專利名稱:制備嗜中性粒細(xì)胞抑制因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本申請(qǐng)是美國專利申請(qǐng)系列號(hào)09/644,942(2000年8月23日提交)的部分繼續(xù)申請(qǐng),其公開內(nèi)容在此引入以供參考。
本發(fā)明涉及一種制備嗜中性抑制因子(NIF)的方法,包括在無動(dòng)物成分的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明可用于大規(guī)模制備NIF。另外,本發(fā)明提供了一種制備重組蛋白質(zhì)的通用方法,包括在無動(dòng)物成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞,特別是CHO細(xì)胞,它們表達(dá)外源性重組蛋白。
背景技術(shù):
和引言NIF是作為嗜中性粒細(xì)胞活性的特異性抑制劑的蛋白質(zhì)。嗜中性粒細(xì)胞是被稱為粒細(xì)胞的細(xì)胞類型組的一員,粒細(xì)胞是細(xì)胞的白細(xì)胞家族的一個(gè)亞類。
嗜中性粒細(xì)胞在宿主抵抗微生物攻擊的防御系統(tǒng)中是一個(gè)重要的組成。在對(duì)損傷位點(diǎn)細(xì)胞釋放的可溶性炎癥介體的應(yīng)答中,嗜中性粒細(xì)胞從血流進(jìn)入受損組織區(qū)域,當(dāng)活化時(shí),通過吞噬作用和/或釋放細(xì)胞毒性化合物,例如氧化劑、蛋白酶和細(xì)胞因子殺死外源細(xì)胞。雖然嗜中性粒細(xì)胞的作用對(duì)于抵抗感染是重要的,但也知道它們損傷宿主組織。嗜中性粒細(xì)胞會(huì)引起異常炎癥應(yīng)答,從而會(huì)在血管壁或未損傷組織中釋放毒性物質(zhì),導(dǎo)致顯著的組織損傷。另外,粘附在毛細(xì)血管壁或在微靜脈中聚集的嗜中性粒細(xì)胞可產(chǎn)生局部缺血的組織損傷。
異常炎癥應(yīng)答與各種臨床疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān),包括成人呼吸窘迫綜合征(ARDS);心肌梗塞后的局部缺血-再灌注損傷、休克、中風(fēng)和器官移植;急性和慢性同種異體移植排斥;脈管炎;敗血癥;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎;頭部創(chuàng)傷;和炎癥性皮膚疾病。Harlan等,Immunol.Rev.1145(1990)。
已報(bào)道NIF抑制的特別活性之一是嗜中性粒細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。
用重組方法制備了從鉤蟲和相關(guān)物種,特別是犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)中分離的某些NIF,Moyle等,J.Biol.Chem.26910008-15(1994)。當(dāng)從寄生蟲中分離時(shí),NIF是糖蛋白。報(bào)道了某些表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)生的重組NIF,它們顯示翻譯后糖基化和唾液酸化。
已報(bào)道NIF抑制嗜中性粒細(xì)胞活性的其它方面,包括過氧化氫的釋放,超氧化陰離子的釋放,髓過氧化物酶的釋放,彈性蛋白酶的釋放,同型嗜中性粒細(xì)胞聚集,對(duì)彈性表面的粘附,對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附,趨化作用,穿過內(nèi)皮細(xì)胞單層遷移和吞噬作用。特別是NIF在大鼠中風(fēng)的重灌注模型中顯示了有效減少梗塞體積的作用。Jiang等,Ann.Neurology,38935-942(1995);Jiang等,Brain Res.,78825-34(1998)。
在美國專利號(hào)5,919,900,1999年7月6日提交,美國專利號(hào)5,747,296,1998年5月5日提交和美國專利號(hào)5,789,178,1998年8月4日提交中更詳細(xì)描述了一些嗜中性粒細(xì)胞抑制因子和從天然來源分離它們,以及通過重組方法克隆它們的方法。這些專利文件在此完整引入以供參考。
迄今,在含有牛血清清蛋白的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)了表達(dá)NIF的細(xì)胞。見例如美國專利號(hào)5,919,900。
作為一般事件,培養(yǎng)表達(dá)重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞最通常是在含有動(dòng)物衍生的血清,或動(dòng)物提取的蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中進(jìn)行的。然而,由于對(duì)使用動(dòng)物成分,特別是對(duì)于病原體對(duì)牛產(chǎn)品的污染,包括對(duì)爆發(fā)牛海綿狀腦病(BSE)的生物的污染愈來愈關(guān)注,需要一種沒有動(dòng)物成分,例如血清和蛋白質(zhì)的生長培養(yǎng)基。在美國專利號(hào)5,122,469中,描述了無血清培養(yǎng)基。然而,無血清培養(yǎng)基常常不對(duì)細(xì)胞生長、蛋白質(zhì)生產(chǎn)和翻譯后修飾進(jìn)行優(yōu)化。
本發(fā)明提供了無動(dòng)物血清和無動(dòng)物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基,以及用所述無血清和無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基制備NIF,以提供高產(chǎn)量的NIF的方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明針對(duì)一種制備嗜中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)的方法,包括步驟在無動(dòng)物成分的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)NIF的細(xì)胞系。優(yōu)選本發(fā)明產(chǎn)生的NIF是一種257個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),成熟NIF-1FL(也稱為“NIF1”)(SEQ ID NO3)。如此產(chǎn)生的NIF被糖基化,并具有約38.3-64.1kDa的相對(duì)分子量。聚糖結(jié)構(gòu)通常是分枝的,可用唾液酸殘基加帽。糖基化程度可變,但優(yōu)選產(chǎn)生的NIF具有一、二、三和四天線聚糖結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選產(chǎn)生的NIF約5-25%一唾液酸化,約10-30%二唾液酸化,約15-35%三唾液酸化,約15-45%四唾液酸化和約1-20%非唾液酸化。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方面,表達(dá)NIF的細(xì)胞系是中國倉鼠卵巢(“CHO”)細(xì)胞系,它含有NIF基因,更優(yōu)選是非錨定依賴的細(xì)胞系。
根據(jù)本發(fā)明的最優(yōu)選方面,細(xì)胞系是CHO-K1細(xì)胞系(ATCC CCL-61),通過用表達(dá)NIF1基因的谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亞胺共擴(kuò)增載體pEE14轉(zhuǎn)染改良。WO87/04462和89/10404描述了重組DNA序列、載體和在表達(dá)系統(tǒng)中使用谷氨酰胺合成酶系統(tǒng)。
根據(jù)本發(fā)明的過程和方法所用的最優(yōu)選細(xì)胞系是細(xì)胞系PFG01(ATCC PTA-2503)。
表達(dá)NIF的最優(yōu)選細(xì)胞系的制備和培養(yǎng)如下文實(shí)施例1和2所述。
本發(fā)明的優(yōu)選例是其中無動(dòng)物成分的生產(chǎn)生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液(ii)次黃嘌呤鈉(iii)胸苷;和(iv)酵母提取物。
“CHO-III-PFM”指對(duì)于懸浮培養(yǎng)CHO細(xì)胞優(yōu)化的無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基,它不含次黃嘌呤和胸苷,購自Life Technologies(Grand Island,NY)。“CHO-III-PFM葡萄糖溶液”指添加葡萄糖制備的CHO-III-PFM培養(yǎng)基,一種也購自LifeTechnologies的制備物。優(yōu)選的CHO-III-PFM/葡萄糖溶液是定制配方號(hào)98-0289(Life Technologies,Rockville,MD,Grand Island,NY,Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA的子公司),它是具有額外的葡萄糖(3.45g/L D-葡萄糖)的CHO-III-PFM/葡萄糖溶液,不含次黃嘌呤、胸苷或L-谷氨酰胺。
CHO-III-PFM/葡萄糖溶液本身是無動(dòng)物成分的(無動(dòng)物血清和動(dòng)物蛋白質(zhì))。然而應(yīng)注意到,其它無動(dòng)物成分,具有上述性質(zhì)并摻入CHO-III-PFM培養(yǎng)基的成分的市售CHO細(xì)胞培養(yǎng)基也可用于本發(fā)明的范圍。
優(yōu)選酵母提取物以商品名Bacto(Difco/Becton-Dickinson)購得。也可使用其它市售酵母提取物。
可在培養(yǎng)基中加入酚紅溶液,優(yōu)選其約0.5%w/v的溶液作為肉眼pH指示劑。這種酚紅溶液更優(yōu)選以約0-3.0ml/l培養(yǎng)基的量使用。
本發(fā)明更優(yōu)選的實(shí)施例是其中無動(dòng)物成分生產(chǎn)生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii每升(i)約50-100μmol次黃嘌呤鈉;(iii)每升(i)約8-32μmol胸苷;和(iv)每升(i)約0.5-5.0克酵母提取物。
根據(jù)優(yōu)選方面,加入次黃嘌呤鈉和胸苷作為10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液。優(yōu)選每升(i)加入約5-20ml次黃嘌呤鈉/胸苷溶液。
本發(fā)明的最優(yōu)選例是其中無動(dòng)物成分生產(chǎn)生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)每升(i)約10.0ml 10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;和(iii)每升(i)約1.5g酵母提取物。
可任選的可在培養(yǎng)基中加入每升(i)約0.5ml 0.5%w/v的酚紅溶液。
本發(fā)明還針對(duì)制備嗜中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)的方法,包括步驟(i)提供接種物,該接種物是通過在無動(dòng)物成分的接種生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)NIF的細(xì)胞系制備的;和(ii)將所述接種物轉(zhuǎn)移到含有無動(dòng)物成分生產(chǎn)生長培養(yǎng)基的容器內(nèi)。
根據(jù)本發(fā)明該方面的優(yōu)選例,接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)次黃嘌呤鈉;(iii)胸苷;(iv)氨基酸溶液,含有選自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-甲硫氨酸;(v)可任選的,L-甲硫氨酸磺亞胺(“MSX”);和(vi)L-半胱氨酸。
可任選的,可在該接種培養(yǎng)基中加入含有酚紅的溶液,優(yōu)選約0.5%w/v酚紅的溶液,用作肉眼pH指示劑;優(yōu)選溶液以約0-0.3ml/升培養(yǎng)基的量加入。
本發(fā)明的該方面的更優(yōu)選例是其中接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;
(ii)每升(i)約50-100μmol次黃嘌呤鈉;(iii)每升(i)約8-32μmol胸苷;(iv)每升(i)加入下列指定量的氨基酸L-天冬氨酸(約15-90mg)、L-谷氨酸(約12-75mg)、L-天冬酰胺(約50-300mg)、L-脯氨酸(約6-38mg)、L-絲氨酸(約15-90mg)和L-甲硫氨酸(約7-45mg);(v)每升(i)約0-75μmol L-甲硫氨酸磺亞胺(MSX);和(vi)每升(i)約10-40mg半胱氨酸。
(iv)的氨基酸可以方便地以作為每升(i)約5-30ml的氨基酸溶液加入,該溶液含有L-天冬氨酸(約3.0g/L)、L-谷氨酸(約2.5g/L)、L-天冬酰胺(約10.00g/L)、L-脯氨酸(約1.25g/L)、L-絲氨酸(約3.0g/L)和L-甲硫氨酸(約1.50g/L)??扇芜x的加入MSX,其量為每升(i)約0.5-3ml 25mM的L-甲硫氨酸磺亞胺(MSX)溶液,以得到每升約12.5-75μmol MSX。可方便地以約5-20ml 10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液加入次黃嘌呤鈉和胸苷。
本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施例是其中接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PPM/葡萄糖溶液;(ii)每升(i)約10.0ml的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;(iii)每升(i)約20.0ml氨基酸溶液,含有L-天冬氨酸(約3.0g/L)、L-谷氨酸(約2.5g/L)、L-天冬酰胺(約10.0g/L)、L-脯氨酸(約1.25g/L)、L-絲氨酸(約3.0g/L)和L-甲硫氨酸(約1.50g/L);(iv)可任選的每升(i)約1.0ml 25mML-甲硫氨酸磺亞胺(MSX)溶液;和(v)每升(i)約25.0mg L-半胱氨酸??扇芜x的,可在接種培養(yǎng)基中每升(i)加入約0.5ml約0.5%w/v的酚紅。
本發(fā)明還涉及一種上述的無動(dòng)物成分生長培養(yǎng)基。另外,本發(fā)明涉及無動(dòng)物成分接種生長培養(yǎng)基。
另外,本發(fā)明還涉及一種制備重組蛋白質(zhì)的方法,包括在本發(fā)明的無動(dòng)物成分生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)外源重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在優(yōu)選例中,哺乳動(dòng)物細(xì)胞是被谷氨酰胺合成酶質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞,該質(zhì)粒含有具有重組蛋白DNA編碼區(qū)的核酸分子。優(yōu)選載體是谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亞胺共擴(kuò)增載體,例如pEE14或pEE14.1(Lonza Biologics,Slough,UK)。
定義“嗜中性粒細(xì)胞抑制因子”或“NIF”指可從天然來源分離或用重組方法制備的蛋白質(zhì)。嗜中性粒細(xì)胞抑制因子是一種蛋白質(zhì),它既不是抗體,整聯(lián)蛋白或選擇蛋白家族的成員,也不是粘著蛋白的免疫球蛋白超家族的成員,當(dāng)從寄生蟲分離時(shí),它被糖基化。重組NIF可以或可以不是糖基化的,或可以是糖基化到不同程度的;這可以通過用于生產(chǎn)重組NIF的表達(dá)系統(tǒng)和/或培養(yǎng)條件影響。
NIF1或成熟NIF-1FL指一種以NIF-1FL(SEQ ID NO2)的形式表達(dá),然后在合成后被切割(當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)),得到成熟NIF-1FL或NIF1(SEQ ID NO3)的蛋白質(zhì)。
“NIF1cr”指NIF1的編碼序列。
術(shù)語“NIF基因”指編碼嗜中性粒細(xì)胞抑制因子的核酸分子。在美國專利號(hào)5,919,900中描述了一些編碼NIF的核酸分子。
術(shù)語“表達(dá)NIF的細(xì)胞系”指被編碼NIF的核酸分子轉(zhuǎn)化,從而表達(dá)嗜中性粒細(xì)胞抑制因子的細(xì)胞系。
細(xì)胞系PFG01是CHO-K1(ATCC-CCL-61)細(xì)胞系,它被表達(dá)NIF1基因的谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亞胺共擴(kuò)增載體pEE14轉(zhuǎn)染。Pfizer Inc.,一家Delaware公司,在紐約州紐約東42街235號(hào)營業(yè),在美國典型培養(yǎng)物保藏中心于2000年9月27日保藏了細(xì)胞系PFG01(ATCC PTA-2503)。
術(shù)語“CHO-III-PFM/葡萄糖溶液”指由Life Technologies(Grand Island,NY;PFM=無蛋白培養(yǎng)基)生產(chǎn)的生長培養(yǎng)基,其中加入對(duì)于CHO細(xì)胞培養(yǎng)特別開發(fā)的葡萄糖。
術(shù)語“酵母提取物”指一種復(fù)雜的補(bǔ)充物,其中含有從酵母細(xì)胞提取的肽,且是不含動(dòng)物衍生的化合物。
附圖簡述
圖1描述了NIF1(SEQ ID NO1)的編碼序列,對(duì)應(yīng)的氨基酸翻譯(SEQ ID NO2)和成熟NIF1的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。核苷酸從5’-末端開始編碼,氨基酸從成熟多肽的起始處開始編碼(SEQ ID NO3)(標(biāo)出了N-末端Asn)。沿左手空白的數(shù)字表示每行第一個(gè)輸入的核酸序列的核苷酸數(shù)目或成熟NIF1序列的氨基酸數(shù)目(黑體)。在用氨基酸測序鑒定的肽下方劃線。肽T-20(SEQ ID NO4)、T-22(SEQ IDNO5)、D-96(SEQ ID NO6)和D-102(SEQ ID NO7)在最初和隨后的克隆中用作正向和反向引物。下方的核苷酸序列代表在拯救用于克隆入BSII穿梭載體(SEQ IDNO8)的編碼區(qū)時(shí),PCR引物加入的核苷酸。該圖代表用{BSII/}{pEE14}{pSG5}NIF1cr構(gòu)建物的兩條DNA鏈測定的序列。
圖2描述了如鉤蟲mRNA制備物獲得的,在將cDNA克隆入λgt10/EcoRI載體,然后亞克隆入BSII拯救載體后獲得的全長cDNA序列(SEQ ID NO9)。用Sanger二脫氧核苷酸測序法確定NIF1的核苷酸序列。左側(cè)空白的數(shù)字表示從序列5’-末端的核苷酸編號(hào)。用黑體標(biāo)出的核苷酸(33-1137)(SEQ ID NO1)代表NIF1的編碼區(qū)。
圖3是產(chǎn)NIF細(xì)胞系構(gòu)建物的示意圖,并描述了從NIF1 cDNA到用于轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞的pEE14載體的途徑。
圖4描述了用于構(gòu)建NIF表達(dá)細(xì)胞系的pEE14表達(dá)載體構(gòu)建物。如其名稱所示,pEE14/NIF1cr表達(dá)質(zhì)粒衍生自廣泛使用的9.4kb pEE14表達(dá)載體(LonzaBiologics,Slough,UK)。pEE14載體含有(1)人CMV主要立即早期啟動(dòng)子(hCMV-MIE),(2)多克隆位點(diǎn)(MCS),(3)SV40早polyA位點(diǎn)(pA),(4)Col E1復(fù)制起始點(diǎn)(Col E1),(5)氨芐青霉素抗性基因(Amp),和(6)SV40晚期啟動(dòng)子(SV40L),它驅(qū)動(dòng)谷氨酰胺合成酶小基因(GS-小基因)。在該圖中標(biāo)出了多克隆位點(diǎn)中的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。5’HindIII插入位點(diǎn)在MCS的稍5’位置。
圖5描述了在克隆過程中(SEQ ID NO10和11)摻入編碼序列兩端的插入物(上方,側(cè)接“NIF1cr”)的其它非編碼序列(下方)。顯示插入序列的5’-末端在pEE14表達(dá)載體中從HindIII位點(diǎn)(圖4中未顯示該位點(diǎn))開始,它與pBluescriptII穿梭載體(“BSII”)多接頭的5’-HindIII位點(diǎn)的互補(bǔ)序列連接。5’HindIII位點(diǎn)后是EcoRI位點(diǎn),由5’-PCR NIF1cr拯救引物提供,用于將NIF1cr序列克隆入BSII。NIF1的NIF1編碼區(qū)域序列從該EcoRI位點(diǎn)開始,延伸大約850個(gè)核苷酸。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法可如下進(jìn)行。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是它在任何培養(yǎng)基,包括接種生長培養(yǎng)基,生產(chǎn)生長培養(yǎng)基和營養(yǎng)物進(jìn)料中不涉及使用動(dòng)物成分。由于對(duì)于在藥物生產(chǎn)中使用動(dòng)物衍生的物質(zhì)愈來愈關(guān)注(例如,擔(dān)心BSE(牛海綿狀腦病)的傳播),該優(yōu)點(diǎn)是顯著的。另外,與先前使用含動(dòng)物衍生的成分的培養(yǎng)基的方法相反,本發(fā)明的方法具有短幾天的生產(chǎn)期,通常得到高3-4倍的合適糖基化的NIF滴度。
優(yōu)選細(xì)胞系和NIF優(yōu)選用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系,更優(yōu)選衍生自CHO-K1(ATCC CCL-61)的重組中國倉鼠卵巢細(xì)胞系,該細(xì)胞系被NIF-表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化,優(yōu)選含有NIF1 DNa的pEE14載體(Lonza Biologics;含有HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI和BcII克隆位點(diǎn)的谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亞胺共擴(kuò)增載體,其中載體表達(dá)谷氨酰胺合成酶和克隆基因)(實(shí)施例1)實(shí)施本發(fā)明。
產(chǎn)NIF細(xì)胞系的構(gòu)建根據(jù)產(chǎn)生重組蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)物的建立方法,它們是本領(lǐng)域已知的,公開于美國專利號(hào)5,919,900;5,747,296;5,789,178;5,591,639;5,658,759;5,849,522;5,122,464;5,770,359;和5,827,739;國際專利出版號(hào)WO 87/04462;WO 89/01036;WO 86/05807和WO 89/10404;Bebbington等,Bio/Technology,10169-175(1992),它們?cè)诖巳客暾胍怨﹨⒖肌?br>
應(yīng)該優(yōu)選選擇細(xì)胞系并在使用前改造,使其容易形成懸浮培養(yǎng)物,因此不是錨定依賴的,并可從經(jīng)過幾代后戒除含動(dòng)物血清和動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。一般實(shí)現(xiàn)這種改造的方法可以通過如下文實(shí)施例2所述的類似地培養(yǎng)細(xì)胞系來進(jìn)行。
稱為PFG01(ATCC PTA-2503)的細(xì)胞系對(duì)本發(fā)明的方法是優(yōu)選的。PFG01細(xì)胞系衍生自CHO-K1細(xì)胞系(ATCC CCL-61),如下文實(shí)施例1和2所述。PFG01細(xì)胞系是通過用含有NIF1基因的pEE14質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞系(ATCC CCL-61)建立的。通過從錨定依賴性品系和使重組細(xì)胞戒除牛血清,產(chǎn)生懸浮培養(yǎng)物,完成PFG01細(xì)胞系的開發(fā)。
可根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生用上述方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的任何NIF。優(yōu)選本發(fā)明方法產(chǎn)生的NIF是257氨基酸蛋白質(zhì),成熟NIF-1FL(NIF1)(SEQ ID NO3),如圖1所述。NIF1是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)生的,作為糖基化和唾液酸化的蛋白質(zhì),具有約38.3-64.1kDa的相對(duì)分子量。根據(jù)優(yōu)選方面,NIF1是作為41kD糖蛋白表達(dá)的,其中約30%-50%的分子量是由糖基團(tuán)(聚糖)寡糖構(gòu)成的,它們可以是分支或用唾液酸殘基加帽的。該特別的NIF在Moyle等,見上中詳述;另見R.Webster等,Xenobiotica,291141-1155(1999)和其中引用的文獻(xiàn)。
NIF的制備根據(jù)本發(fā)明制備NIF的方法涉及通過用無動(dòng)物成分的接種生長培養(yǎng)基制備接種物,將接種物懸浮在含有生產(chǎn)生長培養(yǎng)基的容器中,維持活細(xì)胞的培養(yǎng)物并收集NIF產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中,通過培養(yǎng)PFG01細(xì)胞的培養(yǎng)物產(chǎn)生接種培養(yǎng)物,然后用于“接種”生產(chǎn)反應(yīng)器。該接種培養(yǎng)物是在搖瓶或容器中產(chǎn)生的,一般尺寸比實(shí)際的生產(chǎn)容器要小。
起始的種子細(xì)胞一最初懸浮在預(yù)溫的接種生長培養(yǎng)基中。如果種子細(xì)胞是冷凍的,在約30-38℃之間的水浴中融化表達(dá)NIF的種子細(xì)胞,優(yōu)選PFG01細(xì)胞系(表達(dá)NIF1)的種子細(xì)胞,直到冰沉淀幾乎完全融化。融化的試管一般轉(zhuǎn)移到生物安全容器裝置或箱中,用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)試管外部消毒,例如用酒精棉擦拭等。
然后在預(yù)溫的接種生長培養(yǎng)基中懸浮細(xì)胞,它含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)次黃嘌呤鈉,優(yōu)選每升(i)約50-100μmol;(iii)胸苷,優(yōu)選每升(i)約8-32μmol;(iv)氨基酸溶液,含有選自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-甲硫氨酸;(v)可任選的L-甲硫氨酸磺亞胺;和(vi)L-半胱氨酸。
根據(jù)優(yōu)選方面,接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液,優(yōu)選Life Technologies,定制配方號(hào)98-0289,加入3.45g/L D-葡萄糖;不含次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺;(ii)次黃嘌呤鈉/胸苷溶液,優(yōu)選HT補(bǔ)充物(100×)(Life Technologies,目錄號(hào)11067-030);(iii)氨基酸溶液,優(yōu)選氨基酸選自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-甲硫氨酸;(iv)可任選的L-甲硫氨酸磺亞胺;和(v)L-半胱氨酸溶液。
可任選地,可在培養(yǎng)基中加入含有酚紅溶液,優(yōu)選約0.5%w/v的溶液作為肉眼pH指示劑。更優(yōu)選以每升培養(yǎng)基約0-3.0ml 0.5%w/v的量加入。
上述氨基酸溶液可方便地通過將氨基酸溶于去離子水,用堿水溶液,優(yōu)選氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至約8.0,然后無菌過濾制備。
MSX溶液可以通過將MSX溶于去離子水,用0.2微米濾膜過濾溶液制備。將MSX溶液等份置于無菌試管中,在一定溫度,優(yōu)選5℃以下可保存三個(gè)月或更長。
更優(yōu)選的接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液(Life Technologies,定制配方號(hào)98-0289;含有3.45g/L D-葡萄糖;不含次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺);(ii)每升(i)約5-20ml的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;(iii)每升(i)所述量的氨基酸溶液L-天冬氨酸(約15-90mg)、L-谷氨酸(約12-75mg)、L-天冬酰胺(約50-300mg)、L-脯氨酸(約6-38mg)、L-絲氨酸(約15-90mg)和L-甲硫氨酸(約7-45mg);更優(yōu)選通過每升(i)加入約5-30ml氨基酸溶液加入氨基酸,該溶液含有L-天冬氨酸(3.0g/L;22.5mM)、L-谷氨酸(2.50g/L;17.0mM)、L-天冬酰胺(10.00g/L;75.7mM)、L-脯氨酸(1.25g/L;10.9mM)、L-絲氨酸(3.0g/L;28.5mM)和L-甲硫氨酸(1.50g/L;10.1mM);(iv)可任選的每升(i)約12.5-25μmol L-甲硫氨酸磺亞胺,如果加入,優(yōu)選每升(i)約0.5-3ml 25mM的L-甲硫氨酸磺亞胺(MSX)溶液;和(v)每升(i)約10-40mg L-半胱氨酸。
最優(yōu)選的接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液(Life Technologies,定制配方號(hào)98-0289;含有3.45g/L D-葡萄糖;不含次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺);(ii)每升(i)約10.0ml的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;(iii)每升(i)約20.0ml氨基酸溶液,含有L-天冬氨酸(約3.0g/L)、L-谷氨酸(約2.5g/L)、L-天冬酰胺(約10.00g/L)、L-脯氨酸(約1.25g/L)、L-絲氨酸(約3.0g/L)和L-甲硫氨酸(約1.50g/L);(iv)可任選的每升(i)約1.0ml 25mM的L-甲硫氨酸磺亞胺(MSX)溶液;和(v)每升(i)約25.0mg L-半胱氨酸。
然后將得到的接種生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移入搖瓶或其它容器,用于建立接種物,將種子細(xì)胞懸浮于其中。
在開始時(shí),可用例如臺(tái)盼藍(lán)染料排除法對(duì)接種培養(yǎng)物采樣并計(jì)數(shù),以確定細(xì)胞濃度和存活率,如《細(xì)胞和組織培養(yǎng)生物技術(shù)中的實(shí)驗(yàn)室方法》,(Cell andTissue CultureLaboratory Procedures in Biotechnology)A.Doyle和J.B.Griffiths編(John Wiley & Sons,Ltd.,1998)所述。如果細(xì)胞濃度大于約7.0×105活細(xì)胞/ml(“vc/ml”),可加入更多預(yù)溫的生長培養(yǎng)基,以實(shí)現(xiàn)在約2.0×105-6.0×105vc/ml范圍內(nèi)的最終濃度,但優(yōu)選約5.0×105vc/ml的濃度。
然后可在約30-38℃,優(yōu)選約36.5±1℃;約2-10%,優(yōu)選5±1%的CO2濃度,在約40-90%,優(yōu)選70±5%的相對(duì)濕度下;攪拌速率約50-200rpm,優(yōu)選150±20rpm(偏心距離=直徑3/8英寸),攪拌培養(yǎng)搖瓶或容器。每天對(duì)搖瓶取樣,監(jiān)測細(xì)胞濃度和存活率。每天加入更多預(yù)溫的生長培養(yǎng)基,維持2.0×105-6.0×105vc/ml,優(yōu)選約5.0×105vc/ml的濃度。如果再加入培養(yǎng)基超出容器的體積,或細(xì)胞密度達(dá)到約1.0×106vc/ml,將培養(yǎng)物分層兩份或多份培養(yǎng)物,可以在新的容器中稀釋到約5.0×105vc/ml。
隨后,每次細(xì)胞密度達(dá)到約1.0×106vc/ml,應(yīng)將培養(yǎng)物在其它容器中分成約2.0×105vc/ml。應(yīng)該重復(fù)該步驟,以擴(kuò)大種子系列,直到達(dá)到足夠的體積以對(duì)于生物反應(yīng)器容器獲得約1.5×105vc/ml-4.0×105vc/ml,優(yōu)選約2.0×105vc/ml的接種密度。接種物比(接種后接種培養(yǎng)物體積/反應(yīng)器液體體積)是約10-20%。接種培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度應(yīng)該在1.0×106vc/ml-2.5×106vc/ml,優(yōu)選約1.0×106vc/ml-1.5×106vc/ml之間。在用于實(shí)際生產(chǎn)期之前,接種培養(yǎng)物的壽命是約3-4天。
就NIF而言,用于實(shí)際生產(chǎn)階段的培養(yǎng)基(生產(chǎn)生長培養(yǎng)基)與用于接種生產(chǎn)的不同。生產(chǎn)反應(yīng)器優(yōu)選以補(bǔ)料-分批條件下操作,即在生產(chǎn)期內(nèi)營養(yǎng)物溶液被連續(xù)送入反應(yīng)器。
NIF生產(chǎn)階段的培養(yǎng)基(生產(chǎn)生長培養(yǎng)基)含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)次黃嘌呤鈉;(iii)胸苷;和(iv)酵母提取物。
次黃嘌呤鈉和胸苷可方便地作為次黃嘌呤鈉/胸苷溶液加入,優(yōu)選作為HT補(bǔ)充物(100×)(Life Technologies,目錄號(hào)11067-030)加入。
優(yōu)選生產(chǎn)生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii每升(i)約50-100μmol次黃嘌呤鈉;(iii)每升(i)約8-32μmol胸苷;和(iv)每升(i)約0.5-5.0克酵母提取物。
CHO-III-PFM/葡萄糖溶液優(yōu)選是Life Technologies,定制配方98-0289;含有3.45g/L D-葡萄糖;不含次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺。
可任選的,為了促進(jìn)pH測定可加入酚紅,優(yōu)選約0.5%w/v酚紅的溶液;更優(yōu)選約0-3.0ml/升培養(yǎng)基,最優(yōu)選每升培養(yǎng)基約0.5ml溶液的量。
更優(yōu)選的生產(chǎn)生長培養(yǎng)基包括(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液,由Life Technologies生產(chǎn),定制配方號(hào)98-0289;含有3.45g/L D-葡萄糖;不含次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺;(ii)每升(i)約5-20ml的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;和(iii)每升(i)約0.5-5.0克酵母提取物。
最優(yōu)選的生長生產(chǎn)培養(yǎng)基包括(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液,由Life Technologies生產(chǎn),定制配方號(hào)98-0289;含有3.45g/L D-葡萄糖;不含次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺;(ii)每升(i)約10.0ml的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;和(iii)每升(i)約1.5克酵母提取物。
優(yōu)選在生產(chǎn)階段的過程中用兩種營養(yǎng)物進(jìn)料,以滿足培養(yǎng)物有利的生長速率需要的物質(zhì)。一種營養(yǎng)物進(jìn)料是葡萄糖進(jìn)料(營養(yǎng)物進(jìn)料1),其濃度是約100-500g/L。該葡萄糖進(jìn)料用于將反應(yīng)器中的葡萄糖濃度維持在約0.1-5.0g/L,優(yōu)選約2.0g/L。該進(jìn)料通常以每天約0.0-6.0g葡萄糖/L培養(yǎng)基的速率,用合適的泵或其它裝置加入,使葡萄糖隨時(shí)間分散。
第二種營養(yǎng)物進(jìn)料(營養(yǎng)物進(jìn)料2)含有(i)CHO-III-PFM(5倍濃度或“5X”)溶液(Life Technologies生產(chǎn),定制配方99-0180;僅含1X(由于溶解度原因1倍)L-半胱氨酸,3X(由于溶解度原因3倍)L-酪氨酸;不含葡萄糖、次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉或氯化鈉);(ii)每升(i)25-100ml 10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;和(iii)每升(i)5-20g酵母提取物。更優(yōu)選營養(yǎng)物進(jìn)料含有(i)CHO-III-PFM(5X)溶液(Life Technologies生產(chǎn),定制配方99-0180(5X));含1×L-半胱氨酸,3×L-酪氨酸;不含葡萄糖、次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、氯化鈉;(ii)每升(i)50ml 10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;和(iii)每升(i)7.5g酵母提取物。第二種進(jìn)料是通過在CHO-III-PFM(5X)溶液中加入10mM次黃嘌呤/1.6mM胸苷溶液,優(yōu)選HT補(bǔ)充物100X(Life Technology)和酵母提取物,溶解并混合成分,用氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到約6.8-7.6,然后無菌過濾最終溶液。第二種進(jìn)料溶液在約48小時(shí)開始,以每天接種時(shí)約5-50ml/升培養(yǎng)物的速率連續(xù)供給反應(yīng)器。該添加對(duì)于實(shí)現(xiàn)NIF的高產(chǎn)率和可接受的產(chǎn)物質(zhì)量是必需的。
在2升Wheaton生物反應(yīng)器(B.Braun Biotech Inc.,Allentown,PA),通過Foxboro IA(Intelligence Application)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(Foxboro Company,F(xiàn)oxboro,MA)控制進(jìn)行本發(fā)明的過程,然而可用任何可消毒容器作為生物反應(yīng)器,只要它具有充分的攪拌能力,足夠的進(jìn)料入口,兩個(gè)用于營養(yǎng)物進(jìn)料,一個(gè)用于pH控制和一個(gè)采樣口,配備氣體入口,可使用沖洗功能。容器應(yīng)該能允許足夠的在線過程控制。優(yōu)選容器是可透光或具有被遮蓋以防止環(huán)境光線直接照射的性質(zhì)。容器消毒后,可用無菌調(diào)理溶液漂洗容器,優(yōu)選無谷氨酰胺的DMEM(LifeTechnologies/GibcoBRL;目錄號(hào)11960-044)或Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽(LifeTechnologies/GibcoBRL,目錄號(hào)14190-136)。在足夠的時(shí)間后,根據(jù)容器大小,用新鮮的無菌的生產(chǎn)培養(yǎng)基更換漂洗培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基溫度穩(wěn)定在約30-38℃,優(yōu)選約36.5±1℃,如需要在接種前pH應(yīng)調(diào)節(jié)到約6.8-7.6,優(yōu)選的7.4的pH。加入的接種培養(yǎng)物的體積優(yōu)選在反應(yīng)器中建立約1.0×105活細(xì)胞/ml-5.0×105活細(xì)胞/ml,優(yōu)選2.0×105活細(xì)胞/ml的初始目標(biāo)接種物密度。
應(yīng)以約50-200rpm的速率攪拌容器的內(nèi)容物,視容器大小和幾何形狀以及使用的葉輪而定,充分完全混合容器內(nèi)容物?;蛘?,應(yīng)以實(shí)現(xiàn)相同程度混合的方式攪拌容器的內(nèi)容物。生產(chǎn)培養(yǎng)物的pH應(yīng)該通過合適的控制試劑,它不影響細(xì)胞培養(yǎng)物的存活率和活力,維持在約6.8-7.6,優(yōu)選約7.40±0.05的范圍內(nèi)。對(duì)本發(fā)明而言,優(yōu)選CO2氣體和約7.5%(w/v)NaHCO3的溶液作為pH控制劑。然而,還可成功地使用其它常用堿溶液,例如NaHCO3和Na2CO3的混合液或稀NaOH。
溶解氧濃度應(yīng)該用合適的控制劑維持在約10-100%空氣飽和度,優(yōu)選約60±5%空氣飽和度。生產(chǎn)培養(yǎng)物的溫度應(yīng)維持在約30-38℃,優(yōu)選約36.5±1℃。生產(chǎn)培養(yǎng)基的葡萄糖濃度優(yōu)選通過葡萄糖進(jìn)料溶液(營養(yǎng)物進(jìn)料1)維持在約0.1-5.0g/l,優(yōu)選約2.0g/l±0.5g/l的范圍內(nèi),該營養(yǎng)物每隔一段時(shí)間以少量加入,維持所需的水平。
為了控制pH和溶解氧,可將二氧化碳?xì)怏w和/或氧氣和/或空氣和/或氮?dú)鈬娙肱囵B(yǎng)物中。氮?dú)饣蚩諝饪蓪?dǎo)向頂部空間,以輔助溶解氧控制和/或減少泡沫產(chǎn)生。
營養(yǎng)物進(jìn)料2以每天接種時(shí),約5-50ml/升培養(yǎng)物的速率,優(yōu)選以每天接種時(shí),約25ml/升培養(yǎng)物的速率連續(xù)進(jìn)料,該進(jìn)料應(yīng)該與葡萄糖進(jìn)料同時(shí)開始,通常是在約48小時(shí)時(shí)。
生產(chǎn)培養(yǎng)物應(yīng)在接種后立即采樣。通常立即測定下列參數(shù)最初細(xì)胞密度和存活率;離線pH;初始葡萄糖濃度;初始乳酸鹽濃度;初始氨濃度和初始重量克分子滲透壓濃度。如需要應(yīng)調(diào)節(jié)在線pH。生物反應(yīng)器容積應(yīng)優(yōu)選是不透光的或用不透明的遮光罩遮住,以防止生產(chǎn)培養(yǎng)基與光接觸。通常每天對(duì)生產(chǎn)培養(yǎng)物采樣測定下列參數(shù)細(xì)胞密度;培養(yǎng)物存活率;離線pH;葡萄糖濃度;乳酸鹽濃度;氨濃度;重量克分子滲透壓濃度和NIF濃度,純化或鑒定。
葡萄糖濃度應(yīng)用營養(yǎng)物進(jìn)料1維持在約0.1-5.0g/l,優(yōu)選約1.5-2.5g/l。通常約48小時(shí)后用定量泵與開/關(guān)計(jì)時(shí)器,以30分鐘循環(huán)以初始進(jìn)料速率2.0g/(1-天),或約2.0-3.0g葡萄糖/109活細(xì)胞/天。如需要應(yīng)每天調(diào)節(jié)葡萄糖進(jìn)料速率。葡萄糖消耗率通常隨培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間改變,但所需的進(jìn)料速率通常維持在約0.0-6.0g/1-天的范圍內(nèi)。營養(yǎng)物進(jìn)料2通常在約48小時(shí)時(shí)開始。
本發(fā)明的方法在2升攪拌罐生物反應(yīng)器中,和在10,50,100升攪拌罐中成功地進(jìn)行,因此實(shí)際上可以任何規(guī)模進(jìn)行。在攪拌罐反應(yīng)器中,使用PFG01細(xì)胞系,可在約11天中重復(fù)實(shí)現(xiàn)約4.0單位/毫升的NIF滴度。比較翻譯后唾液酸化/糖基化和大鼠藥物動(dòng)力學(xué)(PK)研究后,產(chǎn)生的NIF1的產(chǎn)品質(zhì)量是高的。用本發(fā)明的方法獲得的NIF的PK研究可以根據(jù)Webster等,見上所述的方法和技術(shù)進(jìn)行。
在實(shí)施例3-8中列出了實(shí)際2升攪拌罐實(shí)驗(yàn)的處理數(shù)據(jù)。在根據(jù)本發(fā)明的方法進(jìn)行的20個(gè)相似反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)中,在11天內(nèi)產(chǎn)生的NIF1的平均濃度是約4.2單位/毫升±0.4單位/毫升,如上述試驗(yàn)所測定的。這些實(shí)驗(yàn)中純化出的樣品顯示可重現(xiàn)的翻譯后修飾(糖基化/唾液酸化)。
NIF滴度的測定在給定樣品中NIF的試驗(yàn)可以通過HPLC層析進(jìn)行,或任何可以測定給定樣品中NIF濃度的其它方法進(jìn)行。
優(yōu)選的HPLC方法利用在分析柱前線路內(nèi)裝配的Rheodyne SS柱入口濾膜(0.5微米)的HPLC柱(Atlantis C5 2.0×50mm,Phenomenex,Torrence CA)。柱附加梯度泵,可變波長紫外檢測器,具有加熱器和冷卻器的自動(dòng)樣品注射器,柱加熱器和數(shù)據(jù)收集綜合系統(tǒng)。使用兩個(gè)流動(dòng)相A和B通常相A是水(J.T.Baker,HPLC級(jí)),乙腈(HPLC級(jí))和三氟乙酸(Sigma,蛋白質(zhì)測序級(jí),無水)的90/10/0.05混合物;B相是乙腈/水/三氟乙酸的90/10/0.04混合物。這些相是通過攪拌900ml和100ml90∶10的組分,然后過濾,攪拌數(shù)分鐘脫氣,轉(zhuǎn)移到儲(chǔ)器內(nèi),最后加入三氟乙酸(0.5或0.4ml),一邊攪拌約10秒鐘制備的。
通常使用的HPLC條件是注射體積20微升(自動(dòng)采樣器中的試管中的樣品維持在20℃);210nm的紫外檢測器;0.4ml/分的初流量;75∶25的寢a-b比;定為30℃的柱加熱器。典型樣品注射運(yùn)行時(shí)間在這些條件下是約44分鐘。
泵通常用梯度程序設(shè)定。典型的梯度程序如下(表I),雖然這可以根據(jù)需要和設(shè)定調(diào)節(jié)表I
從濃縮液制備了NIF的標(biāo)準(zhǔn)樣品,在PBS緩沖液(Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽)中稀釋到已知濃度。0.5ml稀釋液等份可保持冷凍。將等份轉(zhuǎn)移到兩個(gè)自動(dòng)采樣試管中,分別注入。NIF的峰面積取平均數(shù)。(標(biāo)準(zhǔn)濃度/平均峰面積=響應(yīng)因子)。試驗(yàn)樣品中NIF峰的面積乘以響應(yīng)因子得到樣品中的NIF濃度。
從培養(yǎng)物中分離/純化當(dāng)生產(chǎn)容器中的NIF濃度達(dá)到約1.0-8.0單位/毫升的NIF水平(或生產(chǎn)期在約5-20天之間)時(shí),可從培養(yǎng)物中回收NIF。通過離心除去細(xì)胞得到澄清的培養(yǎng)液,然后無菌濾過合適的膜,優(yōu)選0.22微米濾膜聚醚砜(PES)膜。一旦完成過濾,對(duì)澄清培養(yǎng)液進(jìn)行許多純化步驟A.層析步驟1Q瓊脂糖快速流動(dòng)陰離子交換層析含有NIF的澄清液體通過Q瓊脂糖快速流動(dòng)陰離子交換層析柱,其中NIF變?yōu)榕c柱結(jié)合,然后在較高濃度的鹽溶液中洗脫。用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)Q瓊脂糖柱,然后用50mM Na2HPO4/100mM NaCl溶液(pH7.0)平衡。將0.22微米過濾的培養(yǎng)液加到柱上,然后用50mM Na2HPO4/100mM NaCl溶液(pH7.0)洗滌,用50mMNa2HPO4/250mM NaCl溶液(pH7.0)洗脫。
B.濃縮/滲濾步驟1用Pall 10000 MWCO Macrosep單元在離心機(jī)(Sorvall RC5c Plus,HS-4轉(zhuǎn)子,4000rpm,40分鐘)濃縮來自Q瓊脂糖柱的純化的洗脫液。在滲濾期間,濃縮的樣品緩沖液進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的緩沖液加入與20mM Na2HPO4,pH6.0交換,,然后離心。
C.層析步驟2苯基瓊脂糖快速流動(dòng)疏水作用層析用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)苯基瓊脂糖柱,然后用20mM Na2HPO4/1.0M(NH4)2SO4溶液(pH6.0)平衡。在裝樣前在濃縮和滲濾過的Q瓊脂糖洗脫液中加入等體積的20mM Na2HPO4/2.0M(NH4)2SO4溶液(pH6.0)。這樣樣品裝在20mM Na2HPO4,1.0M(NH4)SO4溶液(pH6.0)中。將稀釋的滲濾液加到柱上。NIF不和柱結(jié)合,用20mMNa2HPO4/1.0M(NH4)2SO4溶液(pH6.0)洗滌。
D.濃縮/透析步驟2濃縮來自苯基瓊脂糖柱的純化的洗脫液,然后用Pall 10000 MWCO Macropsep單元在離心機(jī)(sorvall RC5C)Plus,HS-4轉(zhuǎn)子,4000rpm,40分鐘滲濾。在滲濾過程中,濃縮的樣品緩沖液進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的緩沖液加入與25mM CH3CO2Na,pH4.1交換,然后離心。
E.病毒滅活用乙酸將流過后滲濾液的pH調(diào)節(jié)到3.7。樣品在pH3.7維持30-45分鐘,一邊攪拌,重新調(diào)節(jié)到pH4.1,然后濾過Millipore 0.22微米Steriflip濾膜。
F.層析步驟3DEAE瓊脂糖快速流動(dòng)陰離子交換層析在該步驟中,NIF與柱結(jié)合,然后用具有較高鹽濃度的溶液洗脫。用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié)DEAE瓊脂糖快速流動(dòng)陰離子交換柱,然后用25mM CH3CO2Na溶液(pH4.1)平衡。然后將無菌過濾(或DV50-過濾的)材料加到柱上。用25mM CH3CO2Na溶液(pH4.1)洗滌柱,然后用25mM CH3CO2Na/30mM NaCl溶液(pH4.1)或25mMCH3CO2Na/50mM NaCl溶液(pH4.1)洗滌,然后用25mM CH3CO2Na/30mM NaCl溶液(pH4.1)洗脫。洗脫液含有NIF產(chǎn)物。
G.濃縮/滲濾步驟3濃縮來自DEAE瓊脂糖柱的純化的洗脫液,然后用Pall 10000 MWCO Macrosep單元在離心機(jī)(Sorvall RC5C Plus,HS-4轉(zhuǎn)子,4000rpm,40分鐘)中滲濾。在滲濾期間,濃縮的樣品緩沖液進(jìn)行3個(gè)循環(huán)的緩沖液加入與25mM CH3CO2Na,pH7.0交換,然后離心。
糖基化的測定Webster等,Xenobiotica,29(11)1141-1155(1999)描述了測定0,1,2,3和4唾液酸化的百分?jǐn)?shù)的方法,在此引入以供參考。
測定NIF的唾液酸化總程度的方法是使用PA-10柱(Dionex Ion Pac ATC-1流動(dòng)相調(diào)節(jié)器,Dionex CarboPac 4.6×50mm PA-10保護(hù)柱和Dionex Carbopac 4.6×250mm PA-10分析柱),配備Dionex GP40梯度泵、Dionex ED40(用于脈沖電流監(jiān)測模式的EC檢測器)、Dionex AS3500自動(dòng)采樣器和Dionex PeakNet 5.1軟件(用于數(shù)據(jù)獲得和處理)。試驗(yàn)使用兩個(gè)流動(dòng)相A(0.2M NaOH(Fisher)\50mM乙酸鈉(Sigma ACS級(jí))和B(0.2M NaOH)\300mM乙酸鈉)。典型HPLC的運(yùn)行條件是注射體積20微升,PAD檢測(優(yōu)化的糖類波形),流速0.7ml/min,初始流動(dòng)相。A100%,運(yùn)行時(shí)間45分鐘。
泵通常設(shè)定為梯度程序。典型的梯度程序(表II)如下,雖然這可以根據(jù)需要和設(shè)定調(diào)節(jié)
表II
制備濃度為約1.0×10-3單位/毫升的純化的NIF樣品和參比的唾液酸標(biāo)準(zhǔn)。在200微升等份的NIF和參比樣品中加入200微升0.2N HCl。旋轉(zhuǎn)等份并簡單離心,然后80℃加熱1小時(shí)。然后在冰浴中冷卻樣品約10分鐘,接著再次旋轉(zhuǎn)和離心,將它們恢復(fù)到室溫。注射20微升樣品用于分析。然后報(bào)道的結(jié)果作為參比標(biāo)準(zhǔn)的百分?jǐn)?shù)。
嗜中性粒細(xì)胞抑制活性的測定測定嗜中性粒細(xì)胞抑制活性的試驗(yàn)可用于證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞系產(chǎn)生的NIF的質(zhì)量和生物活性,它們是下文列出的塑性粘附試驗(yàn),鈣黃綠素試驗(yàn),過氧化氫釋放試驗(yàn)和ELISA。
A.塑性粘附試驗(yàn)i.嗜中性粒細(xì)胞的分離用一步Ficoll-Hypaque梯度(Mono-poly,ICN Biomedicals,Irvine,CA)從肝素化的靜脈血中分離嗜中性粒細(xì)胞。簡單說,將5ml全血鋪在16×100mm玻璃試管中的3ml Mono-poly分辨培養(yǎng)基上。通過在20℃ 300xg離心60分鐘實(shí)現(xiàn)白細(xì)胞的分離。用Pasteur吸量管收集含有嗜中性粒細(xì)胞的細(xì)胞層,將細(xì)胞懸浮在10體積的冷Dulbeccos改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基(DMEM,Life Technologies Inc.,Gaithersburg MD)。在4℃在200xg沉淀嗜中性粒細(xì)胞10分鐘。將細(xì)胞沉淀的重新懸浮在5ml冷ACK緩沖液(155mM NH4Cl/10mM KHCO3,pH7.4)中,在室溫培養(yǎng)5分鐘,裂解污染的紅血細(xì)胞。然后通過離心并以約107細(xì)胞/毫升重懸浮在HBSS(1.33mm CaCl2,0.5mM MgCl2,0.04mM MgSO4,140mM NaCl,5mM KCl,0.3mM KH2PO4,0.3mM Na2HPO4和5.6mM D-葡萄糖和30mg/l酚紅)洗滌嗜中性粒細(xì)胞一次。通過臺(tái)盼藍(lán)排阻測定細(xì)胞存活率。如自動(dòng)化差相計(jì)數(shù)測定的,這些制備物一致含有大于95%的嗜中性粒細(xì)胞。
ii.塑性粘附試驗(yàn)將激活的人嗜中性粒細(xì)胞與塑性組織培養(yǎng)物粘附,可用標(biāo)準(zhǔn)相差光學(xué)顯微鏡觀測。洗滌一次在上面步驟A中分離的嗜中性粒細(xì)胞,以6.6×106細(xì)胞/毫升重懸浮在冷HAS緩沖液(不含磷酸鈉的RPMI(Life Technologies),1%人血清清蛋白(Calbiochem,San Diego,CA),1.2mM CaCl2,1.0mM MgCl2,10mM HEPES,pH7.3)中。將嗜中性粒細(xì)胞(20微升)置于無菌微離心管中,用PMA(800nM溶液5微升或最終濃度160nM)37℃刺激5分鐘。在含有經(jīng)刺激的細(xì)胞的試管中加入測試樣品(20微升),溫和混合,立即將10微升混合液轉(zhuǎn)移到Terasaki式培養(yǎng)板(Nalge NuncInternational,Naperville,IL)的各孔中。37℃另外5分鐘后,將整個(gè)平板浸入Hanks平衡鹽溶液(JRH Biosciences,Lenexa,KS),用自來水沖洗除去未粘附的細(xì)胞。沖洗/漂洗步驟重復(fù)總共6次。用相差光學(xué)顯微鏡觀察粘附在塑料孔中的細(xì)胞。含有經(jīng)刺激的細(xì)胞和未測試樣品的對(duì)照孔評(píng)分為“++++”,含有經(jīng)刺激的細(xì)胞和單克隆抗體CLB-54(針對(duì)整聯(lián)蛋白CD11b/CD18)的對(duì)照孔評(píng)分為“-”。
B.嗜中性粒細(xì)胞-Huvec粘附(鈣黃綠素)試驗(yàn)用預(yù)先裝有熒光染料鈣黃綠素-AM(乙酰氧基甲酯;Molecular Probes,Eugene,OR)的細(xì)胞監(jiān)測人嗜中性粒細(xì)胞對(duì)HUVEC單層的粘附。用鈣黃綠素如下標(biāo)記人嗜中性粒細(xì)胞。沉淀嗜中性粒細(xì)胞,以最終細(xì)胞濃度約107細(xì)胞/毫升重懸浮在含有10微克/毫升的鈣黃綠素-AM的HBBS溶液中。在使用鈣黃綠素的二甲亞砜(10mg/ml,儲(chǔ)藏在-20℃)的貯存液前,立即制備HBSS/鈣黃綠素的工作液。嗜中性粒細(xì)胞與鈣黃綠素-AM在37℃溫育30分鐘,每隔10分鐘攪拌。標(biāo)記的嗜中性粒細(xì)胞洗滌一次,以1.32×107細(xì)胞/毫升重懸浮在冷HSA緩沖液(不含磷酸鈉的RPMI(Life Technologies),1%人血清清蛋白(Calbiochem,San Diego,CA),1.2mMCaCl2,1.0mM MgCl2,10mM HEPES,pH7.3)中。細(xì)胞保存在4℃直到使用。
20℃,在100ng/ml PMA(Sigma,St.Louis,MO)存在下,溫育鈣黃綠素標(biāo)記的嗜中性粒細(xì)胞(175微升)和175微升測試組分10分鐘。在二甲亞砜中制備1mg/mlPMA的貯存液,常規(guī)儲(chǔ)藏在-70℃。將100微升測試組分/PMA-處理的細(xì)胞(6.6×105嗜中性粒細(xì)胞)加到96孔微量滴定板(Costar,Cambridge,MA)中培養(yǎng)的原代HUVEC的匯合單層中。37℃、30分鐘后,通過倒置離心除去未粘附的細(xì)胞,于75xg密封平板3分鐘。加入100微升0.1 Triton X-100(在50mM Tris-HCl,pH7.4)中裂解粘附的嗜中性粒細(xì)胞,用Cytofluor熒光測定平板閱讀儀(Millipore,Bedford,MA)閱讀485nm激發(fā)得到的530nm處的鈣黃綠素的熒光發(fā)射。各數(shù)據(jù)點(diǎn)以一式三份進(jìn)行。在這些實(shí)驗(yàn)中,在不存在抑制劑時(shí),總輸入嗜中性粒細(xì)胞的40%,或約2.6×105細(xì)胞與HUVEC單層結(jié)合。
C.過氧化氫釋放試驗(yàn)用Pick等,J.Immun.Methods,38161-171(1980)所述的改良方法測定受刺激的人嗜中性粒細(xì)胞釋放的過氧化氫。人嗜中性粒細(xì)胞(6.6×106細(xì)胞/毫升)重懸浮在含有10%胎牛血清的HBSS中。在細(xì)胞懸液中以分別為83微克/毫升和0.01單位/毫升的最終濃度加入酚紅和IV型辣根過氧化物酶(Sigma)。在200微升測試樣品(含有10%胎牛血清的HBSS)中加入500微升該細(xì)胞懸液。用fMLP(sigma)以最終濃度275μM活化細(xì)胞。制備fMLP(500nM)的二甲亞砜貯存液,儲(chǔ)藏在-20℃。釋放試驗(yàn)在1.5ml塑料管(Eppendorf,Madison,WI)中進(jìn)行,該管用胎牛血清在37℃預(yù)包涂60分鐘;包涂的試管用0.15N NaCl洗滌兩次,然后使用。釋放作用在37℃進(jìn)行90分鐘,然后在Eppendorf微離心機(jī)中2000xg沉淀細(xì)胞3分鐘。將200微升上清液轉(zhuǎn)移到96孔微量滴定板中,加入10微升1N NaOH終止反應(yīng)。各數(shù)據(jù)點(diǎn)一式兩份進(jìn)行。用ThermoMax平板閱讀儀(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)在610nm定量樣品。從內(nèi)標(biāo)曲線計(jì)算過氧化氫濃度。
D.NIF1的ELISA用標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)制備針對(duì)NIF1的多克隆抗體。用含有與rNIF1偶聯(lián)的均勻玻璃珠(Bioporcessing Ltd.,Consett,UK)的樹脂免疫親和純化抗體。還在小鼠中用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備了針對(duì)NIF1的單克隆抗體。通過蛋白質(zhì)A層析從小鼠腹水中純化單克隆抗體,用標(biāo)準(zhǔn)方法與辣根過氧化物酶(“HRP”)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,IN)偶聯(lián)。免疫親和純化的多克隆抗體吸附在Immulon 2聚苯乙烯免疫試驗(yàn)平板(Dynatech Labs,Chantilly,VA)的孔上,然后用牛血清清蛋白封閉。在免疫試驗(yàn)平板的孔中加入含有NIF1(100微升/孔)的測試樣品,用平板振搖器混合,在37℃溫育3小時(shí)。除去孔中的內(nèi)容物,用含有0.02%Tween 20的磷酸緩沖鹽洗滌孔。在孔中加入單克隆抗體-HRP偶聯(lián)物(100微升/孔),如前混合,37℃溫育2小時(shí)。用含有0.02%Tween 20的磷酸緩沖鹽漂洗去除未吸附的單克隆抗體-HRP偶聯(lián)物,在孔中加入HRP底物(10ml 0.1M乙酸鈉,pH4.5,0.012%過氧化氫,加0.4ml三甲基聯(lián)苯胺,3mg/ml的0.1M HCl)。當(dāng)用1M硫酸終止反應(yīng)時(shí),在室溫顯色10分鐘。用Molecular Devices 96孔板閱讀儀確定450nm過的光密度。用含有已知濃度的樣品產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
配方可配制成NIF的藥物組合物,并用作口腔給藥的片劑、膠囊或酏劑;直腸給藥的栓劑;注射給藥的無菌容積、懸液等。給藥的劑量和方法可為實(shí)現(xiàn)最佳效力而修改,但將視下列因素重量,飲食,目前的藥物療法和其它醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解到的因素而定。通常,根據(jù)使用的組合物的效力,每天施用0.01-100mg/kg體重的劑量。優(yōu)選例包括制備用于儲(chǔ)藏和隨后給藥的藥物組合物,它含有治療有效量的NIF或NIF的富集組合物,如本文藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑所述的。治療用的可接受載體或稀釋劑在藥學(xué)領(lǐng)域是已知的,在例如《Remington氏藥物科學(xué)》(Remington’s Pharmaceutical Sciences),Mack PublishingCo.(A.R.Gennaro編,1985)中有所描述??稍谒幬锝M合物中提供防腐劑、穩(wěn)定劑、染料,甚至調(diào)味劑。例如,可加入苯甲酸鈉、山梨酸和對(duì)羥苯甲酸的酯作為防腐劑。另外,可使用抗氧化劑和懸浮劑。
可以常規(guī)形式,即液體溶液或懸液,適合在注射前溶解或懸浮在液體中的固體形式,或乳液制備可注射制劑。合適的賦形劑是例如水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸鈉、半胱氨酸鹽酸鹽等。另外如需要,可注射藥物組合物可含有少量無毒的輔助物質(zhì),例如濕潤劑,pH緩沖劑等。如需要,可使用增加吸收的制備物(例如脂質(zhì)體)。
實(shí)用性本發(fā)明的NIF可用于治療哺乳動(dòng)物的炎癥病況,該病況的特征是異常嗜中性粒細(xì)胞活化或異常嗜伊紅粒細(xì)胞活化,包括對(duì)所述哺乳動(dòng)物施用治療有效量的NIF或其藥物組合物。在實(shí)施該優(yōu)選方法中,可單獨(dú)或彼此聯(lián)合,或聯(lián)合其它治療劑或診斷劑使用NIF或其藥物組合物??稍隗w內(nèi),通常在哺乳動(dòng)物體內(nèi),優(yōu)選在人體內(nèi),或體外利用這些組合物。
在體內(nèi)使用NIF或其藥物組合物時(shí),組合物可用各種途徑,包括腸道外、靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、直腸內(nèi)、鼻內(nèi)或腹膜內(nèi),使用各種劑型施給哺乳動(dòng)物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員易理解的,要施用的有用的體內(nèi)劑量和給藥的具體模式將根據(jù)治療的哺乳動(dòng)物物種,使用的具體組合物,和這些組合物的具體用途而定。實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果必需的劑量水平的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)。通常在低劑量水平開始使用組合物,提高劑量水平直到獲得所需效果。
根據(jù)所需效果和治療的適應(yīng)癥,NIF或其藥物組合物的劑量可廣泛變化。通常合適的劑量應(yīng)在約0.01-100mg/kg之間,優(yōu)選約0.01-10mg/kg體重之間。給藥優(yōu)選是胃腸外,例如每天或視需要靜脈內(nèi)給藥。
本發(fā)明方法制備的NIF具有強(qiáng)嗜中性粒細(xì)胞抑制活性,因此可用作嗜中性粒細(xì)胞活性,包括體外嗜中性粒細(xì)胞活化的抑制劑,和用于預(yù)防或治療特征為異常嗜中性粒細(xì)胞活化的哺乳動(dòng)物炎癥病況。因此,NIF可用于治療炎癥,在該炎癥中嗜中性粒細(xì)胞的異?;罨鸬搅酥匾饔?。雖然申請(qǐng)人不希望限于任何理論或作用模式,相信該化合物影響炎癥應(yīng)答,它是由嗜中性粒細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用付諸實(shí)行的。因此,由于防止嗜中性粒細(xì)胞粘附在內(nèi)皮上,嗜中性粒細(xì)胞將不能遷移到組織上引起炎癥前應(yīng)答,隨之發(fā)生組織損傷。這些NIF抑制嗜中性粒細(xì)胞-嗜中性粒細(xì)胞粘附和/或聚集還應(yīng)預(yù)防微血管堵塞。因此,這些NIF將用于治療各種臨床病癥,包括休克、中風(fēng)、急性和慢性移植物排斥、脈管炎、自身免疫性糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、頭部創(chuàng)傷、炎癥性皮膚病、炎癥性腸病、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、心肌梗塞后的缺血-再灌注損傷(其中涉及嗜中性粒細(xì)胞滲透和活化),和細(xì)菌感染引起的急性炎癥,例如敗血癥或細(xì)菌性腦膜炎。
本發(fā)明制備的NIF抑制嗜中性粒細(xì)胞的活性使其能用于抑制炎癥、缺血和其它嗜中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的組織損傷的生理過程。NIF在進(jìn)行這些相關(guān)功能中的專一活性使其特別能用作治療劑和/或診斷劑。
針對(duì)本發(fā)明產(chǎn)生的NIF的單克隆和多克隆抗體用于診斷目的,并用于鑒定各種生物液中的目標(biāo)肽的濃度水平。利用這些抗體的免疫試驗(yàn)可用作診斷試驗(yàn),例如檢測寄生蟲對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的感染,或檢測哺乳動(dòng)物宿主中來自寄生蟲的NIF。這些免疫試驗(yàn)還可用于檢測和分離組織勻漿、克隆的細(xì)胞等中的NIF。在本發(fā)明的另一個(gè)方面,NIF可用于測試方法,以篩選其它化合物,以檢測NIF模擬物或檢測NIF拮抗劑影響NIF與CD11b/CD18受體結(jié)合的能力。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面,本發(fā)明生產(chǎn)的NIF和合適的佐劑可用作針對(duì)哺乳動(dòng)物中寄生蟲感染的疫苗。用NIF疫苗免疫可用于預(yù)防和治療寄生蟲感染。NIF片段和具有NIF的氨基酸序列的合成的多肽也可用作疫苗??赏ㄟ^對(duì)被這些寄生蟲感染的動(dòng)物施用拮抗NIF的物質(zhì)(例如NIF拮抗劑),來治療寄生蟲引起的病況??筛鶕?jù)如上所述的篩選方法篩選化合物的抗NIF作用。這些抗蠕蟲劑的例子包括NIF的抗體,它包括從血清分離的天然存在的抗體和上述多克隆和單克隆抗體。作為NIF抑制劑的化學(xué)合成的化合物也是合適的抗蠕蟲劑。
下列實(shí)施例用于說明本發(fā)明的方法。對(duì)于過程控制參數(shù)和過程規(guī)模的實(shí)際允許范圍可能更廣。
實(shí)施例實(shí)施例1表達(dá)NIF的細(xì)胞系A(chǔ).編碼NIF的核酸重組NIF的編碼序列衍生自犬鉤蟲(Ancylostaoma)cDNA文庫,其中在質(zhì)粒構(gòu)建過程中加入標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)調(diào)控序列。NIF-1FL、成熟NIF-1FL(NIF1)的核苷酸序列以及對(duì)應(yīng)的全長cDNA分別如圖1和2所示。圖2中的核苷酸序列具有822個(gè)核苷酸的開放閱讀框,它編碼274個(gè)氨基酸多肽(核苷酸313-1134)。
B.表達(dá)載體的構(gòu)建將上述NIF1 cDNA如下克隆入一系列穿梭載體和宿主,最終克隆入pEE14載體。圖3是示意圖,表示以NIF1 cDNA到pEE14載體的途徑,它用于轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞。用于細(xì)胞系構(gòu)建過程的一些生物化學(xué)品及其各自的供應(yīng)商如下(表III)
將NIF1編碼區(qū)域(“NIF1cr”)(SEQ ID NO1)拯救入pSG5載體,測定核苷酸序列。編碼區(qū)域本身(不考慮緊靠改變成啟動(dòng)表達(dá)的ATG起始位點(diǎn)上游的序列)正好對(duì)應(yīng)于圖2所示的原始NIF1 cDNA克隆的堿基313-1137。
用pSG5/NIF1cr轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞產(chǎn)生活性NIF1。產(chǎn)生的NIF1和鉤蟲衍生的NIF一樣,以濃度依賴性方式抑制人嗜中性粒細(xì)胞的H2O2產(chǎn)生。對(duì)照感染(用攜帶氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或模擬轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)都不產(chǎn)生類似NIF的活性。
pSG5的有限多克隆位點(diǎn)需要NIF1cr通過能提供編碼區(qū)域的兩端上的不同限制性位點(diǎn)的質(zhì)粒傳代。選擇pBluescript IIKS+,因?yàn)樵谄鋸V泛多克隆位點(diǎn)的中部存在EcoRI位點(diǎn)和它方便操作。然后將其克隆入pEE14表達(dá)質(zhì)粒。表達(dá)構(gòu)建物pEE14/NIF1cr用于轉(zhuǎn)染CHO K1細(xì)胞。
在關(guān)鍵步驟通過限制性作圖或者測序驗(yàn)證準(zhǔn)確的分離和最終或中間構(gòu)建的序列。首先在克隆入pcDNA1/Amp測序載體(測序見圖2)時(shí)測序,驗(yàn)證全長NIF序列。通過雙向測序在克隆入PSG5穿梭載體后驗(yàn)證經(jīng)測序的編碼區(qū)。
C.表達(dá)載體如其名稱所指出的,pEE14/NIFcr表達(dá)質(zhì)粒衍生自圖4所示的廣泛使用的9.4kb pEE14表達(dá)載體(Lonza Biologics)。pEE14載體含有(1)人CMV主要立即早期啟動(dòng)子(hCMV-MIE),(2)多克隆位點(diǎn)(MCS),(3)SV40早期polyA位點(diǎn)(pA),(4)Col E1復(fù)制起始點(diǎn)(Col E1),(5)氨芐青霉素抗性基因(Amp),和(6)SV40晚期啟動(dòng)子(SV40L),它驅(qū)動(dòng)谷氨酰胺合成酶小基因(GS-小基因)。在該圖中標(biāo)出了多克隆位點(diǎn)中存在的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn).5’Hind III插入位點(diǎn)到MCS稍差5’??蓮腂ebbingtong等,Bio/Technology,10169-175(1992)和Stephens和Cockett,Nucleic Acids Research,177110(1989)獲得載體部分的核酸序列。
pEE14/NIF1cr插入物含有825bp的NIF1編碼序列(SEQ ID NO1),它編碼圖1中標(biāo)出的274個(gè)氨基酸(SEQ ID NO2)。成熟NIF-1FL(NIF1)蛋白含有257個(gè)氨基酸,它由密碼子18開始的序列編碼,如圖1所示(SEQ ID NO3)。如圖5所示,在克隆過程中,在編碼序列的兩端其它非編碼序列(SEQ ID NO10和11)摻入插入物。
對(duì)pEE14載體的基本修飾是將NIF1編碼序列插入pEE14 HindIII(bp9292)和SmaI位點(diǎn)(bp9334)之間的載體的插入物表達(dá)區(qū)。該構(gòu)建能在pEE14人CMV主要中間早期(“hCMV-MIE”)啟動(dòng)子的控制下表達(dá)高水平的NIF1。NIFcr(cr=編碼區(qū))插入物的構(gòu)建如圖5所示。
如圖5所示,插入物5’末端序列在pEE14表達(dá)載體中的HindIII位點(diǎn)開始(圖4中位點(diǎn)未顯示),它與來自pBluescriptII穿梭載體(“BSII”)多接頭的5’-HindIII位點(diǎn)的互補(bǔ)序列連接。5’HindIII位點(diǎn)后隨一個(gè)EcoRI位點(diǎn),由5’-PCR NIFcr拯救引物提供,用于將NIF1cr序列克隆入BSII。在該EcoRI位點(diǎn)開始,NIF1的NIF1編碼區(qū)序列延伸約850個(gè)核苷酸。
NIFcr后面是EcoRI位點(diǎn),它是由3’-PCR NIF1拯救引物建立的,用于建立將NIF1cr克隆入BSII所需的3’末端。編碼區(qū)域的3’末端后隨來自pBluescriptII穿梭載體的PstI位點(diǎn),最后是來自pEE14的SmaI位點(diǎn)和其它序列(圖4和5)。NIF1蛋白質(zhì)編碼序列用大寫標(biāo)出,條表明指定限制性酶的切割點(diǎn)。在NIF1cr克隆過程中,HindIII和SmaI位點(diǎn)之間的pEE14序列被除去。
D.表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染用如下的標(biāo)準(zhǔn)鈣方法將pEE14/NIF1cr載體引入CHO-K1細(xì)胞(ATCC CCL-61)。為了轉(zhuǎn)化,在37℃,在7.5-10%CO2氣體中,T-75燒瓶中的DMEM(LifeTechnologies/Gibco)中增殖CHO-K1細(xì)胞。在500ml DMEM中加入標(biāo)準(zhǔn)營養(yǎng)物和50ml胎牛血清(FBS)。在轉(zhuǎn)染前,用豬胰蛋白酶從燒瓶中如上所述除去細(xì)胞,用DMEM-S(DMEM如上制備,但用透析過的FBS)洗滌,以1×106細(xì)胞/板接種在10cm直徑的組織培養(yǎng)板(Costar)上。37℃培養(yǎng)細(xì)胞過夜。就在要轉(zhuǎn)化細(xì)胞之前,用不含F(xiàn)BS的DMEM漂洗一次。如下在兩步中制備DNA-磷酸鈣沉淀物。首先將62微升2M氯化鈣與10微克pEE14/NIF1cr DNA混合,并用無菌水加到500微升。接著將該混合物滴加到500微升2X HEPES緩沖鹽中,一邊用冒泡氣流經(jīng)常的溫和攪拌。一旦加入所有DNA混合物,旋轉(zhuǎn)含有DNA-磷酸鈣沉淀的試管。用2mL不含F(xiàn)BS的DMEM稀釋DNA-磷酸鈣沉淀,并加到含有CHO K1細(xì)胞的10cm直徑培養(yǎng)皿中。將平板置于37℃,7.5%CO2,溫和振搖4小時(shí)。從細(xì)胞中除去培養(yǎng)基和DNA-磷酸鈣沉淀,并用3ml 15%甘油的HEPES緩沖鹽溶液替換。37℃90秒鐘后,加入10ml不含F(xiàn)BS的DMEM,立即吸去。然后用10ml DMEM-S覆蓋細(xì)胞,37℃,7.5%o溫育24小時(shí)。用含有25μM甲硫氨酸磺亞胺(MSX)的新鮮DMEM-S置換培養(yǎng)基。當(dāng)將CO2提高到10%,以降低培養(yǎng)基pH時(shí),平板再培養(yǎng)7天。在此時(shí),平板含有許多各種大小的集落。用豬胰蛋白酶如前處理從培養(yǎng)皿中除去細(xì)胞,如前離心收集,并重懸浮在50ml等體積的條件培養(yǎng)基和補(bǔ)充有20%透析的FBS和25μM MSX的新鮮DMEM-S的混合物中。將重懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔培養(yǎng)板(100微升/孔)中,并在37℃,10%CO2溫育,以獲得單集落。鋪板7天后,加入100微升克隆培養(yǎng)基(50%CHO K1條件的DMEM-S,具有20%經(jīng)透析的FBS,具有20%透析的FBS的50%新鮮DMEM-S,25μM MSX),以替換由于蒸發(fā)損失的培養(yǎng)基。鋪板10天后,201個(gè)孔含有單集落,3個(gè)孔含有2或3個(gè)集落。
鋪板20天后,15個(gè)孔顯示匯合生長,用塑性粘附試驗(yàn)(上述用于NIF活性,因此可用于NIF1活性)測試無細(xì)胞上清液。將陽性克隆在24孔培養(yǎng)板中如下擴(kuò)增。通過用豬胰蛋白酶處理將細(xì)胞與96孔板分離,用胰蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化。在各孔中加入1ml克隆培養(yǎng)基,37℃,10%CO2溫育平板。3天后加入500微升含有25μM MSX的克隆培養(yǎng)基。擴(kuò)增7天后,用塑性粘附和鈣黃綠素試驗(yàn)測定細(xì)胞的NIF1活性。陽性克隆在10cm直徑的組織培養(yǎng)皿中擴(kuò)增。將表達(dá)最高水平NIF1活性的克隆以約1×106細(xì)胞/ml冷凍在含有20%透析的FBS、25μM MSX和10%二甲亞砜的克隆培養(yǎng)基中。
該克隆通過限制的稀釋進(jìn)行兩輪克隆,以確保最終細(xì)胞系來自單一轉(zhuǎn)染的細(xì)胞??寺≡诤?0%透析的FBS和25μM MSX的DMEM-S中生長至匯合,通過胰蛋白酶處理從培養(yǎng)皿中除去,用克隆培養(yǎng)基稀釋到每毫升25個(gè)細(xì)胞,以每孔2.5個(gè)細(xì)胞鋪在96孔板中。在37℃,10%CO2溫育平板。培養(yǎng)17天后,用鈣黃綠素試驗(yàn)測定33個(gè)孔(顯示生長)的NIF活性。根據(jù)生長速率和NIF活性的表達(dá),幾個(gè)克隆在含有10%透析的FBS和25μM MSX的DMEM-S中生長至匯合,并以約1×106細(xì)胞/ml冷凍在克隆培養(yǎng)基中。用ELISA確定產(chǎn)生NIF1的所有培養(yǎng)物(見本發(fā)明的詳述)。
實(shí)施例2適應(yīng)懸浮培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)基A.在T-燒瓶培養(yǎng)物中細(xì)胞系的傳代培養(yǎng)將實(shí)施例1制備的培養(yǎng)物之一在含有DMEM∶RPMI1640 50∶50(無谷氨酰胺)(50∶50 DMEM(Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基,Gibco目錄號(hào)11960)和RPMI1640(Rosewell Park Memorial Institute,Gibco目錄號(hào)21870)的混合物);10%合格的熱滅活的胎牛血清(Gibco);每升培養(yǎng)基1ml 25mM(1000X)L-甲硫氨酸磺亞胺貯存液(Sigma)的培養(yǎng)基中再次培養(yǎng)。
倒去培養(yǎng)基。用10ml Dulbecco PBS(無鈣和鎂)漂洗單層2次;倒去DulbeccoPBS,在單層中加入2ml依地酸。含有依地酸的培養(yǎng)物在37℃培育5分鐘。輕敲燒瓶數(shù)次使細(xì)胞脫落并重懸浮在另外18ml新鮮培養(yǎng)基中,以1∶5分到新的T-燒瓶中。培養(yǎng)物在37℃,5%CO2和70%濕度培育養(yǎng),稱為X+1代。在T-燒瓶中所有的隨后傳代培養(yǎng)中用0.25%胰蛋白酶EDTA的溶液代替依地酸。培養(yǎng)物通常每周兩次按需要分成1∶10到1∶25。如可能不使細(xì)胞達(dá)到100%匯合。
B.使培養(yǎng)物適應(yīng)懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)物適應(yīng)在補(bǔ)充有血清的CHO III PFM培養(yǎng)基的搖瓶中懸浮生長。在X+4代用來自T-燒瓶的細(xì)胞接種懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)基配方含有CHO III PFM(Gibco配方#96-03345A);10%合格的熱滅活胎牛血清(Gibco 10082);1ml/L 25mM(1000X)L-甲硫氨酸磺亞胺溶液;和10ml/l 100X HT補(bǔ)充物(Gibco 11067)。
以1.7×105細(xì)胞/毫升的密度接種懸浮培養(yǎng)物。250mlCorning一次性搖瓶中,培養(yǎng)基體積是50ml。培養(yǎng)物在37℃,5%CO2,70%濕度下在搖床上以130rpm培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106細(xì)胞/ml時(shí),將培養(yǎng)物分成1∶3-1∶5,不分到密度低于2×105細(xì)胞/毫升。
細(xì)胞在懸浮搖瓶培養(yǎng)中的第一代被稱為X代(來自T-燒瓶的X+5代)。培養(yǎng)物繼續(xù)傳代到含有10%胎牛血清的X+7代。在補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基中適應(yīng)懸浮生長花費(fèi)約20天。
C.適應(yīng)無血清懸浮生長逐漸降低培養(yǎng)基中的血清濃度,使懸浮培養(yǎng)物適應(yīng)無血清生長。在戒除過程中培養(yǎng)基配方的所有其它成分不變。隨著懸浮生長適應(yīng),如需要通過分成1∶3或1∶5將細(xì)胞維持在2.5×105-1×106細(xì)胞/毫升之間。培養(yǎng)物在130rpm的振搖器上,37℃,5%CO2,70%濕度培養(yǎng)。在第8代,將血清減少到5%,在第9代,到2%;在第10代,到1%;在第11代,離心細(xì)胞并重懸浮在40ml新鮮培養(yǎng)基/10ml條件培養(yǎng)基中,將血清濃度維持在1%(使大團(tuán)和細(xì)胞碎片從培養(yǎng)物中沉淀出來,并除去);在12-15代,血清維持在1%;在第15代,用60mg/L L-天冬氨酸、120mg/L L-絲氨酸、200mg/L L-天冬酰胺補(bǔ)充培養(yǎng)基,加入作為50x貯存液的60mg/L甲硫氨酸,調(diào)節(jié)到pH7.5并無菌過濾;在第16-21代,將血清減少到0℃,維持氨基酸補(bǔ)充物;在第21代,以1×107細(xì)胞/小瓶制備預(yù)接種貯存液(PSS)冷凍小瓶庫。適應(yīng)無血清培養(yǎng)基需要約55天。本文產(chǎn)生的無血清懸浮培養(yǎng)物稱為PGF01。
D.冷凍培養(yǎng)物將細(xì)胞以500rpm在Beckman GPR離心機(jī)中離心10分鐘,制備如上所述的細(xì)胞,用于冷凍和儲(chǔ)藏。將細(xì)胞重懸浮在含有50%完全培養(yǎng)基(CHO-III-PFM,含有1ml/L 25mM 1000X甲硫氨酸磺亞胺貯存液,10ml/L HT補(bǔ)充物,20ml/L 50X氨基酸貯存液,3g/L L-天冬氨酸、6g/l L-絲氨酸、10g/L L-天冬酰胺、3g/L L-甲硫氨酸)的冷凍培養(yǎng)基中?!皸l件”培養(yǎng)基是一種細(xì)胞已在其中生長數(shù)天,離心細(xì)胞并分離出,然后無菌過濾;加入10g/l牛血清清蛋白作為保護(hù)劑;和75mg/lDMSO(Sigma Cell Culture Tested D2650),密度為1×107細(xì)胞/ml,分散在冷凍小瓶中。在速度控制的冷凍器中以1℃/分鐘冷凍細(xì)胞到-75℃,然后轉(zhuǎn)移到液氮中儲(chǔ)藏。
E.無血清懸浮主細(xì)胞庫(MCB)的制備從液氮儲(chǔ)藏中取出1小瓶的第X+21代培養(yǎng)物,在37℃水浴中快速融化,從X+21代細(xì)胞培養(yǎng)物中制備主細(xì)胞庫。將小瓶的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到含有9ml新鮮培養(yǎng)基的15ml錐形管中,該培養(yǎng)基含有CHO III PFM(Gibco配方#96-03345A);1ml/l25mM(1000X)L-甲硫氨酸磺亞胺貯存液;10ml/L 100x HT補(bǔ)充物(Gibco 11067);20ml/L 50X氨基酸貯存液,調(diào)節(jié)到pH7.5,無菌過濾(貯存液3g/L-天冬氨酸、6g/LL-絲氨酸;10g/L L-天冬酰胺和3g/L L-甲硫氨酸)。
在Beckman GPR離心機(jī)中500rpm離心試管10分鐘。棄去上清液,細(xì)胞從試管底部取出。在試管中加入10ml新鮮培養(yǎng)基,將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Corning 250ml搖瓶中。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基體積至50ml,使培養(yǎng)物中的最初細(xì)胞密度是2×105細(xì)胞/ml。在37℃,5%CO2,70%濕度,在旋轉(zhuǎn)搖床上以100rpm過夜培育培養(yǎng)物。培養(yǎng)第一天后,旋轉(zhuǎn)搖床速度增加到130rpm。在無血清/無動(dòng)物蛋白質(zhì)懸浮培養(yǎng)中傳了5代后,以1×107細(xì)胞/小瓶制備MCB。
實(shí)施例3A.產(chǎn)生接種培養(yǎng)物的培養(yǎng)基用下列成分制備接種培養(yǎng)物的培養(yǎng)基
1.0升含葡萄糖的CHO-III-PFM溶液(Life Technologies,定制配方98-0289;含有3.45g/l D-葡萄糖;不含次黃嘌呤、胸腺嘧啶、L-谷氨酰胺);10.00ml/L HT補(bǔ)充物(Life Technologies,目錄號(hào)11067-030;100x=10mM次黃嘌呤鈉,1.6mM胸腺嘧啶);20.00ml/l氨基酸貯存液(如下文3B制備);1.00ml/L 25mM L-甲硫氨酸磺亞胺儲(chǔ)液(如下文3C制備);25.00mg/l L-半胱氨酸(Sigma);和0.50ml/l酚紅(Sigma,0.5%(w/v)溶液)。
B.氨基酸貯存液通過在去離子水中溶解3.00g/l L-天冬氨酸(sigma)、2.50g/l L-谷氨酸(sigma)、10.00g/L L-天冬酰胺(Sigma)、1.25g/l L-脯氨酸(Sigma)、3.00g/L L-絲氨酸(Sigma)和1.50g/L L-甲硫氨酸(Sigma),制備1升溶液,用5N氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,然后無菌過濾得到的溶液,制備用于上述接種培養(yǎng)基的氨基酸貯存液。
C.L-甲硫氨酸磺亞胺貯存液將L-甲硫氨酸磺亞胺(25mmol,F(xiàn)W180.2,Sigma)溶于1升去離子水。用0.2微米濾膜過濾得到的溶液??蓪⒃撊芤壕S持在4℃達(dá)3個(gè)月,或可以在-2 0℃或以下冷凍儲(chǔ)藏較長的時(shí)間。
實(shí)施例4接種物產(chǎn)生將1小瓶冷凍的PFG01種子細(xì)胞融化在36.5±1℃的水浴中,直到僅剩一小塊冰。將小瓶轉(zhuǎn)移到生物安全箱中,用無菌的70%異丙醇抹布對(duì)外部消毒。將細(xì)胞重懸浮在如實(shí)施例3a中制備的25ml預(yù)溫生長培養(yǎng)基,并轉(zhuǎn)移到125ml的搖瓶中。用臺(tái)盼藍(lán)染料排阻法(Cell and Tissue Culturelaboratory Procedures inBiotechnology,A.Doyle and J.B.Griffiths編(John Wiley & Sons,Ltd.,1998))對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行采樣。如需要,加入更多預(yù)溫的生長培養(yǎng)基,將最終細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到約5.0×105vc/ml。在36.5±1℃,5±1%CO2濃度,70±5%相對(duì)濕度和170±5rpm的攪拌速率溫育燒瓶。每天對(duì)燒瓶采樣,檢查細(xì)胞濃度和存活率。
每天加入足夠的預(yù)溫的生長培養(yǎng)基,以維持燒瓶中5.0×105vc/ml的濃度。當(dāng)搖瓶體積達(dá)到50ml和細(xì)胞密度達(dá)到1.0×106vc/ml時(shí),將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到250ml搖瓶中,稀釋到100ml中5.0×105vc/ml。當(dāng)細(xì)胞密度再次達(dá)到1.0×106vc/ml時(shí),將培養(yǎng)物分開,一半轉(zhuǎn)移到另一個(gè)250ml搖瓶中,稀釋到2.5×105vc/ml。繼續(xù)這些使種子系列擴(kuò)增的步驟,直到達(dá)到足夠的體積,在生物反應(yīng)器中獲得2.0×105vc/ml的接種密度。判斷理想的接種比(接種培養(yǎng)物/接種后的反應(yīng)器液體體積)是約10-20%。因此,將接種培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度理想地調(diào)節(jié)到1.0×106-2.0×106vc/ml之間。接種培養(yǎng)物的壽命是約3天。
實(shí)施例5用于生產(chǎn)生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基A.批量培養(yǎng)基混合下列成分制備NIF1生產(chǎn)的批量培養(yǎng)基1.0升含葡萄糖的CHO-III-PFM溶液(Life Technologies,定制配方98-0289;含有3.45g/l D-葡萄糖;不含次黃嘌呤、胸腺嘧啶、L-谷氨酰胺);10.00ml/L HT補(bǔ)充物(Life Technologies);1.50g/l酵母提取物(Bacto,Difco/Becton-Dickinson);和0.50ml/l酚紅(Sigma,0.5%(w/v)溶液)。
B.營養(yǎng)物進(jìn)料1為了用作營養(yǎng)物進(jìn)料1,將200g葡萄糖(來自結(jié)晶葡萄糖,Corn ProductsInternational)溶于去離子水,制備1升溶液。用該葡萄糖進(jìn)料將反應(yīng)器中的葡萄糖濃度控制在約1.5-2.5g/l。
C.營養(yǎng)物進(jìn)料2為了用作營養(yǎng)物進(jìn)料2,混合下列成分1.0升CHO-III-PFM 5X(調(diào)節(jié)到pH7.4)(Life Technologies,定制配方99-0180;含5X的1XL-半胱氨酸、3X L-酪氨酸;不含葡萄糖、次黃嘌呤、胸腺嘧啶、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉和氯化鈉)。
50ml/l HT補(bǔ)充物(Life Technologies,目錄號(hào)11067-030,100x=10mM次黃嘌呤鈉,1.6mM胸腺嘧啶)。
7.50克酵母抽提物(Difco,Bacto/Becton-Dickinson)。
在CHO-III-PFM 5X中加入HT補(bǔ)充物和酵母提取物?;旌铣煞种钡酵耆芙?,然后用5N氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到7.4,然后無菌過濾得到的溶液。
實(shí)施例6操作2升攪拌罐生物反應(yīng)器在2升Wheaton生物反應(yīng)器(B.Braun Biotech Inc.,Allentown,PA)中進(jìn)行NIF1的生產(chǎn),用Foxboro IA(智能應(yīng)用)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(Foxboro Company,F(xiàn)oxboro,MA)控制。在生物反應(yīng)器滅菌后,加入1升無菌調(diào)節(jié)溶液,無谷氨酰胺的DMEM(Life Technologies/Gibco BRL)。4小時(shí)后,用如實(shí)施例5A中制備的1升新鮮無菌生產(chǎn)批量培養(yǎng)基置換漂洗培養(yǎng)基。使培養(yǎng)基溫度穩(wěn)定在36.5±1℃,將pH調(diào)節(jié)到pH7.4。為了在反應(yīng)器中獲得約2.0×105活細(xì)胞/ml的目標(biāo)密度,加入體積約200ml的接種培養(yǎng)物,以獲得1.2升最初液體體積。
A.操作設(shè)定點(diǎn)設(shè)定了下列參數(shù)用于操作生物反應(yīng)器。
攪拌100rpm(4英寸直徑的單塑料垂直葉片)。
pH7.40±0.15(控制劑CO2氣體和7.5%(w/v)NaHCO3溶液)。
溶解氧濃度60%±5%空氣飽和(控制劑O2和N2)。
溫度36.5℃營養(yǎng)物進(jìn)料1200g/l葡萄糖溶液-以每天約0.0-6.0g/l進(jìn)料。
氣流量在頂部空間200-300ml/分鐘穩(wěn)定空氣流量。根據(jù)控制pH和溶解氧的需要,將CO和CO2(出于安全目的使用N2中的60%O2)噴到培養(yǎng)物中。在溶解氧濃度超過其上限(65%)時(shí),在頂部空間常常導(dǎo)入氮?dú)狻?br>
以30ml/天的恒定速率(即在每天接種時(shí),以25ml/升培養(yǎng)物的速率)連續(xù)供給營養(yǎng)物進(jìn)料2。該進(jìn)料與葡萄糖進(jìn)料在48小時(shí)時(shí)通式開始,并在生產(chǎn)進(jìn)行的整個(gè)過程中維持在該水平。
B.采樣和維持接種后立即對(duì)生物反應(yīng)器采樣。采用下列測量值初始細(xì)胞密度和存活率;離線pH;初始葡萄糖濃度;初始乳酸基濃度;初始氨濃度;和初始重量克分子滲透壓濃度。當(dāng)需要時(shí)調(diào)節(jié)在線pH。用黑色塑料覆蓋生物反應(yīng)器,以保護(hù)培養(yǎng)基免受光。
每天對(duì)生物反應(yīng)器采樣,測定下列參數(shù)細(xì)胞密度;培養(yǎng)物存活率;離線pH;葡萄糖濃度;乳酸鹽濃度;氨濃度;重量克分子滲透壓濃度;和成熟NIF1濃度(在4天開始)。葡萄糖濃度用營養(yǎng)物進(jìn)料1維持在0.1-3.0g/升。營養(yǎng)物進(jìn)料1在48小時(shí)后開始進(jìn)料,最初進(jìn)料速率是每天約2.0g/升,或每天約2.0-3.0g葡萄糖/109活細(xì)胞,用定量泵與開/關(guān)定時(shí)器連接,周期為30分鐘。如需要每天上午調(diào)節(jié)葡萄糖進(jìn)料速率。所需的進(jìn)料速率通常維持在每天0.0-6.0g/l范圍內(nèi)。恒定的營養(yǎng)進(jìn)料2與葡萄糖進(jìn)料同時(shí)開始。
C.用PFG01的NIF1生產(chǎn)方案在下文表IV中列出下列測量值,以觀察使用PFG01細(xì)胞生產(chǎn)NIF1的進(jìn)程。
表IV
根據(jù)Cell and Tissue Culturelaboratory Procedures in Biotechnology,A.Doyle and J.B.Griffiths編(John Wiley & Sons,Ltd.,1998)列出的臺(tái)盼藍(lán)染料排阻法測定細(xì)胞計(jì)數(shù)和存活率。用在發(fā)明詳述中列出的方案測定NIF1滴度。用Kodak生物分析快速分析系統(tǒng)進(jìn)行葡萄糖、乳酸鹽和氨的測定。用先進(jìn)的微量滲透計(jì)(3330型,Advanced Instruments,Inc.,Norwood,MA)測定重量克分子滲透壓濃度。
實(shí)施例7NIF1唾液酸化/糖基化方案測試了從許多不同生物反應(yīng)器過程中收集的NIF1唾液酸化/糖基化的程度,與標(biāo)準(zhǔn)樣品的結(jié)果比較。從如實(shí)施例2中列出的,適合懸浮生長,但在含有牛血清清蛋白的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的實(shí)施例1的細(xì)胞獲得標(biāo)準(zhǔn)NIF1(STD)。通過Webster等,Xenobioteca,29(11),pp.1141-55(1999)列出的方法如下檢測唾液酸化/糖基化方案。
A.NIF1的去唾液酸化NIF1的去唾液?;姆桨赣盟崴鈦磲尫磐僖核帷<尤?.2N HCl(1∶1 v/v),80℃加熱1小時(shí)使NIF1樣品(2mg/ml)去唾液酸化。用Warren,J.Biol.Chem.,234,pp.1971-5(1995)開發(fā)的硫代巴比土酸法測定用酸水解反應(yīng)釋放的唾液酸。當(dāng)觀察到不再增加游離唾液酸時(shí),終止溫育。
B.總唾液酸測定唾液酸殘基是從NIF1用酸水解(上文A部分)釋放的,用具有脈沖電流檢測的離子層析分析與NIF蛋白的聚糖、5-乙酰神經(jīng)氨酸(neu5ac)結(jié)合的大部分唾液酸。將純化的NIF樣品稀釋到0.1mg/ml的濃度。然后將樣品(200微升)與200微升0.2N HCl混合,并在80℃加熱1小時(shí)。然后在冰浴中冷卻樣品10分鐘并離心。用Dionex Carbopac(PA-10 4.6×250mm柱(保護(hù)柱4.6×50mm Carbopac(PA-10),具有0.2M NaOH和0.05M C2H30Na的流動(dòng)相(流速=0.7ml/分鐘,用Dionex Ion PacATC-1流動(dòng)相調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)流動(dòng)相))分析含有5-乙?;窠?jīng)氨酸的上清液(20微升),并用Dionex ED40檢測器,用優(yōu)化的糖類波形設(shè)定進(jìn)行檢測。在以上HPLC條件下,5-乙酰神經(jīng)氨酸標(biāo)準(zhǔn)有10分鐘的保留時(shí)間。在5-乙酰神經(jīng)氨酸洗脫后進(jìn)行洗脫步驟(0.2M NaOH和0.3M C2H3O2Na 5分鐘),在下一次注射之前重新平衡柱30分鐘。列出的數(shù)據(jù)作為對(duì)照批量(即適應(yīng)懸浮但是在牛血清清蛋白存在下制備的實(shí)施例1細(xì)胞制備的NIF1(STD)的標(biāo)準(zhǔn)樣品)的百分?jǐn)?shù),唾液酸化表示的值中的增長代表了NIF1分子上唾液酸量的增加。表V列出了總唾液酸化數(shù)據(jù)。
C.寡糖負(fù)荷情況分析用酶肽-N-糖苷酶F(PNGase-F)從NIF1釋放N-連接的寡糖。用2-氨基苯并酰胺(2-AB)標(biāo)記釋放的寡糖,并用陰離子交換層析分離。純化的NIF1首先稀釋成約0.05mg/ml濃度;加入4微升5%(w/v)的SDS和6微升1.44Mβ-巰基乙醇使50微升稀的NIF變性。在將樣品靜置約5分鐘后,在樣品中加入20微升7.5%NP-40和30微升(100mM Na2HPO4、10mM EDTA-二鈉,pH7.6)的緩沖液。然后,加入10微升1mU/ml PNGase-F,將樣品儲(chǔ)藏在溫箱里37℃、18-24小時(shí)。通過乙醇沉淀從去糖基化的蛋白質(zhì)分離釋放的寡糖,除去上清液并干燥。用標(biāo)記試劑盒(用5微升標(biāo)記試劑重懸浮樣品,Signal 2-AB標(biāo)記試劑盒(Oxford Glycoscience,產(chǎn)品號(hào)K-404))標(biāo)記含有寡糖的干燥樣品。在溫育結(jié)束時(shí)通過在親水膜(和試劑盒一起提供)上層析除去過量的標(biāo)記試劑。將試劑混合液加到乙腈中的盤上,依次用乙腈和乙腈/水洗滌除去過量試劑。用水從盤中洗脫2-AB標(biāo)記的寡糖并干燥。然后在Glycosep C HPLC柱(100×4.6mm,Oxford Glycosystems)上陰離子交換HPLC分析用2-AB標(biāo)記的寡糖。在從80%水/20%乙腈-80%250mM乙酸銨,pH4.5/20%乙腈的梯度中洗脫寡糖35分鐘,流速為0.3ml/分鐘。用激發(fā)波長330nm和發(fā)射波長420nm進(jìn)行熒光檢測。典型的色譜圖包括峰簇,首先洗脫的是不帶電的物質(zhì),然后是一、二、三和四唾液酸化的簇。
指定一批NIF1(STD)用于方案控制。唾液腺化概況數(shù)據(jù)如表V所示。
實(shí)施例8NIF1藥物動(dòng)力學(xué)概況測試了從許多不同生物反應(yīng)器收集的NIF的藥物動(dòng)力學(xué)清除率和半衰期數(shù)據(jù),并將結(jié)果與從實(shí)施例1的細(xì)胞獲得的NIF1的標(biāo)準(zhǔn)樣品的結(jié)果比較,該細(xì)胞適應(yīng)實(shí)施例2中列出的懸浮生長,但是在動(dòng)物蛋白(BSA)存在下產(chǎn)生的。結(jié)果列于下表,作為與NIF1標(biāo)準(zhǔn)樣品的比較。
A.動(dòng)物的準(zhǔn)備通過在頸靜脈中插入導(dǎo)管(0.58mm內(nèi)徑,0.9mm外徑,聚乙烯管,Portex Ltd.)準(zhǔn)備頸靜脈插管的Fischer 344大鼠,用常規(guī)獸醫(yī)學(xué)技術(shù)將導(dǎo)管外置于頸后。在手術(shù)過程中,用70mg/kg鹽酸開他敏(Vetalar,Parke-Davis Veterinary;100mg/ml)/10mg/kg賽拉嗪(Rompun注射2%,Bayer),腹膜內(nèi)注射麻醉大鼠。手術(shù)后,用1ml/kg皮下注射1/5稀釋的Antisedan(Pfizer Animal Health,阿替美唑;5mg/ml),逆轉(zhuǎn)賽拉嗪。在實(shí)驗(yàn)期間皮下注射提供鎮(zhèn)痛(鹽酸丁丙諾非,0.1毫升1/4稀釋的Vetergesic(Reckitt and Colman;0.3mg/ml))?;謴?fù)兩天后,在尾靜脈(推注)用劑量水平為2mg/kg的NIF1(劑量濃度為2mg/ml,以1ml/kg基礎(chǔ)施用)對(duì)大鼠給藥。對(duì)使用頸靜脈插管的大鼠系列采樣,并用兩只大鼠確定各批NIF1的藥物動(dòng)力學(xué)。在下列時(shí)間點(diǎn),用內(nèi)在導(dǎo)管將血樣(50微升)移入肝素化的試管中給藥前,0.25,1,2,4,8,12,24和48小時(shí)。離心血樣,除去血漿并冷凍儲(chǔ)藏用于隨后分析。用Delfia免疫試驗(yàn)(實(shí)施例8C)分析血漿樣品的NIF1。
B.經(jīng)分離灌注的大鼠肝臟制備物用Gardner等,Xenobiotica,25,pp185-187(1995)詳述的方法,進(jìn)行分離灌注的大鼠肝臟(IPRL)的制備。麻醉(靜脈內(nèi),Intraval)所選的重量約250g的雄性大鼠,進(jìn)行手術(shù),給膽道、肝門靜脈和上腔靜脈插管。
以15ml/min流速對(duì)肝臟灌注含有經(jīng)洗滌的人紅細(xì)胞(13%)和10%(w/v)牛血清清蛋白(26%)的pH7.4 Krebs高碳酸氫鹽緩沖液(61%)的灌注液。用95%氧/5%二氧化碳對(duì)該灌注液充氧,并通過肝門靜脈進(jìn)入肝臟,從腔靜脈流出。在再循環(huán)模式中用總灌注體積150ml進(jìn)行IPRL。在實(shí)驗(yàn)期間,以1.33ml/h速率灌注含有?;悄懰?24mg/ml)的溶液,以維持膽汁流。在儲(chǔ)器中加入唾液酸缺乏的NIF1(0.25mg,實(shí)施例7A),在2、5、10、15、20、30、45、60、75和90分鐘后從儲(chǔ)器除去灌注樣品。在實(shí)驗(yàn)期間收集膽汁(0-90分鐘)。對(duì)于競爭性研究,唾液酸缺乏的NIF(0.25mg)與唾液酸缺乏的胎球蛋白(10mg,Sigma A1908)一起施用。離心灌注樣品并除去上清液,冷凍儲(chǔ)藏用于隨后分析。還冷凍儲(chǔ)藏膽汁樣品用于分析。用對(duì)血漿詳述的Delfia免疫試驗(yàn)測定IPRL灌注液和膽汁樣品中的NIFI濃度(實(shí)施例8C)。
C.NIF1血漿樣品的分析用解離增強(qiáng)鑭熒光免疫試驗(yàn)(Delfia)分析血漿樣品。該試驗(yàn)是使用銪標(biāo)記的單克隆抗-NIF抗體作為檢測試劑的“夾心非競爭性免疫試驗(yàn)”。多克隆家兔抗-NIP抗體與用抗家兔抗體包涂的平板結(jié)合。樣品或標(biāo)準(zhǔn)中的NIF與多克隆抗體結(jié)合,最后銪標(biāo)記的單克隆抗體與結(jié)合的NIF上的另一個(gè)表位結(jié)合。加入“增強(qiáng)”溶液后,確定銪。為了進(jìn)行該試驗(yàn),需要5微升血漿。
血漿中的分析范圍是0.1-40微克/毫升。評(píng)估了該試驗(yàn)的準(zhǔn)確性,累積變動(dòng)在0.1,3和40微克/毫升分別為10.5、3.4、6.3%。用質(zhì)量控制樣品檢測試驗(yàn)日與日之間的表現(xiàn)。Delfia免疫試驗(yàn)的特性良好,先前用于確定許多含有分子的蛋白質(zhì)的血漿濃度,包括干擾素(Ronnblom等,APMIS,105,pp.531-536(1997))、載脂蛋白D(Knipping等,J.Immunological Methods,202,pp.85-95(1997))、甲狀腺球蛋白(Dai等,Clinical Biochemistry,29,pp.461-465(1996)和脂蛋白脂肪酶(Wicher等,J.Immunological Methods,192,pp.1-11(1996)))。
D.藥物動(dòng)力學(xué)分析用標(biāo)準(zhǔn)算法測定藥物動(dòng)力學(xué)。用log(血漿濃度)對(duì)時(shí)間的線性回歸從血漿濃度的時(shí)間圖確定消除速率常數(shù)(Kel)。用下列等式確定半衰期半衰期=(Ln2)/Kel-用線性梯形法則從時(shí)間0到最后數(shù)據(jù)點(diǎn)計(jì)算在血漿濃度時(shí)間曲線(AUC)下的面積。用消除速率常數(shù)將AUC外推到無窮大。用下列關(guān)系計(jì)算消除率劑量除以AUC(0-∞)。分布體積是用下列關(guān)系計(jì)算的消除率除以消除速率常數(shù)。
IPRL中的肝臟提取值是通過IPRL中獲得的清除率值除以IPRL流速(15ml/分鐘),并將該值乘以100計(jì)算的。清除率和半衰期測定的結(jié)果列于下表V。用說明書中上文所述的方法測定NIF1滴度。
表V
序列表<110>S.B.普盧希爾(Pluschkell,Stefanie B.)R.W.吉爾達(dá)特(Geldart,Roderick W.)L.何(Ho,Lewis)M.A.科勒爾(Koehler,Mark A.)C.A.奧基迪(Okediadi,Centy A.)S.J.皮亞(Pias,Steven J.)M.M.朱(Zhu,Marie M.)<120>制備嗜中性粒細(xì)胞抑制因子的方法<130>018813-0301456<140>
<141>
<160>11<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>825<212>DNA<213>犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(822)<400>1atg gag gcc tat ctt gtg gtc tta att gcc att gct ggc ata gct cat 48Met Glu Ala Tyr Leu Val Val Leu Ile Ala Ile Ala Gly Ile Ala His1 5 10 15tcc aat gaa cac aac ctg agg tgc ccg cag aat gga aca gaa atg ccc 96Ser Asn Glu His Asn Leu Arg Cys Pro Gln Asn Gly Thr Glu Met Pro20 25 30ggt ttc aac gac tcg att agg ctt caa ttt tta gca atg cac aat ggt 144Gly Phe Asn Asp Ser Ile Arg Leu Gln Phe Leu Ala Met His Asn Gly35 40 45tac aga tca aaa ctt gcg cta ggt cac atc agc ata act gaa gaa tcc 192Tyr Arg Ser Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Ser Ile Thr Glu Glu Ser50 55 60gaa agt gac gat gat gac gat ttc ggt ttt tta ccc gat ttc gct cca 240Glu Ser Asp Asp Asp Asp Asp Phe Gly Phe Leu Pro Asp Phe Ala Pro65 70 75 80agg gca tcg aaa atg aga tat ctg gaa tat gac tgt gaa gct gaa aaa 288Arg Ala Ser Lys Met Arg Tyr Leu Glu Tyr Asp Cys Glu Ala Glu Lys85 90 95agc gcc tac atg tcg gct aga aat tgc tcg gac agt tct tct cca cca 336Ser Ala Tyr Met Ser Ala Arg Asn Cys Ser Asp Ser Ser Ser Pro Pro100 105 110
gag ggc tac gat gaa aac aag tat att ttc gaa aac tca aac aat atc 384Glu Gly Tyr Asp Glu Asn Lys Tyr Ile Phe Glu Asn Ser Asn Asn Ile115 120 125agt gaa gct gct ctg aag gcc atg atc tcg tgg gca aaa gag gct ttc 432Ser Glu Ala Ala Leu Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys Glu Ala Phe130 135 140aac cta aat aaa aca aaa gaa gga gaa gga gtt ctg tac cgg tcg aac 480Asn Leu Asn Lys Thr Lys Glu Gly Glu Gly Val Leu Tyr Arg Ser Asn145 150 155 160cac gac ata tca aac ttc gct aat ctg gct tgg gac gcg cgt gaa aag 528His Asp Ile Ser Asn Phe Ala Asn Leu Ala Trp Asp Ala Arg Glu Lys165 170 175ttt ggt tgc gca gtt gtt aac tgc cct ttg gga gaa atc gat gat gaa 576Phe Gly Cys Ala Val Val Asn Cys Pro Leu Gly Glu Ile Asp Asp Glu180 185 190acc aac cat gat gga gaa acc tat gca aca acc atc cat gta gtc tgc 624Thr Asn His Asp Gly Glu Thr Tyr Ala Thr Thr lle His Val Val Cys195 200 205cac tac ccg aaa ata aac aaa act gaa gga cag ccg att tac aag gta 672His Tyr Pro Lys Ile Asn Lys Thr Glu Gly Gln Pro Ile Tyr Lys Val210 215 220ggg aca cca tgc gac gat tgc agt gaa tac aca aaa aaa gca gac aat 720Gly Thr Pro Cys Asp Asp Cys Ser Glu Tyr Thr Lys Lys Ala Asp Asn225 230 235240acc acg tct gcg gat ccg gtg tgt att ccg gat gac gga gtc tgc ttt 768Thr Thr Ser Ala Asp Pro Val Cys Ile Pro Asp Asp Gly Val Cys Phe245 250 255att ggc tcg aaa gcc gat tac gat agc aag gag ttt tat cga ttc cga 816Ile Gly Ser Lys Ala Asp Tyr Asp Ser Lys Glu Phe Tyr Arg Phe Arg260 265 270gag tta tga 825Glu Leu<210>2<211>274<212>PRT<213>犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)<400>2Met Glu Ala Tyr Leu Val Val Leu Ile Ala Ile Ala Gly Ile Ala His1 5 10 15Ser Asn Glu His Asn Leu Arg Cys Pro Gln Asn Gly Thr Glu Met Pro20 25 30Gly Phe Asn Asp Ser Ile Arg Leu Gln Phe Leu Ala Met His Asn Gly35 40 45Tyr Arg Ser Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Ser Ile Thr Glu Glu Ser50 55 60Glu Ser Asp Asp Asp Asp Asp Phe Gly Phe Leu Pro Asp Phe Ala Pro65 70 75 80Arg Ala Ser Lys Met Arg Tyr Leu Glu Tyr Asp Cys Glu Ala Glu Lys85 90 95Ser Ala Tyr Met Ser Ala Arg Asn Cys Ser Asp Ser Ser Ser Pro Pro
100 105 110Glu Gly Tyr Asp Glu Asn Lys Tyr Ile Phe Glu Asn Ser Asn Asn Ile115 120 125Ser Glu Ala Ala Leu Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys Glu Ala Phe130 135 140Asn Leu Asn Lys Thr Lys Glu Gly Glu Gly Val Leu Tyr Arg Ser Asn145 150 155 160His Asp Ile Ser Asn Phe Ala Asn Leu Ala Trp Asp Ala Arg Glu Lys165 170 175Phe Gly Cys Ala Val Val Asn Cys Pro Leu Gly Glu Ile Asp Asp Glu180 185 190Thr Asn His Asp Gly Glu Thr Tyr Ala Thr Thr Ile His Val Val Cys195 200 205His Tyr Pro Lys Ile Asn Lys Thr Glu Gly Gln Pro Ile Tyr Lys Val210 215 220Gly Thr Pro Cys Asp Asp Cys Ser Glu Tyr Thr Lys Lys Ala Asp Asn225 230 235 240Thr Thr Ser Ala Asp Pro Val Cys Ile Pro Asp Asp Gly Val Cys Phe245 250 255Ile Gly Ser Lys Ala Asp Tyr Asp Ser Lys Glu Phe Tyr Arg Phe Arg260 265 270Glu Leu<210>3<211>257<212>PRT<213>犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(257)<400>3Asn Glu His Asn Leu Arg Cys Pro Gln Asn Gly Thr Glu Met Pro Gly1 5 10 15Phe Asn Asp Ser Ile Arg Leu Glu Phe Leu Ala Met His Asn Gly Tyr20 25 30Arg Ser Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Ser Ile Thr Glu Glu Ser Glu35 40 45Ser Asp Asp Asp Asp Asp Phe Gly Phe Leu Pro Asp Phe Ala Pro Arg50 55 60Ala Ser Lys Met Arg Tyr Leu Glu Tyr Asp Cys Glu Ala Glu Lys Ser65 70 75 80Ala Tyr Met Ser Ala Arg Asn Cys Ser Asp Ser Ser Ser Pro Pro Glu85 90 95Gly Tyr Asp Glu Asn Lys Tyr Ile Phe Glu Asn Ser Asn Asn Ile Ser100 105 110Glu Ala Ala Leu Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys Glu Ala Phe Asn115 120 125Leu Asn Lys Thr Lys Glu Gly Glu Gly Val Leu Tyr Arg Ser Asn His130 135 140Asp Ile Ser Asn Phe Ala Asn Leu Ala Trp Asp Ala Arg Glu Lys Phe
145 150 155 160Gly Cys Ala Val Val Asn Cys Pro Leu Gly Glu Ile Asp Asp Glu Thr165 170 175Asn His Asp Gly Glu Thr Tyr Ala Thr Thr Ile His Val Val Cys His180 185 190Tyr Pro Lys Ile Asn Lys Thr Glu Gly Gln Pro Ile Tyr Lys Val Gly195 200 205Thr Pro Cys Asp Asp Cys Ser Glu Tyr Thr Lys Lys Ala Asp Asn Thr210 215 220Thr Ser Ala Asp Pro Val Cys Ile Pro Asp Asp Gly Val Cys Phe Ile225 230 235 240Gly Ser Lys Ala Asp Tyr Asp Ser Lys Glu Phe Tyr Arg Phe Arg Glu245 250 255Leu<210>4<211>8<212>PRT<213>犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)<400>4Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)<400>5Glu Phe Tyr Arg Phe Arg Glu Leu1 5<210>6<211>11<212>PRT<213>犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)<400>6Asp Ile Ser Asn Phe Ala Asn Leu Ala Trp Asp1 5 10<210>7<211>30<212>PRT<213>犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)<400>7Asp Glu Asn Lys Tyr Ile Phe Glu Asn Ser Asn Asn Ile Ser Glu Ala1 510 15Ala Leu Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys Glu Ala Phe Asn20 25 30
<210>8<211>885<212>DNA<213>部分犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)<400>8ggcgaattca ccatggaggc ctatcttgtg gtcttaattg ccattgctgg catagctcat 60tccaatgaac acaacctgag gtgcccgcag aatggaacag aaatgcccgg tttcaacgac 120tcgattaggc ttcaattttt agcaatgcac aatggttaca gatcaaaact tgcgctaggt 180cacatcagca taactgaaga atccgaaagt gacgatgatg acgatttcgg ttttttaccc 240gatttcgctc caagggcatc gaaaatgaga tatctggaat atgactgtga agctgaaaaa 300agcgcctaca tgtcggctag aaattgctcg gacagttctt ctccaccaga gggctacgat 360gaaaacaagt atattttcga aaactcaaac aatatcagtg aagctgctct gaaggccatg 420atctcgtggg caaaagaggc tttcaaccta aataaaacaa aagaaggaga aggagttctg 480taccggtcga accacgacat atcaaacttc gctaatctgg cttgggacgc gcgtgaaaag 540tttggttgcg cagttgttaa ctgccctttg ggagaaatcg atgatgaaac caaccatgat 600ggagaaacct atgcaacaac catccatgta gtctgccact acccgaaaat aaacaaaact 660gaaggacagc cgatttacaa ggtagggaca ccatgcgacg attgcagtga atacacaaaa 720aaagcagaca ataccacgtc tgcggatccg gtgtgtattc cggatgacgg agtctgcttt 780attggctcga aagccgatta cgatagcaag gagttttatc gattccgaga gttatgaata 840agtcgagacg tataaagaag ccaaggcaac gtaagcgaga atttc 885<210>9<211>1845<212>DNA<213>犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)<400>9agttctcaga tagtcacagt agcccttctt ttcattgtac acaagtgaag atgggcactt 60catggtagtc gcgactcctt cattacagta aacatagtcg gatgtgcatc ccaacgaata 120gtagccattc tgctttgtct tgcagtcaac ggtcttcgca atttgtggta cagcagcagg 180agccggaggc tgcatcgctg gagctgctgg tggagctggc acaacagaag ccggaggtgg 240agcaaccagt tcaggcgtgc agttctcagg atagtcgcag tagcccttct tctcatggta 300tacaagtgaa gaatggaggc ctatcttgtg gtcttaattg ccattgctgg catagctcat 360tccaatgaac acaacctgag gtgcccgcag aatggaacag aaatgcccgg tttcaacgac 420tcgattaggc ttcaattttt agcaatgcac aatggttaca gatcaaaact tgcgctaggt 480cacatcagca taactgaaga atccgaaagt gacgatgatg acgatttcgg ttttttaccc 540gatttcgctc caagggcatc gaaaatgaga tatctggaat atgactgtga agctgaaaaa 600agcgcctaca tgtcggctag aaattgctcg gacagttctt ctccaccaga gggctacgat 660gaaaacaagt atattttcga aaactcaaac aatatcagtg aagctgctct gaaggccatg 720atctcgtggg caaaagaggc tttcaaccta aataaaacaa aagaaggaga aggagttctg 780taccggtcga accacgacat atcaaacttc gctaatctgg cttgggacgc gcgtgaaaag 840tttggttgtc gcagttgtta actgcccttt gggagaaatc gatgatgaaa ccaaccatga 900tggagaaacc tatgcaacaa ccatccatgt agtctgccac tacccgaaaa taaacaaaac 960tgaaggacag ccgatttaca aggtagggac accatgcgac gattgcagtg atacacaaaa 1020aaagcagaca ataccacgtc tgcggatccg gtgtgtattc cggatgacgg agtctgcttt 1080attggctcga aagccgatta cgatagcaag gagttttatc gattccgaga gttatgaata 1140agtcgagacg tataaagaag ccaaggcaac gtaagcgagc aagtctcgaa gacgatggag 1200tcagcgaaag aggcggctgc caaagttggc gagcaggtgt cagatttttt ccaagggaac 1260ccattttcca cgcctgtggg ccgcaagata gaacttgcca cgaacgcttc gattcttgca 1320ctgagaattg gggtttgaac atggaaatct gtgatttcgt caataacact gaggacggtg 1380
ccaaagatgc tgtacgggct attcgcaaac gtctgcacac aaatatgtgt aagaataacg 1440caatcgtcat gtacacatta acggtgctgg agacgtgcgt gaagaactgt ggccataatt 1500tccacgtgct cgtatgttcc aaggactttg tgcaggattt ggtgaagttg atcggctcga 1560agttcgatac gcctcagatt attcacgagc gtgtattgtc acttattcag gcttgggcag 1620atgcattccg caatcaacca gatcttcagg gagtcgtaca ggtctatgaa gaacttgtta 1680gtaagggggt tacattccct gcaactgatc tagacgctat ggcacctata ctaacaccaa 1740aacaaacagt cttcactgag ccaaaggcat caacggctgt tccttcgcag tcaggtggag 1800gacctagtta cgaggtggtc agccaaccag atggtccaat ttact 1845<210>10<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述來自克隆載體的合成序列<400>10ctgcagtcac cgtccttgac acaagcttga tatcgaattc acc43<210>11<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述來自克隆載體的合成序列<400>11ataagtcgag acgtataaag aagccaaggc aacgtaagcg agaattcctg cagcccggg 59
權(quán)利要求
1.一種制備嗜中性粒細(xì)胞抑制因子的方法,其特征在于,該方法包括步驟在無動(dòng)物成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)嗜中性粒細(xì)胞抑制因子的細(xì)胞系,以得到生產(chǎn)培養(yǎng)物,所述培養(yǎng)基選自接種生長培養(yǎng)基、生產(chǎn)生長培養(yǎng)基和營養(yǎng)物進(jìn)料。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述嗜中性粒細(xì)胞抑制因子是SEQID NO3的蛋白質(zhì)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述蛋白質(zhì)是糖基化的,具有約38.3-64.1kDa的相對(duì)分子量。
4.如權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于,所述蛋白質(zhì)約5-25%-唾液酸化;約10-30%二唾液酸化;約15-35%三唾液酸化;約15-45%四唾液酸化;和約1-20%無唾液酸化。
5.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述無動(dòng)物成分生產(chǎn)生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)次黃嘌呤鈉/胸腺嘧啶溶液;和(iii)酵母提取物。
6.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述無動(dòng)物成分生產(chǎn)生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)約5-20ml/l(i)的10mM次黃嘌呤鈉/1.6M胸腺嘧啶溶液;和(iii)約0.5-5.0g/升(i)的酵母提取物。
7.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述無動(dòng)物成分生產(chǎn)生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)10.0ml/l(i)的10mM次黃嘌呤鈉/1.6M胸腺嘧啶溶液;和(iii)1.5g/升(i)的酵母提取物。
8.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,該方法還包括步驟(a)提供接種物,所述接種物是通過在無動(dòng)物成分的接種生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)嗜中性粒細(xì)胞抑制因子的細(xì)胞系;和(b)將所述接種物轉(zhuǎn)移到含無動(dòng)物成分的生產(chǎn)生長培養(yǎng)基的容器中。
9.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,所述接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)次黃嘌呤鈉/胸腺嘧啶溶液;(iii)氨基酸溶液,含有選自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-甲硫氨酸的氨基酸;(iv)可任選的,L-甲硫氨酸磺亞胺溶液;和(v)L-半胱氨酸溶液。
10.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,所述接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)約5-20ml/L(i)的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸腺嘧啶溶液;(iii)約5-30ml/l(i)的氨基酸溶液,含有3.0g/l的L-天冬氨酸、2.5g/l的L-谷氨酸、10.0g/l的L-天冬酰胺、1.25g/l的L-脯氨酸、3.0g/l的L-絲氨酸和1.5g/l的L-甲硫氨酸;(iv)約0-75μmol/l(i)的L-甲硫氨酸磺亞胺溶液;和(v)約10-40mg/l(i)的L-半胱氨酸。
11.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,所述接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)10.0ml/L(i)的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸腺嘧啶溶液;(iii)20.0ml/l(i)的氨基酸溶液,含有3.0g/l的L-天冬氨酸、2.5g/l的L-谷氨酸、10.0g/l的L-天冬酰胺、1.25g/l的L-脯氨酸、3.0g/l的L-絲氨酸和1.5g/l的L-甲硫氨酸;(iv)可任選的1.0ml/l(i)的25mM L-甲硫氨酸磺亞胺溶液;和(v)25.0mg/l(i)的L-半胱氨酸溶液。
12.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,該方法還包括步驟(c)用至少一種營養(yǎng)物進(jìn)料供給生產(chǎn)培養(yǎng)物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法,其特征在于,所述步驟(c)包括第一營養(yǎng)物進(jìn)料和第二營養(yǎng)物進(jìn)料。
14.如權(quán)利要求13所述的方法,其特征在于,所述第一營養(yǎng)物進(jìn)料是含有約100-500g/l葡萄糖的水溶液的營養(yǎng)物進(jìn)料。
15.如權(quán)利要求13所述的方法,其特征在于,所述第一營養(yǎng)物進(jìn)料是含有約200g/l葡萄糖的水溶液的營養(yǎng)物進(jìn)料。
16.如權(quán)利要求15所述的方法,其特征在于,所述第一營養(yǎng)物進(jìn)料以每天每升生長培養(yǎng)基約0.0-0.6克葡萄糖的速率加入。
17.如權(quán)利要求13所述的方法,其特征在于,所述第二營養(yǎng)物進(jìn)料含有(i)CHO-III-PFM(5X)溶液,含有1X L-半胱氨酸、3X L-酪氨酸,不含葡萄糖、次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉或氯化鈉;(ii)每升溶液(i)25-100ml 10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;和(iii)每升溶液(i)5-20g酵母提取物。
18.如權(quán)利要求13所述的方法,其特征在于,所述第二營養(yǎng)物進(jìn)料含有(i)CHO-III-PFM(5X)溶液,含1X L-半胱氨酸,3X L-酪氨酸,不含葡萄糖、次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉、氯化鈉;(ii)每升溶液(i)50ml 10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;和(iii)每升溶液(i)7.5g酵母提取物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法,其特征在于,第二營養(yǎng)物進(jìn)料以每天每升約25ml的速率連續(xù)加到反應(yīng)器中。
20.如權(quán)利要求13所述的方法,其特征在于,所述營養(yǎng)物進(jìn)料含有約100-500g/L葡萄糖,所述第二營養(yǎng)物進(jìn)料含有(1)CHO-III-PFM(5x)溶液,(2)每升(1)約25-100ml的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸腺嘧啶溶液;和(3)每升(1)約5-5g酵母提取物。
21.如權(quán)利要求12所述的方法,其特征在于,所述營養(yǎng)物進(jìn)料是含有約100-500g/l葡萄糖的水溶液的營養(yǎng)物進(jìn)料。
22.如權(quán)利要求13所述的方法,其特征在于,所述第一營養(yǎng)物進(jìn)料是含有約200g/l葡萄糖的水溶液的營養(yǎng)物進(jìn)料。
23.如權(quán)利要求22所述的方法,其特征在于,所述營養(yǎng)物進(jìn)料以每天每升生長培養(yǎng)基約0.0-0.6克葡萄糖的速率加入。
24.用權(quán)利要求1所述的方法制備的嗜中性粒細(xì)胞抑制因子。
25.一種無動(dòng)物成分生產(chǎn)生長培養(yǎng)基,其特征在于,該培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)次黃嘌呤鈉/胸腺嘧啶溶液;和(iii)酵母提取物。
26.如權(quán)利要求25所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)約5-20ml/l(i)的10mM次黃嘌呤鈉/1.6M胸腺嘧啶溶液;和(iii)約0.5-5.0g/升(i)的酵母提取物。
27.如權(quán)利要求25所述的培養(yǎng)基,其特征在于,所述培養(yǎng)基含有;(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)10.0ml/l(i)的10mM次黃嘌呤鈉/1.6M胸腺嘧啶溶液;和(iii)1.5g/升(i)的酵母提取物。
28.一種制備重組蛋白質(zhì)的方法,其特征在于,該方法包括在權(quán)利要求25所述的無動(dòng)物成分生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)外源重組蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
29.如權(quán)利要求28所述的方法,其特征在于,所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是被含有重組蛋白DNA編碼區(qū)的谷氨酰胺合成酶質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞。
30.如權(quán)利要求29所述的方法,其特征在于,所述載體是選自pEE14和pEE14.1的谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亞胺共擴(kuò)增載體。
31.一種接種生長培養(yǎng)基,其特征在于,該培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)次黃嘌呤鈉/胸腺嘧啶溶液;(iii)氨基酸溶液,含有選自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-絲氨酸和L-甲硫氨酸的氨基酸;(iv)可任選的,L-甲硫氨酸磺亞胺溶液;和(v)L-半胱氨酸溶液。
32.如權(quán)利要求31所述的接種生長培養(yǎng)基,其特征在于,該培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)約5-20ml/L(i)的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸腺嘧啶溶液;(iii)約5-30ml/l(i)的氨基酸溶液,含有約3.0g/l的L-天冬氨酸、約2.5g/l的L-谷氨酸、約10.0g/l的L-天冬酰胺、約1.25g/l的L-脯氨酸、約3.0g/l的L-絲氨酸和約1.5g/l的L-甲硫氨酸;(iv)約0-75μmol/l(i)的L-甲硫氨酸磺亞胺;和(v)約10-40mg/l(i)的L-半胱氨酸溶液。
33.如權(quán)利要求32所述的接種生長培養(yǎng)基,其特征在于,所述接種生長培養(yǎng)基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液;(ii)10.0ml/L(i)的10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸腺嘧啶溶液;(iii)20.0ml/l(i)的氨基酸溶液,含有3.0g/l的L-天冬天氨酸、2.5g/l的L-谷氨酸、10.0g/l的L-天冬酰胺、1.25g/l的L-脯氨酸、3.0g/l的L-絲氨酸和1.5g/l的L-甲硫氨酸;(iv)可任選的1.0ml/l(i)的25mM L-甲硫氨酸磺亞胺溶液;和(v)25.0mg/l(i)的L-半胱氨酸溶液。
34.一種營養(yǎng)物進(jìn)料,其特征在于,該進(jìn)料含有(i)CHO-III-PFM(5x)溶液,含有1x L-半胱氨酸、3X L-酪氨酸,不含葡萄糖、次黃嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氫鈉或氯化鈉;(ii)每升溶液(i)25-111ml 10mM次黃嘌呤鈉/1.6mM胸苷溶液;和(iii)每升溶液(i)5-20g酵母提取物。
35.細(xì)胞系PFG-01ATCC PTA-2503。
36.一種制備嗜中性粒細(xì)胞抑制因子的方法,其特征在于,該方法包括在促進(jìn)嗜中性粒細(xì)胞抑制因子表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求35所述的細(xì)胞系,并回收嗜中性粒細(xì)胞抑制因子。
37.如權(quán)利要求36所述的方法,其特征在于,所述嗜中性粒細(xì)胞抑制因子含有SEQ ID NO3的氨基酸序列。
38.通過培養(yǎng)細(xì)胞系PFG01ATCC PTA-2503制備的嗜中性粒細(xì)胞抑制因子。
39.用權(quán)利要求36或37所述的方法制備的嗜中性粒細(xì)胞抑制因子。
40.如權(quán)利要求1-23任一所述的方法,其特征在于,所述細(xì)胞系是PFG01ATCCPTA-2503。
41.用權(quán)利要求1-23任一所述的方法制備的嗜中性粒細(xì)胞抑制因子。
42.一種分離的嗜中性粒細(xì)胞抑制因子,其特征在于,該抑制因子具有嗜中性粒細(xì)胞抑制活性,具有由細(xì)胞系PFG01ATCC PTA-2503產(chǎn)生的SEQ ID NO3的氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備嗜中性粒細(xì)胞抑制因子(NIF)的方法,它包括在無動(dòng)物成分的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)NIF的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明可用于大規(guī)模制備NIF。本發(fā)明還涉及制備重組蛋白質(zhì)的方法,它包括在無動(dòng)物成分的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)表達(dá)外源重組蛋白質(zhì)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1531592SQ01816825
公開日2004年9月22日 申請(qǐng)日期2001年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月23日
發(fā)明者S·B·普盧希爾, R·W·吉爾達(dá)特, L·何, M·A·科勒爾, C·A·奧基迪, S·J·皮亞, M·M·朱, S·J·霍賴?yán)? M·莫伊爾, S B 普盧希爾, 吉爾達(dá)特, 奧基迪, 朱, 煉, 皮亞, 科勒爾, 霍賴?yán)?申請(qǐng)人:菲塞產(chǎn)品股份有限公司, 科爾凡斯國際股份有限公司