專利名稱：重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑的藥物用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)的在制藥領(lǐng)域中的新用途，尤其涉及在治療哮喘的藥物中的新用途。
背景技術(shù)：
重組白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)是存在于人體的蛋白質(zhì)類細(xì)胞因子受體拮抗劑，分子量17KD，通過結(jié)合白細(xì)胞介素-1受體(I型和II型)，特異性地封閉IL-1的活性。1990年，美國Synergen公司的Eisenberg等人在英國Nature雜志首次報道了全長cDNA序列，(Nature1990；343341-346)。
IL-1在機體的炎癥反應(yīng)中起著極為關(guān)鍵的啟動作用。人類許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中都有IL-1參與，IL-1本身不僅可以趨化體內(nèi)的炎性反應(yīng)細(xì)胞聚集至炎癥發(fā)生部位，還可刺激體內(nèi)的多種炎癥介導(dǎo)介質(zhì)的產(chǎn)生，而使炎癥反應(yīng)進一步加劇。因此，如何消除IL-1的影響將對治愈某些炎癥疾病起著重要作用。IL-1ra是體內(nèi)自然存在的IL-1拮抗劑。它可以特異地與細(xì)胞表面的IL-1受體結(jié)合而不激活靶細(xì)胞，從而阻斷IL-1的生物學(xué)活性。IL-1ra是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一細(xì)胞因子拮抗劑。
自從IL-1ra被發(fā)現(xiàn)以來，人們就試圖將其開發(fā)為可供臨床應(yīng)用的藥品，大量基礎(chǔ)研究和初步臨床研究結(jié)果顯示IL-1ra對人類的許多炎性疾病確有療效。此類報道更激起了人們對IL-1ra成為新藥的企盼。90年代初期，Arend等成功地克隆出人IL-1ra cDNA，為使用基因重組手段大規(guī)模制備rhIL-1ra成為可能。近十年來，人類在對IL-1ra更為全面深入了解基礎(chǔ)上，對rhIL-1ra的臨床應(yīng)用進行了全面開發(fā)。研究結(jié)果表明，rhIL-1ra將有可能用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、移植排異反應(yīng)、移植物抗宿主反應(yīng)、哮喘、牛皮癬等疾病。早在1996年，美國就開始了rhIL-1ra治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床研究。經(jīng)過5年多的大規(guī)模、多中心、隨機雙盲、安慰劑對照的臨床研究，結(jié)果表明，以rhIL-1ra 75-150mg的劑量治療6個月，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病人的臨床癥狀和影象學(xué)征象均有明顯改善。2001年報11月，美國FDA正式批準(zhǔn)rhIL-1ra作為新藥投入市場。
哮喘是一種慢性支氣管疾病，哮喘可以分為外源性及內(nèi)源性兩類?；颊叩臍夤芤驗榘l(fā)炎而腫脹，呼吸管道變得狹窄，因而導(dǎo)致呼吸困難。支氣管哮喘不僅是一種常見病，又是難以治愈的頑癥。此病本身易反復(fù)發(fā)作，不易根除。哮喘患者可能有呼吸困難，有反復(fù)的胸悶、咳嗽，嚴(yán)重時可以致人以死亡。據(jù)一項最新調(diào)查確認(rèn)，我國哮喘病患者約有2500萬，已成為第二大呼吸道疾病。我國哮喘病發(fā)病率在兒童為2-3％，老年人為1％左右。近年來，世界范圍內(nèi)的哮喘發(fā)病量與日俱增，世界上有1.5億人被診斷為哮喘病，在過去的10年中，病例已增加3倍以上，每年有18萬人死于此病。
目前治療哮喘病廣泛使用的激素類藥物有抗過敏、平喘、減少滲出及調(diào)節(jié)β2受體功能等多種作用，幾乎對所以的哮喘有效。雖然挽救過不少危重病人的生命，但長期大劑量使用有較大副作用，如出現(xiàn)肥胖、高血壓、潰瘍病、機體抵抗力降低，甚至發(fā)生激素依賴等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人通過大量的試驗，首次證明了重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑在治療哮喘中的新用途，并且提供了一種可用于替代激素的治療哮喘的藥物組合物。
發(fā)明人進行了一系列物試驗表明，重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑對于預(yù)防、治療支氣管哮喘較對照組(異丙腎上腺激素組)相比，療效更顯著，且無激素的副作用。
本發(fā)明另一方面提供了治療哮喘病的藥物，為含有治療有效量的重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑與藥劑學(xué)上可接受的輔劑的藥物組合物。
用于實現(xiàn)本發(fā)明目的的rhIL-1ra可以來自任何已知技術(shù)的不同制備過程，本發(fā)明沒有特別限定，例如，一種重組人白介素-1受體拮抗劑上游構(gòu)建過程可以簡述如下1、從含有人白介素-1受體拮抗劑基因的基因文庫中克隆出人白介素-1受體拮抗劑基因；2、將人白介素-1受體拮抗劑基因連接到適當(dāng)?shù)谋磉_載體上；3、以表達載體轉(zhuǎn)化(轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞；4、使帶有人白介素-1受體拮抗劑基因表達載體的宿主細(xì)胞繁殖；(如以大腸桿菌為宿主細(xì)胞，此過程可通過發(fā)酵手段實現(xiàn))。
所以，本發(fā)明的公開一方面為重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑提供了新的適應(yīng)癥，另一方面對于開發(fā)新的治療哮喘提供了可行的途徑，藥理研究用rhIL-1ra一次性給小鼠吸入1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg(相當(dāng)于豚鼠ED50的1倍、3倍和10倍)及PBS磷酸緩沖液后，連續(xù)觀察小鼠30分鐘內(nèi)的一般行為和自主活動計數(shù)；在同樣劑量下，觀察小鼠對戊巴比妥鈉催眠的影響。另外，還觀察一次性給麻醉犬吸入rhIL-1ra 0.2mg/kg、0.6mg/kg、2.0mg/kg和PBS磷酸緩沖液后對心率，呼吸頻率、幅度，血壓及心電圖的影響。結(jié)果顯示中劑量的rhIL-1ra(3.0mg/kg)在給藥后20分鐘內(nèi)可引起小鼠自主活動次數(shù)的增多(P＜0.05)；并且rhIL-1ra呈劑量依賴性使小鼠對戊巴比妥鈉催眠潛伏期延長，睡眠持續(xù)時間縮短(P＜0.05、0.01、0001)。但對麻醉犬的心率，呼吸頻率、幅度，血壓及心電圖未見明顯的影響，與用藥前比較(P＞0.05)。
藥效學(xué)實驗結(jié)果(一)整體實驗結(jié)果重組白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)1.0、2.0、4.0、8.0mg.kg.d-1(豚鼠用量)能明顯減輕組胺-乙酰膽堿引起的正常豚鼠哮喘的發(fā)作，測得半數(shù)有效量為0.60mg.kg.d-1。重組白介素受體拮抗劑(rhIL-1ra)0.33、1.0、3.0、9.0mg.kg.d-1(豚鼠用量)能明顯減輕組胺-乙酰膽堿引起的致敏豚鼠哮喘的發(fā)作，測得半數(shù)有效量為0.74mg.kg.d-1，根據(jù)量效研究結(jié)果，選用4.0mg.kg.d-1劑量進行不同時間點平喘實驗，結(jié)果證明該藥在給藥后1-5min平喘作用達高峰。
(二)離體實驗結(jié)果1.rhIL-1ra對豚鼠靜息狀態(tài)氣管片呈劑量依賴性松弛作用，其半數(shù)有效濃度EC50為8.06×10-8M。
2.rhIL-1ra在10-7-10-5M濃度時，對10-3M組織胺(His)、10-3M乙酰膽堿(Ach)和10-6M5-羥色胺(5-TH)所致氣管痙攣均有明顯解痙作用(P＜0.05，0.01)。但10-9M rhIL-1ra卻能增強乙酰膽堿收縮氣管效應(yīng)(P＜0.05)。
3.10-8-10-6M rhIL-1ra呈現(xiàn)非競爭性拮抗His收縮氣管的作用，減活指數(shù)PD2’為6.63±0.31。同樣濃度rhIL-1ra也能拮抗5-HT收縮氣管作用，但最大效應(yīng)不下降，曲線亦非平行右移。10-7-10-6M rhIL-1ra抑制Ach作用與抑制5-HT作用相似。但10-9-10-8M rhIL-1ra卻增強Ach收縮氣管作用。
4.10-11-10-7g/ml白介素-1β對豚鼠靜息狀態(tài)氣管片有收縮作用，EC50為2.48×10-9g/ml。10-10-10-8M rhIL-1ra對白介素的這一作用呈現(xiàn)非競爭性拮抗，pD2’為8.89±0.14。
5.rhIL-1ra對卵白蛋白致敏后的豚鼠靜息狀態(tài)離體氣管片有直接松弛作用，EC50為5.88×10-7M。
6.10-7M rhIL-1ra對卵白蛋白(0.1％，0.1ml)攻擊引起的氣管收縮有顯著松弛作用(P＜0.01)。預(yù)先給予rhIL-1ra能明顯抑制卵白蛋白的上述作用，劑量越大抑制越強，半效抑制濃度(IC50)為4.48×10-7M。
毒理實驗(一)長期毒性結(jié)果(大鼠)rhIL-1ra 7.0mg/kg、21mg/kg、35mg/kg(為豚鼠ED50的10倍、30倍和50倍)和等容積的PBS緩沖液，分別給大鼠連續(xù)吸入30天，每天觀察所有動物的一般狀況，并每周測體重和進食量一次。在最后一次給受試藥后，24小時內(nèi)每組活殺2/3動物，留下部分動物繼續(xù)觀察2周后再活殺。對所有大鼠的血常規(guī)、生化指標(biāo)及臟器進行病理組織學(xué)檢測。結(jié)果顯示與對照組比較無顯著性差異。綜上所述，rhIL-1ra長期應(yīng)用(大于有效療程的3-4倍時間)不會引起機體明顯的毒性反應(yīng)，可以安全使用。
(二)長期毒性結(jié)果(犬)分別以0.2mg.kg-1、1.2mg.kg-1和7.2mg.kg-1重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(rhIL-1ra)三個劑量給藥，對照組以等容量PBS噴霧給藥，每天一次，分別連續(xù)給藥30天，最后一次給受試藥后每組活殺2/3動物，留下部分動物連續(xù)觀察2周后再活殺。結(jié)果表明rhIL-1ra對外周血紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板數(shù)量及凝血時間無影響，與對照組比較差異無顯著性(P＞0.05)。給藥期間各劑量組犬進食、飲水及體重均正常，毛色有光澤，糞便成型，與對照組比較無顯著性差異?；謴?fù)期觀察可逆性變化，喉部、氣道及肺部炎癥減輕，基本恢復(fù)正常，其余各項指標(biāo)正常。
結(jié)論rhIL-1ra 0.2mg.kg-1-7.2mg.kg-1劑量范圍長期給藥，無毒性反應(yīng)。
(三)急性毒性實驗結(jié)果rhIL-1ra小鼠一次皮下注射(最大濃度、最大容積)給藥后，連續(xù)觀察7天，未出現(xiàn)毒性反應(yīng)和死亡。rhIL-1ra皮下注射的LD50大于222.6mg/kg。
權(quán)利要求
1.重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑在制備治療哮喘病的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中，治療哮喘病的藥物為含有治療有效量的重組人白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑與藥劑學(xué)上可接受的輔劑的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了重組人白細(xì)胞介素－1受體拮抗劑的新的醫(yī)藥用途，發(fā)現(xiàn)重組人白細(xì)胞介素－1受體拮抗劑對于預(yù)防、治療支氣管哮喘較對照組(異丙腎上腺素組)相比，療效更顯著，且無激素的副作用。本發(fā)明另一方面提供了治療哮喘病的藥物。
文檔編號A61K38/20GK1471968SQ02125699
公開日2004年2月4日 申請日期2002年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月29日
發(fā)明者馬大龍, 狄春輝, 朱仁英, 楊璐, 韓普 申請人:北京北醫(yī)聯(lián)合生物工程公司