專利名稱：抗菌劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可與細菌翻譯因子EF-Tu結合的物質用于抑制細菌細胞中細胞骨架形成以及用于生產抗菌劑的用途。本發(fā)明也涉及抗菌劑，其含有細菌EF-Tu蛋白結構域2或/和3的氨基酸序列的部分片段，優(yōu)選地長度為4-20個氨基酸。
以前主要使用對細菌細胞的生長具有特異抑制作用的青霉素或其它抗生素作為抗菌劑。這種抑制作用是基于這些抗生素對細胞生長所必需的肽聚糖骨架延伸的抑制。胞壁質的這種不穩(wěn)定使細胞生長大大減弱。穩(wěn)定期的細菌不被抑制，因為該階段胞壁質骨架不延伸。
細菌蛋白EF-Tu含有結構域1、2、3(Song，H.，Parsons，M.R.，Rowell，S.，Leonard，G.，Phillips，E.V.，J.Mol.Biol.285，1245-1256，1999)。大腸桿菌和其它許多真細菌的EF-Tu蛋白及其編碼基因的序列已經公開，并且可從數據庫中獲得。也曾經描述，EF-Tu的結構域1在蛋白質合成中起作用。
Naturwissensch.85，1998，278-282(Mayer等人)討論了可能存在永久性原核細胞骨架。然而，細菌蛋白EF-Tu在這種細胞骨架形成中的作用還不清楚。
關于EF-Tu在細菌細胞中的位置，以前在文獻(參見，例如Schilstra，M.J.，Slot.，J.W.van der Meide，P.H.，Posthuma，G.，Cremers，A.F.，Bosch，L.延伸因子Tu在大腸桿菌細胞中的免疫細胞化學定位，Biochem.Biophys.Acta 1291，(1996)，122-130)中曾經認為，EF-Tu在細胞質中幾乎均勻分布。然而，以前的實驗未考慮低溫能夠使人工生產的EF-Tu原纖維在體外解聚這一事實。
令人驚訝地發(fā)現，在能夠用抗-EF-Tu抗體染色的原核細胞中存在細胞骨架。這種細胞骨架包含一個蛋白質原纖維網絡，這些原纖維位于細胞質膜朝向細胞質的表面附近，并且穿過細胞質延伸。細胞質膜和該網絡的外周部分可被視為兩個同心空管，其中細胞質膜是兩個管中的外管，網絡(細胞骨架)的外周部分是內管。穿過細胞質的原纖維互補并穩(wěn)定該系統(tǒng)，而且是核糖體附著位點。在細胞骨架朝向細胞質的外周部分中也檢測到核糖體。
因此，原核細胞骨架有以下幾種變體—介導特定功能的變體，它由類似于高等生物細胞肌動蛋白的蛋白質組成，在桿狀細菌中，其確定細胞的長度和直徑，—由類似于高等生物細胞微管蛋白的蛋白質組成、并確保受控細胞分裂的變體，和—在所有原核生物中普遍存在的一種變體(基本細胞骨架)，其包含蛋白質EF-Tu(延伸因子Tu)的原絲網絡，細胞用其作為穩(wěn)定形狀的結構元件，并且作為核糖體和其它復雜分子聚集體的附著結構。最后一種變體在此也被稱為細胞骨架網絡。
EF-Tu是一種含有三個結構域的蛋白質，其中結構域1參與翻譯過程。迄今為止尚未描述結構域2和3的具體功能。現在發(fā)現，結構域2和3的側面暴露表位形成一個擬合(fit)，其中一個表面是凸面，另一個表面是凹面。推斷這種擬合能導致EF-Tu聚合體的形成，特別是原纖維在體外及在體內的線性排列。這些原纖維是作為細胞骨架的網絡的組分。因此，可與EF-Tu結合，特別是在結構域2或/和3的區(qū)域內結合的物質能用來抑制細菌細胞中細胞骨架的形成，因而能用來生產一種抗菌劑。
因此，細胞骨架網絡能作為一類新抗生素的靶標。
具體而言，EF-Tu能作為新抗菌劑的靶蛋白，該抗菌劑能夠占據結構域2或/和3的擬合位點，從而阻止細胞中EF-Tu聚合體的形成，而后者是細菌細胞結構所必需的。
這種作用模式根本不同于作用于EF-Tu的其它抗生素的作用模式(參見，例如Vogeley，L.，Palm，G.J.，Mesters，J.R.，Hilgenfeld，R.抗生素結合誘導的延伸因子Tu(EF-Tu)的構象改變。J.Biol.Chem.276(2001)，17149-17155)。該文獻表明，以前所知的黃色霉素類抗生素的作用是由于它們能阻止結構域1的構象改變的可逆性，當結合GTP時導致結構域1向結構域2彎曲。這種機制根本不同于此處所述的涉及結構域2和3的聚合抑制作用機制。
EF-Tu包含394個氨基酸。氨基酸8-204屬于結構域1，氨基酸172-204構成與結構域2的連接結構。氨基酸205-298屬于結構域2，結構域3包含氨基酸299-394。
在結構域2和3內存在不同的二級結構。在本文中，位于結構域3內的氨基酸序列317-328和343-354特別重要，因為它們形成自由突出于間隙內的環(huán)，是與位于結構域2外周相應位置上的凹陷內的氨基酸序列(這些序列是氨基酸218-224)相互作用的候選序列。
根據本發(fā)明，令人驚訝地發(fā)現，對于細菌細胞骨架，通過抑制EF-Tu的聚合而損傷細胞基本上是可能的。特別是，在具有細胞壁的普通細菌細胞中也能實現這種細胞損傷。本發(fā)明特別適用于真細菌。
有多種物質能用于抑制細胞骨架的形成，只要它們能抑制相鄰兩個EF-Tu分子的結構域2和結構域3之間的相互作用。例如，能用一種方法鑒定合適的物質，該方法包括(a)使待測物質接觸細菌EF-Tu或其能夠聚合的部分片段，如含有結構域2和3的片段，和(b)確定該物質是否能抑制EF-Tu聚合體的形成。
該方法能夠在體外以及在體內進行。在一種體外方法中，純化的EF-Tu分子或其適當的部分片段優(yōu)選地在能夠形成原纖維的條件下溫育。待測物質對原纖維的影響能夠用一種簡單的方法測定，例如利用標記抗-EF-Tu抗體的免疫染色，或者使用攜帶標記基團(例如熒光標記基團)的EF-Tu分子。當然該方法也能在體內進行，在此情況下，添加待測物質對細胞內原纖維網絡的影響能夠用免疫學方法測定，例如使用標記抗-EF-Tu抗體的免疫組織化學和顯微評價。
抑制EF-Tu聚合體形成并且能夠通過上述方法獲得的物質，以及由此(例如通過經驗產生或/和通過計算機模建)產生的物質，能夠任選地與常用藥物載體、輔助物質或/和稀釋劑一起配制成藥物組合物。
例如，該藥物組合物可以是液體制劑、固體制劑、乳劑或分散劑。根據制劑的不同，能夠通過注射或經口、直腸、鼻、局部等施用。根據活性物質、施用形式和疾病的類型及嚴重程度選擇劑量，使其能夠對抗細菌感染。
抗菌劑可能有多種作用。一方面，使用能與EF-Tu結構域2或/和3的擬合位點直接結合的物質。另一方面，也能使用與EF-Tu分子上的其它位置結合，但是對擬合有抑制作用，從而阻止原纖維形成的物質。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中使用肽抗菌劑。肽劑是基于可與EF-Tu結合，優(yōu)選地在結構域2或/和3的擬合位點區(qū)內結合的寡肽。這些寡肽可能含有結構域2或/和3的氨基酸序列的部分片段，其長度優(yōu)選地為4-20個氨基酸，特別優(yōu)選地為5-15個氨基酸，特別優(yōu)選地為6-12個氨基酸。這些部分片段能夠與其它結構域的互補序列結合，即來自結構域2的序列能夠與結構域3結合，來自結構域3的序列能夠與結構域2結合。
在另一個優(yōu)選實施方案中，可與EF-Tu結合的物質含有來自結構域2的氨基酸序列的部分片段，其長度至少為4個氨基酸，特別是至少為5個氨基酸，尤其是結構域2區(qū)域中氨基酸218-224的部分片段，同時不含對應于EF-Tu結構域3的氨基酸317-328區(qū)或/和氨基酸343-354區(qū)的片段。此外也優(yōu)選如下物質，其含有來自結構域3的氨基酸序列的部分片段，該片段的長度為至少4個氨基酸，特別是至少5個氨基酸，特別優(yōu)選地至少6個氨基酸，并且不含對應于結構域2的氨基酸218-224的部分片段。例如，這些片段可以是截短的EF-Tu，其僅由結構域3組成，不含結構域1和2，或者僅由結構域1和2組成，不含結構域3。這種EF-Tu片段在細胞內與細胞合成的天然EF-Tu蛋白分子競爭，在摻入聚合的原絲內時導致鏈的終止，因為在所有情況下都不含鏈延伸所需的第二個結構域。結果不再形成完整的網絡。這與細菌細胞生存能力的喪失含義相同。實驗證明，細菌細胞內網絡發(fā)育的紊亂對細菌細胞的形狀和行為具有不利影響。對細胞形狀和行為的不利影響表明，當使用根據本發(fā)明的抗生素時發(fā)生預期的細胞死亡。
也能用其它方法，例如由于存在可阻止其它EF-Tu蛋白分子結合的片段，使用可阻止EF-Tu蛋白分子聚合(即鏈終止)的抗生素，代替所述的截短EF-Tu片段。
根據本發(fā)明的抗生素的一個獨特優(yōu)點是，只存在極小的細菌產生對這類新抗生素的抗性的危險?？剐砸馕吨毦山到廪D移到細胞內的肽。如果這樣，細菌將無法避免同樣降解其自身的結構相同的肽，而這種肽是細胞EF-Tu蛋白的一種成分，對于翻譯而言是非常重要的。
抗菌劑可能含有線性或環(huán)狀肽化合物或擬肽。肽化合物可能含有天然L-α-氨基酸，而且也可能含有其它氨基酸，例如，D-α-氨基酸、氮雜氨基酸(azaamino acid)、β-氨基酸、非基因編碼的L-或/和D-α-氨基酸等，或其組合。擬肽的制備例如在RIPKA，A.S.，RICH，D.H.(1998)擬肽設計，Curr.Op.Chem.Biol.2，441-452中有描述。
另外，肽化合物或擬肽也可能含有有利于通過細胞質膜轉移的結合疏水基，或者可阻止更多EF-Tu分子附著，從而阻止形成聚合產物的極大基團。該抗菌劑也可能攜帶保護其免遭降解的基團。
該抗菌劑能夠用來對抗任何原核生物和古生物(archaea)，尤其是病原生物。革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和支原體含有一個基于EF-Tu的細胞骨架，因此根據本發(fā)明的藥物能夠對抗它們。例如，能夠使用對抗萬古霉素抗性微生物如葡萄球菌的抗菌劑。
因此，這類新抗生素具有廣泛的用途。已經發(fā)現，在檢測的所有細菌中，負責結合單體以形成原絲的區(qū)域具有極其相似的氨基酸序列。EF-Tu在該區(qū)高度保守。特定EF-Tu分子內這些區(qū)域之間的距離，即結構域2和3的暴露區(qū)之間的距離，在氨基酸數量上也是相同的，在保守區(qū)之間總有126個氨基酸。
根據本發(fā)明的抗生素的特征在于高度的特異性，尤其是極低的副作用。在人類細胞中，除了線粒體之外，不含大的EF-Tu序列。線粒體的雙層膜基本保護了線粒體EF-Tu樣序列免遭抗生素的作用。
本發(fā)明通過下列附圖和實施例加以闡明。
圖1顯示細菌蛋白EF-Tu的大分子結構，其中比較詳細地描述了結構域1、2、3。在聚合過程中，這種細菌蛋白EF-Tu能夠結合，從而形成如圖2所示的周期性結構的原纖維。
圖3顯示在結構域2和3(以+或-標記)的反應性結合區(qū)處聚合的示意圖。
圖4顯示從EF-Tu蛋白分子分離的、體內聚合的原纖維的電子顯微照片的放大圖(放大約150萬倍)。結構域1位于虛線上方，并列的結構域2和3位于下方。
如果加入含有結構域2或3的氨基酸序列的部分片段的過量顆粒能夠在結合區(qū)(在圖3中以+和-標記)處抑制EF-Tu蛋白的聚合，則受影響的細菌細胞因為細胞結構破壞而不能存活。
實施例用革蘭氏陽性菌熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)EM1(以下簡稱EM1)和缺乏細胞壁的細菌肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)(以下簡稱Mp)進行實驗，證實這些細菌含有基于EF-Tu的永久性細胞骨架。
實驗包括利用抗肌動蛋白抗體(針對高等生物細胞的肌動蛋白而制備)對候選蛋白質的鑒定和相對于細菌細胞骨架的細胞定位，因為已知細菌含有屬于肌動蛋白超家族、但與高等生物細胞的肌動蛋白沒有顯著序列同源性的蛋白質，抗肌動蛋白抗體可與細菌蛋白質較高或較低程度地交叉反應。原核生物不含不同的肌動蛋白基因。
除了用上述抗體對細菌超薄切片進行免疫電子顯微鏡檢外，也使用完整的封固(mount)技術。通過這些技術組合發(fā)現，蛋白質原纖維網絡位于細胞質膜朝向細胞質的表面附近，并且穿過細胞質延伸。這些原纖維的成分與抗肌動蛋白抗體交叉反應。細胞質膜和該網絡的外周部分形成兩個同心空管，其中細胞質膜構成兩個管中的外管，網絡(細胞骨架)的外周部分構成內管。穿過細胞質延伸的原纖維互補并穩(wěn)定該系統(tǒng)，而且是核糖體附著位點。核糖體也位于細胞骨架朝向細胞質的外周部分上。
用弗氏壓碎器(French press)破裂EM1細胞，獲得的物質(可溶性級分，顆粒性級分)進行SDS凝膠電泳和Western印跡分析。在SDS凝膠上獲得幾條確定的帶，其中一條帶(約43kDa)能用抗肌動蛋白抗體以及針對Mp的EF-Tu獲得的抗EF-Tu抗體染色。當用通過低速離心獲得的細胞裂解液的顆粒性級分作為SDS凝膠電泳物時，這條帶特別明顯。使用抗EF-Tu抗體是因為EF-Tu通常在43kDa處發(fā)現(約含細菌蛋白質質量的9％)，因為EF-Tu屬于肌動蛋白超家族，并且因為EF-Tu在原核細胞中大量存在。
EF-Tu作為細菌細胞骨架的一種結構成分的作用是新的發(fā)現。EF-Tu作為類似于細胞骨架的復雜網絡的一種結構成分的這種性質，意味著細菌細胞不得不利用大量蛋白質用于該目的。通過這種細菌細胞骨架的結構與高等生物細胞結構的比較，顯然細菌細胞骨架必然也由幾種類型的蛋白質組成。EF-Tu是一種主要成分。盡管在高等生物細胞中EF-Tu與細胞骨架的形成無關(高等生物細胞不含EF-Tu)，然而，已知有大量不同的蛋白質在細胞骨架的形成中起作用。
在切片和整個封固中能夠顯示，可與抗肌動蛋白抗體反應的上述細胞骨架網絡的成分也可與抗EF-Tu抗體強烈反應。
對于含有原來覆蓋、但通過Triton處理(除去細胞質膜)暴露于環(huán)境的完整表面的Mp，發(fā)生這種反應。以未用Triton處理、但其它均同樣處理、因而未失去其細胞質膜的細胞進行對照，其不顯示標記。因此，在該對照實驗中，細胞質膜掩蓋了EF-Tu的可能的結合位點。
通過去除細胞質膜暴露的表面是細胞骨架的外周部分。然而這不暴露內部細胞成分，如核糖體，已經顯示它們是EF-Tu的附著位點，在翻譯過程中行使輔助功能(在該情況下EF-Tu的結構域1起作用)。因此推斷，在翻譯過程中，EF-Tu不是去往核糖體，而是核糖體去往EF-Tu，因為它作為細胞骨架成分的性質在空間上固定于細胞外周和交叉穿過細胞質的原纖維上。
在真細菌大腸桿菌、桿菌屬的種、Ralstonia eutropha和熱產硫磺熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)以及古細菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)和沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)中也檢測到永久性細菌細胞骨架的存在。
權利要求
1.可與EF-Tu結合的物質用于抑制細菌細胞中細胞骨架形成的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，該物質可與EF-Tu的結構域2(氨基酸205-298)或/和結構域3(氨基酸299-394)區(qū)結合。
3.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于，該物質可與EF-Tu的結構域2的氨基酸218-224區(qū)結合。
4.如權利要求1或2所述的用途，其特征在于，該物質可與EF-Tu的結構域3的氨基酸317-328或/和343-354區(qū)結合。
5.如權利要求1-4之一所述的用途，其特征在于，該物質含有結構域2或/和結構域3的氨基酸序列的部分片段，其長度為4-20個氨基酸。
6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，該部分片段的長度為5-15個氨基酸，特別是6-12個氨基酸。
7.如權利要求1-6之一所述的用途，其特征在于，該物質選自線性或環(huán)狀肽化合物或擬肽。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，該肽化合物或擬肽含有結合疏水基、極大基團或/和保護其免遭降解的基團。
9.如權利要求1-8之一所述的用途，用于生產抗菌劑。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，該抗菌劑任選地與常用藥物載體、稀釋劑或/和輔助物質一起配制成藥物組合物。
11.如權利要求9或10所述的用途，所述用于生產針對革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌的藥物。
12.如權利要求9或10所述的用途，用于生產針對支原體的藥物。
13.抗菌劑，其含有細菌蛋白EF-Tu結構域2和/或3的氨基酸序列的部分片段，長度為4-20個氨基酸。
14.如權利要求13所述的抗菌劑，其含有長度為5-15個氨基酸的部分片段。
15.如權利要求13或14所述的抗菌劑，其含有長度為6-12個氨基酸的部分片段。
16.如權利要求13-15之一所述的抗菌劑，其特征在于，其含有與該部分片段結合的疏水基、極大基團和/或保護其免遭降解的基團。
17.如權利要求13-16之一所述的抗菌劑，其任選地與常用藥物載體、稀釋劑或/和輔助物質一起配制成藥物組合物。
18.鑒定新抗菌物質的方法，包括(a)使待測物質接觸細菌EF-Tu或其能夠聚合的部分片段，和(b)確定該物質是否能抑制EF-Tu聚合體的形成。
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，該方法作為一種體外試驗進行。
20.如權利要求18所述的方法，其特征在于，該方法作為一種體內試驗進行。
21.如權利要求18-20之一所述的方法，其特征在于，利用標記抗體或/和標記EF-Tu蛋白或其可聚合部分片段測定EF-Tu聚合體的形成。
22.如權利要求18-21之一所述的方法，其特征在于，抑制EF-Tu聚合體形成的物質或由其產生的物質任選地與常用藥物載體、稀釋劑或/和輔助物質一起配制成藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及可與細菌翻譯因子EF－Tu結合的物質用于抑制細菌細胞中細胞骨架形成以及用于生產抗菌劑的用途。另外，本發(fā)明也涉及抗菌劑，其含有細菌EF－Tu蛋白結構域2和/或3的氨基酸序列的部分片段，長度優(yōu)選地為4－20個氨基酸。
文檔編號A61K38/16GK1518455SQ02810218
公開日2004年8月4日 申請日期2002年4月22日 優(yōu)先權日2001年4月30日
發(fā)明者F·梅爾, F 梅爾 申請人:諾沃羅吉斯有限公司