專利名稱：兩性脂質體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及兩性脂質體及其應用，該兩性脂質體同時包含基膜的或構膜的正電荷和負電荷載體。
脂質體這一概念包括三種能從生物膜中分離出的天然產物磷脂、鞘脂、膽固醇及其衍生物。它還包括具有相同特征的合成物質，提及的代表物質有二乙酰甘油、二烷基甘油、3-氨基-1，2-二羥基丙烷酯或醚以及N，N-二烷基氨。
這些物質對于制備脂質體具有技術上的重要性。脂質體的應用之一是作為藥物制劑中活性成分的載體?；谠撃康?，需要一種能與體液相兼容且可控的、能選擇性定位釋放藥物的一種高效、穩(wěn)定的包裝。
不利之處在于將兩種需求結合起來存在困難。包裝越緊密、穩(wěn)定，再一次釋放被包裹的活性成分就越困難。因此，人們開發(fā)出在外界刺激下改變其性質的脂質體。人們已了解熱敏感和PH敏感性的脂質體。PH敏感性脂質體具有特殊的重要性，因為PH這個參數可以隨著生理環(huán)境的改變而發(fā)生變化，例如脂質體在細胞內被內吞(endocytotic)吸收或者通過胃腸道時的PH變化。根據文獻情況，PH-敏感性脂質體特別包括膽固醇半琥珀酸酯(CHEMS)。
膽固醇半琥珀酸酯被用于與磷脂酰乙醇胺混合以制備PH-敏感性脂質體(Tachibana et al.(1998)；BBRC 251538-544，U.S.patent 4,891,208))。這樣的脂質體能被多個細胞內吞，采取這種方式可將被載分子轉運到細胞內，而無需破壞細胞膜的完整性。
CHEMS的陰離子特征使其具有很不利因素。由其制備的脂質體具有完全負電荷，其被細胞吸收的效率則很低。因此，無論上面描述的轉運機理怎樣，這些脂質體很難將大分子轉運到細胞內。
具有可能最高價的、恒定的表面電荷的陽離子脂質體可以用來將活性成分轉運至細胞內(轉染)。這種帶全部正電荷的粒子導致對細胞的靜電吸附，從而有效地轉運至細胞內。然而，這些化合物和由此產生的脂質體被限制到離體(in vitro)或來自于體外(ex vitro)的使用，因為這樣的帶正電荷的脂質體與血清中成分形成了無法控制的聚集。
根據文獻描述的情況，將PH值限制到少數幾個PK值，通常限定到膽固醇半琥珀酸酯的羧基的PK值(大約4.5)是目前的PH-敏感性脂質體的弊端之一。該化合物的另一個弊端是對負電荷載體的限制。它們不適合與核酸及蛋白質進行有效的結合。
帶正電荷的脂質體顯示與核酸和蛋白質能很好的結合，并且能夠將這些活性成分帶到細胞中，但其缺點是不能在體內使用。
因此，制備以下脂質體結構成為一大目標(i)允許包容制劑中的活性成分，(ii)能將這些活性成分轉運到生物細胞中，(iii)適宜于在體內條件下使用，(iv)生產簡單、成本低。
本發(fā)明的目的通過兩性脂質體而得以實現(xiàn)，該兩性脂質體包括至少一個正電荷載體和一個不同于正電荷載體的負電荷載體，脂質體的等電點在4和8之間。該目的的實現(xiàn)是因為脂質體是在PH-依賴性的、電荷變化的條件下制備而得。
所形成的具有所需性質的脂質體結構，例如，在低PH時，構膜的和基膜的正電荷載體的數量超過負電荷載體的數量，則在高PH時，其比率會反過來。這種情況通常適用于可電離成分的Pka值在4-9之間時。隨著介質PH值的降低，所有正電荷載體所帶電荷更多，而所有負電荷載體都失去電荷。
以下為本發(fā)明所用的縮寫形式CHEMS膽固醇半琥珀酸酯PC 磷脂酰膽堿PE 磷脂酰乙醇胺PS 磷脂酰絲氨酸PG 磷脂酰丙三醇Hist-Chol組氨酰膽固醇半琥珀酸酯構膜的或基膜的帶電荷載體具有以下通用的兩性結構
帶電荷基團-膜支撐物已知的天然物或其改造形式都可作為膜支撐物，其包括，尤其是二乙酰甘油、二乙酰磷酸甘油(磷脂)和甾醇，還包括二烷基甘油、二烷基或二乙?；?1-氨基-2，3-二羥基丙烷、具有8-25個碳原子的長鏈烷基或?；?、鞘脂、神經酰胺等。這些膜支撐物是本領域共知的。與支撐物結合的帶電荷基團可分為以下6組強正離子，Pka＞9，凈正電荷根據其化學性質，它們是，例如，銨、脒鹽、胍鹽或吡啶鹽基團或有時是仲胺或叔胺官能基。弱正離子，Pka＜9，凈正電荷根據其化學性質，它們尤其是含氮的堿，例如，哌嗪、咪唑和嗎啉、嘌呤或嘧啶。存在于生物系統(tǒng)的分子片段，優(yōu)選為，如4-咪唑(組胺)、2-，6-，或9-嘌呤(腺嘌呤、鳥嘌呤、腺苷或鳥苷)、1-，2-或4-嘧啶(尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿苷、胸苷、胞苷)或吡啶-3-羧酸(煙酯或酰胺)。
具有優(yōu)選Pka值的含氮堿也是由低分子量的羥基烷烴諸如羥甲基或羥乙基經過一次或多次取代氮原子而形成。例如，氨基二羥基丙烷、三乙醇胺、三-(羥甲基)甲胺、二-(羥甲基)甲胺、三-(羥乙基)甲胺、二-(羥乙基)甲胺或其對應的取代乙胺。
PH從4至9的中性或兩性離子根據其化學性質，這些中性基團是，諸如羥基、酰胺、硫醇或具有一個強正離子和強負離子基團的兩性基團，諸如磷脂酰膽堿、氨基羧酸、氨基磺酸、甜菜堿或其它結構。
弱陰離子，Pka＞4，凈負電荷根據其化學性質，它們尤其是羧酸。其包括脂肪族的含有至多12個碳原子的，且含0，1或2個烯類不飽和鍵的線性或支化的單-，雙-或三羧酸和。在合適的情況下，羧酸也可以是芳香族的取代物。
其它的陰離子基團是能夠存在于抗壞血酸中并能分離出的含羥基化合物或硫醇，N-取代的阿脲、N-取代的巴比妥酸、佛羅那(veronal)、苯酚或為硫醇基。
強陰離子，Pka＜4，凈負電荷根據其化學性質，它們是諸如磺酸酯或磷酸酯的官能團。
兩性電荷載體，PI在4.5和8.5之間，PI值以下為凈正電荷，PI值以上為凈負電荷根據其化學性質，這些電荷載體由兩個或更多的上述基團片段組成。實施本發(fā)明時，起初帶電荷基團無論是在一個相同的膜支撐物上還是在不同的支撐物上都不是實質性問題。實施本發(fā)明時，PI值在5至7之間的兩性電荷載體為特別優(yōu)選的載體。
強正電荷化合物是，例如DC-Chol 3-β-[N-(N’，N’-二甲基乙烷)氨甲酰基]膽固醇，TC-Chol 3-β-[N-(N’，N’，N’-三甲氨基乙烷)氨甲酰基]膽固醇BGSC 雙胍鹽-亞精胺-膽固醇BGTC 雙-胍鹽-三(氨乙基)胺-膽固醇DOTAP(1，2-二油酰氧丙基)-N，N，N-三甲基銨氯化物DOSPER (1，3-二油酰氧基-2-(6-羧基-精胺基(spermyl))-丙酰胺DOTMA氯化(1，2-二油酰氧丙基)-N，N，N-三甲基銨(Lipofectin)DORIE溴化(1，2-二油酰氧丙基)-3-二甲羥乙銨DOSC (1，2-二油?；?3-琥珀酰-順-甘油膽堿酯)DOGSDSO (1，2-二油?；?順-甘油-3-琥珀酰-2-羥乙基二硫化鳥氨酸)DDAB 溴化二甲基二-十八銨DOGS ((C18)2GlySper3+)N，N-二-十八氨基-乙二醇-精胺(Transfectam)(C18)2Gly+N，N-二-十八氨基甘氨酸CTAB 溴化鯨蠟基三甲銨CpyC 氯化鯨蠟基吡啶鹽DOEPC1，2-二油?；?順-甘油-3-乙基磷酸膽堿或其它O-烷基-磷脂酰膽堿或乙醇胺，賴氨酰胺、精氨酰胺或鳥氨酰胺和磷脂酰乙醇胺。
弱陰離子化合物的例子是His-Chol組胺酰-膽固醇半琥珀酸酯、Mo-chol嗎啉-N-乙氨基-膽固醇半琥珀酸酯或組胺酰-PE。
中性化合物的例子是膽固醇、神經酰胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、四醚脂或二乙酰甘油。
弱陰離子化合物的例子是CHEMS膽固醇半琥珀酸酯、具有8至25個碳原子的烷基羧酸或二乙酰甘油半琥珀酸酯。其它的弱陰離子化合物是天冬氨酰胺、谷氨酰胺和PE，還有PS及其與甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸鹽、天冬酰胺酸、絲氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或其它的氨基酸或氨基二羧酸形成的酰胺。根據相同的原則，羥基羧酸或羥基二羧酸和PS也是弱的陰離子化合物。
強的陰離子化合物是，例如SDS十二烷基硫酸鈉、膽固醇硫酸酯、膽固醇磷酸酯、膽固醇磷酸膽堿、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰肌醇、二乙酰甘油磷酸酯、二乙酰甘油硫酸酯、鯨蠟醇磷酸酯或溶血磷脂(lyosophospholipids)。
兩性化合物是，例如，His-Chol Nα-組胺酰-膽固醇半琥珀酸酯、EDTA-chol亞乙基二氨基四乙酸膽固醇酯，Hist-PS Nα-組胺酰-磷脂酰絲氨酸或N-烷基肌肽。
本發(fā)明的脂質體包括多種含量的構膜或基膜的兩性物質，以使其具有兩性特征。這意味著脂質體能夠完全改變電荷符號。在介質特定的PH中存在的脂質體的電荷載體數量可以利用以下公式計算出z＝∑ni((qi-1)+10(PK-PH)/(1+10(PK-PH))其中，qi是各離子基團在其PK值以下的絕對電荷(例如，羧基＝0，單個含氮堿＝1，二級電離的磷酸鹽基＝-1，等。)ni是脂質體中這些基團的數目。
在等電點，脂質體的凈電荷數為0。對于可選擇等電點的結構，其可通過將陰離子和陽離子部分混合而制得。
這種結構特別是能夠被構建成，當PH值下降時，分子的電荷總體上從負的轉變成正的。當制得的帶這些結構的脂質體需要用于生理學中的相互關系上時，這樣的電荷逆轉尤其有利。只有整體上帶負電荷的脂質體與血液和血清中的成分相兼容。正電荷會導致聚集。然而，帶正電荷的脂質體具有非常好的融合性(fusogenically)，并且能夠將活性成分轉運至細胞內。PH-依賴性的電荷逆轉因此使得被構建的化合物與血清相兼容，原因在于這些化合物具有負電荷；而當它們被內吞吸收后，其電荷發(fā)生逆轉，在細胞內只成為融合狀態(tài)。
在本發(fā)明實施方式中的一個優(yōu)選實施方式中，兩性脂質體的等電點在5至7之間。
本發(fā)明也涉及包括至少一個兩性電荷載體的兩性脂質體，該兩性電荷載體的等電點在4和8之間。
在一種優(yōu)選的實施方式中，脂質體中兩性電荷載體的等電點在5和7之間。
本發(fā)明還涉及至少包括一個兩性電荷載體和一個陰離子和/或陽離子電荷載體的兩性脂質體。
在一種優(yōu)選的方式中，兩性脂質體合適的等電點在5和7之間。
本發(fā)明的一個特殊方式是，本發(fā)明的脂質體包括磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、二乙酰甘油、膽甾醇、四醚脂、神經酰胺、鞘磷脂、和/或二乙酰甘油。當然，可以用本發(fā)明所教導的方法通過很多脂質的結合制備脂質體。例如，脂質體可以利用大量的CHEMS(大約40％)和較少量的DOTAP(大約30％)來合成。在CHEMS中羧基的PK值下，該成分的負電荷總是被抑制著，而由正電荷載體整體支配。另一種制劑是將CHEMS和His-Chol相混合，正電荷載體HisChol的電荷隨著CHEMS的負電荷損失得越多而變得越強。
對于本身是兩性的His-Chol，如果其與例如磷脂酰膽堿的一種中性膜相結合，則也會形成一等電點與His-Chol相一致的兩性脂質體。
本領域技術人員都知道如何通過本發(fā)明所教導的多種變化形式來調節(jié)各參數(i)脂質體電荷逆轉時的電荷密度通過所用的電荷載體數量和Pka值調節(jié)，(ii)電荷逆轉曲線的斜率通過兩種電荷載體的比率，通過載體的絕對數量和兩種互補的PH-敏感性脂質體的最佳協(xié)同作用調節(jié)，(iii)Z電勢通過零值是由于兩種電荷載體的比率或其PK值的位置調節(jié)。
本發(fā)明進一步的變化方式中，脂質體的平均大小在50和1000nm之間，優(yōu)選在70和250nm之間，特別優(yōu)選在60和130nm之間。兩性脂質體可通過本領域已知的方法合成，例如將乙醇注入到緩沖水溶液中的脂質體溶液中，通過水化干燥的油脂膜或通過去垢劑的透析得到。脂質體的大小可以改變，通常在50和10,000nm之間。相同大小的脂質體可通過高壓勻化或過濾獲得。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選變化方式中，脂質體包括一種活性成分。
合適的一種優(yōu)選方式是活性成分為蛋白質、肽、DNA、RAN、反義核苷酸和/或誘餌(decoy)核苷酸。
本發(fā)明進一步優(yōu)選的方式是脂質體內部具有至少80％的活性成分。
本發(fā)明也涉及一種將活性成分裝入脂質體的方法，該方法是在一個確定的PH值下進行包囊，再將PH調節(jié)至第二個值以分離出未結合的物質。
本發(fā)明還涉及將活性成分裝入脂質體的方法，該脂質體是可滲透的，并在一確定的PH值下封閉滲透通道。
本發(fā)明也涉及脂質體在通過脂質體層上沉積聚合物或聚電解質而制備納米膠囊中的應用。這樣的物質可以一次或多次地沉積在表面上。重復沉積時，也可以在沒有交聯(lián)劑的存在下進行，這種脂質體的納米膠囊在WO00/28972或WO01/64330中有描述。當使用本發(fā)明所描述的物質，有一個好處是其與電解質的靜電作用能被避免。眾所周知，聚電解質與脂質體膜的電荷載體的相互作用能夠導致膜成分的分層并形成油脂聚集體。很多情況下，這種分層與脂質體的滲透性有關。本發(fā)明的物質能使這種相互作用在涂層過程后被中止。如果此時PH值升高且膜和聚電解質之間不再存在任何的相互作用時，脂質體只能在微膠囊中被無菌包裹，并因此避免了油脂聚集體的形成和與此有關的膜滲透。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的脂質體在包裝和釋放活性成分中的應用。此時，脂質體特別引起活性成分如核酸的有效包裝。核酸與所述的脂質體在一個較低的PH值(大約3至6)下培養(yǎng)，待脂質體形成后，通過提高PH值(大約7至9)可以將附著在其外表的核酸洗掉。
可以用類似的方法包裝蛋白質。有利的做法是將介質的PH值調至脂質體的PI值和蛋白質的PI值之間。已得到證明，特別有利的是二者的PI值相差一個單位以上。
本發(fā)明的又一個方面是將脂質體用于制備診斷學中的釋放系統(tǒng)。
本發(fā)明的再一個優(yōu)選的方式是將脂質體用于轉染系統(tǒng)，即將活性成分帶到細胞內。
本發(fā)明的另一個方式是利用脂質體通過膜的融合或滲透作用控制其內包含物的釋放。例如，一種油脂的脂質體，其本身并不是構膜成分，可以通過與帶電荷載體，如PE的結合而得以穩(wěn)定。當電荷載體被轉化成中性的、無電荷的或兩性離子的狀態(tài)，膜的滲透性就增加了。文獻中(PE/CHEMS，Tachibana et al.)已知的脂質體狀態(tài)允許在低PH值下有滲透能力，該PH條件在生理條件下只有在核內體內部或通過胃時才能獲得?？梢园凑丈鲜龇椒ㄖ苽鋬尚灾|體，并使其中性點為在pH4到9之間的任意預定值。在這樣條件下制備的脂質體是可滲透的并能夠將所包含物轉運到介質中。
然而，脂質體制劑可以在滲透性更小的條件下制備、加工和儲藏。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，制備的脂質體能使其包含物在生理性PH值條件下被釋放，而在低PH值下可安全地包裹該包含物。這樣的脂質體尤其適于制備動力學上的緩慢釋放制劑，包含物的釋放只有在與體液接觸時被啟動，而在儲藏或轉運過程中不發(fā)生。
因此，本發(fā)明中的一個優(yōu)選實施方式包括用于治療目的的脂質體的應用，特別是利用有特定靶向作用的脂質體的應用。微弱的非特異性結合是將脂質體轉運到靶點的先決條件。相反，強的非特異性結合會抑制脂質體向靶點部位的轉運?？梢酝ㄟ^文獻中的其它方法進行特異性結合，即通過選擇脂質體的大小或通過將配體結合到脂質體的表面，該脂質體再結合到細胞表面的靶向受體上。配體可以是諸如，抗體或其片段、糖、激素、維生素、肽如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)、生長因子、膽紅素或其它成分。
本發(fā)明的優(yōu)選方式還涉及脂質體在體內治療或診斷中的應用。優(yōu)選地，這樣的脂質體是在生理條件下有微弱的非特異性結合并伴隨有微弱的融合趨向，而在變化了的條件下，結合力則強且融合能力也強。這樣的脂質體是兩性脂質體，其在生理條件下整體上為陰離子粒子，而在PH低于6.5的條件下，陽離子的電荷增加。在脂質體被內吞至細胞時才有這樣的PH值。在腫瘤內和皮膚表層也存在這樣的PH值。對體外器官進行灌注達一定時間后也會得到這樣的低PH值。因此高結合力和融合性僅限于被細胞和特定組織占據的脂質體。結合力和融合能力的增加支持脂質體膜與細胞膜進行融合。這一行為導致了包容物被直接釋放到細胞內，而沒有釋放危及包容物或細胞成分的核內體溶胞成分。
而且，將脂質體應用到持續(xù)釋放制劑和/或作為循環(huán)性的儲庫也是適合的。脂質體也能夠有利地應用在靜脈內或腹腔內給藥。本發(fā)明中的一個特別優(yōu)選的方式是將脂質體作為體內、離體(in vitro)和體外(ex vivo)細胞轉染的載體中的應用。
本發(fā)明的脂質體具有幾個優(yōu)點。即使是在中性PH條件下，含40％的HisChol和PC的陽離子脂質體可將核酸，如DAN，結合至其膜上。令人驚異的是，當上述脂質體再加入5％的PG來制備，并具有兩性的特點，則這種結合就被完全抑制了。然而，隨著PH值的降低，核酸與膜的結合能夠再一次被恢復。因此，本發(fā)明的脂質體特別適合于核酸的PH-依賴性結合。
而且，我們驚異地發(fā)現(xiàn)一系列的蛋白質也具有所描述的核酸的行為表現(xiàn)。例如，抗體與本發(fā)明的脂質體膜的結合并不是在中性PH下，而是在弱酸性條件下進行有效的結合。這樣的現(xiàn)象不能從中性油脂和CHEMS的PH-敏感性脂質體中觀察到，也不能從中性油脂和HisChol的PH-敏感性脂質體中觀察到。因此，這是兩性脂質體的一種特殊性質。另人驚異的發(fā)現(xiàn)是，與已知構成的陽離子脂質體相反，本發(fā)明的脂質體與血清相兼容。因此，本發(fā)明一種合適的實施方式包括了這樣的脂質體在治療性質上的應用。與已知構成的陽離子脂質體相比，本發(fā)明的脂質體的一個優(yōu)點是其與細胞的非特異性結合明顯減少。
也驚異地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明脂質體的融合能力依賴于介質的PH值。與細胞生物膜相比，融合能力由選擇的油脂和脂質體的電荷決定。通常，結合步驟先于真正的融合。然而，正如上面所描述的，脂質體與細胞膜的強結合并不總是需要的和應該發(fā)生的，這種情況只有在特定的細胞或組織中的控制條件下才發(fā)生。
脂質體也因此能被用于構建脂質體的載體以將活性成分轉運至細胞內。所有不形成膠束的物質都在活性成分的考慮范圍內。水溶性物質特別適合作為活性成分。它們包括許多蛋白質和肽，特別是抗體或酶或抗原，所有的核酸，而不管它們的分子量，也不管是從RAN或DAN衍生而來的。然而，它們也包括其它的生物大分子，諸如復合糖、天然產物和其它化合物，也有合成的或天然的低分子量活性成分，其用其它方法不能穿透細胞膜屏障。在載體的幫助下，這些物質能夠被轉運到細胞內并開始發(fā)生作用，這是在沒有這種轉運的情況下所不可能發(fā)生的。
因此，在本發(fā)明的教導下，制備得到這樣的脂質體，其融合和結合的性質在不同的PH值下表現(xiàn)不同。負載大量的活性成分并將其轉運到細胞內的與血清兼容的脂質體，也可以用這種方法制備。本領域的技術人員能夠根據本發(fā)明闡述的內容，制備那些最適用于某特定用途的脂質體。
以下結合實施例對本發(fā)明進行詳細的闡述，但本發(fā)明并不受限于這些例子。
實施例1帶有電荷載體的兩性脂質體的制備及其電荷性質，該電荷載體通常帶負電，但也可以轉化為正電將His-chol(5mg)、7.8mg的POPC和2mg的DPPG溶于4ml的1∶1(v/v)的氯仿和甲醇的混合液中，再在旋轉蒸發(fā)儀上徹底旋干。該油脂膜用4.3ml的適當的緩沖液(10mM Kac，10mM HEPES，150mMNaCl，PH7.5)水化，用超聲處理該濃度為5mM的油脂達5分鐘。然后，凍結懸浮液，融化后，再經過幾次過濾(extrude)(Avestin LiposoFast，用200nm孔徑的聚合碳酸酯濾器)。測定Z電勢時，需將脂質體的濃度調節(jié)至0.2mM。用PH值是7.5或4.2的上述緩沖體系進行稀釋。測定的Z電勢位于18mV(在PH為7.5時)和+35mV(在PH為4.2時)之間。
實施例2帶電荷載體的兩性脂質體的制備及其電荷性質，該電荷載體帶恒定的正電荷和可變的負電荷將POPC、DOTAP和CHEMS以下述所給摩爾比溶于4ml的1∶1(v/v)的氯仿和甲醇的混合液中，再在旋轉蒸發(fā)儀上徹底旋干。該油脂膜用4.3ml的適當的緩沖液(10mM KAc，10mM HEPES，150mM NaCl，PH7.5)水化，用超聲處理該濃度為5mM的油脂達5分鐘。然后，凍結懸浮液，融化后，再經過幾次過濾(Avestin LiposoFast，用200nm孔徑的聚合碳酸酯濾器)。下表顯示了Z電勢隨PH變化而產生的變化。
脂質體組分的摩爾百分比脂質體1 POPC 50 DOTAP 40Chems 10脂質體2 POPC 50 DOTAP 30Chems 20脂質體3 POPC 50 DOTAP 25Chems 25脂質體4 POPC 50 DOTAP 20Chems 30脂質體5 POPC 50 DOTAP 40Chems 10表1 用mV表示的Z電勢PH 脂質體1脂質體2脂質體3脂質體4脂質體54 44.2 38.4 34.7 31.7 16.25 39.9 25.6 27.2 22.1 3.36 37 21.4 16.4 2.5-7.37.529.2 1.8-7.9 -18.9 -34.6一種適當組分的Z電勢的高度和斜率可以在界限值范圍之內選擇獲得。
實施例3具有完全可轉化性(switchability)化合物的兩性脂質體的制備及其電荷性質將His-chol(5mg)和9.8mg的POPC溶于4ml的1∶1(v/v)的氯仿和甲醇的混合液中，再在旋轉蒸發(fā)儀上徹底旋干。該油脂膜用4.3ml的適當的緩沖液(10mM KAc，10mM HEPES，150mM Nacl，PH7.5)水化，用超聲處理該濃度為5mM的油脂達5分鐘。然后，凍結懸浮液，融化后，再經過幾次過濾(Avestin LiposoFast，用200nm孔徑的聚合碳酸酯濾器)。
下表(表2)顯示了不同的PH值和離子強度下的Z電勢。
表2
實施例4血清的聚集油脂膜按照實施例1的方法制備。不含DPPG的油脂混合物作為對照樣品。油脂膜在緩沖液(10mM的磷酸鹽，150mM的氯化鈉，PH為7.4)中被水化并按上述方法過濾。人血清用等量的緩沖液(10mM的磷酸鹽，150mM的氯化鈉，PH為7.4)稀釋，通過離心將特定的成分和脂肪去除(20分鐘，13000rpm，4℃)；清澈的血清用孔徑為0.2μm的過濾器進行無菌過濾。
將上述制備的脂質體以1mM的濃度加入到血清中，37℃下，溫育15分鐘。溫育后，含有DPPG的脂質體懸浮液是均勻的渾濁體；然而，未觀察到絮結現(xiàn)象。通過動力學的光散射方法測定脂質體的直徑，其比起始樣品的直徑減小了10％。不含DPPG的脂質體的懸浮液很清楚地顯示出絮結現(xiàn)象。
實施例5膜的血清穩(wěn)定性除了血清聚集以外，還進行了活性成分(羧基熒光素，CF)在人血清存在下的沉淀研究。基于該目的，按照實施例2的方法制備了不同分解情況的POPC/DOTAP/CHEMS脂質體POPC 100％(作為對照)，POPC/DOTAP/CHEMS 60∶30∶10，60∶20∶20和60∶10∶30(摩爾百分比)。沒有被包囊的CF通過凝膠過濾而被去除。為用于測試，將脂質體稀釋到0.1mM，在37℃下，溫育15分鐘。以適當的次數移出30μL的樣品，并將其用100mM的Tris緩沖液稀釋至300μL，PH為8.2，測定熒光。用10μL的Tritron X-100(10％的水溶液)將脂質體溶解，得到100％的值。下表顯示了被包囊的CF隨時間的變化而發(fā)生的變化。
脂質體在4個小時的測試期間只在血清中損失了少量的CF。POPC/DOTAP/CHEMS 60∶30∶10，和60∶20∶20仍含有大約75％的CF，POPC和POPC/DOTAP/CHEMS 60∶10∶30甚至還保留最初CF含量的100％(見表3)。
表3時間 POPCPOPC/DOTAP/CHEMSPOPC/DOTAP/CHEMSPOPC/DOTAP/CHEMS(分鐘) 60∶30∶10 60∶20∶20 60∶10∶300 100％ 100％ 100％ 100％15 91％84％95％107％60 94％81％87％110％12096％80％76％105％24096％80％77％107％實施例6DNA的結合含有以下組分(摩爾百分數)的脂質體如實施例1的方法制備(所有數據都是以摩爾百分數表示)。
A60 POPC 40 HisCholB55 POPC 40 HisChol5 CHEMSC60 POPC 20 HisChol20 CHEMS將脂質體懸浮在緩沖液(10mM的醋酸鉀，10Mmhepes，PH為4.2或7.5)中，濃度為0.2mM。將DNA溶液(45μL，1mgDNA(鯡魚(Herring)精子，SIGMA D3159)的1mL水溶液)分別加到各種脂質體的樣品中至1mL，并快速混合。培養(yǎng)15分鐘后，用6mL的適宜的緩沖液裝滿，測定各種脂質體的Z電勢(表4)。
表4脂質體 pH4.2 pH7.5-DNA +DNA -DNA +DNAA+47.6-32.0+2.4 -44.4B+47.8-28.1+0.1 -38.4C+34.0-28.6-10.1-24.7當正電荷過剩(pH為4.2)時，粒子發(fā)生很強的電荷逆轉。在中性pH7.5時，高濃度的CHEMS(脂質體C)可以過度代償HisChol的電荷，且粒子的Z電勢為負值。只有少量的DNA與這樣的粒子相結合。
實施例7DNA的結合和分離按實施例2的方法制備組分為POPC/DPTAP/CHEMS，比率為60∶15∶25和POPC/DCChol/CHEMS，比率為60∶15∶25(摩爾百分比)的脂質體。在PH值為4.2時，采取上述實施例的方法結合DNA并測定Z電勢。然后，將樣品的pH值調節(jié)至7.5，再一次測定Z電勢。
混合物 Z電勢(mv)(a)POPC/DCChol/CHEMS 60∶15∶25(pH4.2)(聚集) -43.5(b)POPC/DPTAP/CHEMS -43.7(c)POPC/DCChol/CHEMS -18.5(d)POPC/DPTAP/CHEMS -14.5在DNA存在下，低PH值下測定的Z電勢是負值；而最初的粒子是帶正電荷的。在PH變成中性后，由于存在DNA而使電荷減少了。Z電勢值接近未處理過的脂質體的Z電勢(PH為7.5時，值為-11mV)。
實施例8DNA的包容及未被包囊的物質的分離將分別具有組分POPC60/DOTAP15/CHEMS25和POPC85/DOTAP15的兩種脂質體制劑，制備成如前述的干燥油脂膜。每一種中油脂的總含量為4μmol。進行水化時，在PH為4.0時，將鯡魚(Herrings)DNA溶解在10mM的醋酸鉀，10mM的HEPES和100mM的氯化鈉中。將DNA(4mg)直接加入到油脂膜中。得到的脂質體被凍結后，反復融化，然后通過200nm的濾器過濾。
每500μL的粒子與2.5mL的蔗糖溶液混合(0.8M的上述緩沖液中的蔗糖，PH值為4.2或7.5)。在其上，再加入1.5mL的0.5M蔗糖溶液和0.5mL的緩沖液。
然后，浮在上面的脂質體就與未結合的DNA分離開來。浮出后，將脂質體從緩沖液/0.5M的蔗糖接觸面上移出。結合的DNA的量通過加入碘化丙錠進行測定。用Stewart檢測法測定油脂的量。只有PC對Stewart檢測法有反應。其它的油脂不采取該數值計算。結果顯示于下表中(表5)。
表5脂質體 PH4.0 PH7.5POPC/DOTA/CHEMS 2μgDNA/μgDOTAP 1.2μgDNA/μgDOTAP60/15/25POPC/DOTAP 85/15 2.3μgDNA/μgDOTAP 2.3μgDNA/μgDOTAP在改變PH值至7.5后，兩性脂質體中只有大約一半的結合DNA浮起來。這樣的物質是真正的被包囊的物質。類似的結果通過脫氧核糖核酸酶的消化得到。
DNA不能通過改變PH或通過增加離子強度的方法再一次從構成的陽離子脂質體中分出，而總是保留在外面。
實施例9融合性質具有下面組分的脂質體如實施例1的方法進行制備(所有數據以摩爾百分比表示)(A)POPC 60 HisChol 40(B)POPC 55 HisChol 40CHEMS5(X)POPC 100(Y)POPC 60 DPPG 40兼性的(facultative)陽離子脂質體A或B與中性脂質體X或陰離子脂質體Y在緩沖液中(10mMHEPES，10mM醋酸鉀，PH為4.2或7.5)中培育。通過動力學的光散射方法測定大小來分析可能發(fā)生的脂質體融合(表6)。
表6脂質體1 X X Y Y脂質體2 A B A BPH4.2 161.6nm191.9nm1689.3nm 2373.2nmPH7.5 191.8nm202.4nm250.0nm206.3nm脂質體的起始大小在PH4.2時是161.8nm，在PH7.5時是165.9nm。
(A)183.2nm(X)195.2nm(Y)183.2nm補充電荷對(YA和YB)的大小完全不同于具有中性脂質體X的混合懸浮液的大小。相互作用的程度取決于兼性的陽離子脂質體的電荷數量。與更大的脂質體融合的程度并不依賴于融合性脂質體PE。
實施例10大分子的滲透性將DOPE(13.75μmol)，2.5μmol的CHEMS和10μmol的HisChol溶解在異丙醇中，在真空下除去溶劑。將緩沖液(1mg/mL的蛋白酶K，10mM的醋酸鉀，10mMHEPES，150mM氯化鈉，PH為4.2)中的蛋白酶K溶液(2.5mL)加入到干燥的油脂膜中。待膜被水化后，形成的脂質體通過400nm的膜過濾。沒有被包裹的蛋白酶在梯度變化的蔗糖中，通過脂質體的浮出而被分離。在PH4.2和7.2(緩沖液同上，起始PH為4.2和8.0)時，通過在7.5mL的緩沖液中培育如此制備出的脂質體。在結合后，用0.1μm的膜濾除釋放出的蛋白酶K。然后，用7.5mL Triton X-100的緩沖液溶液(同上，PH8.0)處理濾液中余下的脂質體。
測定所有濾液中是否含有蛋白酶K。在進行該測試時，使用了偶氮酪蛋白溶液(1M尿素中含6mg/mL的偶氮酪蛋白，200mM的tris硫酸鹽，PH8.5)。將該溶液(500μL)與100μL的濾液或緩沖液混合，然后在37℃溫育30分鐘。通過加入10％的三氯乙酸終止該反應。沉淀的蛋白質通過離心去除。在390nm下測量顯色度(表7)。
表7
如果脂質體的溫育是在PH約為4.2時進行，幾乎沒有蛋白酶K釋放。只有溶解在Triton X-100的脂質體才導致酶的釋放。如果脂質體的溫育是在PH約為7.2時進行，即使不加入Triton也會釋放大量的蛋白酶K，并在第一次濾液中就能發(fā)現(xiàn)。即使后來加入Triton，幾乎沒有額外的酶從脂質體中溶解出來。
該實驗結果也是說明本發(fā)明的分配單元是基于不同于所謂攔截效果的機理而發(fā)明的證據。
表1分配單元的占有面積與吸收速度
本發(fā)明中使用僅覆蓋吸收體表頂層片整個表面的一部分的面積的液體分配單元時，根據目標性能或使用形式等諸條件來改變其平面形狀。圖8(A)～圖8(E)示例了幾種形狀。這些圖中，標號30表示吸收體制品的吸收體主體，在其頂層片上配置本發(fā)明的液體分配單元100。圖8(A)的例中，液體分配單元100是縱向長的長方形，圖8(B)的例中，液體分配單元100是橫向長的長方形。液體分配單元100可以成為圖8(C)所示橢圓形，圖8(D)所示三角形，圖8(E)所示凸形等各種形式。
具有本發(fā)明的液體分配單元的吸收體制品的吸收體部分基本上具<p>實施例13脂質體的結合和轉染如實施例2法制備組成為POPC/DOTAP/CHEMS/N-戊二酰-DPPE(50∶10∶30∶10(摩爾百分比))的脂質體。同時，在PH為7.5時，用3mg/mL的10mMHEPES和150mM氯化鈉中的TRITC-右旋糖苷(分子量大約為4400)溶液進行水化。未包裹的TRITC-右旋糖苷通過Sephadex G-75柱凝膠過濾除去。用EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨丙基碳二亞胺)(每400μL脂質體懸浮液中含3.5mgEDC)活化N-戊二酰DEPPs，然后在暗處攪拌5個小時以使環(huán)狀的肽RCDCRGDCFC結合到脂質體表面。然后加入RGD肽(150μL緩沖液中含250μg)并持續(xù)攪拌過夜。通過凝膠過濾將脂質體與未被結合的肽分離。
將人內皮細胞(HUVEC)在特殊的介質中培養(yǎng)。將0.5mM配體修飾的脂質體和無RGD配體的對照脂質體懸浮液加入到細胞中。2個小時后，除去脂質體，用PBS緩沖液沖洗細胞室3次并在熒光顯微鏡下觀察。已用RDG脂質體處理過的細胞中的TRITC熒光比對照脂質體的熒光顯得更紅。
實施例14藥物代謝動力學研究(PH-可轉化的脂質體的血液水平和器官分布)將POPC/Chol(60∶40)，POPC/Hist-Chol/Chol(60∶20∶20)和POPC/DOTAP/Chems(60∶10∶30)(500μL)的脂質體注射到雄性Wistar鼠的尾靜脈中。
脂質體懸浮液(50mM)通過水化相應制劑(在PH為7.5時，在10mMHEPES，150nm的氯化鈉中加入0.03摩爾的[14]C-DPPC)和2mL含1mg的[3]H-菊粉)進行制備。經過3個凍結和融化循環(huán)，懸浮液通過400nm的膜反復過濾(LiposoFast，Avestin)。未包裹的[3]H-菊粉通過G-75Sephadex-柱凝膠過濾除去，然后在CENTRIPREP(微孔)離心機上濃縮。
將每種制劑的脂質體懸浮液(0.5ml)對4個實驗動物給藥，在5分鐘、15分鐘、60分鐘、3個小時、12個小時和24個小時后抽取血液樣品。膜片段和可溶解的包含物的放射活性通過閃爍法測定，以下為所測數值從血液獲得的半衰期POPC/Chol 超過120分鐘POPC/DOTAP/Chems超過120分鐘POPC/Hist-Chol 超過120分鐘本發(fā)明的脂質體在血液中具有相對長的半衰期使其具備一個載體系統(tǒng)的基本先決條件。它們沒有劇烈毒性，也不被網狀內皮系統(tǒng)快速吸收。直到本試驗結束，血液中3[H]與14[C]的放射活性比率仍穩(wěn)定不變。因此，在任何情況下都沒有發(fā)生通過補充胞溶作用而釋放包容物的現(xiàn)象。
權利要求
1.兩性脂質體，其中，該脂質體包括至少一種正電荷載體和至少一種不同于正電荷載體的負電荷載體，該脂質體的等電點位于4和8之間。
2.如權利要求1所述的兩性脂質體，其中，該脂質體的等電點位于5和7之間。
3.兩性脂質體，其中，該脂質體包括至少一種兩性電荷載體，該兩性電荷載體的等電點位于4和8之間。
4.如前述權利要求所述的兩性脂質體，其中，該兩性電荷載體的等電點位于5和7之間。
5.兩性脂質體，其中，該脂質體包括至少一種兩性電荷載體和至少一種陰離子和/或陽離子電荷載體。
6.如權利要求5所述的兩性脂質體，其中，該脂質體的等電點位于5和7之間。
7.如權利要求1至6之一所述的兩性脂質體，其中，該脂質體包括選自磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、膽甾醇、四醚脂、神經酰胺、鞘磷脂和/或二乙酰甘油的中性油脂。
8.如上述權利要求之一所述的兩性脂質體，其中，該脂質體的平均尺寸在50至1000nm之間，優(yōu)選在70和250nm之間，特別優(yōu)選在60和130nm之間。
9.如上述權利要求之一所述的兩性脂質體，其中，該脂質體包括一種活性成分。
10.如上述權利要求之一所述的兩性脂質體，其中，該活性成分為蛋白質、肽、DNA、RNA、反義核苷酸和/或誘餌核苷酸。
11.如上述權利要求之一所述的兩性脂質體，其中，該脂質體內含有至少80％的活性成分。
12.將活性成分裝入權利要求1至11所述的脂質體中的方法，其中，在一個確定的PH值下進行包囊，再在另一個PH值下分離未結合的物質。
13.將活性成分裝入權利要求1至11所述的脂質體中的方法，其中，使該脂質體具有滲透性，并在一個確定的PH下關閉滲透通道。
14.權利要求1至11之一所述的脂質體在制備微膠囊中的應用。
15.權利要求1至11之一所述的脂質體在制備診斷學釋放系統(tǒng)中的應用。
16.權利要求1至11之一所述的脂質體在轉運和/或釋放活性成分中的應用。
17.權利要求1至11之一所述的脂質體作為持續(xù)釋放制劑和/或循環(huán)儲庫的應用。
18.權利要求1至11之一所述的脂質體在靜脈內或腹腔內給藥的應用。
19.如權利要求1至11之一所述的脂質體作為在體內、離體和體外轉染細胞的載體的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩性脂質體及其應用，該兩性脂質體同時包含基膜的或構膜的正電荷和負電荷載體。
文檔編號A61K47/18GK1492756SQ02805213
公開日2004年4月28日 申請日期2002年2月21日 優(yōu)先權日2001年2月21日
發(fā)明者斯特芬·潘茨納, 斯特凡·范克豪尼爾, 弗朗克·埃斯勒, 科妮莉亞·潘茨納, 埃斯勒, 范克豪尼爾, 亞 潘茨納, 斯特芬 潘茨納 申請人:諾沃薩姆股份有限公司