca agcagaacgt gcagctgatc 720gccgacctga tgggctacat cccactggtg ggcgccccac tgggcaagaa gggccacgtg 780agcggccacc gcatggcctg ggacatgatg atgaactggg ccagcaagaa ggccgccagc 840cgcgccgccg gcttgcagga cagcaccatg ctggtgagcc acacccgcgt gaccggcggc 900gtggccggcc acgtgaccag cggcctggtg tccctgttca gccctggcgc cagccagaag 960atccagctgg tgggctccag cttcagcctg ttcctgttgg ccctcctgag cagcttgacc 1020atcaagaaga tgagctactc ctggaccggc gccctggtga ccccaagcgc cgccgagaag 1080aagctgttgt tcaacatcct gggcggctgg gtgaagaaga gcatggtggg caactgggcc 1140aaggtgaaga agtacaccgg cgacttcgac agcgtgatcg actccaggcc ttaa1194
<210>5<211>569<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述pIDKE1Sm<220>
<221>基因<222>(1)..(566)<223>包括編碼HCV E1的核苷酸序列，該核苷酸具有兩個核苷酸插入片段，從而改變了ORF并產(chǎn)生了不相關(guān)的小蛋白質(zhì)<400>5attgttcctt ttggctttgc tgtcctgttt gaccatccca gtttccgcct atgaagtgcg 60caacgcgtcc ggggtgtacc atgtcacgaa cgactgactc caactcaagc attgtgtatg 120aggcagacga catgatcatg cacacccccg gatgcgtgcc ctgcgttcgg gaggacaaca 180cctcccgctg ctgggtagcg ctcaccccca cactcgcggc caggaatgcc agcgtcccca 240ccacgacaat acgacgccac gtcgatttgc tcgttggggc ggctgctctc tgctccgcta 300tgtacgtggg ggatctctgc ggatctgttt tcctcgtttc ccagctgttc accttctcgc 360ctcgccggca tgagacagca caggactgca actgctcaat ctatcccggc cacgtatcag 420gtcaccgcat ggcctgggat atgatgatga actggtcacc ttcaacagcc ctagtggtat 480cgcagttact ccggatccca caagccgtcg tggacatggt agcgggggcc cactggggag 540tcctagcggg ccttgcctac tactcctaa569權(quán)利要求
1.一種疫苗制劑，其具有表達蛋白質(zhì)的DNA和蛋白質(zhì)抗原作為組分，其中該制劑中所述組分的至少一種作為另一種組分的佐劑。
2.權(quán)利要求1中的疫苗制劑，其具有DNA和病毒蛋白作為組分，其中所述DNA表達包含丙型肝炎病毒E1抗原的區(qū)域的蛋白質(zhì)變體。
3.權(quán)利要求1和2中的疫苗制劑，其具有由SEQ ID No.3序列鑒定的DNA和丙型肝炎病毒衣殼蛋白質(zhì)作為組分。
4.權(quán)利要求1和2中的疫苗制劑，其具有由SEQ ID No.3序列鑒定的DNA和乙型肝炎病毒衣殼蛋白質(zhì)作為組分。
5.權(quán)利要求1和2中的疫苗制劑，其具有由SEQ ID No.2-4序列鑒定的DNA和乙型肝炎病毒表面抗原作為組分。
6.權(quán)利要求1至5中的疫苗制劑，用作針對丙型肝炎病毒的治療和/或預(yù)防劑。
7.權(quán)利要求4和5中的疫苗制劑，用作針對乙型肝炎病毒的治療和/或預(yù)防劑。
8.權(quán)利要求4和5中的疫苗制劑，用作針對丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒的治療和/或預(yù)防劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種疫苗抗原制劑，包含以下主要組分a)一種或者多種DNA，其可以在被免疫的個體內(nèi)表達一種或者多種蛋白質(zhì)；b)適當比例的病毒抗原。本發(fā)明的新穎性在于至少一種組分對另一種組分所引起的免疫應(yīng)答起增強作用。本發(fā)明還涉及到新制劑的研制，該制劑使能夠擴大和加強抗不同病原體的免疫應(yīng)答的成分的數(shù)目最小化，并且還產(chǎn)生抗病原體的組合疫苗。所述制劑適用于以針對個體預(yù)防和/或治療為目的的工業(yè)制藥。
文檔編號A61K39/29GK1529616SQ02814282
公開日2004年9月15日 申請日期2002年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月16日
發(fā)明者S·杜納斯卡里拉, J·默拉爾斯格里洛, L·阿爾瓦里茲－拉喬切爾龐斯德里昂, A·穆薩奇奧拉薩, R·帕喬佩特, A·維納羅德里奎茲, J·C·阿爾瓦里茲奧博里宮, N·阿克斯塔里維羅, G·馬提尼茲多納托, S 杜納斯卡里拉, 呃鎰 拉喬切爾龐斯德里昂, 垢窶锫, 姘呂, 崮嶙榷嗄賞, 慫顧 鏤 , 橋逄, 阿爾瓦里茲奧博里宮, 陜薜呂錕 申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心