專利名稱：用人單克隆抗體治療乙型肝炎病毒感染的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防乙型肝炎感染的藥物組合物，其包含兩種人單克隆抗體的混合物。
背景技術(shù)：
盡管在超過100個國家引入了抗乙型肝炎的普遍接種，但持續(xù)性HBV感染仍然是一個世界性的嚴重問題，其導(dǎo)致了預(yù)計一百萬的年死亡率(Kane，Lancet 1996；348-696)。接種的效果轉(zhuǎn)化為降低的傳染和發(fā)病率可能要用數(shù)十年。這期間，持續(xù)性HBV感染患者需要比目前可用的更好的抗病毒治療方式。在美國，每年急性HBV感染的新發(fā)病例大約有300,000名，其中10％的患者將成為HBV攜帶者，而其中的50％將發(fā)展為慢性肝臟疾病，其發(fā)展成為肝細胞癌(HCC)的風(fēng)險增加(El-Serag和Mason，N Eng J Med 1999；340 745-750)。
乙型肝炎疫苗能有效地預(yù)防原發(fā)感染，但對已感染患者尚未顯示顯著的效果。
目前批準兩種療法用于治療慢性HBV感染干擾素α-2b(IFNα)(Wong等，Ann Intern Med 1993；119，312-323)和拉米夫定(lamivudine)(Dienstag等，N Eng J Med 1999；341，1256-1263)。由于相對低的應(yīng)答率，IFNα強烈的副作用和出現(xiàn)拉米夫定抗性株這些原因，使得這兩種療法都只能提供針對疾病的部分解決方案(Liaw等，Hepatology 1999；30，567-572)。
在肝移植后，利用來自HBV免疫患者的人超免疫免疫球蛋白制劑的被動免疫療法通常被用來預(yù)防抗肝臟再感染。將其肌肉內(nèi)給藥給嬰兒以預(yù)防來自感染母親的HBV垂直傳染。其不能用于治療慢性患者。
總的來說，血漿源性多克隆抗體的應(yīng)用具有局限性，因為這些制劑具有易變的活性、有限的可利用性并且存在傳遞感染性試劑的潛在危險。
相反，單克隆抗體(mAbs)可被持續(xù)性生產(chǎn)且其不具有與血漿源性制品相關(guān)的感染風(fēng)險。
以前使用單一人mAb治療經(jīng)歷肝移植的HBV-感染患者的研究導(dǎo)致出現(xiàn)脫逸突變體(McMahon等，1992 Hepatology 15(5)757-766)。將同一抗體施用于預(yù)先用拉米夫定治療的慢性乙型肝炎患者，時間為2周，結(jié)果顯示與HBsAg形成復(fù)合體從而降低其在患者體內(nèi)的水平。治療3個月后HBsAg水平返回到治療前水平(Heijtink等，2001 J.Med.Vrrol.64 427-434)。
在另一研究中，開發(fā)了直接針對乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的不同表位的兩種完全人源化單克隆抗體(PCT/IL97/00184和PCT/IL97/00183)。將這些抗體的混合物單獨給藥到HBV慢性攜帶者黑猩猩，結(jié)果導(dǎo)致了HBsAg水平的即時降低，隨后在幾天內(nèi)回復(fù)至起始水平(Eren等，2000Hepatology 32 588-596)。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物包含兩種、完全人源化、高親和性的單克隆抗體的組合，所述單克隆抗體直接抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的不同表位。
根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，藥物組合物(表示為HBV-AbXTL)包含作為活性成分的混合物以及藥用載體，所述混合物為人單克隆抗體19.79.5及其保留了抗體的抗原結(jié)合特性的片段和人單克隆抗體17.1.41及其保留了抗體的抗原結(jié)合特性的片段的混合物。分泌抗體19.79.5的雜交瘤細胞系保藏在歐洲動物細胞保藏中心(ECACC)，保藏號為96052168，而分泌抗體17.1.41的雜交瘤細胞系保藏在ECACC，保藏號為96052169。PCT/IL97/00184和PCT/IL97/00183中所公開的序列進一步表征了抗體19.79.5和17.1.41。保留了抗體的抗原結(jié)合特性的片段可以是，例如，通過使用現(xiàn)有技術(shù)中已知并詳盡描述的酶來消化完全抗體而獲得的Fab或F(ab)2片段?？赏ㄟ^利用標準試驗如RIA、ELISA或FACS分析檢測抗體與特定抗原決定簇的結(jié)合來測定抗體的抗原特性。
本發(fā)明的另一個方面是抗體混合物的多種預(yù)防性和治療性應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的這一方面，包含抗體混合物的藥物組合物可被用于治療慢性乙肝患者，其是通過對該患者給藥治療有效量的能夠結(jié)合HBVsAg的抗體或其片段的混合物，所述治療有效量是能夠有效緩解HBV感染癥狀或降低個體的循環(huán)病毒顆粒數(shù)量的用量。評估HBV感染癥狀緩解的方法可包括，作為非限制性實例，通過測定酶丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(enzyme alanineaminotransferase)(ATL)水平或通過檢測血清轉(zhuǎn)變即HBeAg的消失或通過檢測肝臟活體解剖和用本領(lǐng)域中眾所周知的方法測定組織纖維樣變性水平來進行肝功能檢測。例如通過利用PCR來測定HBV DNA水平或通過測定血液中HBsAg水平可確定循環(huán)病毒顆粒的數(shù)量。
在本發(fā)明的一個實施方案中，給予藥物組合物的劑量范圍為0.26mg至80mg。優(yōu)選為10mg或40mg。
在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，藥物組合物包含各抗體19.79.5和17.1.41，比率大約為1∶3。
除抗體混合物外，本發(fā)明的藥物組合物任選地還可包含載體，所述載體選自本領(lǐng)域中已知的任一種載體。所述載體的一個實例為脂質(zhì)體。本發(fā)明的藥物組合物還可包含本質(zhì)上已知的各種稀釋劑和佐劑。
本發(fā)明的組合物可采用多種給藥方式來給藥，包括靜脈內(nèi)、肌肉和皮下給藥。
本發(fā)明的藥物組合物可以與其它抗病毒劑聯(lián)合給藥。這類抗病毒劑可包括，作為非限制性實例干擾素、抗乙型肝炎單克隆抗體、抗乙型肝炎多克隆抗體、核苷類似物、DNA聚合酶抑制劑和治療性疫苗。在這種聯(lián)合治療情形中，抗體可以與抗病毒劑同時給藥，或順序地在用抗病毒劑治療之前或之后給藥。
本發(fā)明的藥物組合物還可用于，例如作為如下情況的預(yù)防性治療HBV感染的母親所生育的新生兒或接觸病毒的保健工作者或用于肝移植受體以消除移植肝臟可能的復(fù)發(fā)性HBV感染。
附圖簡述

圖1用單劑量HBV-AbXTL混合物輸注的2名患者的HBsAg和HBV-DNA血清水平。HBV-AbXTL混合物在時間點0給藥。時間范圍未按比例。A303號患者，劑量0.26mg，Ab∶Ag克分子比＝1∶14；B310號患者，劑量39mg，Ab∶Ag克分子比＝1∶2。
HBV-DNA——■—— HBsAg---●---圖2多次輸注HBV-AbXTL混合物的4名患者的HBsAg和HBV-DNA血清水平。HBV-AbXTL混合物在時間點(天)0，8，15和22給藥；箭頭指示給藥時間。A303號患者，劑量4×10mg；B308號患者，劑量4×20mg；C105號患者，劑量4×40mg；D301號患者，劑量4×80mg；HBV-DNA——■——HBsAg---●---圖3多次輸注HBV-AbXTL混合物的4名患者的HBsAg和抗-HBsAg抗體血清水平。HBV-AbXTL混合物在時間點(天)0，8，15和22給藥；箭頭指示給藥時間。A303號患者，劑量4×10mg；B308號患者，劑量4×20mg；C105號患者，劑量4×40mg；D301號患者，劑量4×80mg；HBsAg——■——抗-HBsAg抗體---●---目前參考下述實施例，其是以例證方式提供而不是意圖限制本發(fā)明。
實施例材料和方法病毒學(xué)和免疫學(xué)試驗血清HBsAg水平。利用純化的HBsAg制劑(Bio-Hep-B，BiotechnologyGeneral，Ness-Ziona，以色列)作為標準，通過改良的自動化免疫試驗(IMX系統(tǒng)，Abbott GmbH Diagnostika)測定HBsAg水平。
血清抗-HBs水平。通過AUSAB RIA測定抗-HBs水平，并將其與用于抗-HBs的WHO參考相比較?？?HBs的參考血清獲自CLB，Red CrossBlood Transfusion Service，荷蘭。
血清HBV-DNA水平。通過按照制造商的說明書利用Amplicor HBVMontiorTM測試(Hoffman-La Roche Inc.Roche Diagnostics，Branchburg，N.J，美國)的HBV-DNA PCR來分析患者血清中的HBV-DNA水平。
制備HBV-AbXTL
如下制備每劑HBV-AbXTL在250ml普通鹽溶液中，以各抗體間約1∶3的比例(即，對于每mg的抗體19.79.5，加入大約3mg的抗體17.1.41)稀釋兩種抗體19.79.5和17.1.41。
實施例1首先在未治療的慢性乙肝感染患者的劑量增加(單劑量)IA期研究來檢測HBV-AbXTL(Galun等，2000 Hepatology 32(4 Pt.2)221A頁)。在研究中登記全部15名患者，對每名患者施以單劑量HBV-AbXTL。劑量范圍為0.26至40mg。劑量水平是基于根據(jù)抗體與抗原(Ab∶Ag)的克分子比(表1)。靜脈內(nèi)輸注給藥HBV-AbXTL2～8小時。
表1IA期患者的治療前臨床特征
在輸注開始后不久，可檢測到HBsAg和HBV-DNA水平降低，但只在施以高Ab∶Ag比抗體的患者中觀察到。在第五組中(Ab∶Ag克分子比為1∶2)的HBsAg水平降至無法檢測到的水平，然后在輸注開始后24小時開始升高，僅在輸注8天后就達到治療前的水平(圖1)。在HBV-AbXTL輸注開始后，HBV-DNA水平也降低，而在1天后達到治療前的水平。HBV-DNA水平的降低在1～3個數(shù)量級之間。報道的最常見副作用是在6名患者(40％)中觀察到輕微肌痛。
實施例2隨后，進行慢性乙肝感染患者的多劑量，劑量增加IB期研究，登記12名患者，每4個連續(xù)劑量組3名患者(表2)。對每名患者每周施以4次HBV-AbXTL輸注，每次輸注劑量范圍為10至80mg。靜脈輸注進行2或4小時。
表21B期患者的治療前臨床特征
第一組患者已接受每周4次每次10mg的輸注。三名患者中的兩名患者在給藥后HBsAg水平立即降至無法檢測到的水平，而在下次輸注前幾乎回到原始水平。在每次給藥后都觀察到相似的情況，這導(dǎo)致重復(fù)給藥期間HBsAg水平呈現(xiàn)遞減趨勢。在注射后24小時，在一名患者中仍然檢測不到HBsAg水平，但在另兩名患者中則開始升高。相似地，經(jīng)過輸注，HBV-DNA水平降低了3個對數(shù)，且每次給藥觀察到遞減。在每次輸注后這些水平保持24小時無法檢測(圖2)。
第二組患者接受每周4次，每次20mg HBV-ABXTL輸注(圖2B)。在這三名患者中，同樣觀察到HBsAg水平降至無法檢測的這一相似情況。HBV-DNA水平也降低了1～4個對數(shù)。第三組接受40mg HBV-ABXTL的每周4次輸注，第四組接受每次80mg HBV-AbXTL的每周4次輸注。這些給藥在HBsAg和HBV-DNA動力學(xué)上顯示出類似的效果(圖2C，D)。在所有病例中，HBV-DNA顯著地降低，HBsAg在輸注后立即降至檢測不到的水平。
抗體被充分耐受未出現(xiàn)嚴重的副作用，僅在一名患者(8％)中報道了肌痛。最普遍的副作用為血尿和輕微的胸痛，12名患者中的3名(25％)出現(xiàn)了上述各副作用。沒有免疫復(fù)合物疾病(immune complex disease)的證據(jù)。
在對IB期患者進行了每周4次的輸注后，我們已追蹤了HBV-AbXTL水平。與HBsAg水平相比，抗-HB(乙型肝炎)抗體水平增高和降低的動力學(xué)具有相反的模式。在所有患者中，每次輸注后，抗-HB抗體水平增高并達到一個峰值，然后在下次給藥前回落到治療前水平(圖3)。在以40mg和80mg重復(fù)劑量給藥的患者中，抗-HB抗體水平的降低稍較緩慢。
實施例3在隨后的研究中，將HBV-AbXTL與拉米夫定聯(lián)合給藥。拉米夫定的給藥劑量為100mg/天(用于治療慢性乙肝病毒感染的拉米夫定推薦劑量)，而HBV-AbXTL的靜脈給藥劑量為10mg或40mg。
表3中所示為這些具體劑量的制劑。
表3HBV-AbXTL中HBV-Ab 17.1.41和HBV-Ab 19.79.5的量
按照下述劑量方案對患者進行治療A.HBV-AbXTL以每周10mg給藥4周，隨后以每4周10mg給藥48周加上拉米夫定以每日一次100mg給藥64周。
B.HBV-AbXTL以每周40mg給藥4周，隨后以每4周10mg給藥48周加上拉米夫定以每日一次100mg給藥64周。
C.HBV-AbXTL以每周40mg給藥4周，隨后以每4周40mg給藥48周加上拉米夫定以每日一次100mg給藥64周。
D.HBV-AbXTL以每周三次，每次40mg給藥2周，隨后以每周一次40mg給藥2周，隨后以每4周10mg給藥48周加上拉米夫定以每日一次100mg給藥64周。
E.HBV-AbXTL以每周三次，每次40mg給藥2周，隨后以每周一次40mg給藥2周，隨后以每4周40mg給藥48周加上拉米夫定以每日一次100mg給藥64周。
權(quán)利要求
1.一種藥物組合物，其包含作為活性成分的混合物和藥用載體，所述混合物為人單克隆抗體19.79.5及其保留了所述抗體的抗原結(jié)合特性的片段和人單克隆抗體17.1.41及其保留了所述抗體的抗原結(jié)合特性的片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述抗體濃度范圍為0.26至80mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述抗體濃度為10mg。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述抗體濃度為40mg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的藥物組合物，其中所述人單克隆抗體19.79.5與所述人單克隆抗體17.1.41之間的毫克濃度比約為1∶3。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的藥物組合物，其包含2.38mg的所述人單克隆抗體19.79.5和7.6mg的所述人單克隆抗體17.1.41。
7.根據(jù)權(quán)利要求4的藥物組合物，其包含9.5mg的所述人單克隆抗體19.79.5和30.5mg的所述人單克隆抗體17.1.41。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的藥物組合物用于治療乙型肝炎(HBV)感染。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的藥物組合物用于預(yù)防乙型肝炎感染。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的藥物組合物與抗病毒劑聯(lián)合用于治療或預(yù)防HBV感染的應(yīng)用。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的藥物組合物的應(yīng)用，其中所述抗病毒劑選自干擾素，抗乙型肝炎單克隆抗體，抗乙型肝炎多克隆抗體，核苷類似物，DNA聚合酶抑制劑和治療性疫苗。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的藥物組合物的應(yīng)用，其中所述抗病毒劑為拉米夫定。
13.一種用于治療HBV感染的方法，其包含對需要的個體給藥根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的藥物組合物。
14.一種用于預(yù)防HBV感染的方法，其包含對個體給藥根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的藥物組合物以預(yù)防被治療的HBV個體的進一步感染。
15.一種用于治療HBV感染的方法，其包含與抗病毒劑聯(lián)合對需要的個體給藥根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的藥物組合物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的用于治療HBV感染的方法，其中所述抗病毒劑選自干擾素，抗乙型肝炎單克隆抗體，抗乙型肝炎多克隆抗體，核苷類似物，DNA聚合酶抑制劑和治療性疫苗。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的用于治療HBV感染的方法，其中所述抗病毒劑為拉米夫定。
18.根據(jù)權(quán)利要求15-17任一項的用于治療HBV感染的方法，其中所述藥物組合物聯(lián)合治療有效量的抗病毒劑以每周1或3次給藥4周來給藥，然后每4周1次給藥48周。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的用于治療HBV感染的方法，其中所述抗病毒劑為拉米夫定。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的用于治療HBV感染的方法，其中以100mg劑量每日1次給藥拉米夫定。
21.根據(jù)權(quán)利要求13-20任一項的用于治療或預(yù)防HBV感染的方法，其中所述藥物組合物以皮下注射方式給藥。
22.根據(jù)權(quán)利要求13-20任一項的用于治療或預(yù)防HBV感染的方法，其中所述藥物組合物以肌肉注射方式給藥。
23.根據(jù)權(quán)利要求13-20任一項的用于治療或預(yù)防HBV感染的方法，其中所述藥物組合物以靜脈內(nèi)注射方式給藥。
全文摘要
公開了一種治療或預(yù)防乙型肝炎病毒感染的藥物組合物，其包含兩種完全人源化抗HBsAg單克隆抗體19.79和17.1.41的1∶3混合物。還公開了優(yōu)選的給藥方式。該藥物組合物可作為單獨治療給藥或與其它抗病毒劑聯(lián)合給藥。
文檔編號A61K38/21GK1558763SQ01823692
公開日2004年12月29日 申請日期2001年10月4日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月4日
發(fā)明者什洛莫·達岡, 拉赫爾·埃倫, 埃倫, 什洛莫 達岡 申請人:Xtl生物制藥有限公司