專利名稱：Il－8受體拮抗劑在治療病毒感染中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及IL-8、GROα、GROβ、GROγ、NAP-2和ENA-78調(diào)節(jié)劑在治療病毒感染中的應(yīng)用。
HRV能感染鼻上皮細(xì)胞。最近的證據(jù)表明病毒也可感染支氣管上皮組織。在感染后的24小時內(nèi)會出現(xiàn)前驅(qū)感冒癥狀，2至5天時最嚴(yán)重，在7-14天之內(nèi)消退。然而，這種效應(yīng)對一些個體的影響時間更長。當(dāng)病毒清除后，癥狀往往還存在。據(jù)信，這些癥狀是更多地由宿主對感染的反應(yīng)而引起的，而非急性細(xì)胞毒素效應(yīng)所致，這是因為僅有小部分的上呼吸道上皮細(xì)胞被證實感染，受損的上皮細(xì)胞極少。在感染了鼻病毒的正常個體中發(fā)現(xiàn)其鼻內(nèi)的激肽、IL-1、IL-8、IL6、IL-11和嗜中性白細(xì)胞水平增加。最近的幾項研究已經(jīng)證實了鼻分泌物中IL-8濃度與局部骨髓過氧化物酶水平以及癥狀嚴(yán)重性之間的相關(guān)性。IL-1和IL-6的鼻內(nèi)濃度也與癥狀的嚴(yán)重性相關(guān)。實驗性鼻病毒感染也可導(dǎo)致增強型直接和晚期變態(tài)反應(yīng)，并可增加T淋巴細(xì)胞和嗜曙紅細(xì)胞對下氣道的浸潤。在特異性和哮喘中，這些效應(yīng)會持續(xù)至感染后的2個月。已經(jīng)證明人支氣管上皮細(xì)胞系在對鼻病毒感染的應(yīng)答中可產(chǎn)生IL-1、IL-6，IL-8、IL-11和GM-CSF。因此，鼻病毒感染的上皮細(xì)胞早期產(chǎn)生的細(xì)胞因子會引起嗜中性白細(xì)胞、T細(xì)胞和活化嗜曙紅細(xì)胞觸發(fā)補充到上和下氣道中。
另外，在對其他呼吸病毒(流感、呼吸道合胞體病毒)感染的應(yīng)答中也會產(chǎn)生IL-1、IL-6和IL-8，所述病毒可誘導(dǎo)普通感冒和相關(guān)后遺癥。
白介素-8(IL-8)有許多不同的名稱，例如嗜中性誘引劑/活化蛋白-1(NAP-1)、單核細(xì)胞衍生的嗜中性白細(xì)胞趨化因子(MDNCF)、嗜中性白細(xì)胞活化因子(NAF)和T細(xì)胞淋巴細(xì)胞趨化因子。白介素-8是嗜中性白細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞和T細(xì)胞亞型的化學(xué)引誘物。它可由許多有核細(xì)胞(包括接觸TNF、IL-1α、IL-1β或LPS的巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，并可由接觸LPS或趨化因子例如FMLP的嗜中性白細(xì)胞本身產(chǎn)生。參見M.Baggiolini等，J.Clin.Invest.84，1045(1989)；J.Schroder等，J.Immunol.139，3474(1987)和J.Immunol.144，2223(1990)；Strieter等，Science 243，1467(1989)和J.Biol.Chem.264，10621(1989)；Cassatella等，J.Immunol.148，3216(1992)。
GROα、Groβ、GROγ和NAP-2也屬于趨化因子家族。與IL-8一樣，這些趨化因子也具有許多不同的名稱。例如GROα、β、γ分別被稱為MGSAα、β、γ(黑素瘤生長刺激活性)，參見Richmond等，J.Cell Physiology 129，375(1986)和Chang等，J.Immunol 148，451(1992)。在CXC基序之前直接具有ELR基序的所有α-家族趨化因子均可與IL-8B受體(CXCR2)結(jié)合。
IL-8、GROα、Groβ、GROγ、NAP-2和ENA-78可在體外刺激多種功能。它們對嗜中性白細(xì)胞均表現(xiàn)出化學(xué)引誘物特性，而IL-8和GROα已證實具有T-淋巴細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞趨化活性。另外，IL-8可誘導(dǎo)組胺從正常和特異反應(yīng)性個體的嗜堿細(xì)胞中釋放。GROα和IL-8還可誘導(dǎo)嗜中性白細(xì)胞的溶菌酶釋放和呼吸爆發(fā)。IL-8還可增加Mac-1(CD1 lb/CD18)在嗜中性白細(xì)胞上的表面表達(dá)而沒有全程合成蛋白質(zhì)。
在體外，IL-8、GROα、Groβ、GROγ和NAP-2可通過結(jié)合并活化七跨膜受體、G蛋白結(jié)合家族，特別是IL-8受體、尤其是IL-8β受體(CXCR2)結(jié)合，而誘導(dǎo)嗜中性白細(xì)胞的形態(tài)變化、趨化性、顆粒釋放和呼吸爆發(fā)。Thomas等，J.Biol.Chem.266，14839(1991)；和Holmes等，Science253，1278(1991)已經(jīng)表征了兩種高親合性的人IL-8受體(77％同源性)IL-8RA，它僅與IL-8以高親合性結(jié)合，和IL-8RB，它與IL-8以及GROα、Groβ、GROγ和NAP-2具有高親合性。參見Holmes等，同上述文獻(xiàn)；Murphy等，Science 253，1280(1991)；Lee等，J.Biol.Chem.267，16283(1992)；LaRosa等，J.Biol.Chem.267，25402(1992)；和Gayle等，J.Biol.Chem.268，7283(1993)。
因病毒感染而對上皮細(xì)胞的生物化學(xué)進程所造成的干擾代表了IL-8受體拮抗劑的可行的新型治療靶。本發(fā)明即涉及治療這種治療靶的新發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明將證實IL-8受體拮抗劑可用來治療與呼吸病毒感染相關(guān)的癥狀，它能防止/減輕潛在癥狀(包括哮喘和中耳炎、COPD、鼻竇炎、慢性支氣管炎等)加重的程度。
適宜的IL-8抑制劑是本領(lǐng)域已知的，而且測定IL-8抑制的分析法也可很容易獲得。例如，參見美國專利5886044，5780483，6005008，5929250，6015908；5919776；美國專利申請09/111663，09/125279，09/240354，09/202570，09/202586，09/202569，09/202568，09/230120，09/230290，09/230952，09/230977，09/230981，09/230980，09/242187，09/341378，09/341382，09/341262，09/463673，09/508039，09/486986；WO99/65310，WO0012489，WO0009511，WO9942464，WO9942463，WO9942461，WO00/05216，WO99/36069，WO99/36070，WO00/06557；PCT/US99/23776，PCT/US99/29940；美國臨時申請60/134728，60/136666，60/136665，60/136717，60/136667，60/139675，60/139680，60/139678，60/139673，60/140024，60/139677，60/139674，60/140025，60/145756，60/164350，60/186239，60/186183，60/186182，60/188410，60/188243，60/189176，60/189175，60/189848，60/192132，或60/196022。
IL-8受體拮抗劑也可與第二治療劑聯(lián)用。所述第二種治療劑可以是抗病毒劑，例如利巴韋林、amantidine、rimantidine、relenza、tamiflu、BTA 188、RWJ-270210(BCX1812)、sICAM-1、tICAM453、Pleconaril或AG 7088；也可是抗組胺劑，例如苯海拉明、撲爾敏及其鹽、溴苯吡丙胺及其鹽等，減充血劑，例如N-去甲麻黃堿及其鹽、假麻黃堿及其鹽；甾族化合物，例如地塞米松、潑尼松或氫化潑尼松等；各種抗生素，例如喹諾酮類、頭孢菌素類、p-內(nèi)酰胺酶抑制劑等；抗炎劑，例如CSAIDS、COX-1或COX-2抑制劑、ASA、或吲哚美辛等。
附圖
2-為CXCR2拮抗劑X對RV-誘導(dǎo)的人嗜中性白細(xì)胞趨化性的抑制附圖3-為RV、Groα、Groβ和groβ-T誘導(dǎo)的嗜中性白細(xì)胞中鈣遷移。
治療方法本發(fā)明IL-8受體拮抗劑或其藥用鹽可用來制造用于預(yù)防性或治療性治療人或其他哺乳動物病毒感染癥候或后遺癥的藥物，所述癥候或后遺癥是因哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生過度或失調(diào)的IL-8細(xì)胞因子而加重或所引起的，所述哺乳動物細(xì)胞例如但不限于單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞，或與IL-8A或B受體(也稱為I型或II型受體)結(jié)合的其他趨化因子。
因此，本發(fā)明提供了治療病毒感染的方法，其中趨化因子是與IL-8A或B受體結(jié)合的趨化因子，該方法包括給藥有效量的本發(fā)明抑制劑或其藥用鹽。特別地，趨化因子為IL-8、GROα、Groβ、GROγ、NAP-2或ENA-78。
為了使本發(fā)明IL-8受體拮抗劑或其藥用鹽能用于治療，通?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)制藥方法將其配制成藥物組合物。因此，本發(fā)明還涉及藥物組合物，其中包括有效的、非毒性量的本發(fā)明IL-8受體拮抗劑和藥用載體或稀釋劑。
本發(fā)明IL-8受體拮抗劑、及其藥用鹽和藥物組合物可方便地以任何常規(guī)給藥途徑進行給藥，例如口服、局部、經(jīng)頰(bucolally)、非腸道或經(jīng)吸入。它們可以常規(guī)劑型給藥，按照常規(guī)方法將本發(fā)明化合物與標(biāo)準(zhǔn)藥用載體混合，即可制得所述劑型。它們也可與另一已知的治療活性化合物以常規(guī)劑型聯(lián)合給藥。這些方法包括混合、制粒和壓制，或需要時將各成分溶解得到所需制劑?？梢岳斫?，所用的藥用載體或稀釋劑的形式以及特性將取決于與其混合的活性成分的用量、給藥途徑和其他已知因素。載體必須是“可接受的”，即能與制劑中的其他成分配伍并且對接受者無害。
所用的藥用載體例如可以是固體或液體。示例性固體載體是乳糖、白土、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸等。示例性液體載體為糖漿、花生油、橄欖油、水等。同樣地，載體或稀釋劑還可包括本領(lǐng)域已知的延時材料，例如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬酸酯或與蠟的混合物。
可以采用各種藥物形式。如果采用固體載體，則制劑可以經(jīng)壓片、或者置于硬明膠膠囊中的粉末或微丸形式，或者是錠劑或糖錠形式。固體載體的用量可以有較大的變化，但是優(yōu)選約為25mg-1g。當(dāng)采用液體載體時，制劑可以是糖漿劑、乳劑、軟明膠膠囊、無菌注射液例如安瓿劑或非水性液體混懸劑。
本發(fā)明拮抗劑可局部給藥，即非全身性給藥。這包括將本發(fā)明化合物外部給藥到表皮或口腔，以及將化合物滴注到耳、眼和鼻中，從而使化合物不至于明顯地進入血流。相反地，全身性給藥是指經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)和肌內(nèi)給藥。
適于局部給藥的制劑包括適于穿透皮膚炎癥部位的液體或半液體制劑，例如搽劑、洗劑、乳膏、軟膏、或糊劑，和適于耳或鼻給藥的滴劑，適于吸入給藥的溶液或混懸劑。對于局部給藥，活性成分可以占制劑重量的0.001％-10％w/w，例如1％-2％。盡管可高達(dá)制劑的10％w/w，但是優(yōu)選低于5％w/w，更優(yōu)選為0.1％-1％w/w。
本發(fā)明洗劑包括那些適于皮膚或眼部給藥的制劑。眼用洗劑可包括無菌水性溶液，其中任選含有殺菌劑，并且可按類似于配制滴劑的方法配制。皮膚用的洗劑或搽劑也可包括用來加速皮膚干燥和冷卻的試劑，例如醇或丙酮，和/或增濕劑例如甘油或油類例如蓖麻油或花生油。
本發(fā)明乳膏、軟膏或糊劑是供外用的活性成分的半固體制劑。借助于適宜的機械，將單獨的或在水性或非-水性液體中的溶液或混懸液中的細(xì)碎和粉末形式的活性成分與油脂或非油脂基質(zhì)混合，即可制得上述制劑。基質(zhì)可以包括烴類例如硬、軟或液體石蠟、甘油、蜂蠟、金屬皂；膠漿；天然來源的油例如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄欖油；羊毛脂或其衍生物或脂肪酸例如硬脂酸或油酸以及醇例如丙二醇或聚乙二醇。制劑中可摻入任何適宜的表面活性劑，例如陰離子、陽離子或非離子表面活性劑例如脫水山梨醇酯或其聚氧化乙烯衍生物。還可還有助懸劑，例如天然膠、纖維素衍生物或無機材料例如硅石，和其他成分例如羊毛脂。
本發(fā)明滴劑可以包括無菌水性或油性溶液或混懸劑，將活性成分溶于適宜含水溶液中即可制得，所述溶液中含有殺菌劑和/或殺真菌劑和/或任何其他適宜的防腐劑和優(yōu)選包括表面活性劑。然后，經(jīng)濾過將所得溶液澄清，移至適宜的容器中，然后密封并經(jīng)高壓滅菌法或于98-100保持半小時滅菌?；蛘?，將溶液經(jīng)濾過滅菌并在無菌操作下移至容器中。適用于滴劑的示例性殺菌劑和殺真菌劑是硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、氯芐烷銨(0.01％)和醋酸洗必泰(0.01％)。用于制備油性溶液的適宜溶劑包括甘油、稀醇和丙二醇。
本發(fā)明拮抗劑可經(jīng)非腸道給藥，即經(jīng)靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、或腹膜內(nèi)給藥，通常優(yōu)選皮下和肌內(nèi)的非腸道給藥。采用常規(guī)技術(shù)，可配制用于給藥的這類適當(dāng)劑型。本發(fā)明拮抗劑也可經(jīng)吸入給藥，即經(jīng)鼻內(nèi)和口吸入給藥。采用常規(guī)技術(shù)，可配制用于給藥的合適劑型例如氣霧劑或計量吸入劑。
至于在此公開的本發(fā)明拮抗劑的所有使用方法，每日口服劑量方案優(yōu)選約為0.0-80mg/kg體重。每日非腸道劑量方案約為0.00-80mg/kg體重。每日局部劑量方案優(yōu)選為0.1mg-150mg(每日給藥1-4次、優(yōu)選2或3次)。每日吸入劑量方案優(yōu)選約為0.01mg/kg-1mg/kg/天。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明拮抗劑或其藥用鹽的最佳用量和各劑量的給藥間隔取決于所治療病癥的性質(zhì)和程度、劑型、給藥途徑和部位以及所治療的具體患者，所述最佳方案可采用常規(guī)技術(shù)確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以理解，最佳的療程即本發(fā)明化合物或其藥用鹽在指定天數(shù)內(nèi)每天給藥的次數(shù)，可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)的療程確定試驗來確定。
現(xiàn)將參考以下生物學(xué)實施例描述本發(fā)明，這些實施例旨在說明，對本發(fā)明范圍并無限制。生物學(xué)實施例通過以下體外試驗，測定了本發(fā)明化合物的IL-8和GROα的趨化因子抑作用受體結(jié)合試驗[125I]IL-8(人重組體)來自Amersham公司，ArlingtonHeights，IL，其比活性為2000 Ci/mmol。GROα來自NEN-New England Nuclear公司。所有其他化學(xué)品均為分析純。按在先所述(Holmes，等，Science，1991，253，1278)，用中國倉鼠卵巢細(xì)胞分別表達(dá)高水平的重組人IL-8α型和β受體。按一種在先所述的方法(Haour，等，J.Biol.Chem.，249 pp 2195-2205(1974))將中國倉鼠卵巢細(xì)胞勻化。不同的是，勻化緩沖液改為10mM Tris-HCL、1mMMgSO4、0.5mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1mM PMSF(α-甲苯璜酰氟)、0.5mg/L亮肽素，pH 7.5。采用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用Pierce Co.公司的微分析試劑盒測定膜蛋白質(zhì)濃度。所有試驗均在96-孔微平板中完成。每一反應(yīng)混合物含有在20mM Bis-Trispropane和0.4mM Tris HCl緩沖液中(pH 8.0)的125IIL-8(0.25nM)或125I GROα和0.5pg/mL的IL-8Rα或1.0pg/mL的IL-8Rβ膜，所述緩沖液中1.2mM MgSO4、0.1mM EDTA、25mM Na和0.03％CHAPS。此外，加入待試藥物或化合物(預(yù)先溶于DMSO中，其終濃度為0.01nM-100μM)。加入125I-IL-8啟動試驗。室溫反應(yīng)1小時后，用Tomtec 96-孔采集器將平板收采集到玻璃纖維濾墊上(已用1％聚乙烯亞胺/0.5％BSA阻斷)，用25mM NaCl、10.mM TrisHCl、1mM MgSO4、0.5mM EDTA、0.03％CHAPS(pH 7.4)洗滌3次，然后干燥濾器，用Betuplate液體閃爍計數(shù)器計數(shù)。重組體IL-8Rα(或I型)受體在此稱為非允許受體，而重組IL-8Rβ(或II型)受體稱為允許受體。趨化性試驗按照《免疫學(xué)通用方法》(Current Protocols In Immunology)，I卷，增刊1，6.12.3.單元中描述的方法，用嗜中性白細(xì)胞趨化性試驗測定這些化合物的體外抑制特性，其全部公開內(nèi)容在此引入作為參考。如同《免疫學(xué)通用方法》卷I，增刊1 7.23.1單元中的描述，從人血中分離出嗜中性白細(xì)胞，其全部公開內(nèi)容在此引入作為參考。將化學(xué)引誘物IL-8、GROα、GROβ、GROγ和NAP-2置于48孔多孔室(Neuro Probe，Cabin John，MD)的底部室(濃度為0.1-100nM)。兩個室間用5uM聚碳酸酯濾器隔開。當(dāng)檢測本發(fā)明化合物時，在將細(xì)胞加到上部室之前，將化合物與細(xì)胞(0.001-1000nM)混合。在含5％CO2的加濕恒溫箱中，于約37保溫約45-90分鐘。保溫結(jié)束時，除去聚碳酸酯膜，洗滌頂側(cè)面，然后用Diff Quick染色法(Baxter Products，McGaw Park，IL，USA)對膜進行染色。采用顯微鏡，對已趨化成趨化因子的細(xì)胞用肉眼計數(shù)。通常，每個試樣計數(shù)4個區(qū)域，將這些數(shù)字平均得到已遷移細(xì)胞的平均數(shù)。每個試樣試驗三次，每一化合物重復(fù)至少4次。某些細(xì)胞(陽性對照細(xì)胞)中不加入化合物，這些細(xì)胞代表著細(xì)胞的最大趨化性反應(yīng)。在需要陰性對照(未刺激的)的情況下，下部室中不加入趨化因子，陽性對照與陰性對照間的差異代表了細(xì)胞的趨化活性。彈性酶釋放試驗測試了本發(fā)明化合物抑制人嗜中性白細(xì)胞釋放彈性酶的能力。如同《免疫學(xué)通用方法》卷I，增刊1 7.23.1單元中的描述，從人血中分離出嗜中性白細(xì)胞。將懸浮于林格液(NaCl 118、KCl 4.56、NaHCO325、KH2PO41.03、葡萄糖11.1、HEPES 5mM，pH 7.4)中的PMNs(0.88×106細(xì)胞)置于體積為50μl的96孔平板的每一孔中。向平板中加入體積為50μl的待試化合物(0.001-1000nM)、體積為50μl的細(xì)胞松弛素B(20ug/ml)和體積為50μl的林格緩沖液。在加入IL-8、GROα、GROβ、GROγ或NAP-2(終濃度為0.01-1000nM)之前，將這些細(xì)胞加熱(37，5％CO2，95％相對濕度)5分鐘。反應(yīng)進行45分鐘，然后將96孔平板離心(800xg 5分鐘)，取出100μl上清液。將該上清液加至另一96孔平板中，然后加入溶于磷酸緩沖鹽水中的人工彈性酶底物(終濃度為6ug/ml)(MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC，Nova Biochem公司，La Jolla，CA)。按照Nakajima等J.Biol.Chem.254 4027(1979)中的方法，立即將平板置于熒光96孔平板閱讀器(Cytofluor 2350，Millipore，Bedford，MA)上，并以3分鐘的間隔收集數(shù)據(jù)。測定MeOSuc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC的降解率，可計算出從PMNs中釋放的彈性酶量。鼻病毒方法細(xì)胞系和鼻病毒血清型39購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。按照ATCC提供的指導(dǎo)，采用購自Clonetics公司的BEGM(支氣管上皮生長培養(yǎng)基)培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞。將用于病毒檢測和效價的HELA細(xì)胞培養(yǎng)物保持在Eagle氏最低要求標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(含有10％胎牛血清、2mM 1-谷氨酰胺和10mM HEPES緩沖劑(MEM))中。
在這些研究中，采用了Subauste等在上述文獻(xiàn)中報道的體外用鼻病毒感染人支氣管上皮細(xì)胞的改良方法。在用鼻病毒感染之前，將BEAS-2B細(xì)胞(2×105/孔)在膠原涂層的孔中培養(yǎng)24小時。將鼻病毒血清型39加至細(xì)胞培養(yǎng)物中，于34保溫1小時，然后用新鮮培養(yǎng)基替換接種物，再于34將培養(yǎng)物保溫72小時。感染72小時后收集上清液，采用市售試劑盒(R&DSystems)經(jīng)ELISA法測定細(xì)胞因子蛋白質(zhì)的濃度。在HELA細(xì)胞培養(yǎng)物中，采用微量滴定分析法(Subauste等，同上述文獻(xiàn)，1995)，測定培養(yǎng)物上清液中的病毒產(chǎn)量。在感染30分鐘之前，向經(jīng)IL-8抑制劑處理的培養(yǎng)物中加入藥物。在DMSO(10mM藥物)中配制化合物貯備液并與-20貯存。
為了檢測IL-8R的抑制，將培養(yǎng)物置于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中保溫，所述培養(yǎng)基中不含生長因子和添加劑，以減少內(nèi)源性活化的IL-8水平。加入鼻病毒后，在不同時間點采集上清液并濃縮。濃縮物在Superose 6柱上分級。采用Amicon濃縮器(截留摩爾量為5,000)，將上清液濃縮(大于50倍)。向Superose6尺寸分級柱一次進樣(0.5ml)，分級柱用單一流速(0.2ml/min)洗脫。收集0.5ml級分，供在新鮮分離的人PMN(負(fù)載FURA-2)中測定Ca2+遷移活性。結(jié)果表征RV感染的BEAS-2B人上皮細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子在靜止(resting)條件下，人BEAS-2B人上皮細(xì)胞可產(chǎn)生少量的至少3種已知人趨化因子GROα、IL-8和ENA78。與靜止條件下的產(chǎn)量相比，當(dāng)這些細(xì)胞被鼻病毒感染時，這3種ELR趨化因子的產(chǎn)量提高6.6-20倍(表1)。
表1.在靜止和感染的條件下BEAS-2B上皮細(xì)胞產(chǎn)生的ELR趨化因子(n＝6)
當(dāng)將HRV-39感染的上皮細(xì)胞上清液在Superose 6柱上進行尺寸排阻分級時，用人嗜中性白細(xì)胞(圖III)或經(jīng)CXCR1或CXCR2受體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系測定，可得到Ca2+遷移活性單峰。在相同級分(洗脫趨化因子IL-8、ENA78和Groα)中，均出現(xiàn)Ca2+在嗜中性白細(xì)胞中的遷移。
為了確定未經(jīng)ELISA試劑盒分析的HRV-39感染的BEAS-2B是否會產(chǎn)生其他趨化因子，在能表達(dá)多種趨化因子受體(包括CCR1、CCR2、CCR3和CCR5)的其他新鮮分離的人周圍細(xì)胞中，對BEAS-2B上清液進行了測定。當(dāng)采用負(fù)載Fura-2的嗜曙紅細(xì)胞或周圍血液單核細(xì)胞(PBLs)，對衍生于BEAS-2B上皮細(xì)胞的上述活性級分進行Ca2+遷移測定時，沒有級分使Ca2+遷移。這表明除IL-8、Groα和ENA-78之外，并不存在足以促進Ca2+遷移的有效濃度的趨化因子。
為了確定對其他PMN活化的趨化因子的潛在性以及L-8經(jīng)CXCR2活化PMNs的可能性，我們在負(fù)載Fura-2的PMNs中測定了IL-8受體拮抗劑抑制Ca2+遷移的能力，所述遷移由Groβ、濃縮BEAS-2B上清液或經(jīng)Superose6柱分離得到的活性級分所誘導(dǎo)。如附圖I所示，化合物-X劑量依賴性地完全抑制了含有趨化因子的RV濃縮上清液和級分(由Superose 6柱得到)，其IC50為1.7-2nM。該IC50與單獨Groβ得到的IC50(IC50＝5nM)相似，這表明濃縮物或級分中的所有Ca2+遷移活性是通過CXCR2受體起作用。
為了確定RV上清液是否僅通過CXCR2受體來起作用，我們測定了許多選擇性CXCR2拮抗劑與其抑制Ca2+遷移(由濃縮RV上清液和Groβ誘導(dǎo))的能力之間的等級相關(guān)性。CXCR2拮抗劑趨異傾向(divergent set)與其抑制RV和Groβ所致Ca2+遷移的能力之間具有良好的等級相關(guān)性，這表明RV上清液Ca2+遷移活性僅通過PMNs上的CXCR2受體起作用。
在濃縮和分級的RV試樣中，也測定了對PMN趨化性的抑制。特定CXCR2拮抗劑對趨化性的抑制如附圖II所示。
這些結(jié)果證實，BEAS-2B細(xì)胞產(chǎn)生了多種ELR趨化因子，這些趨化因子通過CXCR2受體而起作用并且可被選擇性CXCR2拮抗劑所阻斷。盡管上清液中也存在IL-8，但是它完全被CXCR2拮抗劑阻斷。與Groα相比，IL-8的水平較低，是不大可能起作用的。
本說明書中提及的所有出版物，包括但不限于專利或?qū)＠暾垼诖艘米鳛閰⒖?，就好象每一出版物均特定和獨立地被引入作為參考?br> 以上說明完全公開了本發(fā)明所包括的優(yōu)選實施方案。對在此具體公開的實施方案所作的修飾或改進均在下面權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。無需進一步說明，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為本領(lǐng)域技術(shù)人員利用上述說明能充分實現(xiàn)本發(fā)明。在此所述的實施例僅僅是示例性的，對本發(fā)明范圍并無任何限定。下面將限定要求保護的專有權(quán)或特權(quán)的本發(fā)明實施方案。
權(quán)利要求
1.治療病毒感染所致普通感冒癥候的方法，所述病毒包括人鼻病毒、其他腸道病毒、皰疹病毒、冠狀病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞體病毒或腺病毒，該方法包括將有效量的IL-8受體拮抗劑給予需要這種治療的人。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述呼吸病毒感染使哮喘加重。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述呼吸病毒感染使慢性支氣管炎加重。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述呼吸病毒感染使慢性阻塞性肺部疾病加重。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述呼吸病毒感染使中耳炎加重。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述呼吸病毒感染使鼻竇炎加重。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述呼吸病毒感染與另一細(xì)菌感染例如中耳炎、鼻竇炎或肺炎相關(guān)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一的方法，其中IL-8受體拮抗劑與第二種治療劑聯(lián)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中第二種治療劑選自抗病毒劑、抗組胺、減充血劑、甾類化合物、抗生素和抗炎劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一的方法，其中經(jīng)口、經(jīng)頰、局部(鼻內(nèi))或經(jīng)吸入(氣霧劑)，或經(jīng)局部和經(jīng)吸入給藥治療劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述化合物與第二種治療劑聯(lián)用。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中第二種治療劑選自抗病毒劑；抗組胺；減充血劑；甾類化合物；抗生素；和抗炎劑。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中IL-8受體拮抗劑選自以下專利或申請披露的化合物美國專利5886044，5780483，6005008，5929250，6015908，或5919776；美國申請09/111663，09/125279，09/240354，09/202570，09/202586，09/202569，09/202568，09/230120，09/230290，09/230952，09/230977，09/230981，09/230980，09/242187，09/341378，09/341382，09/341262，09/463673，09/508039，或09/486986；WO99/65310，WO0012489，WO0009511，WO9942464，WO9942463，WO9942461，WO00/05216，WO99/36069，WO99/36070，或WO00/06557；PCT/US99/23776，或PCT/US99/29940；美國臨時申請60/134728，60/136666，60/136665，60/136717，60/136667，60/139675，60/139680，60/139678，60/139673，60/140024，60/139677，60/139674，60/140025，60/145756，60/164350，60/186239，60/186183，60/186182，60/188410，60/188243，60/189176，60/189175，60/189848，60/192132，或60/196022。
全文摘要
本發(fā)明涉及IL－8受體拮抗劑在治療人病毒感染以及相關(guān)加重癥狀中的新用途。
文檔編號A61P11/06GK1449285SQ01813095
公開日2003年10月15日 申請日期2001年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月18日
發(fā)明者蘇珊·B·狄龍, 魯思·塔爾－辛格 申請人:史密絲克萊恩比徹姆公司