專利名稱：新型胰島素/胰島素樣生長因子/松弛素家族多肽及其dna的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)機(jī)體分泌機(jī)能的新型蛋白質(zhì)及其DNA等。更具體地說，本發(fā)明涉及新型胰島素/胰島素樣生長因子/松馳素家族蛋白質(zhì)及其DNA等。
背景技術(shù)：
生物機(jī)體通過細(xì)胞間或組織間相互的信息傳遞，調(diào)節(jié)整合機(jī)體的發(fā)育、分化、增殖以及個體穩(wěn)定性的維持等。在這種調(diào)節(jié)機(jī)體時，很多情況都是由蛋白質(zhì)因子起著調(diào)節(jié)作用。例如，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多有關(guān)免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)中具有分泌功能的因子(液體因子)，它們被稱為細(xì)胞因子。其中包括淋巴因子、單核因子、干擾素、菌落刺激因子、腫瘤壞死因子等。關(guān)于這些因子人們正在積極地研究它們與疾病的關(guān)系以及用藥的方法。
另外，如由內(nèi)分泌組織產(chǎn)生的肽激素和增殖因子等的液體因子對維持個體的恒常性和生長起著非常重要的作用，關(guān)于這方面的作用人們正投入精力研究如何應(yīng)用到醫(yī)藥方面。
胰島素(insulin)、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、胰島素樣生長因子-II(IGF-II)、松馳素H1(relaxin H1)、松馳素H2(relaxin H2)從其結(jié)構(gòu)特征上來看，它們被認(rèn)為可形成一組家族液體因子，并且在生物機(jī)體內(nèi)起著各種各樣的生理作用，即碳水化合物的代謝調(diào)節(jié)、促進(jìn)組織的生長、生殖功能的調(diào)節(jié)等(《BioScience用語文庫 細(xì)胞因子·增殖因子》羊土社第108-109頁，1995年；《激素分子生物學(xué)6發(fā)育和生長因子·激素》學(xué)會出版中心第1-23頁，1996年)。而且，不斷地發(fā)現(xiàn)屬于同一家族新的分子種(內(nèi)分泌分子學(xué)第13卷，第2163-2174頁，1999年)。這些前體蛋白的結(jié)構(gòu)通過具有信號序列-B結(jié)構(gòu)域-C結(jié)構(gòu)域-A結(jié)構(gòu)域的特征，使成熟型分子的B結(jié)構(gòu)域和A結(jié)構(gòu)域之間通過2個二硫鍵結(jié)合。另外在A結(jié)構(gòu)域內(nèi)的1個二硫鍵對維持立體構(gòu)造和活性的表達(dá)非常重要。胰島素、胰島素樣生長因子、松馳素具有各種生理活性，對于生物體來說，是非常重要的信息傳遞因子。胰島素由胰腺β細(xì)胞分泌，它在肝臟、肌肉、脂肪組織中對能量代謝的調(diào)節(jié)起著非常重要作用，如具有促進(jìn)糖的吸收、促進(jìn)脂肪酸合成、促進(jìn)糖原合成等，除此之外還具有細(xì)胞增殖作用。胰島素樣生長因子-I主要合成于肝臟中，對包括骨細(xì)胞在內(nèi)的很多細(xì)胞都具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化的作用。胰島素樣生長因子-II與胰島素樣生長因子-I一樣具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和胰島素樣的作用。這些因子特異性與受體結(jié)合而使該受體磷酸化，進(jìn)而產(chǎn)生其后的一系列的作用。另一方面，近幾年來，已經(jīng)弄清了松馳素具有如產(chǎn)婦產(chǎn)道的松弛、膠原再構(gòu)建而引起的結(jié)締組織的軟化、促進(jìn)乳腺增殖的分化等主要以與生殖功能有關(guān)的各種生理作用。例如具有促進(jìn)分布于子宮、乳腺、肺、心臟等中的血管擴(kuò)張、心臟的搏動作用、抑制肥大細(xì)胞釋放組胺、抑制血小板的凝集、調(diào)節(jié)垂體激素的分泌、調(diào)節(jié)體液平衡、調(diào)節(jié)培養(yǎng)系中的乳癌細(xì)胞的增殖和分化等(Gen Pharmacol第28卷，第13-22頁，1997年)。
對于生物體來說，這些重要的具有蛋白性質(zhì)和肽性質(zhì)的因子，過去很早就發(fā)現(xiàn)了其作為一種固有的生物活性指標(biāo)。還有，針對已知生理活性蛋白質(zhì)的同源性為手段通過克隆技術(shù)相繼發(fā)現(xiàn)了同源性高的類似基因。但是高等生物，尤其是哺乳動物為了維持其健康，除了公知的基因組之外人們普遍認(rèn)為用現(xiàn)有技術(shù)還不能鑒定未知的、具有非常重要的生理作用的體液性因子。
最近，通過使用微機(jī)借助于信息情報處理技術(shù)，把從DNA序列信息中發(fā)現(xiàn)的新的基因產(chǎn)物試圖應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等方面，也就是說，有關(guān)生物信息(Bioinformatics)的各項研究正在不斷地展開(Trends inBiotechnology第14卷，第294-298頁，1996年)。近年來，由于cDNA文庫大規(guī)模序列成為信息獲得的可能，通過累積EST(expressed sequence tag)的信息等，不斷地發(fā)現(xiàn)數(shù)量巨大的新型基因或者其增補(bǔ)基因，但是還有很多信息是不正確的、斷片的序列，而現(xiàn)實中，有關(guān)現(xiàn)存的cDNA文庫所公開的數(shù)據(jù)庫還不能完全覆蓋每種生物的全部表達(dá)基因。因此，從這些數(shù)據(jù)中進(jìn)一步探索全新的有用的基因產(chǎn)物也未必很容易。另一方面，一個生物個體所具有的全部DNA，即基因組的結(jié)構(gòu)分析已經(jīng)在若干種的細(xì)菌類、真菌類(酵母等)、昆蟲、植物中完成了，預(yù)計人的基因組的分析還需要幾年時間。迄今為止，雖然很多編碼分泌蛋白或分泌肽的基因已經(jīng)被分離，但其數(shù)量還不能說已經(jīng)涵蓋了全部基因組。而且人們強(qiáng)烈希望屬于胰島素、胰島素樣生長因子、松馳素家族新物質(zhì)的早日登場如上面所敘述的迫切希望能夠把那些新物質(zhì)應(yīng)用到醫(yī)療方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問題就是提供一種可用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的、屬于胰島素、胰島素樣生長因子、松馳素家族的新型蛋白及其前體蛋白、它們的斷片以及編碼它們的多核苷酸。本發(fā)明的另外所要解決的問題是提供含有所述多核苷酸的重組載體、含有該載體的轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)導(dǎo)包括所述多核苷酸基因的轉(zhuǎn)基因動物。另外，本發(fā)明還提供所述蛋白質(zhì)或肽的制備方法、針對所述蛋白質(zhì)或多肽的抗體、激動劑或拮抗劑、受體以及它們的鑒定方法。本發(fā)明所要解決的問題進(jìn)一步提供含有所述蛋白質(zhì)、多肽、多核苷酸、拮抗劑、抗體、受體的藥物組合物、疾病的治療方法以及預(yù)防方法等。
本發(fā)明人為了解決上述課題，經(jīng)過反復(fù)鉆研終于在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了表達(dá)的新型基因，又發(fā)現(xiàn)了它所編碼的蛋白質(zhì)為屬于胰島素、胰島素樣生長因子、松馳素家族、具有調(diào)節(jié)生物機(jī)體分泌功能的新型蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人進(jìn)一步刻苦鉆研繼發(fā)現(xiàn)新的人型調(diào)節(jié)機(jī)體分泌功能的蛋白質(zhì)之后，又發(fā)現(xiàn)了新的大鼠型、該大鼠型變異體、小鼠型以及豬型調(diào)節(jié)機(jī)體分泌功能的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明人基于這些發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過廣泛的研究，總結(jié)其研究結(jié)果，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明涉及(1)一種多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其含有與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同的序列；(2)(1)中所述的多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中所述基本相同的序列是指SEQ ID NO19或SEQ ID NO47所示的氨基酸序列；(3)一種多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中含有與SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同的序列；(4)(3)中所述多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中所述基本相同的序列是指SEQ ID NO21或SEQ ID NO49所示的氨基酸序列；(5)(1)或(3)中所述的多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其含有與SEQ IDNO7所示氨基酸序列相同或基本相同的序列以及含有與SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同的序列；(6)一種多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中含有與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同序列的多肽、其酰胺或其酯以及含有與SEQID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同序列的多肽、其酰胺或其酯它們通過二硫鍵相結(jié)合；(7)(5)或(6)中所述的多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中所述含有與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同的序列為SEQ ID NO19或SEQ ID NO47所示的氨基酸序列，所述含有與SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同的序列為SEQ ID NO21或SEQ ID NO49所示的氨基酸序列；(8)一種DNA，其中含有編碼權(quán)利要求1或3所述多肽的DNA；(9)(1)或(3)中所述多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其含有與SEQ IDNO3所示氨基酸序列相同或基本相同的序列；(10)(9)中所述多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中所述基本相同的氨基酸序列為SEQ ID NO17、SEQ ID NO23、SEQ ID NO45或SEQ ID NO51所示的氨基酸序列；(11)(8)中所述DNA，其中含有編碼(9)中所述多肽的DNA；(12)(10)中所述的DNA，其中包含SEQ ID NO12、SEQ ID NO18、SEQID NO24、SEQ ID NO46或SEQ ID NO52所示的堿基序列；(13)一種重組載體，其中包含權(quán)利要求8所述的DNA；(14)一種轉(zhuǎn)化體，其用(13)中所述重組載體轉(zhuǎn)化而成；(15)一種生產(chǎn)(1)、(3)或(6)中所述多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽的方法，其包含培養(yǎng)(14)中所述的轉(zhuǎn)化體，并從中生成(1)、(3)或(6)中所述的多肽；(16)一種抗體，其針對(1)、(3)或(6)中所述的多肽、其酰胺、或其酯或其鹽；(17)一種篩選化合物或其鹽的方法，所述化合物或其鹽具有促進(jìn)或抑制(1)、(3)或(6)中所述多肽、其酰胺或其酯或其鹽的活性，該方法包括使用(1)、(3)或(6)中所述的多肽、其酰胺或其酯或其鹽；(18)一種用于篩選化合物或其鹽的試劑盒，所述化合物或其鹽具有促進(jìn)或抑制(1)、(3)或(6)中所述多肽、其酰胺或其酯或其鹽的活性，其中所述試劑盒包括(1)、(3)或(6)中所述的多肽、其酰胺或其酯或其鹽；(19)一種化合物或其鹽，其具有促進(jìn)或抑制(1)、(3)或(6)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽的活性，所述化合物或其鹽可通過使用(17)中所述篩選法或(18)中所述篩選試劑盒而獲得；(20)一種藥物，其包含具有促進(jìn)或抑制(1)、(3)或(6)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽活性的化合物或其鹽，所述化合物或其鹽可通過使用(17)中所述篩選法或(18)中所述篩選試劑盒而獲得；(21)一種藥物，其含有(1)、(3)或(6)中所述的多肽、其酰胺或其酯、或其鹽；(22)一種藥物，其包含(16)中所述的抗體；(23)一種預(yù)防或治療如下疾病的藥物，該藥物包含①(1)、(3)或(6)中所述多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽；②(19)中所述的化合物或其鹽；③(16)中所述的抗體，所述疾病包括代謝調(diào)節(jié)紊亂、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常、組織的纖維變性、循環(huán)系統(tǒng)障礙、內(nèi)分泌障礙、體液平衡異常、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血管再生障礙；(24)(23)中所述的藥物，其中所述藥物為治療或預(yù)防肝硬化或肺纖維變性、硬皮癥、腎纖維變性或外周動脈疾病的藥物；(25)一種診斷藥物，其包含(16)中所述的抗體；(26)①(1)、(3)或(6)中所述多肽、其酰胺或其酯、或其鹽；②通過使用(17)中所述的篩選法或(18)中所述的篩選試劑盒而獲得的、具有促進(jìn)或抑制(1)、(3)或(6)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽活性的化合物或其鹽；或③(16)中所述的抗體，它們在制備治療或預(yù)防如下疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病包括代謝調(diào)節(jié)紊亂、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常、組織的纖維變性、循環(huán)系統(tǒng)障礙、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血管再生障礙；(27)一種治療或預(yù)防如下疾病的方法，該方法包括把①(1)、(3)或(6)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽；②通過使用(17)中所述的篩選法或(18)中所述的篩選試劑盒而獲得的、具有促進(jìn)或抑制(1)、(3)或(6)中所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽活性的化合物或其鹽；或③(16)中所述的抗體投藥于哺乳動物，所述疾病包括代謝調(diào)節(jié)紊亂、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常、組織的纖維變性、循環(huán)系統(tǒng)障礙、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血管再生障礙。
又，本發(fā)明的DNA以及多肽、其酰胺、其酯、或其鹽等可用于基礎(chǔ)性研究如，分子量標(biāo)記、組織標(biāo)記、染色體作圖、遺傳病鑒定、引物和探針的設(shè)計等。


圖1表示本發(fā)明新型蛋白質(zhì)(前體蛋白)的開放讀碼以及它所編碼的氨基酸序列。
圖2表示在實施例4中通過RT-PCR分析人型多肽表達(dá)組織的結(jié)果。圖中，泳道1為心臟(heart)、泳道2為腦(brain)、泳道3為胎盤(placenta)、泳道4為肺(lung)、泳道5為肝臟(liver)、泳道6為骨骼肌肉(skeletal muscle)、泳道7為腎臟(kidney)、泳道8為胰腺(pancreas)、泳道9為脾臟(spleen)、泳道10為胸腺(thymus)、泳道11為前列腺(prostate)、泳道12為睪丸(testis)、泳道13為卵巢(ovary)、泳道14為小腸(small intestine)、泳道15為結(jié)腸(colon)、泳道16為外周血白血球(peripheral blood leukocyte)、泳道17為丘腦下部(hypothalamus)、泳道18為海馬(hippocampus)、泳道19為垂體(pituitary)、泳道20為脂肪細(xì)胞(adipocyte)、泳道21為胎兒腦(fetalbrain)、泳道22為胎兒肺(fetal lung)、泳道23為胎兒肝臟(fetal liver)、泳道24為胎兒腎臟(fetal kidney)、泳道25為胎兒心臟(fetal heart)、泳道26為胎兒脾臟(fetal spleen)、泳道27為胎兒胸腺(fetal thymus)、泳道28為胎兒骨骼肌肉(fetal skeletal muscle)、泳道29為基因組DNA(genomic DNA)。
圖3表示本發(fā)明每種新的人型·小鼠型·大鼠型·豬型蛋白質(zhì)(前體蛋白)氨基酸序列的排列。
圖4表示針對本發(fā)明新型多肽A鏈N端肽的小鼠抗血清的抗體滴度。
圖5表示自轉(zhuǎn)導(dǎo)有本發(fā)明新型多肽基因的AtT20細(xì)胞系培養(yǎng)上清液中通過反向-HPLC分離純化新型多肽時的吸光值215nm及其免疫活性的檢測結(jié)果。
圖6表示在人型多肽純化標(biāo)樣THP-1細(xì)胞系中促進(jìn)其細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生作用。
圖7表示人型多肽融合蛋白用于大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建圖。
圖中，「T7/lac0 promoter」表示T7啟動子及l(fā)ac操縱基因區(qū)域，「Amp」表示抗氨芐西林藥物區(qū)域，「ColE1 roi」表示質(zhì)粒復(fù)制起點，「lac Iq」表示lac阻遏物，「B鏈」表示SEQ ID NO16所示的堿基序列，「A鏈」表示SEQ ID NO15所示的堿基序列，「C鏈」表示SEQ ID NO4所示第184位至第375位的堿基序列。
圖8表示從人體新型多肽融合蛋白表達(dá)重組大腸桿菌中制備的全部菌體蛋白的SDS-PAGE的結(jié)果。
圖9表示在人體新型多肽純化標(biāo)樣THP-1細(xì)胞系中的細(xì)胞刺激作用。
圖10表示用胰蛋白酶和CPB處理(16-53)/(110-133)之后形成的反應(yīng)物，再通過利用TSKgelODS-80Ts柱的HPLC分離得到分離類型。
圖11表示通過大腸桿菌制備的人體新型多肽純化標(biāo)樣對THP-1細(xì)胞系促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生作用。
圖12表示通過大腸桿菌制備的人體新型多肽衍生物純化標(biāo)樣對THP-1細(xì)胞系促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生作用。圖中，-●-表示人體新型多肽(16-42)/(110-133)，-□-表示(16-53)/(110-133)，-△-表示(16-41)/(110-133)。
圖13表示人體新型多肽(16-42)/(110-133)純化標(biāo)樣在正常人肺的成纖維細(xì)胞系CCD-19Lu中促進(jìn)MMP-1及VEGF基因表達(dá)的結(jié)果。
圖14表示人體新型多肽(16-42)/(110-133)純化標(biāo)樣在正常人皮膚成纖維細(xì)胞系NHDF中促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生的作用。
圖15表示人的新型多肽(16-42)/(110-133)純化標(biāo)樣在大鼠垂體前葉第一代培養(yǎng)細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP的作用。
圖16表示人的新型多肽(16-42)/(110-133)純化標(biāo)樣對促進(jìn)THP-1細(xì)胞VEGF基因表達(dá)的作用。
圖17表示轉(zhuǎn)導(dǎo)有各種新型表達(dá)多肽載體的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的新型多肽的免疫活性。Control表示轉(zhuǎn)導(dǎo)有原親本質(zhì)粒pCAN618在COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的免疫活性，blank表示在COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的免疫活性。
圖18表示轉(zhuǎn)導(dǎo)有新型表達(dá)多肽載體的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中對THP-1細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP的活性。Control表示加入了轉(zhuǎn)導(dǎo)有原親本質(zhì)粒pCAN618在COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液時促進(jìn)THP-1細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP的活性，100mM新型多肽表示加入了新型多肽純化標(biāo)樣100mM時促進(jìn)THP-1細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP的活性。
具體實施例方式
在本發(fā)明中，含有與SEQ ID NO7或8所示氨基酸序列相同或基本相同的多肽(下文通常將含有與SEQ ID NO7或8所示氨基酸序列相同或基本相同的多肽統(tǒng)稱為″本發(fā)明多肽″)均可來自人或溫血動物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、家雞、兔子、豬、綿羊、牛、猴子等)細(xì)胞中的多肽，還有重組多肽，或者合成多肽。所述細(xì)胞如肝細(xì)胞、脾細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、腎小球膜細(xì)胞、朗格罕氏細(xì)胞、表皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、纖維細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、免疫細(xì)胞(例如，巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)、巨核細(xì)胞、滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、或間質(zhì)細(xì)胞、或這些細(xì)胞的前體細(xì)胞、干細(xì)胞或癌細(xì)胞等；或含此類細(xì)胞的組織，所述組織例如腦、腦的任何部分(例如，嗅球、屏狀核、大腦基底神經(jīng)節(jié)、海馬、丘腦、下丘腦、大腦皮質(zhì)、延髓、小腦)、脊髓、垂體、胃、胰腺、腎、肝、生殖腺、甲狀腺、膽囊、骨髓、腎上腺、皮膚、肌肉、肺、消化道(例如大腸、小腸)、血管、心臟、胸腺、脾、唾液腺、外周血、前列腺、睪丸、卵巢、胎盤、子宮、骨、軟骨、關(guān)節(jié)、骨骼肌等。
又，如果本發(fā)明多肽中含有信號多肽時，則可以使該多肽更有效地分泌到細(xì)胞外。
那么，所述與SEQ ID NO7或8所示氨基酸序列基本相同的序列，可舉例為，具有與SEQ ID NO7或8所示氨基酸序列同源性至少大于50％的氨基酸序列，優(yōu)選同源性約大于60％，較優(yōu)選約大于70％，進(jìn)一步優(yōu)選約大于80％，更優(yōu)選約大于90％，最優(yōu)選約大于95％。
SEQ ID NO3所示氨基酸序列包含SEQ ID NO7以及SEQ ID NO8所示的氨基酸序列。
那么，所述與SEQ ID NO3所示氨基酸序列基本相同的序列，可舉例為，具有與SEQ ID NO3所示氨基酸序列同源性至少大于50％的氨基酸序列，優(yōu)選同源性約大于60％，較優(yōu)選約大于70％，進(jìn)一步優(yōu)選約大于80％，更優(yōu)選約大于90％，最優(yōu)選約大于95％。
所述具有與本發(fā)明SEQ ID NO7或8所示氨基酸序列基本相同的多肽，優(yōu)選含有與所述SEQ ID NO7或8所示氨基酸序列基本相同的序列，同時優(yōu)選與SEQ ID NO7或8所示氨基酸序列基本相同的序列具有基本相同性質(zhì)的多肽等。
所述與SEQ ID NO7所示氨基酸序列基本相同的序列，更具體地說，可舉例為SEQ ID NO19或47所示的氨基酸序列等。
又，所述與SEQ ID NO8所示氨基酸序列基本相同的序列，更具體地說，可舉例為SEQ ID NO21所示氨基酸序列或SEQ ID NO49所示氨基酸序列。
還有，所述具有與SEQ ID NO3所示氨基酸序列基本相同的多肽，優(yōu)選含有與所述SEQ ID NO3所示氨基酸序列基本相同的序列，同時優(yōu)選與含有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的具有基本相同性質(zhì)的多肽等。
所述與SEQ ID NO3所示氨基酸序列基本相同的序列，更具體地說，可舉例為SEQ ID NO17、23、45、51所示氨基酸序列。
所述性質(zhì)基本相同的例子，如抗原性、由分泌而形成的具有液體因子功能、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生作用等。所謂性質(zhì)基本相同是指，它們的性質(zhì)在定性上相同。因此，優(yōu)選其分泌作用或溶解性或生理作用性質(zhì)等相同(例如，約0.1-100倍，優(yōu)選約0.5-10倍，更優(yōu)選0.5-2倍)。然而，這些性質(zhì)的程度或多肽分子量等其量化要素可以不盡相同。
所述含有與SEQ ID NO7、8或3所示氨基酸序列基本相同的多肽可以包括所謂的突變蛋白，如包含下述多肽(i)SEQ ID NO7、8或3所示氨基酸序列，其中的1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～30個氨基酸，再優(yōu)選1～10個氨基酸，更優(yōu)選1～5個氨基酸)被缺失；(ii)SEQ ID NO7、8或3所示氨基酸序列，其中的1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～30個氨基酸，再優(yōu)選1～10個氨基酸，更優(yōu)選數(shù)個(1-5)氨基酸)被附加；(iii)SEQ ID NO7、8或3所示氨基酸序列，其中的1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～30個氨基酸，再優(yōu)選1～10個氨基酸，更優(yōu)選數(shù)個(1-5)氨基酸)被插入；(iv)SEQ ID NO7、8或3所示氨基酸序列，其中的1或2個以上氨基酸(優(yōu)選1～30個氨基酸，再優(yōu)選1～10個氨基酸，更優(yōu)選數(shù)個(1～5)氨基酸)被其他氨基酸所取代；以及(v)上述氨基酸序列的組合。
如上所述當(dāng)氨基酸序列被插入、缺失或取代時，其插入、缺失或取代的位置不作特別限定。但在SEQ ID NO7、8或3它們各自序列號所示氨基酸序列中包括除了半胱氨酸殘基以外的其它氨基酸殘基。
含有與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同的序列以及含有與SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同的序列的多肽除了含有SEQ ID NO7所示氨基酸序列以及SEQ ID NO8所示氨基酸序列單鏈多肽以外，還包含與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同的序列的多肽(以下，在本說明書中有時簡稱為A鏈)和含有與SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同的序列的多肽(以下，在本說明書中有時簡稱為B鏈)并由該2條鏈構(gòu)成多肽(以下，在本說明書中有時簡稱為2條多肽鏈)。
具體地說，所述2條多肽鏈?zhǔn)侵?，與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同的序列以及與SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同的序列通過二硫鍵結(jié)合的多肽，并表示在A鏈及B鏈內(nèi)的半胱氨酸殘基通過分子間以及分子內(nèi)形成二硫鍵的多肽。所述半胱氨酸殘基之間的組合優(yōu)選如下例如A鏈的Cys11(所述A鏈的Cys11表示從SEQ ID NO7、19或47所示氨基酸序列N末端起第1位的半胱氨酸殘基。下同)和B鏈的Cys10(所述B鏈的Cys10表示從SEQ ID NO8、21或49所示氨基酸序列N末端第10位的半胱氨酸殘基。下同)結(jié)合，并且A鏈的Cys24和B鏈的Cys22結(jié)合，再有A鏈的Cys10和A鏈的Cys15結(jié)合。
所述包含與SEQ ID NO3所示氨基酸序列相同或基本相同的多肽(以下，有時簡稱為前體蛋白。)優(yōu)選如下所述①當(dāng)為SEQ ID NO3時，在其N末端第26位(Arg)至第52位(Trp)上包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列(即編碼B鏈的氨基酸序列)，并在SEQ ID NO3的N末端第119位(Asp)至第142位(Cys)上包含SEQ ID NO7所示氨基酸序列(即編碼A鏈的氨基酸序列)；②當(dāng)為SEQ ID NO17時，在其N末端第25位(Arg)至第51位(Trp)上包含SEQ ID NO21所示氨基酸序列(即編碼B鏈的氨基酸序列)，并在SEQ ID NO17的N末端第118位(Asp)至第141位(Cys)上包含SEQID NO19所示氨基酸序列(即編碼A鏈的氨基酸序列)；③當(dāng)為SEQ ID NO23時，在其N末端第24位(Arg)至第50位(Trp)上包含SEQ ID NO21所示氨基酸序列(即編碼B鏈的氨基酸序列)，并在SEQ ID NO23的N末端第117位(Asp)至第140位(Cys)上包含SEQID NO19所示氨基酸序列(即編碼A鏈的氨基酸序列)；④當(dāng)為SEQ ID NO45時，在其N末端第27位(Arg)至第53位(Trp)上包含SEQ ID NO49所示氨基酸序列(即編碼B鏈的氨基酸序列)，并在SEQ ID NO45的N末端第117位(Asp)至第140位(Cys)上包含SEQID NO47所示氨基酸序列(即編碼A鏈的氨基酸序列)；⑤當(dāng)為SEQ ID NO51時，在其N末端第24位(Arg)至第50位(Trp)上包含SEQ ID NO21所示氨基酸序列(即編碼B鏈的氨基酸序列)，并在SEQ ID NO51的N末端第151位(Asp)至第174位(Cys)上包含SEQID NO19所示氨基酸序列(即編碼A鏈的氨基酸序列)，并具有A鏈、B鏈、2條鏈多肽前體的性質(zhì)。
本發(fā)明的多肽(以下，把A鏈、B鏈、2條鏈、前體蛋白統(tǒng)稱為本發(fā)明多肽)用本領(lǐng)域已知的描述肽的方法來定義。即，左末端為N-末端(氨基端)，右末端為C-末端(羧基端)。本發(fā)明多肽中包括以SEQ ID NO3、7以及8所示的氨基酸序列為主的多肽，其C-末端通常為羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C-末端也可為酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。
這里R代表的酯如C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、或正丁基等；C3-8環(huán)烷基包括環(huán)戊基和環(huán)己基等；C6-12芳基包括苯基和α-萘基等；以及C7-14芳烷基包括苯基-C1-2烷基如苯甲基、苯乙基等；或α-萘基-C1-2烷基如α-萘甲基，還有通常用作口服給藥的酯的三甲基乙酰氧甲基。
當(dāng)本發(fā)明多肽在C-末端以外的位置上包括羧基(或羧酸酯)時，它可以酰胺化或酯化，則這類酰胺或酯也可以包括在本發(fā)明所述多肽的范圍之內(nèi)。所述酯基可以與上述C-末端的酯基相同。
另外，本發(fā)明多肽可以包括下述衍生物，其中N-末端氨基酸殘基(如甲硫氨酸殘基)的氨基用保護(hù)基(C1～6酰基，如甲?；?、乙?；菴1～6烷酰基)保護(hù)；所述N末端在體內(nèi)切割，形成的谷氨?；构劝彼峄?；所述C-末端氨基酸殘基為高絲氨酸或高絲氨酸內(nèi)酯；所述多肽分子中氨基酸側(cè)鏈上的取代基(例如，-OH，-SH，氨基、咪唑基、吲哚基、胍基等)受適當(dāng)基團(tuán)(C1～6酰基，如甲?；?、乙?；菴1-6烷?；?保護(hù)，或結(jié)合多肽如通過糖鏈連接的糖多肽等。
本發(fā)明多肽可以是單體，也可以是多聚體，如二聚體、四聚體、六聚體、八聚體等。
作為本發(fā)明的多肽或其鹽，可以使用與生理上可接受的酸(如無機(jī)酸或有機(jī)酸)或堿(如堿金屬鹽)形成的鹽，尤其優(yōu)選生理上可接受的酸加成鹽。這樣的鹽有，與無機(jī)酸(例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，或者與有機(jī)酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
本發(fā)明多肽或它們的鹽既可用公知的從前述的人或其它溫血動物細(xì)胞或組織中純化多肽(蛋白質(zhì))的方法來制備。也可以通過培養(yǎng)含有編碼后述的多肽的DNA轉(zhuǎn)化體而制備，也可用下述肽合成法來制備。
當(dāng)從人或哺乳動物組織或細(xì)胞中制備多肽或它們的鹽時，首先將人或哺乳動物組織或細(xì)胞勻漿，然后用酸等抽提，通過反相層析、離子交換層析等多種層析技術(shù)的聯(lián)用來分離純化該抽提物。
為了合成本發(fā)明多肽、或其鹽或其酰胺物，可以使用可用于多肽(蛋白質(zhì))合成的商用樹脂。這類樹脂包括氯甲基樹脂、羥甲基樹脂、二苯甲胺樹脂、氨甲基樹脂、4-芐氧基苯甲醇樹脂，4-甲基二苯甲基胺樹脂，PAM樹脂，4-羥甲基甲苯乙酰胺甲基樹脂，聚丙烯酰胺樹脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯羥甲基)苯氧基樹脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基樹脂。使用這些樹脂時，將那些α-氨基及側(cè)鏈上官能團(tuán)受到相應(yīng)保護(hù)的氨基酸，在樹脂上按目標(biāo)多肽的序列順序，用本領(lǐng)域公知的各種縮合方法縮合。反應(yīng)結(jié)束時，將多肽從樹脂上切除下來，同時除去各種保護(hù)基團(tuán)。然后在高度稀釋的溶液中進(jìn)行分子內(nèi)二硫鍵的形成反應(yīng)，以獲得目標(biāo)多肽、或其酰胺物。
進(jìn)行上述受保護(hù)氨基酸的縮合反應(yīng)時，可使用多肽合成的多種活化試劑，但優(yōu)選使用碳二亞胺。所述碳二亞胺有DCC、N，N′-二異丙基碳二亞胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨?；?碳二亞胺。用這些試劑活化時，直接在樹脂上添加受保護(hù)的氨基酸及外消旋抑制劑(例如，HOBt，HOOBt)，或先將受保護(hù)的氨基酸活化為對稱酸酐、HOBt酯或HOOBt酯，然后添加到樹脂上。
適用于受保護(hù)氨基酸的活化反應(yīng)或適用于與樹脂的縮合反應(yīng)的溶劑選自已知可用于多肽(蛋白質(zhì))縮合反應(yīng)的溶劑。這樣的溶劑有酰胺類如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；鹵化烴類如亞甲基鹽酸鹽和氯仿等；醇類如三氟乙醇等；亞砜類如二甲亞砜等；醚類如吡啶、二惡烷和四氫呋喃等；腈類如乙腈和丙腈等；酯類如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；或者這些溶劑的適當(dāng)混合物。反應(yīng)溫度從已知適用于多肽(蛋白質(zhì))成鍵反應(yīng)的范圍中選取，通常選約-20℃-50℃?；罨陌被嵫苌锿ǔＲ赃^量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反應(yīng)檢驗所述縮合反應(yīng)；當(dāng)所述縮合不充分時，可通過不除去保護(hù)基團(tuán)而重復(fù)縮合反應(yīng)來完成。當(dāng)即使重復(fù)反應(yīng)后仍未充分縮合時，用乙酸酐或乙酰咪唑?qū)⑽捶磻?yīng)的氨基酸乙酰化，以消除對后續(xù)反應(yīng)的可能負(fù)影響。
用于保護(hù)初始氨基的保護(hù)基團(tuán)有Z、Boc、叔戊氧基羰基、異冰片基氧羰基、4-甲氧芐氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金剛烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙酰基、鄰苯二甲?；⒓柞；?-硝基苯基亞硫?；?、二苯硫膦基，以及Fmoc等。
羧基可用如下的酯化作用保護(hù)，例如烷基酯化(烷基如甲基、乙基、丙基、丁基、叔丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基和2-金剛烷基等的直鏈、支鏈或環(huán)狀烷基酯)，芳烷基酯化(例如酯化為芐酯、4-硝基芐酯、4-甲氧芐酯、4-氯芐酯以及二苯甲基酯等)，苯甲酰甲基酯化，芐氧羰基酰肼化，叔丁氧羰基酰肼化以及三苯甲基酰肼化等。
絲氨酸的羥基可以通過例如酯化作用或醚化作用來保護(hù)。適于酯化作用的基團(tuán)有低級C1～6烷?；缫阴；?，芳?；绫郊柞；?，以及來自碳酸的基團(tuán)如芐氧羰基和乙氧羰基。適于醚化的基團(tuán)有苯甲基、四氫吡喃基和叔丁基等。
適于保護(hù)酪氨酸中酚羥基的基團(tuán)有Bzl，Cl2-Bzl，2-硝基芐基、Br-Z和叔丁基等。
適于保護(hù)組氨酸中咪唑基的基團(tuán)有Tos，4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺?；NP、芐氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc等。
初始氨基酸中的活化羧基有相應(yīng)的酸酐、疊氮化物、活化酯(帶有醇的酯(如五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基酚、氰甲基醇、對硝基苯酚、HONB，N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基鄰苯二甲酰亞胺、HOBt)。將初始物質(zhì)中待活化氨基酸的氨基活化時，可以使用其相應(yīng)磷酰胺。
為了除去(脫離)保護(hù)基，在氫氣流下用Pd-黑或Pd-碳等催化劑進(jìn)行催化還原；用氫氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸或三氟醋酸，或這些酸的混合液進(jìn)行酸處理；用二異丙基乙胺、三乙胺、哌啶或哌嗪等堿進(jìn)行堿處理；以及用液態(tài)氨中的鈉還原。用上述酸處理除去所述保護(hù)基團(tuán)的反應(yīng)通常在約-20℃～40℃進(jìn)行。在酸處理中，添加陽離子清除劑以使反應(yīng)有效進(jìn)行，例如使用甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、間甲酚、對甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇、1，2-乙二硫醇。此外，用苯硫酚處理以除去已知可作為組氨酸中咪唑的保護(hù)基團(tuán)的2，4-二硝基苯基。用作色氨酸中吲哚的保護(hù)基團(tuán)的甲?；孟率龇椒ㄈコ?，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇等存在時用上述酸進(jìn)行處理，以及用氫氧化鈉稀溶液和稀氨水等堿進(jìn)行處理。
與起始物質(zhì)之反應(yīng)無關(guān)的官能團(tuán)的保護(hù)、保護(hù)基的選擇、該保護(hù)基的消除、以及與上述反應(yīng)有關(guān)的官能團(tuán)的活化，從公知的基團(tuán)和公知的方法中適當(dāng)選擇。
獲得酰胺化多肽的其它方法有，如先將羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化而加以保護(hù)；然后，將肽(多肽)鏈從氨基側(cè)延伸至預(yù)期長度。然后，制備只將其中N-末端α-氨基的保護(hù)基團(tuán)除去的多肽以及只將其中C-末端羧基的保護(hù)基團(tuán)除去的多肽。將這兩種多肽濃縮在上述溶劑的混合液中。濃縮反應(yīng)的細(xì)節(jié)同上。對濃縮所得被保護(hù)多肽進(jìn)行純化后，通過上述方法除去所有的保護(hù)基團(tuán)，獲得所需粗制多肽。該粗制多肽可用各種已知的純化方法進(jìn)行純化。凍干主要級分獲得所需多肽的酰胺物。
將羧基末端氨基酸的α-羧基與所選醇類縮合獲得氨基酸酯，然后用與上述制備酰胺化多肽方法類似的方法獲得所需酯化本發(fā)明多肽酯。
本發(fā)明多肽或它們的鹽可通過已知的肽合成方法而制備。就肽合成的方法而言，固相合成或液相合成都可使用。即，將能構(gòu)成本發(fā)明部分肽的部分肽或氨基酸與本發(fā)明多肽的其他部分縮合在一起。當(dāng)產(chǎn)物中包含保護(hù)基團(tuán)時，除去這些保護(hù)基團(tuán)得到所需肽。用來縮合或除去保護(hù)基團(tuán)的公知方法見下列1)～5)。
1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti肽的合成，Interscience Publishers，紐約(1966)2)Schroeder和Luebke肽，Academic Press，紐約(1965)3)泉屋信夫等多肽合成與實驗，丸善公司(1975)4)矢島治明和榊原俊平生物化學(xué)實驗教材1，蛋白質(zhì)化學(xué)IV，205(1977)5)矢島治明主編藥物開發(fā)續(xù)篇，卷14，肽合成，廣川書店反應(yīng)完成后，可將常規(guī)純化方法如溶劑提取、蒸餾、柱層析、液相層析以及重結(jié)晶等進(jìn)行組合以純化回收本發(fā)明多肽。當(dāng)用上述方法獲得的多肽為游離形式時，可以用公知的方法或其改良方法將所述肽轉(zhuǎn)化為相應(yīng)鹽；當(dāng)所述多肽以鹽形式獲得時，可以用公知的方法或改良方法將其轉(zhuǎn)化為游離形式。
編碼本發(fā)明多肽的DNA可為任意DNA，只要其含有編碼本發(fā)明多肽氨基酸序列的堿基序列。這類DNA也可以是基因組DNA、所述細(xì)胞或組織的cDNA、合成DNA。
用于上述文庫的載體可以為噬菌體、質(zhì)粒、粘粒以及噬菌粒中的任意一種。所述DNA可以用從上述細(xì)胞或組織中制備的總RNA或mRNA級分通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(以下簡稱為RT-RCR)直接擴(kuò)增。
編碼本發(fā)明多肽的DNA可以為任一種DNA，只要其具有，例如，SEQID NO12、15、16、18、20、22、24、25、26、46、48、50或52所示堿基序列，或其具有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO12、15、16、18、20、22、24、25、26、46、48、50或52所示堿基序列雜交的堿基序列，且具有編碼的多肽具有與本發(fā)明多肽的活性(如生物活性、免疫原性、經(jīng)分泌具有體液因子功能、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生等)基本相同，并且其DNA編碼的多肽具有與本發(fā)明多肽性質(zhì)基本相同。
在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO12、15、16、18、20、22、24、25、26、46、48、50或52所示堿基序列能雜交的DNA，分別為與SEQ ID NO12、15、16、18、20、22、24、25、26、46、48、50或52所示堿基序列至少具有約60％同源性的DNA，優(yōu)選至少約70％，更優(yōu)選至少約80％。
又，在嚴(yán)謹(jǐn)條件下所述與SEQ ID NO12、15、16、18、20、22、24、25、26、46、48、50或52所示堿基序列能雜交的DNA，其具有能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO12、15、16、18、20、22、24、25、26、46、48、50或52所示堿基序列進(jìn)行雜交的堿基序列，且具有編碼的多肽具有與本發(fā)明多肽的活性(如生物活性、免疫原性、經(jīng)分泌具有體液因子功能、促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生等)基本相同，并且其DNA編碼的多肽具有與本發(fā)明多肽性質(zhì)基本相同。
可以用公知方法或其改良方法進(jìn)行所述雜交反應(yīng)，例如，分子克隆，第2版；J.Sambrook等，冷泉港實驗室出版社，(1989)中所述方法。也可以按照所附說明書使用文庫商品。該雜交反應(yīng)優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件下進(jìn)行。
此處的高度嚴(yán)謹(jǐn)條件是，例如鈉離子的濃度約為19-40mM，優(yōu)選約19-20mM，而溫度約為50-70℃，優(yōu)選約60-65℃。
所述編碼本發(fā)明多肽的DNA，可以使用含SEQ ID NO12、15、16、18、20、22、24、25、26、46、48、50或52所示堿基序列的DNA。
更具體地說，可舉例如下(I)所述編碼A鏈(人型多肽，其中含有SEQ ID NO7所示氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO15所示堿基序列的DNA等，(II)所述編碼A鏈(大鼠型多肽，其中含有SEQ ID NO19所示氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO20所示堿基序列的DNA等，(III)所述編碼A鏈(小鼠型多肽，其中含有SEQ ID NO19所示氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO25所示堿基序列的DNA等，(IV)所述編碼A鏈(豬型多肽，其中含有SEQ ID NO47所示氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO48所示堿基序列的DNA等，(V)所述編碼B鏈(人型多肽，其中含有SEQ ID NO8所示的氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO16所示堿基序列的DNA等，(VI)所述編碼B鏈(大鼠型多肽，其中含有SEQ ID NO21所示氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO22所示堿基序列的DNA等，(VII)所述編碼B鏈(小鼠型多肽，其中含有SEQ ID NO21所示氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO26所示堿基序列的DNA等，(VIII)所述編碼B鏈(豬型多肽，其中含有SEQ ID NO49所示氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO50所示堿基序列的DNA等，(IX)所述編碼2條鏈多肽(人型)以及前體蛋白(人型多肽，其中含有SEQ ID NO3所示的氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO12所示堿基序列的DNA等，(X)所述編碼2條鏈多肽(大鼠型)以及前體蛋白(大鼠型多肽，其中含有SEQ ID NO17或51所示的氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQID NO18或52所示堿基序列的DNA等，(XI)所述編碼2條鏈多肽(小鼠型)以及前體蛋白(小鼠型多肽，其中含有SEQ ID NO23所示的氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ IDNO24所示堿基序列的DNA等，(XII)所述編碼2條鏈多肽(豬型)以及前體蛋白(豬型多肽，其中含有SEQ ID NO45所示的氨基酸序列)的DNA，其DNA包含SEQ ID NO46所示堿基序列的DNA等。
對完全編碼本發(fā)明多肽的DNA進(jìn)行克隆時，可以用含有本發(fā)明多肽之部分堿基序列的合成型DNA引物按公知的PCR進(jìn)行擴(kuò)增，或通過與編碼本發(fā)明多肽之部分或完整區(qū)的標(biāo)記的DNA片段或合成DNA片段雜交來篩選已插入合適載體中的DNA。雜交反應(yīng)可以根據(jù)分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港實驗室出版社，1989)描述的方法進(jìn)行。也可用商品化的文庫根據(jù)所附說明書進(jìn)行雜交。
DNA堿基序列的轉(zhuǎn)換可根據(jù)眾所周知的方法如ODA-LA PCR法、Gupped duplex法或Kunkel法或其改進(jìn)方法，使用PCR或眾所周知的商品化試劑盒如MutanTM-super express Km(寶酒造株式會社)、MutanTM-K(寶酒造株式會社)進(jìn)行。
已經(jīng)克隆的編碼本發(fā)明多肽的DNA，根據(jù)需要，或者單獨(dú)使用或者經(jīng)限制酶消化后或連接一接頭之后使用。該DNA可能在其5′端包含ATG作為翻譯起始密碼子，而在其3′端有TAA、TGA或TAG作為翻譯終止密碼子。這些翻譯起始和終止密碼子也可用合適的合成型DNA接頭加上。
本發(fā)明多肽的表達(dá)載體可通過以下方法生產(chǎn)，例如，(a)從編碼本發(fā)明多肽的DNA上切下所需DNA片段，(b)將該DNA片段連接到一合適載體上的啟動子下游或者連接到適當(dāng)編碼保護(hù)肽的堿基序列的下游。
可以使用的載體包括來自大腸桿菌的質(zhì)粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、來自枯草桿菌的質(zhì)粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、來自酵母的質(zhì)粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌體如λ噬菌體等、動物病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒、痘苗病毒、桿狀病毒等以及pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo、pET-1、pET-2、pET-3、pET-4、pET-5、pET-11等。
本發(fā)明所使用的啟動子可以是任意啟動子，只要它能同所用基因表達(dá)宿主匹配。在使用動物細(xì)胞作為宿主時，啟動子有SRα啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CMV啟動子、HSV-TK啟動子、β-肌動蛋白等。
在這些啟動子中，優(yōu)選CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動子、SRα啟動子、β-肌動蛋白等。如果宿主為大腸桿菌屬的細(xì)菌，優(yōu)選的啟動子有trp啟動子、lac啟動子、recA啟動子、λPL啟動子、lpp啟動子、T7啟動子等。在使用枯草桿菌屬的細(xì)菌作宿主時，優(yōu)選的啟動子有SPO1啟動子、SPO2啟動子、penP啟動子等。在用酵母作宿主時，優(yōu)選的啟動子有PHO5啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子等。在用昆蟲細(xì)胞作宿主時，優(yōu)選的啟動子有多角體蛋白啟動子、P10啟動子等。
當(dāng)使用T7啟動子表達(dá)系時，作為T7啟動子可以使用T7DNA上的17種啟動子(J.L.Oakley et al，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A，744266-4270(1979)，J.J.Dunn等，J.Mol.Biol.，166477-535(1983))中的任意一種，但優(yōu)選φ10啟動子(A.H.Rosenberg et al，Gene，56125-135(1987))。
作為載體優(yōu)選在上述載體中將T7啟動子、T7終止子重組而構(gòu)建的載體，如此所述的載體包括pET-1、pET-2、pET-3、pET-4、pET-5、pET-11(A.H.Rosenberg，Gene，56125-135(1987))。
除了前述的實例，根據(jù)需要，表達(dá)載體還可使用包含增強(qiáng)子、剪接信號、poly A加尾信號、選擇標(biāo)記、SV40復(fù)制起始子(下文通常簡寫為SV40ori)等。選擇標(biāo)記的例子包括，二氫葉酸還原酶(下文通?？s寫為dhfr)基因[甲氨喋呤(MTX)抗性]、氨芐西林抗性基因(下文通?？s寫為Ampr)、新霉素抗性基因(下文通?？s寫為Neor，Geneticin抗性)等。尤其是，當(dāng)CHO(dhfr-)細(xì)胞缺少dhfr基因并用dhfr基因作為選擇標(biāo)記時，使用無胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基可以篩選重組型體細(xì)胞。
根據(jù)需要，可在本發(fā)明多肽的N-端加上同宿主匹配的信號序列。在用大腸桿菌屬細(xì)菌作宿主時，可以使用的信號序列為Pho A信號序列、OmpA信號序列等；當(dāng)用枯草桿菌屬的細(xì)菌作宿主時，可以使用的信號序列為α-淀粉酶信號序列、枯草桿菌蛋白酶信號序列等；在用酵母作宿主時，可以使用的信號序列為MFα信號序列、SUC2信號序列等；在用動物細(xì)胞作宿主時，可以使用的信號序列為胰島素信號序列、α干擾素信號序列、抗體分子信號序列等。
使用含有如此構(gòu)建的編碼本發(fā)明多肽的DNA序列的載體，可獲得轉(zhuǎn)化體。
可以使用的宿主的實例有，屬于大腸桿菌屬的細(xì)菌、屬于枯草桿菌屬的細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、昆蟲以及動物細(xì)胞等。
大腸桿菌屬的細(xì)菌有，大腸桿菌(Escherichia coli)K12 DH1(美國國家科學(xué)院院刊，60，160(1968))、JM103(核酸研究，9，309(1981))、JA221(分子生物學(xué)雜志，120，517(1978))、HB101(分子生物學(xué)雜志，41，459(1969))、C600(遺傳學(xué)，39，440(1954))等。
當(dāng)利用T7啟動子表達(dá)系時，作為其轉(zhuǎn)化體的宿主包括整合有T7 RNA聚合酶基因(F.W.Studier et al，J.Mol.Biol.189113-130(1986))的大腸桿菌，例如MM294、DH-1、C600、JM109、BL21或者把T7 RNA聚合酶基因與其它質(zhì)粒形成的重組型大腸桿菌等。優(yōu)選使用把T7 RNA聚合酶基因重組到λ噬菌體經(jīng)過溶原化MM294系、BL21系以及BL21(DE3)系等。此時，作為T7 RNA聚合酶基因的啟動子可以使用其表達(dá)被異丙基-1-硫基-β-D-吡喃半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)的lac啟動子。
枯草桿菌屬的細(xì)菌有，枯草桿菌MI 114(基因，24，255(1983))、207-221(生物化學(xué)雜志，95，87(1984))等。
酵母有，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913、NCYC2036、巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)KM71等。
就昆蟲細(xì)胞而言，病毒為AcNPV時有草地夜蛾幼蟲(Spodopterafrugiperda，Sf)的細(xì)胞株、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)中腸的MG1細(xì)胞、粉紋夜蛾卵的High FiveTM細(xì)胞、甘藍(lán)夜蛾(Mamestra brassicae)的細(xì)胞、Estigmenaacrea的細(xì)胞等；病毒為BmNPV時有家蠶(Bombyx mori)的N細(xì)胞(BmN細(xì)胞)等?？捎玫腟f細(xì)胞有Sf9細(xì)胞(ATCC CRL1711)、Sf21細(xì)胞(這兩種細(xì)胞均由Vaughn，J.L.et al.在In Vivo，13，213-217(1977)中描述)。
作為昆蟲的例子，可以使用家蠶的幼蟲(前田等，自然，315，592(1985))。
動物細(xì)胞包括猴COS-7細(xì)胞、Vero、中華倉鼠細(xì)胞CHO(以下簡稱CHO細(xì)胞)、dhfr基因缺陷的中華倉鼠細(xì)胞CHO(以下簡稱CHO(dhfr-)細(xì)胞)、小鼠L細(xì)胞、小鼠AtT-20細(xì)胞、小鼠骨髓瘤細(xì)胞、大鼠GH3、人FL細(xì)胞等。
大腸桿菌屬的細(xì)菌可以根據(jù)美國國家科學(xué)院院刊，69，2110(1972)或基因，17，107(1982)中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
枯草桿菌屬的細(xì)菌可以根據(jù)分子及普通遺傳學(xué)，168，111(1979)中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
酵母可以根據(jù)酶學(xué)方法，194，182-187(1991)或美國國家科學(xué)院院刊.，75，1929(1978)中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
昆蟲細(xì)胞或昆蟲可以根據(jù)生物/技術(shù)，6，47-55(1988)中描述的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以根據(jù)《細(xì)胞工程學(xué)增訂版8，細(xì)胞工程學(xué)實驗最新技術(shù)》秀潤出版社，263-267(1995)或病毒學(xué)，52，456(1973)中描述的方法進(jìn)行。
由此，可以獲得用含有本發(fā)明多肽之編碼DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
當(dāng)培養(yǎng)宿主為大腸桿菌、枯草桿菌的轉(zhuǎn)化體時，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有轉(zhuǎn)化體生長所必需的物質(zhì)例如碳源、氮源、無機(jī)物等。碳源包括葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等。氮源包括無機(jī)或有機(jī)物質(zhì)如銨鹽、硝酸鹽、玉米漿、蛋白胨、酪蛋白、酵母提取液、肉汁、黃豆餅粉、馬鈴薯抽提物等。無機(jī)物又包括氯化鈣、磷酸二氫鈉、氯化鎂等。此外，在培養(yǎng)基中也可加入酵母提取液、維生素、促生長因子等。培養(yǎng)基的pH值優(yōu)選約5-8。
用于培養(yǎng)大腸桿菌屬細(xì)菌的培養(yǎng)基優(yōu)選為，加有葡萄糖和酪蛋白水解物的M9培養(yǎng)基(Miller，分子遺傳學(xué)實驗雜志，431-433，冷泉港實驗室，紐約，1972)。必要時可以在培養(yǎng)基中加入試劑如3β-吲哚基丙烯酸，來有效激活啟動子。
當(dāng)用大腸桿菌屬的細(xì)菌作為轉(zhuǎn)化宿主時，轉(zhuǎn)化體通常在大約15-43℃培養(yǎng)約3-24小時。必要時培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
當(dāng)用枯草桿菌屬的細(xì)菌作為轉(zhuǎn)化宿主時，轉(zhuǎn)化體通常在大約30-40℃培養(yǎng)約6-24小時。必要時培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
當(dāng)用酵母作為宿主時，轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在，例如Burkholder氏基本培養(yǎng)基(Bostian，K.L.等，美國國家科學(xué)院院刊，77，4505(1980))或加了0.5％酪蛋白水解物的SD培養(yǎng)基(Bitter，G.A.等，美國國家科學(xué)院院刊，81，5330(1984))上。優(yōu)選培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到大約5-8。轉(zhuǎn)化體通常在大約20-35℃培養(yǎng)約24-72小時。根據(jù)需要，培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
當(dāng)用昆蟲細(xì)胞或昆蟲作為宿主時，轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在，例如Grace’s昆蟲培養(yǎng)基(Grace，T.C.C.，自然，195，788(1962))上，其中添加有固相化10％牛血清等適當(dāng)添加劑。優(yōu)選培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到大約6.2-6.4。轉(zhuǎn)化體通常在大約27℃培養(yǎng)大約3-5天。根據(jù)需要，培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
當(dāng)用動物細(xì)胞作為宿主時，轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在，例如含有大約5-20％胎牛血清的MEM培養(yǎng)基(科學(xué)，122，501(1952))、DMEM培養(yǎng)基(病毒學(xué)，8，396(1959))、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國醫(yī)學(xué)會雜志，199，519(1967))、199培養(yǎng)基(Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1(1950))等中。優(yōu)選培養(yǎng)基pH值調(diào)節(jié)到大約6-8。轉(zhuǎn)化體通常在大約30-40℃培養(yǎng)大約15-60小時。根據(jù)需要，培養(yǎng)物可以進(jìn)行充氣或攪拌。
如上所述，本發(fā)明的多肽可以產(chǎn)生在轉(zhuǎn)化體的細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞膜或細(xì)胞外。
可以根據(jù)下述方法從上述培養(yǎng)物中分離純化本發(fā)明的多肽。
在培養(yǎng)后，用眾所周知的方法收集轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，懸浮在一合適的緩沖液中，從中抽提本發(fā)明的多肽。然后用眾所周知的方法破碎轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞，如超聲處理、溶菌酶處理和/或反復(fù)凍融等，然后離心、過濾，獲得本發(fā)明多肽的粗提物。由重組物產(chǎn)生的多肽在菌體中形成包含體時，通過離心收集菌體后，通過超聲等處理破碎菌體，把得到的包含體用變性劑(如2-8M鹽酸胍、5-9M尿素等)處理，通過溶化作用可以抽提多肽。當(dāng)所述多肽分泌在培養(yǎng)液中時，在培養(yǎng)結(jié)束后，用眾所周知的方法從轉(zhuǎn)化體或細(xì)胞中經(jīng)分離而收集上清。
上清或包含在所獲抽提物中的多肽可通過將已知的分離和純化方法適當(dāng)組合來進(jìn)行純化。這些眾所周知的分離純化方法包括，利用溶解性差異的方法如鹽析、溶劑沉淀等；主要利用分子量差異的方法如透析、超濾、凝膠過濾、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳等；利用電荷差異的方法如離子交換層析等；利用特異性親和力差異的方法如親和層析等；利用疏水性差異的方法例如反相高效液相色譜等；利用等電點差異的方法如等電聚焦電泳。
當(dāng)如此獲得的多肽為游離形式時，可用眾所周知的方法或其改良法將其轉(zhuǎn)換為鹽。相反，當(dāng)獲得的多肽為鹽時，可用眾所周知的方法或其改良法將其轉(zhuǎn)換為游離形式或另一種鹽形式。
重組產(chǎn)生的多肽，在純化前或純化后，可用相應(yīng)蛋白修飾酶或蛋白分解酶等處理，或者通過化學(xué)反應(yīng)從而使多肽經(jīng)適當(dāng)修飾，部分除去一段多肽。其中所述酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰內(nèi)肽酶、激素原轉(zhuǎn)變酶1(PC1)、激素原轉(zhuǎn)變酶2(PC2)、羧肽酶B、蛋白激酶、糖苷酶等。所述化學(xué)反應(yīng)包括利用溴化氰(CNBr)而進(jìn)行的切割反應(yīng)等。
抽提的目標(biāo)蛋白或分離純化的目標(biāo)蛋白根據(jù)需要可以進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊。折疊的進(jìn)行可根據(jù)[《蛋白質(zhì)折疊》(R.H.Pain編，245-279(1995))SpringerVerlag，東京]所描述的公知方法或其類似方法實施。其實施可通過不含抽提試劑(如胍鹽酸鹽、尿素之類的促溶劑、n-月桂基甲基甘氨酸、SDS之類的表面活性劑等)，或在含低濃度的抽提試劑的緩沖液中經(jīng)過一次或多次稀釋或者經(jīng)過半透膜的透析，以及通過使用凝膠過濾的緩沖液置換等進(jìn)行。此時，為了防止目標(biāo)蛋白的凝集，可以添加精氨酸、聚乙烯乙二醇、中性表面活性劑等。為了使蛋白質(zhì)形成二硫鍵，可以進(jìn)行空氣氧化，或者添加氧化還原緩沖液等。在氧化還原緩沖液中有，以谷胱甘肽、半胱氨酸、二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇或半胱胺為主的緩沖液。
當(dāng)分別產(chǎn)生了本發(fā)明多肽，即A鏈以及B鏈時，可以用二硫鍵使之結(jié)合。例如分別把編碼A鏈和B鏈的DNA片段連接于lacZ(β-半乳糖苷酶)基因，用大腸桿菌作宿主制備β-半乳糖苷酶+A鏈、β-半乳糖苷酶+B鏈形成的結(jié)合蛋白，然后用溴化氰或酶處理將A鏈和B鏈從結(jié)合蛋白上切割下來。被切割的A鏈和B鏈在還原狀態(tài)下進(jìn)行混合，逐漸使之氧化可被轉(zhuǎn)換為一種A鏈和B鏈通過二硫鍵連接的蛋白質(zhì)。優(yōu)選A鏈和B鏈的連接狀態(tài)為，例如A鏈的Cys11和B鏈的Cys10形成二硫鍵，并且A鏈的Cys24和B鏈的Cys22形成二硫鍵，而且A鏈的Cys10和A鏈的Cys15形成二硫鍵。此時的轉(zhuǎn)換條件可以按照，如胰島素分子的制備方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76卷，106(1979)]進(jìn)行。
由此產(chǎn)生的本發(fā)明多肽或它們的鹽的存在與否，可通過利用特異性抗體的酶免疫分析法或蛋白質(zhì)印跡法等進(jìn)行測定。
針對本發(fā)明的多肽、其酰胺或其酯或其鹽(以下，有時簡稱為本發(fā)明的多肽)的抗體，只要所述抗體能夠識別本發(fā)明多肽，多克隆抗體或單克隆抗體均可。
針對本發(fā)明多肽的抗體可使用本發(fā)明多肽作為抗原，根據(jù)本領(lǐng)域公知的抗體或抗血清的制備方法進(jìn)行制備。
(a)產(chǎn)生單克隆抗體細(xì)胞的制備將本發(fā)明的多肽，單獨(dú)或與載體或稀釋劑一起給藥于溫血動物體內(nèi)能產(chǎn)生抗體的部位。為了增加給藥后抗體的產(chǎn)量，可給予福氏完全或不完全佐劑。有效給藥通常為每2-6周一次，一共2-10次。使用的溫血動物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、家雞，優(yōu)選小鼠和大鼠。
在制備產(chǎn)生單克隆抗體細(xì)胞時，從抗原免疫的溫血動物如小鼠中選擇抗體滴度比較明顯的動物，在最后一次免疫的2-5天后取脾臟或淋巴結(jié)，使其中產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與同種或異種動物的骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞?？寡逯锌贵w滴度的測定可以通過使抗血清與標(biāo)記的隨后所述的多肽反應(yīng)，然后測定標(biāo)記試劑同抗體的結(jié)合活性?？梢愿鶕?jù)Koehler和Milstein(自然，256，495，1975)的方法進(jìn)行融合。融合加速劑的例子為聚乙二醇(PEG)、仙臺病毒等，優(yōu)選PEG。
溫血動物骨髓瘤細(xì)胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0和AP-1等，其中優(yōu)選P3U1。所用抗體產(chǎn)生細(xì)胞(脾臟細(xì)胞)同骨髓瘤細(xì)胞的比例優(yōu)選約為1∶1到20∶1，加入濃度約為10％-80％的PEG(優(yōu)選PEG 1000-6000)。然后在20-40℃保溫。為了有效實施細(xì)胞融合，優(yōu)選30-37℃保溫約1-10分鐘。
可以用各種方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤。所述這些方法可舉例為將作為抗原的多肽直接或與載體一起吸附至一種固相(如微量反應(yīng)板)，將雜交瘤上清加入到該固相中，然后加入標(biāo)記的放射性物質(zhì)或酶的抗免疫球蛋白抗體(如果用小鼠細(xì)胞作融合，則用抗小鼠的免疫球蛋白抗體)或蛋白A，檢測結(jié)合到固相上的單克隆抗體；另一方法為，將雜交瘤上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗體或蛋白A的固相中，加入標(biāo)記的放射性物質(zhì)或酶的多肽，檢測結(jié)合到固相上的單克隆抗體。
單克隆抗體的篩選可以根據(jù)眾所周知的方法或其改進(jìn)方法進(jìn)行。一般地，在含有HAT(次黃嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶)的動物細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選?？梢允褂萌魏魏Y選和生長培養(yǎng)基，只要雜交瘤可以在其中生長。例如，可以使用含有1％-20％，優(yōu)選10-20％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基、含有1％-10％胎牛血清的GIT培養(yǎng)基(和光純藥工業(yè)株式會社)、或者無血清的雜交瘤培養(yǎng)基(SFM-101，日水制藥株式會社)作為篩選或生長培養(yǎng)基。通常在含5％CO2的條件下于20-40℃(優(yōu)選37℃)培養(yǎng)約5天-3周(優(yōu)選1-2周)。雜交瘤培養(yǎng)上清液中抗體滴度的測定同上述抗血清中抗體滴度測定方法相同。
(b)單克隆抗體的純化單克隆抗體的分離和純化可根據(jù)公知方法，例如免疫球蛋白的分離和純化方法(如鹽析、乙醇沉淀、等電點沉淀、電泳、離子交換劑(如DEAE)吸附和去吸附、超離心、凝膠過濾、或一種特異性純化方法，其包括僅收集與結(jié)合了抗原的固相、蛋白A或蛋白G等已活化吸附劑相結(jié)合的抗體并使之分離以獲得該抗體)。

本發(fā)明多克隆抗體的制備用眾所周知的方法或其改進(jìn)方法進(jìn)行。例如，用與上述生產(chǎn)單克隆抗體相似的方法生產(chǎn)免疫原(多肽抗原)或配制免疫原與載體蛋白形成的復(fù)合物并用其免疫溫血動物。從已免疫的動物中收集產(chǎn)物，其中含有本發(fā)明多肽的抗體，分離和純化該抗體。
在由免疫原和載體蛋白組成的用于免疫溫血動物的復(fù)合物中，對載體蛋白的類型和載體同半抗原的混合比率無限定，只要能針對與載體一起交聯(lián)而免疫的半抗原有效產(chǎn)生抗體。例如，牛血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或匙孔血藍(lán)蛋白與半抗原以載體比半抗原重量比約0.1-20，優(yōu)選約1-5的比率偶聯(lián)。
不同的縮合劑可用于偶聯(lián)載體和半抗原。戊二醛、碳二亞胺、馬來酰亞胺活化的酯和含有巰基或二硫代吡啶基活化的酯試劑可用于偶聯(lián)。
將縮合產(chǎn)物單獨(dú)或與載體或稀釋劑一起給藥于溫血動物體內(nèi)能產(chǎn)生抗體的部位。為了增加給藥后抗體的產(chǎn)量，可給予福氏完全或不完全佐劑。大約每2-6周給藥一次，共3-10次。
多克隆抗體從用上述方法免疫的溫血動物的血液、腹水等(優(yōu)選血液)中收集。
抗血清中多克隆抗體滴度的測定同上述測定血清抗體滴度的方法相同?？梢愿鶕?jù)上述用于分離和純化單克隆抗體的免疫球蛋白分離純化方法來分離和純化多克隆抗體。
另外，利用本發(fā)明多肽也可以按照Nat.Biotechnol，14，845-851.(1996)；Nat Genet.15，146-156.(1997)；PNAS，97(2)，722-727(2000)等描述的方法制備人的抗體。
具有與編碼本發(fā)明多肽的DNA(下文，有時稱作本發(fā)明DNA)互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的堿基序列的反義DNA可為任一種反義DNA，只要其含有與本發(fā)明DNA互補(bǔ)或基本互補(bǔ)的堿基序列，并能抑制該DNA的表達(dá)。
與本發(fā)明DNA基本互補(bǔ)的堿基序列，包括具有與互補(bǔ)于本發(fā)明DNA之堿基序列(即本發(fā)明DNA互補(bǔ)鏈)的全部或部分堿基序列至少約70％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％同源性的DNA。尤其是在本發(fā)明DNA互補(bǔ)鏈的全部堿基序列中，優(yōu)選反義DNA具有與編碼本發(fā)明多肽上N-末端區(qū)的部分堿基序列(如起始密碼子附近的堿基序列等)的互補(bǔ)鏈至少約70％同源性，優(yōu)選至少約80％同源性，更優(yōu)選至少約90％，最優(yōu)選至少約95％。這些反義DNA可以使用公知的DNA合成裝置生產(chǎn)合成。
當(dāng)本發(fā)明多肽包含信號肽時，它能有效地分泌到細(xì)胞外，并作為一種液體因子發(fā)揮著重要生物活性的作用，如生物機(jī)體的調(diào)節(jié)等。
下面闡述本發(fā)明多肽；本發(fā)明DNA；針對本發(fā)明多肽或其鹽的抗體(以下通常簡稱為本發(fā)明抗體)以及反義DNA的用途。
(1)由于本發(fā)明多肽在組織中能夠進(jìn)行特異性表達(dá)，所以可將其用作組織標(biāo)記。也就是說，它作為一種標(biāo)記可來檢測組織的分化、病變、癌轉(zhuǎn)移等。也可用來提取相應(yīng)的受體、結(jié)合多肽等。另外，它作為本領(lǐng)域公知的用于高產(chǎn)量篩選的組群，可用來研究生物活性。
(2)與本發(fā)明多肽相關(guān)的各種疾病的預(yù)防藥物與治療藥物因為本發(fā)明多肽它是以液體因子形式存在于生物體內(nèi)，如后面將要敘述的實施例中所描述的那樣，它具有促進(jìn)MMP-1(間質(zhì)金屬蛋白酶-1)或者VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子)的表達(dá)作用，因此當(dāng)本發(fā)明多肽，或本發(fā)明DNA等發(fā)生異常或缺陷，或者當(dāng)表達(dá)水平異常減少或亢進(jìn)時，將導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。如碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等。因此本發(fā)明多肽以及本發(fā)明的DNA可以用作預(yù)防或治療如下疾病的藥物。所述疾病包括碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等。
還有，為了與其他胰島素/胰島素樣生長因子/松馳素家族多肽形成一個家族，本發(fā)明多肽當(dāng)其他家族多肽或其DNA等產(chǎn)生異常或缺陷時，或者其表達(dá)水平異常減少或產(chǎn)生亢進(jìn)時，可以通過與其他家族的互補(bǔ)作用，進(jìn)一步在表達(dá)水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)異常時，可以通過本發(fā)明多肽獨(dú)自的藥理作用可作為治療或預(yù)防各種疾病的藥物等，所述疾病包括碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等。
如上所述，本發(fā)明多肽進(jìn)一步優(yōu)選由1組A鏈內(nèi)二硫鍵和2組A鏈和B鏈之間二硫鍵而形成，但可允許2組二硫鍵的A鏈單獨(dú)或具有1組的二硫鍵的B鏈單獨(dú)的分子種存在。后者的A鏈或B鏈單獨(dú)的分子種也可用作治療或預(yù)防各種疾病的藥物，所述疾病包括代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等。
例如，當(dāng)生物體內(nèi)本發(fā)明多肽很少或缺失時，當(dāng)患者不能使其細(xì)胞內(nèi)信息傳遞充分或正常地發(fā)揮作用時，本發(fā)明DNA可以通過以下3種方式充分地或正常地為該患者提供本發(fā)明多肽的作用(a)給予該患者本發(fā)明DNA，以便在體內(nèi)表達(dá)本發(fā)明多肽；(b)將本發(fā)明DNA插入細(xì)胞中，表達(dá)本發(fā)明多肽之后，通過將該細(xì)胞轉(zhuǎn)移給該患者或(c)直接將本發(fā)明多肽投藥于該患者體內(nèi)。
當(dāng)本發(fā)明DNA用作上述預(yù)防或治療藥物時，該DNA本身可單獨(dú)使用，或插入合適載體如反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或腺伴隨病毒載體后按常規(guī)方法給藥于人或其它溫血動物。本發(fā)明DNA也可以以裸露DNA的形式給藥，或與生理學(xué)上承認(rèn)的用于促進(jìn)吸收的輔助劑等的載體一起制成藥劑并給藥以便于其被基因槍攝入或通過含有水凝膠的導(dǎo)管。
當(dāng)本發(fā)明多肽用作所述治療或預(yù)防藥物時，優(yōu)選所用純度至少90％，優(yōu)選95％以上，更優(yōu)選98％以上，最優(yōu)選99％以上。例如，本發(fā)明的多肽可以以片劑(必要時加糖衣)、膠囊、酏劑、微膠囊等劑型口服，或以可注射型制劑如，與水或其它可藥用液體形成的無菌溶液或懸浮制劑經(jīng)非胃腸道給藥。例如，將本發(fā)明的多肽與生理學(xué)上可接受的已知載體、調(diào)味劑、賦形劑、載色劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、粘合劑等制成符合制藥規(guī)定的要求的常用單位劑型。控制制劑中的活性成分使得在給定范圍內(nèi)獲得合適劑量?？膳c片劑、膠囊等混合的添加劑包括，粘和劑如明膠、玉米淀粉、西黃耆膠、金合歡膠等；賦形劑如結(jié)晶纖維素；膨脹劑如玉米淀粉、明膠和藻酸；潤滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖和糖精；調(diào)味劑如薄荷、akamono oil或櫻桃。當(dāng)單位劑型為膠囊形式時，可進(jìn)一步將液體載體如油和脂肪同上述添加劑一起使用。可根據(jù)常規(guī)制藥方法制備注射用無菌組合物，例如將活性成分與天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或懸浮在載體，如注射用的水中來制備藥物。用于注射的液體介質(zhì)的例子包括，生理鹽水、及包含葡萄糖和其它輔助制劑(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化鈉等)的等滲溶液，并可以進(jìn)一步同合適的助溶劑如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非離子表面活性劑(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等結(jié)合使用。油性介質(zhì)有橄欖油、芝麻油、大豆油、花生油、棉籽油、玉米油等植物油、丙二醇等，它們可與助溶劑如苯甲酸芐酯和苯甲醇結(jié)合使用。此外，上述的治療或預(yù)防制劑可進(jìn)一步與緩沖液(例如磷酸鹽緩沖液和乙酸鈉緩沖液等)、鎮(zhèn)靜劑(例如苯扎氯胺和鹽酸普魯卡因等)、穩(wěn)定劑(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐劑(例如苯甲醇、酚等)、抗氧化劑等結(jié)合使用。由此制備的注射液體一般裝在合適的安瓿中。
本發(fā)明DNA所插入的載體用與上述類似的方法制成制劑，這類制劑通常經(jīng)非胃腸道途徑給藥。如此所獲制劑安全、低毒，因此可用于溫血動物(例如，人、大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、鳥、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)。
本發(fā)明多肽的劑量依賴于病癥、受試者和給藥方法等而異；例如口服給藥本發(fā)明多肽治療代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.01-1000mg/天，優(yōu)選大約1-1000mg/天，更優(yōu)選10-500mg/天，再優(yōu)選10-200mg/天。當(dāng)非胃腸道給藥時，該多肽一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如在治療代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等時，成年人(體重60kg)優(yōu)選活性成分靜脈注射患部或周身，其注射劑量為大約0.001-500mg/天，優(yōu)選大約0.01-500mg/天，更優(yōu)選大約0.1-200mg/天，再優(yōu)選大約0.1-100mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重?fù)Q算相應(yīng)給藥劑量。
(2)篩選可作為疾病治療藥物的侯選化合物由于本發(fā)明多肽是以液體因子形式存在于生物體內(nèi)，因此具有促進(jìn)本發(fā)明多肽功能(活性)的化合物或其鹽可作為以下各種疾病的治療或預(yù)防藥物而使用例如碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等。
另一方面，具有抑制本發(fā)明多肽功能(活性)的化合物或其鹽可作為治療或預(yù)防起因于本發(fā)明多肽過量產(chǎn)生導(dǎo)致疾病的藥物。
因此，本發(fā)明多肽可作為一種試劑，用于篩選具有促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽功能(活性)的化合物或其鹽。
即，本發(fā)明提供(1)一種篩選方法，其用于篩選具有促進(jìn)本發(fā)明多肽或其鹽的功能(活性)的化合物或其鹽(下文通常簡稱為促進(jìn)劑)，或者其用于篩選具有抑制本發(fā)明多肽或其鹽的功能(活性)的化合物(下文通常簡稱為抑制劑)，其特征為，該篩選法包括應(yīng)用本發(fā)明多肽或其鹽。
本發(fā)明篩選用試劑盒包含本發(fā)明多肽或其鹽。
所述以包括應(yīng)用本發(fā)明多肽為特征的、篩選具有促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽或其鹽的功能(活性)的化合物或其鹽的方法，具體地說，包括如下篩選方法使本發(fā)明多肽與組織、細(xì)胞或它們的膜級分之間的結(jié)合特性改變的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)或其鹽的方法，該方法特征為(i)使本發(fā)明多肽與由本發(fā)明多肽所結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分接觸時和(ii)使本發(fā)明多肽以及待測化合物與由本發(fā)明多肽結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分接觸時進(jìn)行比較。
在本發(fā)明的篩選方法中，在上述所說的(i)使本發(fā)明多肽與由本發(fā)明多肽所結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分接觸的時候和(ii)使本發(fā)明多肽以及待測化合物與由本發(fā)明多肽所結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分接觸的時候測定并比較配體與由本發(fā)明多肽所結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分結(jié)合的結(jié)合量、細(xì)胞的刺激活性、組織的反應(yīng)性等。
更具體地說，本發(fā)明的篩選方法為①一種篩選本發(fā)明多肽和由本發(fā)明多肽所結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分之間的結(jié)合特性改變的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)或其鹽的方法，該方法特征為(i)使標(biāo)記的本發(fā)明多肽與由本發(fā)明多肽所結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分接觸時和(ii)使標(biāo)記的本發(fā)明多肽以及待測化合物與由本發(fā)明多肽結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分接觸的時候，測定并比較標(biāo)記的本發(fā)明多肽與由本發(fā)明多肽所結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分的結(jié)合量；②一種篩選本發(fā)明多肽和針對本發(fā)明多肽受體之間特性改變的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)或其鹽的方法，該方法特征為使標(biāo)記的本發(fā)明多肽與含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞或該細(xì)胞膜級接觸時和，使標(biāo)記的本發(fā)明多肽以及待測化合物與含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞或該細(xì)胞膜級接觸時測定并比較標(biāo)記的本發(fā)明多肽針對該細(xì)胞或該膜級分的結(jié)合量；③一種篩選本發(fā)明多肽和針對本發(fā)明多肽受體之間特性改變的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)或其鹽的方法，該方法特征為使標(biāo)記的本發(fā)明多肽與通過培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽受體DNA的轉(zhuǎn)化體并在細(xì)胞膜上表達(dá)的、針對本發(fā)明多肽受體接觸的時候和，使標(biāo)記的本發(fā)明多肽以及待測化合物與通過培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽受體DNA的轉(zhuǎn)化體并在細(xì)胞膜上表達(dá)的、針對本發(fā)明多肽受體接觸的時候，測定并比較標(biāo)記的本發(fā)明多肽針對本發(fā)明多肽受體結(jié)合的結(jié)合量；
④一種篩選本發(fā)明多肽和針對本發(fā)明多肽受體之間特性改變的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)或其鹽的方法，該方法特征為使激活本發(fā)明多肽受體的化合物(如本發(fā)明多肽)與含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞接觸的時候和，使激活本發(fā)明多肽受體的化合物及待測化合物與含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞接觸的時候，測定并比較通過本發(fā)明多肽受體介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性(如促進(jìn)或抑制以下各種活性包括花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放、細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生、磷酸肌醇的產(chǎn)生、細(xì)胞膜電位變化、細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化、c-fos的激活、細(xì)胞外液pH的降低、NO產(chǎn)生、該細(xì)胞特有形成的生理活性物質(zhì)的產(chǎn)生等)以及；⑤一種篩選本發(fā)明多肽和針對本發(fā)明多肽受體之間特性改變的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)或其鹽的方法，該方法特征為使激活本發(fā)明多肽受體的化合物(如本發(fā)明多肽)與通過培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽受體DNA的轉(zhuǎn)化體并在細(xì)胞膜上表達(dá)的、針對本發(fā)明多肽受體接觸的時候和，使激活本發(fā)明多肽受體的化合物及待測化合物與通過培養(yǎng)含有編碼本發(fā)明多肽受體DNA的轉(zhuǎn)化體并在細(xì)胞膜上表達(dá)的、針對本發(fā)明多肽受體接觸的時候，測定并比較通過本發(fā)明多肽受體介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性(如促進(jìn)或抑制以下各種活性包括花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放、細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生、磷酸肌醇的產(chǎn)生、細(xì)胞膜電位變化、細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化、c-fos的激活、細(xì)胞外液pH的降低、NO產(chǎn)生、該細(xì)胞特有形成的生理活性物質(zhì)的產(chǎn)生等)。
⑥編碼本發(fā)明多肽受體的DNA可以通過以下方法獲得。將本發(fā)明多肽用125I等放射性同位素或熒光素等的熒光物質(zhì)或生物素等標(biāo)記，檢測由該標(biāo)記物特異性結(jié)合的細(xì)胞系、組織、器官等。下面用公知方法從所述的細(xì)胞、組織和器官中提取mRNA合成cDNA，然后克隆于用于動物細(xì)胞的表達(dá)載體上。再將其轉(zhuǎn)入到COS7細(xì)胞中，在該轉(zhuǎn)化體細(xì)胞中上面所述的標(biāo)記物是否結(jié)合作為指標(biāo)，進(jìn)而可以篩選出由編碼本發(fā)明多肽受體的DNA重組的轉(zhuǎn)換體細(xì)胞(表達(dá)克隆)。
⑦另外，制備一種混和引物，該引物具有與胰島素受體家族結(jié)構(gòu)相同特征(如酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域等的氨基酸序列)，通過進(jìn)行RT-PCR可以獲得屬于胰島素受體家族新的受體cDNA片斷。然后將得到的DNA序列以此為模板進(jìn)行5′-RACE和3′-RACE PCR反應(yīng)，獲得全長的cDNA。再將其導(dǎo)入上述的用于動物細(xì)胞表達(dá)的載體，在適當(dāng)?shù)膭游锱囵B(yǎng)細(xì)胞中如CHO細(xì)胞或COS7細(xì)胞等中進(jìn)行表達(dá)，通過確認(rèn)本發(fā)明多肽的特異性結(jié)合，可以證實其為編碼本發(fā)明多肽受體的DNA。
以下更具體地說明本發(fā)明的篩選方法首先，應(yīng)用于本發(fā)明篩選方法的本發(fā)明多肽結(jié)合的組織、細(xì)胞或它們的膜級分等，也就是說，作為本發(fā)明多肽的受體，只要其能特異性與本發(fā)明多肽結(jié)合的均可，但優(yōu)選人、溫血動物的臟器、培養(yǎng)細(xì)胞或它們的膜級分等。但是使用來源于人的臟器是非常困難的事情，所以人的重組體就適合用大量表達(dá)的人體重組受體等。
利用所述本發(fā)明多肽的制造方法等以制備本發(fā)明多肽的受體。
在本發(fā)明的篩選方法中，當(dāng)使用含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞或該細(xì)胞膜級分等時，可以按照后面闡述的制備方法進(jìn)行。
當(dāng)使用含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞時，可以使用戊二醛或福爾馬林等固定。其固定方法可以按照本領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行。
所述含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞是指，已經(jīng)表達(dá)本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞系，它們可以是以大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞等作為宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體細(xì)胞。所述獲取已經(jīng)表達(dá)本發(fā)明多肽受體細(xì)胞的方法，包括同前面所述的用本發(fā)明多肽表達(dá)載體轉(zhuǎn)化形成的轉(zhuǎn)化體的制造方法相同。
所述膜級分是指，用眾所周知的方法破裂細(xì)胞并進(jìn)行分級分離而制備的含有大量細(xì)胞膜的級分。細(xì)胞破裂的有效方法包括用Potter-Elvehjem勻漿器擠壓、用Waring blender或Polytron(Kinematica)破裂、超聲破裂、用Frenchpress等加壓使細(xì)胞通過細(xì)嘴噴射而破裂。細(xì)胞膜組分分離主要通過離心力來實現(xiàn)，如分級離心和密度梯度離心。例如，細(xì)胞破碎液在低速(500-3000rpm)離心一段時間(通常為1-10分鐘)，得到的上清在高速(15000-30000rpm)通常離心0.5-2小時。由此獲得的沉淀部分用作細(xì)胞膜級分。細(xì)胞膜級分富含表達(dá)的本發(fā)明多肽的受體蛋白以及膜成分如細(xì)胞來源的磷脂或膜蛋白。
在含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞和細(xì)胞膜級分中，其受體含量優(yōu)選103-108分子/細(xì)胞，更優(yōu)選105-107分子/細(xì)胞。隨著表達(dá)量的增加，單位細(xì)胞膜級分的配體結(jié)合活性(比活)增加，因而不但可以構(gòu)建高敏感篩選體系，而且可以大量地測定同一批的樣品。
為了實施前面所述的方法①-③來篩選具有改變本發(fā)明多肽和本發(fā)明多肽受體之間的結(jié)合特性的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)，使用適當(dāng)?shù)谋景l(fā)明多肽受體級分和標(biāo)記的本發(fā)明多肽等。所述本發(fā)明多肽受體級分優(yōu)選本發(fā)明多肽的天然組織或細(xì)胞受體級分或者與其具有等同活性的重組型受體級分等。此處術(shù)語“同等活性”是指在配體結(jié)合活性同天然受體蛋白所擁有的活性同等，所述標(biāo)記的配體可以使用標(biāo)記的本發(fā)明多肽等。例如可以利用[3H]、[125I]、[14C]、[35S]熒光色素、生物素、β-半乳糖苷酶或過氧化物酶等標(biāo)記的本發(fā)明多肽。
更具體地，為了篩選具有改變本發(fā)明多肽和本發(fā)明多肽受體之間的結(jié)合特性的化合物，首先，將含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞或其膜級分懸浮于本方法的相應(yīng)的緩沖液中，制備標(biāo)準(zhǔn)受體制劑?？梢允褂萌魏尉彌_液，只要它不干擾配體-受體結(jié)合。此類緩沖液包括pH值約4-10(優(yōu)選6-8)的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖液。為了降低非特異結(jié)合，可任選在緩沖液中加入表面活性劑如CHAPS、Tween-80TM(Kao-Atlas)、毛地黃皂甘、脫氧膽酸等。為了抑制蛋白酶對受體或配體的降解，可加入蛋白酶抑制劑如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Institute)、抑肽素等。將一定量(5000-500000cpm)的經(jīng)過標(biāo)記的本發(fā)明多肽加入到0.01-10ml的受體溶液中，同時允許含有10-10-10-6m的待測化合物。為了測定非特異性結(jié)合(NSB)，需提供一個含有過量未標(biāo)記的本發(fā)明多肽的反應(yīng)管。在約0-50℃(優(yōu)選4-37℃)反應(yīng)20分鐘-24小時(優(yōu)選30分鐘-3小時)。在反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合物用玻璃纖維濾紙等過濾，用適量的相同緩沖液洗滌。然后用液閃儀或γ-計數(shù)儀測定在玻璃纖維濾紙中的殘留放射活性。當(dāng)不存在拮抗物時的數(shù)值(B0)中減去非特異結(jié)合值(NSB)而得到數(shù)值(B0-NSB)再乘以100％，此時可以選擇特異的結(jié)合量(B-NSB)，例如低于50％待測化合物作為具有拮抗抑制能力的候選物質(zhì)。
為了實施前面所述的方法④-⑤來篩選具有改變本發(fā)明多肽和本發(fā)明多肽受體之間的結(jié)合特性的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)，可以使用公知方法或市售的測定用試劑盒測定通過本發(fā)明多肽受體介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性(如促進(jìn)或抑制以下各種活性包括花生四烯酸釋放、乙酰膽堿釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放、細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生、磷酸肌醇的產(chǎn)生、細(xì)胞膜電位變化、細(xì)胞內(nèi)蛋白磷酸化、c-fos的激活、細(xì)胞外液pH的降低、NO產(chǎn)生、該細(xì)胞特有形成的生理活性物質(zhì)的產(chǎn)生等)。更具體地，首先在多孔平板上培養(yǎng)含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞等。當(dāng)進(jìn)行篩選之前，用新鮮培養(yǎng)基或合適的非細(xì)胞毒性緩沖液替換培養(yǎng)基，然后添加待測化合物等保溫一段時間。然后提取細(xì)胞或回收上清液，對得到的產(chǎn)物用適當(dāng)方法定量。很難檢測細(xì)胞刺激活性的指示物質(zhì)(例如花生四烯酸)的產(chǎn)生，因為細(xì)胞中存在降解酶，故在分析前可加入該降解酶的抑制劑。檢測cAMP產(chǎn)生的抑制等活性時，細(xì)胞中基礎(chǔ)生產(chǎn)水平可通過毛喉素等提高，因此可檢測對提高的基礎(chǔ)生產(chǎn)的抑制效應(yīng)。另外，對于細(xì)胞外液的pH降低來說，使用微量分析儀(CytosensorTM)測定其酸性率的變化。
測定細(xì)胞刺激活性而進(jìn)行篩選時，需要的細(xì)胞是已經(jīng)適當(dāng)表達(dá)了本發(fā)明多肽受體。所述表達(dá)了本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞優(yōu)選天然細(xì)胞系或前面所述的本發(fā)明多肽受體表達(dá)細(xì)胞系等。
所述待測化合物包括，例如肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取液、植物提取液、動物組織提取液等。
用于篩選具有使本發(fā)明多肽和本發(fā)明多肽受體之間的結(jié)合特性發(fā)生改變的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)或其鹽的試劑盒，包含本發(fā)明多肽以及本發(fā)明多肽所結(jié)合的對象(即本發(fā)明多肽受體、含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞、或者含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞膜級分等)。
通過使用本發(fā)明篩選法或篩選用試劑盒獲得的化合物或其鹽是一種具有使本發(fā)明多肽和本發(fā)明多肽受體之間的結(jié)合特性發(fā)生改變(促進(jìn)或抑制結(jié)合)的化合物(促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物)，具體地說，所述通過本發(fā)明多肽受體介導(dǎo)具有細(xì)胞刺激活性的化合物或其鹽(所說的本發(fā)明多肽受體的激動劑)、或者是不具細(xì)胞刺激活性的化合物(所說的本發(fā)明多肽受體的拮抗劑)。所述該化合物例如肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物等，它們即可以是新的化合物也可以是已知的化合物。
評價所述本發(fā)明多肽受體的激動劑或本發(fā)明多肽受體的拮抗劑具體地按照如下的(i)和(ii)進(jìn)行。
(i)當(dāng)?shù)玫揭环N具有使本發(fā)明多肽和本發(fā)明多肽受體之間的結(jié)合特性發(fā)生改變(尤其是抑制結(jié)合)的化合物之后，測定該化合物是否通過本發(fā)明多肽受體介導(dǎo)并具有細(xì)胞刺激活性。具有細(xì)胞刺激活性的化合物或其鹽可以說是本發(fā)明多肽受體的激動劑，不具有細(xì)胞刺激活性的化合物或其鹽可以說是本發(fā)明多肽受體的拮抗劑。
(ii)(a)使含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞與待測化合物接觸，測定本發(fā)明多肽受體介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性。具有細(xì)胞刺激活性的化合物或其鹽可以說是本發(fā)明多肽受體的激動劑。
(b)當(dāng)使活化本發(fā)明多肽受體的化合物與含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞(如針對本發(fā)明多肽或本發(fā)明多肽受體的激動劑)接觸的時候，和當(dāng)使活化本發(fā)明多肽受體的化合物及待測化合物與含有本發(fā)明多肽受體的細(xì)胞接觸的時候，測定并比較本發(fā)明多肽受體介導(dǎo)的細(xì)胞刺激活性。能夠降低細(xì)胞刺激活性的化合物或其鹽可以說是本發(fā)明多肽受體的拮抗劑，該活性的降低是由于激活本發(fā)明多肽受體的化合物的存在。
本發(fā)明多肽受體激動劑與針對本發(fā)明多肽受體的多肽所具有的生理活性具有同樣的作用，因此本發(fā)明多肽受體激動劑與本發(fā)明多肽一樣低毒安全適用于醫(yī)藥。
反之，本發(fā)明多肽受體拮抗劑能夠抑制針對本發(fā)明多肽受體的本發(fā)明多肽所具有的生理活性，因此本發(fā)明多肽過剩的時候，它可以抑制這種活性，進(jìn)而低毒安全適用于醫(yī)藥。
通過本發(fā)明篩選法或篩選用試劑盒獲得的化合物或其鹽是從，例如肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取液、植物提取液、動物組織提取液、血漿等篩選出來的化合物，它是一種具有促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽功能的化合物。
所述該化合物之鹽同上述本發(fā)明多肽所使用的鹽相同。
當(dāng)將通過使用本發(fā)明篩選法或篩選用試劑盒獲得的化合物用作上述治療或預(yù)防藥物時，可以按照常規(guī)方法進(jìn)行實施。例如，含有本發(fā)明多肽的藥物可以制成片劑、膠囊、酏劑、微膠囊、無菌溶液、懸浮液劑型等。
如此所獲制劑安全、低毒，因此可對溫血動物(例如，人、大鼠、小鼠、兔子、綿羊、豬、牛、馬、鳥、貓、狗、猴等)給藥。
所述化合物或其鹽的劑量依賴于該化合物的作用、病癥、受試者和給藥方法等而異；例如當(dāng)以代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等為治療目的口服給藥能夠促進(jìn)本發(fā)明多肽之機(jī)能的化合物時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.01-1000mg/天，優(yōu)選大約0.1-1000mg/天，更優(yōu)選1.0-200mg/天，最優(yōu)選1.0-50mg/天。當(dāng)非胃腸道給藥時，該化合物一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如在給藥能夠促進(jìn)治療代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等之機(jī)能的化合物時，成年人(體重60kg)優(yōu)選靜脈注射，劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重?fù)Q算相應(yīng)給藥劑量。
另一方面，當(dāng)口服給藥能夠抑制本發(fā)明多肽之機(jī)能的化合物時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.1-1000mg/天，優(yōu)選大約0.1-1000mg/天，更優(yōu)選1.0-200mg/天，最優(yōu)選1.0-50mg/天。當(dāng)非胃腸道給藥時，該化合物一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如在給藥能夠抑制本發(fā)明多肽之機(jī)能的化合物時，成年人(體重60kg)優(yōu)選靜脈注射，劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重?fù)Q算相應(yīng)給藥劑量。
(3)本發(fā)明多肽或其鹽的定量針對本發(fā)明多肽的抗體(下文通常簡稱為本發(fā)明抗體)能特異性識別本發(fā)明的多肽，因此可用于定量測試樣品溶液中的本發(fā)明多肽，尤其是通過夾心免疫分析進(jìn)行定量。因此，本發(fā)明提供了下述的定量方法(i)一種定量待測樣品液中本發(fā)明多肽的方法，其包括，使本發(fā)明的抗體與待測樣品液以及標(biāo)記的本發(fā)明多肽進(jìn)行競爭反應(yīng)，測定與該抗體結(jié)合的本發(fā)明標(biāo)記性多肽的比率；和，(ii)一種定量待測樣品液中本發(fā)明多肽的方法，其包括，同時或先后使所述待測樣品液與固定在固相載體上的本發(fā)明抗體以及標(biāo)記的本發(fā)明其它抗體反應(yīng)，測定固相載體上標(biāo)記試劑的活性。
又，除了使用本發(fā)明多肽的單克隆抗體(下文，通常稱作本發(fā)明單克隆抗體)定量本發(fā)明多肽之外，也可通過組織染色來檢測本發(fā)明多肽。為此，可用抗體本身或使用抗體分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。
對利用本發(fā)明抗體進(jìn)行本發(fā)明多肽的定量方法沒有特別的限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法，即根據(jù)待測樣品液中相應(yīng)抗原含量(例如多肽的量)，用化學(xué)或物理方法檢測抗體、抗原或抗體-抗原復(fù)合物的量，然后根據(jù)含已知量抗原的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算。優(yōu)選的方法為，例如比濁法、競爭法、免疫測定法和夾心法；就敏感性和特異性而言，特別優(yōu)選后面將要描述的夾心法。
用于分析方法的標(biāo)記試劑的例子為放射性同位素、酶、熒光物質(zhì)和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。優(yōu)選酶的例子為穩(wěn)定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶、蘋果酸脫氫酶等。熒光物質(zhì)的例子包括熒光胺、異硫氰酸熒光素等?；瘜W(xué)發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾、魯米諾衍生物、螢光素、光澤精等。此外，也可使用生物素-鏈霉素系統(tǒng)來對抗原或抗體標(biāo)記。
在固定抗原或抗體時，可以使用物理吸附。作為替代方法，也使用傳統(tǒng)上來固定多肽或酶的化學(xué)結(jié)合。載體的例子包括，固相多糖如瓊脂糖、葡聚糖、纖維素等；合成樹脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅；或玻璃等。
在夾心法中，待測樣品溶液與本發(fā)明的固定化單克隆抗體反應(yīng)(第一反應(yīng))，然后與本發(fā)明的標(biāo)記的其它單克隆抗體反應(yīng)(第二反應(yīng))，測定固相載體上的標(biāo)記試劑活性，由此可以測定待測樣品中本發(fā)明多肽的量。第一和第二反應(yīng)可以以相反次序進(jìn)行，或同時或有間隔的先后進(jìn)行。標(biāo)記試劑的類型和固定的方法同上述的相同。在夾心法免疫分析中，用于標(biāo)記的抗體和用于固相的抗體未必是一個種類的抗體，也可使用兩種或多種抗體的混合物來改善測定的靈敏度等。
在根據(jù)本發(fā)明的夾心方法測定本發(fā)明多肽時，優(yōu)選用于第一和第二反應(yīng)的單克隆抗體與本發(fā)明多肽的結(jié)合位點彼此不同。也就是說，在第一和第二反應(yīng)用的抗體為，當(dāng)?shù)诙磻?yīng)的抗體識別本發(fā)明多肽的C端區(qū)域時，優(yōu)選在第一反應(yīng)中使用能識別除C端區(qū)域以外的位點，如N端區(qū)域的抗體。
本發(fā)明的單克隆抗體可用于除夾心法以外的其它分析方法，例如競爭法、免疫測定法、比濁法等。
在競爭法中，待測溶液中的抗原和標(biāo)記抗原競爭與抗體反應(yīng)，然后將未反應(yīng)的標(biāo)記抗原(F)及結(jié)合于抗體的標(biāo)記抗原(B)分離(即B/F分離)，測定B或F的標(biāo)記量，從而可以測定待測溶液中的抗原量。在此類方法的反應(yīng)中，有一種液相方法和一種固相方法，前者使用可溶性抗體，加入針對第一抗體的第二抗體后，用聚乙二醇來有效分離B/F；后者可用固定的抗體作為第一抗體，或用可溶性抗體作為第一抗體但第二抗體為固相抗體。
在免疫測定法中，待測溶液中的抗原和固相抗原競爭性地與一定量的標(biāo)記抗體反應(yīng)，然后使液相與固相分離；或待測溶液中的抗原與過量標(biāo)記抗體反應(yīng)，然后加入固相抗原，使未反應(yīng)的標(biāo)記抗體與該固相結(jié)合，然后使液相與固相分離。隨后，測定兩相的標(biāo)記量，來測定待測溶液中的抗原量。
在比濁法中，測定抗原-抗體在凝膠或溶液中反應(yīng)產(chǎn)生的固相沉淀的量。即使待測溶液中抗原量很少且僅獲得小量的沉淀，利用激光散射的激光比濁法也可以實施。
本發(fā)明應(yīng)用這些免疫分析方法中任何一個進(jìn)行分析時，不需要任何特殊條件和操作。除了每種方法的常規(guī)條件和操作外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可構(gòu)建測定本發(fā)明多肽的分析系統(tǒng)。
所述常規(guī)技術(shù)的細(xì)節(jié)，參見如入江寬(編)“放射免疫分析”(1974，講談社，日本)；入江寬(編)“放射免疫分析，續(xù)編”(1979，講談社，日本)；石川榮治等(編)“酶免疫分析”(醫(yī)學(xué)書院，1978)；石川榮治等(編)“酶免疫分析，第二版”(醫(yī)學(xué)書院，1982)；石川榮治等(編)“酶免疫分析，第三版”(醫(yī)學(xué)書院，1987)；“酶學(xué)方法”卷70(免疫化學(xué)技術(shù)(A))；同上，卷73(免疫化學(xué)技術(shù)(B))；同上，卷74(免疫化學(xué)技術(shù)(C))；同上，卷84(免疫化學(xué)技術(shù)(D選擇性免疫分析))；同上，卷92(免疫化學(xué)技術(shù)(E單克隆抗體及普通免疫分析方法))；同上，卷121(免疫化學(xué)技術(shù)(I雜交瘤技術(shù)及單克隆抗體))(Academic Press出版)等)。
如上所述，使用本發(fā)明的抗體可高度敏感地定量本發(fā)明多肽。
此外，使用本發(fā)明的抗體可定量本發(fā)明多肽的濃度，從而當(dāng)檢出本發(fā)明多肽濃度的增加或減少時，能夠診斷出如下各種疾病或者將來對這些疾病的高度易感性例如碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、組織的生長·增殖·分化抑制、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等。
本發(fā)明抗體可用于檢出體液或者組織等待檢標(biāo)本液中存在的本發(fā)明多肽。又可用于抗體柱的制作，該抗體柱可用于純化本發(fā)明多肽；檢出各純化組分中的本發(fā)明多肽；對被檢細(xì)胞內(nèi)本發(fā)明多肽的行蹤進(jìn)行分析等。
(4)基因診斷制劑例如，本發(fā)明的DNA作為一種探針可以檢出溫血動物(例如，人、大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、雞、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴等)中編碼本發(fā)明多肽的DNA或mRNA的異常(基因異常)，因此，本發(fā)明的DNA可用作基因診斷制劑，用于診斷DNA或mRNA的損傷、突變，或其表達(dá)量的減少、和/或該DNA或mRNA的增加或過表達(dá)。進(jìn)行染色體作圖用于研究遺傳疾病。
上述基因診斷通過使用本發(fā)明的DNA，用本領(lǐng)域公知的Northern雜交分析或PCR-SSCP分析來完成(Genomics，5，874-879(1989)；美國科學(xué)院學(xué)報，86，2766-2770(1989))、DNA微列陣(Science，270，467-470(1995))等。
例如，當(dāng)用Northern雜交分析、DNA微列陣檢出表達(dá)量的減少時和PCR-SSCP分析、DNA微列陣檢出DNA突變時，能夠很大程度地診斷出如下各種疾病例如碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、組織的生長·增殖·分化抑制、生殖功能降低、結(jié)合組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等。
(5)含有反義DNA的藥物反義DNA能與本發(fā)明DNA互補(bǔ)地結(jié)合并抑制該DNA的表達(dá)，因此反義DNA能夠抑制生物體內(nèi)本發(fā)明多肽或本發(fā)明DNA，因此它可用作治療或預(yù)防起因于本發(fā)明多肽表達(dá)過剩的各種疾病。
當(dāng)將所述反義DNA用作上述各種疾病的治療或預(yù)防藥物時，同前所述含有本發(fā)明DNA的各種疾病的治療或預(yù)防藥物一樣可以實施。
例如，當(dāng)反義DNA用作上述預(yù)防/治療藥物時，反義DNA可單獨(dú)使用，或插入合適載體如反轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體或腺伴隨病毒載體后按常規(guī)方法給藥。該反義DNA可以以裸露DNA的形式給藥，或與生理學(xué)上承認(rèn)的用于促進(jìn)吸收的輔助劑等的載體一起制成藥劑并給藥以便于其被基因槍攝入或通過含有水凝膠的導(dǎo)管。
該反義DNA的劑量因患病特征、給藥對象、以及給藥方式等不同，例如將本發(fā)明反義DNA制成吸入劑在氣管內(nèi)局部給藥，一般成年人(體重60kg)，每天給藥約0.1-100mg。
該反義DNA也可用作用于診斷寡核苷酸探針，其目的是檢查組織或細(xì)胞中是否有本發(fā)明DNA的存在或者該DNA的表達(dá)情況。
(6)含有本發(fā)明抗體的藥物本發(fā)明抗體具有中和本發(fā)明多肽活性的作用，例如，該抗體可用作治療或預(yù)防起因于本發(fā)明多肽表達(dá)過剩的各種疾病。
上述各種疾病的治療藥物或預(yù)防藥物含有本發(fā)明抗體，其可直接以原始液體制劑或以適當(dāng)劑型的藥用組合物，對哺乳動物(例如，人、大鼠、兔子、綿羊、豬、牛、貓、狗、猴等)經(jīng)過口服或非口服形式給藥。本發(fā)明抗體的劑量依賴于給藥受體、癥狀和給藥方法等而異；本發(fā)明抗體靜脈注射的一次劑量為每天大約0.01-20mg/kg體重，優(yōu)選大約0.1-10mg/kg體重，更優(yōu)選0.1-5mg/kg體重，一天1-5次，優(yōu)選一天1-3次。其他非胃腸道給藥或經(jīng)口給藥均依據(jù)此量。癥狀特別嚴(yán)重者根據(jù)其病癥可以增加使用量。
本發(fā)明的抗體可以直接給藥或者制成適當(dāng)?shù)乃幱媒M合物給藥。所述藥用組合物包含上述抗體或它們的鹽和可藥用載體、稀釋劑或者賦形劑。這種組合物可以為適于經(jīng)口或非胃腸道給藥的劑型。
即，適于經(jīng)口給藥的組合物包括固體型制劑或液體型制劑，具體地有片劑(包括糖衣片、薄膜包衣片劑)、丸劑、顆粒劑、粉劑、膠囊(包括軟膠囊)、糖漿、乳劑、懸浮劑等。這種組合物可以通過公知的方法生產(chǎn)，其制劑通常包括制藥領(lǐng)域常規(guī)使用的載體、稀釋劑或賦形劑。例如用于片劑的載體或賦形劑有乳糖、淀粉、蔗糖、硬脂酸鎂等。
適于非胃腸道給藥的組合物有針劑、栓劑等，針劑包含的劑型有靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、肌肉注射劑、點滴注射劑等。這類注射劑根據(jù)公知方法，例如將所述抗體或它們的鹽溶解、懸浮或者乳化于無菌水性溶液或無菌油性溶液而制備。注射用水溶液有生理鹽水、包含葡萄糖及其它輔助制劑的等滲溶液，并還可以進(jìn)一步與合適的助溶劑如醇(如乙醇)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇)、非離子表面活性劑(如聚山梨酸酯80TM、HCO-50(加氫的蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加成化合物)等結(jié)合使用。油性溶液包括植物油如，橄欖油、芝麻油、大豆油、花生油、棉籽油、玉米油，除此之外還有丙二醇，它們可與助溶劑如苯甲酸芐酯和苯甲醇結(jié)合使用。由此制備的注射液一般裝在合適的安瓿中。用于直腸給藥的栓劑通過將所述抗體或它們的鹽與一般的栓劑基質(zhì)混合而制備。
上述口服或非口服的藥用組合物，最好制成適合于活性成分投藥劑量的用藥劑型。其投藥劑型包括，片劑、丸劑、膠囊、注射制劑(安瓿)、栓劑等，每個單位劑型通常含有上述抗體5-500mg，注射劑優(yōu)選含5-100mg，其他制劑優(yōu)選含有10-250mg。
此外，前面所述各種組合物也可含有其它活性成分，只要與上述抗體的結(jié)合不發(fā)生不利的相互作用。
(7)轉(zhuǎn)基因動物本發(fā)明提供一種非人哺乳動物，其具有編碼外源性本發(fā)明多肽的DNA(以下簡稱為本發(fā)明外源性DNA)或其DNA變體(通常簡稱為本發(fā)明外源性DNA變體)。
即，本發(fā)明提供(1)一種非人哺乳動物，其具有本發(fā)明外源性DNA或其DNA變體；(2)(1)中所述非人哺乳動物，其為嚙齒動物；(3)(2)中所述嚙齒動物，其為小鼠或大鼠；以及(4)一種重組載體，其含有本發(fā)明外源性DNA或其DNA變體，并能在哺乳動物中表達(dá)。
具有本發(fā)明外源性DNA或其DNA變體的非人哺乳動物(以下簡稱為本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物)可如下產(chǎn)生將所需DNA轉(zhuǎn)染至未受精卵、受精卵、精子以及含有相應(yīng)原始細(xì)胞的胚細(xì)胞等，優(yōu)選它們處于非人哺乳動物發(fā)育過程中胚胎發(fā)生期(更優(yōu)選單細(xì)胞或受精卵細(xì)胞期，一般在8細(xì)胞期以前)，可用方法有磷酸鈣法、電脈沖法、脂轉(zhuǎn)染技術(shù)、凝集法、顯微注射法、粒子槍法、DEAE-葡聚糖法等?？筛鶕?jù)這些轉(zhuǎn)基因法將本發(fā)明外源DNA轉(zhuǎn)移至體細(xì)胞、活器官、組織細(xì)胞等，對轉(zhuǎn)化體進(jìn)行組織培養(yǎng)或細(xì)胞培養(yǎng)?？梢赃M(jìn)一步地根據(jù)公知細(xì)胞融合法使這些細(xì)胞與所述胚細(xì)胞融合而產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物。
非人哺乳動物的例子有猴、牛、豬、綿羊、山羊、兔子、狗、貓、豚鼠、倉鼠、小鼠、大鼠等，就構(gòu)建人類疾病的動物模型而言，優(yōu)選個體發(fā)育以及生命周期比較短，容易繁殖的嚙齒動物，主要是小鼠(例如，其純種系有C57BL/6系、DBA2系等；雜種系有B6C3F1系、BDF1系、B6D2F1系、BALB/c系、ICR系等)或大鼠(例如，Wistar，SD等)等。
能夠在哺乳動物中進(jìn)行表達(dá)的重組載體中的[哺乳動物]除了所述非人哺乳動物外還包括人等。
所說本發(fā)明外源性DNA并不是非人哺乳動物本來具有的DNA，而是指從哺乳動物中分離并提取的本發(fā)明DNA。
所述本發(fā)明的DNA變體包括因本發(fā)明原始DNA的堿基序列發(fā)生變異(例如，突變等)產(chǎn)生的DNA，具體地說，包括堿基添加、缺失、用其它堿基置換產(chǎn)生的DNA，還有異常DNA。該異常DNA是指能表達(dá)異常的本發(fā)明多肽的DNA，例如，所述DNA表達(dá)的多肽可抑制本發(fā)明多肽的正常功能。
本發(fā)明外源性DNA可以來自任一哺乳動物，不論是與靶動物同種還是異種均可。當(dāng)把本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)移至靶動物體中時，優(yōu)選使用DNA構(gòu)建體，其中使該DNA連接在能于該靶動物中表達(dá)該DNA的啟動子下游。例如，轉(zhuǎn)移本發(fā)明的人源DNA時，以高水平表達(dá)本發(fā)明DNA的轉(zhuǎn)基因動物可如下制備選擇攜有與所述人源DNA高度同源的本發(fā)明DNA的非人哺乳靶動物，以及能在該靶動物中對來源于各種哺乳動物(如兔、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠等)的DNA進(jìn)行表達(dá)的各種啟動子，將所述本發(fā)明人源DNA連接于所述各種啟動子的下游形成DNA構(gòu)建體(如載體等)，然后顯微注射至所述靶動物的受精卵中，如小鼠受精卵。
本發(fā)明多肽的表達(dá)載體有大腸桿菌質(zhì)粒、枯草桿菌質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒、噬菌體如λ噬菌體、反轉(zhuǎn)錄病毒如鼠白血病病毒、動物病毒如痘苗病毒或桿狀病毒。其中優(yōu)選使用大腸桿菌質(zhì)粒、枯草桿菌質(zhì)粒、或酵母質(zhì)粒。
進(jìn)行上述DNA表達(dá)調(diào)節(jié)的啟動子通常使用如下的啟動子①來自病毒(如，人類猿病毒、巨細(xì)胞病毒、鼠白血病病毒、JC病毒、乳腺癌病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等)DNA的啟動子；②來自各種哺乳動物(人、兔子、狗、貓、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠等)的啟動子，例如下述蛋白啟動子白蛋白、胰島素II、尿空斑蛋白(uroplakin)II、彈性蛋白酶、促紅細(xì)胞生成素、內(nèi)皮素、肌酸激酶、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、血小板衍生的生長因子β、角蛋白K1、K10以及K14、I型及II型膠原蛋白、cAMP依賴性蛋白激酶βI亞單位、肌營養(yǎng)不良蛋白、抗酒石酸堿性磷酸酶、心房利鈉激素、內(nèi)皮受體-酪氨酸激酶(縮寫為Tie2)、Na/K-ATP酶、神經(jīng)微絲輕鏈、金屬硫蛋白I及IIA、金屬蛋白酶1組織抑制劑、MHC I類抗原(H-2L)、H-ras、腎素、多巴胺β-羥化酶、甲狀腺過氧化物酶(TPO)、多肽鏈延伸因子1α(EF-1α)、β-肌動蛋白、α及β-肌球蛋白重鏈、肌球蛋白輕鏈1及2、髓磷脂基質(zhì)蛋白、甲狀腺球蛋白、Thy-1、免疫球蛋白、H鏈可變區(qū)(VNP)、血清淀粉樣蛋白P成分、肌紅蛋白、肌鈣蛋白C、平滑肌α-肌動蛋白、前腦啡肽原A、加壓素等。其中最好使用能在全身高效表達(dá)的巨細(xì)胞病毒啟動子、人多肽鏈延伸因子1α(EF-1α)啟動子、人及家雞β-肌動蛋白啟動子等。
優(yōu)選上述載體在轉(zhuǎn)基因動物中有終止目標(biāo)mRNA轉(zhuǎn)錄的序列(一般稱為終止子)，例如，可以使用來自病毒以及各種哺乳動物的各種DNA的序列，優(yōu)選使用類人猿病毒的SV40終止子。
此外，為了更進(jìn)一步提高外源目標(biāo)DNA的表達(dá)，可根據(jù)不同目的將各種DNA的剪接信號、增強(qiáng)子區(qū)、真核DNA內(nèi)含子的一部分連接在該啟動子區(qū)的5′上游、或啟動子區(qū)和翻譯區(qū)之間或翻譯區(qū)的3′下游。
該翻譯區(qū)可以通過常規(guī)基因工程方法構(gòu)建成能在轉(zhuǎn)基因動物中進(jìn)行表達(dá)的DNA構(gòu)建體，其中將所述DNA連接至所述啟動子下游，必要時還同時位于轉(zhuǎn)錄終止位點的上游。
在受精卵細(xì)胞階段轉(zhuǎn)移本發(fā)明外源DNA必須保證靶哺乳動物的所有胚細(xì)胞及體細(xì)胞中都存在該外源DNA。在轉(zhuǎn)基因DNA之后產(chǎn)生的動物的胚細(xì)胞中所述本發(fā)明外源性DNA的存在表明該動物的所有后代均在其胚細(xì)胞及體細(xì)胞中含有本發(fā)明外源性DNA。繼承了這種本發(fā)明外源性DNA的動物后代在其所有胚細(xì)胞及體細(xì)胞中應(yīng)攜有本發(fā)明外源性DNA。
已轉(zhuǎn)移有正常的本發(fā)明外源性DNA的非人哺乳動物通過雜交證實該外源DNA的穩(wěn)定維持后，可作為攜有該DNA的動物在一般飼養(yǎng)環(huán)境下傳代。
在本發(fā)明受精卵細(xì)胞階段中外源DNA的轉(zhuǎn)移必須保證靶哺乳動物的所有胚細(xì)胞及體細(xì)胞中都存在過量外源DNA。在轉(zhuǎn)移DNA之后產(chǎn)生的動物胚細(xì)胞中所述本發(fā)明外源性DNA的過量存在意味著產(chǎn)生的動物后代均在其所有胚細(xì)胞及體細(xì)胞中含有過量本發(fā)明外源性DNA。繼承了這種本發(fā)明外源性DNA的動物后代在所有胚細(xì)胞及體細(xì)胞中應(yīng)保持有過量的本發(fā)明外源性DNA。
通過獲得一對同源染色體上都有導(dǎo)入的DNA的純合體動物，再通過它們的雌雄動物雜交其所有的后代就可以維持過量的該DNA。
具有正常本發(fā)明DNA的非人哺乳動物通過正常的本發(fā)明DNA高效表達(dá)，并促進(jìn)內(nèi)源性正常DNA的功能最終將導(dǎo)致本發(fā)明多肽機(jī)能亢進(jìn)病，這時，該動物可以作為這種疾病的病理模型動物使用。例如，使用本發(fā)明的正常DNA轉(zhuǎn)基因動物，可以闡明本發(fā)明多肽發(fā)生功能亢進(jìn)病癥、與本發(fā)明多肽有關(guān)的疾病的病理機(jī)制以及研究這些疾病的治療方法。
又，由于含有正常的本發(fā)明外來DNA的哺乳動物具有游離的本發(fā)明多肽增加癥狀，因此這種動物也可用于篩選與本發(fā)明多肽有關(guān)的疾病的治療藥物。
另一方面，具有異常的本發(fā)明外源性DNA的非人哺乳動物通過雜交確定外源性DNA的穩(wěn)定維持之后，可以在一般飼養(yǎng)環(huán)境下傳代。還可通過將外源目標(biāo)DNA重組到所述質(zhì)粒中而將該DNA作為起始材料使用。帶有啟動子的DNA構(gòu)建體可以通過一般DNA工程學(xué)方法制備而成。在受精卵細(xì)胞階段中本發(fā)明的異常DNA的轉(zhuǎn)基因必須保證靶哺乳動物的所有胚細(xì)胞及體細(xì)胞中都存在該異常DNA。在轉(zhuǎn)基因DNA之后產(chǎn)生的動物的胚細(xì)胞中所述本發(fā)明異常DNA的存在表明該動物的所有后代均在其胚細(xì)胞及體細(xì)胞中保持本發(fā)明異常DNA。繼承了這種本發(fā)明外源性DNA的動物后代在其所有胚細(xì)胞及體細(xì)胞中應(yīng)攜有本發(fā)明異常DNA。通過獲得一對同源染色體上都有導(dǎo)入的DNA的純合體動物，再通過它們的雌雄動物雜交，其所有的后代就可以維持該DNA。
由于具有本發(fā)明異常DNA的非人哺乳動物可使該異常DNA高效表達(dá)，通過抑制內(nèi)在的正常DNA功能，最終將導(dǎo)致該動物發(fā)生本發(fā)明多肽的功能失活型不適應(yīng)病癥，因而該動物可作為相應(yīng)疾病的模型動物使用。例如，利用本發(fā)明的異常DNA轉(zhuǎn)基因動物，可以闡明本發(fā)明多肽的功能失活型不適應(yīng)病癥以及研究這些疾病的治療方法。
又，本發(fā)明異常DNA高效表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動物可作為動物模型用于闡明本發(fā)明多肽的功能失活型不適應(yīng)病癥中本發(fā)明異常多肽對正常多肽的功能的抑制(顯性失活作用)作用。
由于攜有本發(fā)明之異常外源DNA的哺乳動物中游離形式的本發(fā)明多肽增加，因此這類動物也可用于篩選本發(fā)明多肽的功能失活型不適應(yīng)癥的治療藥物。
上述2種轉(zhuǎn)基因動物的其它可能應(yīng)用包括①作為組織培養(yǎng)的細(xì)胞來源；②通過直接分析本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物組織中的DNA或RNA，或者間接分析該DNA所表達(dá)的多肽組織，來闡述它們與被本發(fā)明多肽特異性表達(dá)或活化的多肽的關(guān)連性；③用標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)的含有所述DNA的組織細(xì)胞，研究難以培養(yǎng)的組織中細(xì)胞的功能；④用上述③中細(xì)胞篩選能夠提高該細(xì)胞功能的藥物；⑤分離純化本發(fā)明多肽的變體并制備其抗體。
用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物可以研究與本發(fā)明多肽有關(guān)的疾病的臨床癥狀，其中包括本發(fā)明多肽的功能失活型不適應(yīng)癥，同時在與本發(fā)明多肽有關(guān)的疾病模型中還能得到各器官中更詳細(xì)的病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，從而開發(fā)新治療方法，以及用于研究和治療與該疾病相關(guān)的繼發(fā)性疾病的方法。
從本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物中取出各種器官，切碎后，用胰蛋白酶等多肽酶(蛋白)分解可以得到游離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，然后建立培養(yǎng)細(xì)胞系。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物還可用于專門產(chǎn)生本發(fā)明多肽的細(xì)胞，研究這些細(xì)胞的特殊性、其與細(xì)胞凋亡、分化或增殖的關(guān)系，或者這些特性中的信號傳導(dǎo)機(jī)制，從而研究其中的任何異常性，因此本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物可以為研究本發(fā)明多肽并闡明其作用提供有用的研究材料。
為了利用本發(fā)明轉(zhuǎn)DNA基因動物，開發(fā)與本發(fā)明多肽相關(guān)的疾病(包括本發(fā)明多肽的功能失活型不適應(yīng)癥)的治療藥物，可利用上述檢查法以及定量法提供有效而快速的藥物篩選法。還可利用本發(fā)明轉(zhuǎn)基因動物或能表達(dá)本發(fā)明外源性DNA的載體，研究并開發(fā)與本發(fā)明多肽有關(guān)的疾病的基因治療方法。
(8)基因敲除實驗動物本發(fā)明提供攜有無活性的本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細(xì)胞及在本發(fā)明DNA的表達(dá)中有缺陷的非人哺乳動物。
即，本發(fā)明提供(1)攜有無活性的本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細(xì)胞；(2)第(1)所述胚胎干細(xì)胞，其中通過導(dǎo)入報道基因(例，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因)使該DNA滅活；(3)第(1)所述胚胎干細(xì)胞，其為抗新霉素；(4)第(1)所述胚胎干細(xì)胞，其中所述非人哺乳動物為嚙齒動物；(5)第(4)所述胚胎干細(xì)胞，其中所述嚙齒動物為小鼠；(6)對本發(fā)明DNA的表達(dá)有缺陷的非人哺乳動物，其中本發(fā)明DNA不具活性；(7)第(6)所述非人哺乳動物，通過導(dǎo)入報道基因(例，大腸桿菌的β-半乳糖苷酶基因)使該DNA滅活，該報道基因能在本發(fā)明DNA的啟動子控制下表達(dá)；(8)第(6)所述非人哺乳動物，其為嚙齒動物；(9)第(8)所述非人哺乳動物，其中所述嚙齒動物為小鼠，以及(10)一種對本發(fā)明DNA的啟動子活性具有促進(jìn)或抑制作用的化合物或其鹽的篩選方法，包括給第(7)所述動物投與待測化合物，并檢測報道基因的表達(dá)。
所謂攜有無活性本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細(xì)胞是指，通過對本發(fā)明DNA進(jìn)行人工突變而抑制該非人哺乳動物表達(dá)所述DNA，或通過使該DNA編碼的本發(fā)明多肽活性基本喪失，從而使該DNA基本上不具有表達(dá)本發(fā)明多肽的能力(下文有時稱本發(fā)明的基因敲除DNA)的非人哺乳動物胚胎干細(xì)胞(簡稱ES細(xì)胞)。
非人哺乳動物可以使用前述的動物。
對本發(fā)明DNA進(jìn)行人工突變的方法包括，可根據(jù)基因工程學(xué)方法對該DNA序列的一部分或全部進(jìn)行缺失、插入或用其它DNA置換。通過這些變異，可以利用諸如讀碼框的移動，或啟動子或外顯子功能的破壞來制備本發(fā)明的基因敲除DNA。
攜有無活性本發(fā)明DNA的非人哺乳動物胚胎干細(xì)胞(下文簡稱攜有無活性本發(fā)明DNA的ES細(xì)胞或本發(fā)明的基因敲除ES細(xì)胞)可如下獲得分離所選非人哺乳動物所具有的本發(fā)明DNA，在其外顯子部分插入抗藥基因如抗新霉素基因、抗潮霉素基因，或插入報道基因如lacZ(β-半乳糖苷酶基因)、cat(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)以破壞外顯子的功能，或在外顯子之間的內(nèi)含子上插入能夠終止基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列(如，polyA加尾信號等)以抑制完整mRNA的合成，將如此構(gòu)建的含有被破壞的上述DNA的序列(下文簡稱為靶載體)通過同源重組整合至該動物的染色體上。對如此獲得的ES細(xì)胞用本發(fā)明DNA上或其附近的DNA序列作為探針進(jìn)行Southern雜交分析，或用上述靶載體上的DNA序列和另一種位于本發(fā)明DNA附近但不包括在上述靶載體中的DNA序列作為引物進(jìn)行PCR，從而篩選本發(fā)明的基因敲除ES細(xì)胞。
通過同源重組使本發(fā)明DNA失活的親本ES細(xì)胞可以是上述已建立的細(xì)胞株，也可以是根據(jù)Evans及Kaufma方法的改良法建立的細(xì)胞株。例如，目前常用的小鼠ES細(xì)胞是129系ES細(xì)胞，但其免疫學(xué)背景不十分清楚，故優(yōu)選使用遺傳免疫學(xué)背景清晰的純系ES細(xì)胞等，例如，其中所述BDF1小鼠(C57BL/6和DBA/2的F1代)是使C57BL/6通過與DBA/2雜交而改良其卵數(shù)少的特點。BDF1小鼠其優(yōu)點卵數(shù)多且卵飽滿，具有C57BL/6小鼠的背景，因此用其ES細(xì)胞產(chǎn)生病理模型小鼠時，通過再與C57BL/6小鼠進(jìn)行回交可以使其遺傳背景恢復(fù)為C57BL/6小鼠的背景。
當(dāng)建立ES細(xì)胞時，一般使用受精后第3.5天的胚泡，本發(fā)明優(yōu)選在8細(xì)胞胚期采集胚胎并培養(yǎng)至胚泡，通過使用此胚泡可以更有效地獲得大量的初期胚。
雖然可以利用的ES細(xì)胞無所謂性別，但是通常雄性ES細(xì)胞比較容易形成生殖細(xì)胞系的嵌合體。為了減少培養(yǎng)時的繁雜過程最好盡快判斷雌雄性。
ES細(xì)胞的雌雄判斷方法有，用PCR法擴(kuò)增并檢測Y染色體上性決定區(qū)的基因。如果使用這種方法，只需一個菌落(約50個)的ES細(xì)胞就足以進(jìn)行性別分析，而進(jìn)行核型分析則需要約106個細(xì)胞；因此可在培養(yǎng)初期根據(jù)對性別的鑒定對ES細(xì)胞進(jìn)行第一次篩選，及早選出雄性細(xì)胞，從而大大縮短培養(yǎng)初期的時間。
可用G帶法確定染色體數(shù)而完成第二次選擇。優(yōu)選所獲得的ES細(xì)胞染色體數(shù)為正常數(shù)的100％，但經(jīng)物理操作建立細(xì)胞系很難獲得具有正常染色體數(shù)的細(xì)胞時，優(yōu)選對ES細(xì)胞的基因?qū)嵤┗蚯贸?，再克隆成正常?xì)胞(如，染色體數(shù)為2n＝40的小鼠體細(xì)胞)。
這樣所得的胚胎干細(xì)胞通常繁殖能力強(qiáng)，但個體發(fā)育能力低，因此必須傳代。例如，在適當(dāng)飼養(yǎng)細(xì)胞如STO成纖維細(xì)胞上，在有LIF(1-10000U/ml)的情況下，在CO2培養(yǎng)箱(優(yōu)選約5％CO2和約95％空氣，或約5％CO2、約5％O2和90％空氣)內(nèi)約37℃培養(yǎng)所述胚胎干細(xì)胞系，傳代時，可用胰酶/EDTA溶液(通常約0.001-0.5％胰酶/約0.1-5mM EDTA，優(yōu)選約0.1％胰酶/1mM EDTA)處理以獲得單細(xì)胞，然后接種至新鮮制備的飼養(yǎng)細(xì)胞。通常每1-3天傳代一次，并在傳代時觀察細(xì)胞，將形態(tài)異常的細(xì)胞除去。
ES細(xì)胞在適當(dāng)條件下，在單層培養(yǎng)中長至高密度，或在懸浮培養(yǎng)中形成細(xì)胞集團(tuán)后，它們可自發(fā)分化成各種類型的細(xì)胞，如頭頂肌細(xì)胞、內(nèi)臟肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞等[M.J.Evans及M.H.Kaufman，自然，292，154(1981)；G.R.Martin，美國國家科學(xué)院院刊，78，7634(1981)；T.C.Doetschman等，胚胎學(xué)和實驗形態(tài)學(xué)雜志87，27(1985)]，從本發(fā)明分化的ES細(xì)胞得到對本發(fā)明DNA的表達(dá)有缺陷的細(xì)胞，它們可用于體外進(jìn)行本發(fā)明多肽的細(xì)胞生物學(xué)研究。
可用公知方法測定所選動物的mRNA量，并間接比較表達(dá)量，從而使本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物與正常動物有所區(qū)別。
非人哺乳動物的例子如前述。
對本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物而言，可將如上制備的靶載體導(dǎo)入小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠卵細(xì)胞，然后通過同源重組使小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠卵細(xì)胞染色體上的本發(fā)明DNA被靶載體上的已失活的本發(fā)明DNA序列所取代，從而完成對本發(fā)明DNA的基因敲除。
以位于本發(fā)明DNA內(nèi)或附近的一段DNA序列作為探針通過DNA雜交分析，或以靶載體上的一段DNA序列以及不包含在該靶載體中的另一DNA序列為引物通過PCR分析，可以鑒定攜有本發(fā)明已破壞的DNA的基因敲除細(xì)胞。當(dāng)使用非人哺乳動物胚胎干細(xì)胞時，對其中所含本發(fā)明DNA已失活的一個細(xì)胞系通過同源重組進(jìn)行克?。辉谶m當(dāng)時期如8細(xì)胞期將所得已克隆的細(xì)胞注射至，例如非人哺乳動物胚胎或胚泡中。將所得嵌合體胚胎移植到非人哺乳動物的假妊娠子宮。所得動物是由具有正常的本發(fā)明DNA位點的細(xì)胞和具有人工突變的本發(fā)明DNA位點的細(xì)胞構(gòu)成的嵌合體。
當(dāng)該嵌合體動物的部分生殖細(xì)胞中本發(fā)明DNA位點發(fā)生突變后，可從這種嵌合動物與正常動物交配得到的子代群體中，通過毛色(coat color)鑒定等方法，篩選以下個體，其所有組織均由具有突變的本發(fā)明DNA位點的細(xì)胞組成。所得個體通常在本發(fā)明多肽的雜合子表達(dá)中有缺陷。通過這些雜合體的交配后代可獲得本發(fā)明多肽的純合子表達(dá)有缺陷的個體。
使用卵細(xì)胞時，可將DNA溶液顯微注射至細(xì)胞核內(nèi)，獲得一種非人哺乳類轉(zhuǎn)基因動物，其中已將靶載體導(dǎo)入其染色體上?？筛鶕?jù)同源重組從這些非人哺乳類轉(zhuǎn)基因動物中篩選本發(fā)明DNA位點上有變異的個體。
如上述，針對本發(fā)明DNA的基因敲除個體的雜交后代在證實了帶有此基因敲除后，可通過常規(guī)培養(yǎng)條件進(jìn)行繁衍。
可按照常規(guī)方法獲得并維持繁殖系。即通過含有所述非活性DNA的雌雄動物交配，可以獲得兩條同源染色體上都具有該非活性DNA的純合體。對于母本動物來說，在1個正常個體、多個純合體的狀態(tài)下飼養(yǎng)，就能更有效地得到這種純合體動物。通過雌雄雜合體的雜交，可繁殖并傳代具有該非活性DNA的純合體以及雜合體動物。
本發(fā)明DNA已失活的非人哺乳動物胚胎干細(xì)胞在產(chǎn)生本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物方面十分有用。
由于本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物喪失了由本發(fā)明多肽誘導(dǎo)所得的各種生物活性，故可作為本發(fā)明多肽的生物活性失活的疾病模型，并因此有利于闡明這些疾病的原因及研究其治療方法。
(8a)對本發(fā)明DNA之缺失或損傷等所致疾病能進(jìn)行有效預(yù)防或治療的化合物的篩選方法可用本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物篩選對本發(fā)明DNA之缺失或損傷所致疾病(碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等)進(jìn)行篩選有效預(yù)防/治療的化合物。
即，本發(fā)明提供對本發(fā)明DNA之缺失或損傷等所致疾病能進(jìn)行有效預(yù)防/治療的化合物的篩選方法，其特征為，對本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物施用一種待測化合物，觀察和測定該動物的變化。
可用于所述篩選方法的本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物實例如上述。
所述待測化合物如多肽、蛋白質(zhì)、非多肽化合物、合成化合物、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞提取液、植物提取液、動物組織提取液、血漿等，它們既可為新化合物也可為已知化合物。
具體地，用待測化合物處理本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物，與未處理的對照動物比較，以動物的各個器官、組織、疾病的癥狀變化為指標(biāo)，可以評價此待測化合物的治療/預(yù)防效果。
所述用待測化合物處理對象動物的方法，可以口服給藥、靜脈注射，可以根據(jù)待測動物的癥狀和待測化合物的性質(zhì)等適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行選擇。另外，待測化合物的給藥量還可以根據(jù)投藥途徑、待測化合物的性質(zhì)等進(jìn)行適當(dāng)選擇。
當(dāng)篩選針對胰腺機(jī)能障礙具有治療或預(yù)防效應(yīng)的化合物時，對本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物進(jìn)行糖耐量試驗，在試驗前或試驗后給予待測化合物，定時地測定該動物的血糖值以及重量的變化等。
用該篩選法得到的化合物是從上述的待測化合物中選出的化合物，對因本發(fā)明多肽的缺陷、損傷引起的疾病(碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等)具有治療或預(yù)防效應(yīng)，所以這種化合物可以用作治療和預(yù)防這些疾病的藥物，既安全又毒性低。另外，如上述篩選的化合物所衍生的化合物也可以使用。
用上述篩選法得到的化合物可以與生理上可接受的堿(如堿金屬鹽)或酸(如無機(jī)酸或有機(jī)酸)形成鹽而使用，優(yōu)選為生理上可接受的酸加成鹽。這樣的鹽有，與無機(jī)酸(例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，與有機(jī)酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
含有用上述篩選法所得的化合物或其鹽的藥物，可以用類似于制備含上述本發(fā)明多肽的藥物的方法進(jìn)行制備。
如此得到的制劑安全、低毒，因此可以對哺乳動物投藥，例如人、大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴子等。
該化合物或其鹽的劑量依賴于病癥、受試者和給藥方法等而異；例如經(jīng)口投與該化合物用于治療代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.01-1000mg/天，優(yōu)選0.1-1000mg/天，更優(yōu)選大約1.0-200mg/天，最優(yōu)選1.0-50mg/天。非胃腸道給藥時，一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如，以針劑注射該化合物用于治療代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、組織的生長·增殖·分化抑制、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等時，成年人(體重60kg)的劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重?fù)Q算相應(yīng)給藥劑量。
(8b)篩選具有促進(jìn)或抑制本發(fā)明DNA中啟動子之活性的化合物的方法本發(fā)明提供篩選能促進(jìn)或抑制本發(fā)明DNA中啟動子之活性的化合物或其鹽的方法，其特征為，對本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物給予待測化合物，并檢測報道基因的表達(dá)。在上述篩選方法中，本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物選自上述本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物，該動物中通過導(dǎo)入報道基因使本發(fā)明DNA失活，而該報道基因是在本發(fā)明DNA的啟動子控制下表達(dá)。用于篩選的具體待測化合物實例同上。報道基因?qū)嵗?，?yōu)選β-半乳糖苷酶基因(lacZ)、可溶性堿性磷酸酶基因或熒光素酶基因等。
由于本發(fā)明DNA表達(dá)缺陷型非人哺乳動物之中，本發(fā)明DNA以報道基因取代，而報道基因又受本發(fā)明DNA啟動子的調(diào)控而出現(xiàn)，因此追蹤報道基因編碼物質(zhì)的表達(dá)可以檢測啟動子活性。
例如，當(dāng)用大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因(lacZ)取代編碼本發(fā)明多肽的DNA區(qū)的一部分時，原本表達(dá)本發(fā)明多肽的組織中，表達(dá)了β-半乳糖苷酶以代替本發(fā)明多肽。因此，用試劑β-半乳糖苷酶的底物如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷(X-gal)染色可以很容易地觀察到本發(fā)明多肽在動物體內(nèi)的表達(dá)狀態(tài)。具體地，選取本發(fā)明多肽缺陷型小鼠或其經(jīng)戊二醛等固定的組織切片，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用含有X-gal的染色液在室溫或37℃左右反應(yīng)約30分至1個小時，之后將組織標(biāo)本用1mM EDTA/PBS溶液洗滌，停止β-半乳糖苷酶反應(yīng)并觀察其顏色。或者，可按照常規(guī)法檢測編碼lacZ的mRNA。
用該篩選法得到的化合物或其鹽是從上述待測化合物中選出的、具有促進(jìn)或抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物。
用上述篩選法得到的化合物可以形成鹽，所述鹽可以優(yōu)選使用與生理上可接受的堿(如堿金屬鹽)或酸(如無機(jī)酸或有機(jī)酸)形成鹽，尤其優(yōu)選為生理上可接受的酸加成鹽。這樣的鹽有，與無機(jī)酸(例如，鹽酸、磷酸、氫溴酸、硫酸)形成的鹽，或與有機(jī)酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、馬來酸、琥珀酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的鹽等。
由于具有促進(jìn)本發(fā)明DNA啟動子的活性的化合物或其鹽，可促進(jìn)本發(fā)明多肽的表達(dá)，或可促進(jìn)本發(fā)明多肽的功能，因此它們可作為安全、低毒性藥物用于治療或預(yù)防如下所述疾病如碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、組織的生長·增殖·分化抑制、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等)等。
再者，由上述篩選得到的化合物進(jìn)而衍生的化合物同樣可以使用。
含有用上述篩選法所得的化合物或其鹽的藥物，可以用類似于制備含上述本發(fā)明多肽或其鹽的藥物的方法進(jìn)行制備。
如此得到的制劑安全、低毒，因此可以對哺乳動物給藥，例如人、大鼠、小鼠、豚鼠、兔子、綿羊、豬、牛、馬、貓、狗、猴子等。
該化合物或其鹽的劑量依賴于病癥、受試者和給藥途徑等而異；例如經(jīng)口投藥促進(jìn)本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物用于治療代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等時，一般成年人(體重60kg)的正常劑量為大約0.01-1000mg/天，優(yōu)選0.1-1000mg/天，更優(yōu)選大約1.0-200mg/天，最優(yōu)選1.0-50mg/天。非胃腸道給藥時，一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如，以針劑注射促進(jìn)本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物用于治療代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病、肥胖癥等)、組織的生長·增殖·分化抑制、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、動脈硬化、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病(如過敏、炎癥、自體免疫性疾病等)、血管再生障礙疾病等時成年人(體重60kg)的劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重?fù)Q算相應(yīng)給藥劑量。
相反，經(jīng)口服給予抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物時，一般成年人(體重60kg)正常劑量為大約0.1-1000mg/天，優(yōu)選大約1.0-200mg/天，更優(yōu)選1.0-50mg/天。非胃腸道給藥時，一次投藥量依賴于給藥受體、癥狀等而變，例如，以針劑注射抑制本發(fā)明DNA啟動子活性的化合物時，成年人(體重60kg)的劑量為大約0.01-30mg/天，優(yōu)選大約0.1-20mg/天，更優(yōu)選大約0.1-10mg/天。對于其它動物種類，可以按每60kg體重?fù)Q算相應(yīng)給藥劑量。
在說明書和附圖中，堿基和氨基酸的代碼使用IUPAC-IUB生化命名委員會規(guī)定的或本領(lǐng)域通用的代碼，如下述例示。對于有光學(xué)異構(gòu)體的氨基酸，除非特別說明，均指L形式。
DNA 脫氧核糖核酸cDNA 互補(bǔ)的脫氧核糖核酸A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鳥嘌呤C 胞嘧啶RNA 核糖核酸mRNA 信使核糖核酸dATP 脫氧腺苷三磷酸dTTP 脫氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP 脫氧鳥苷三磷酸dCTP 脫氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸鈉Gly或G甘氨酸Ala或A丙氨酸Val或V纈氨酸Leu或L亮氨酸Ile或I異亮氨酸Ser或S絲氨酸Thr或T蘇氨酸Cys或C半胱氨酸Met或M甲硫氨酸Glu或E谷氨酸Asp或D天冬氨酸Lys或K賴氨酸Arg或R精氨酸
His或H組氨酸Phe或F苯丙氨酸Tyr或Y酪氨酸Trp或W色氨酸Pro或P脯氨酸Asn或N天冬酰胺Gln或Q谷氨酰胺PGlu 焦谷氨酸Hse 高絲氨酸另外，在本說明書中，頻繁使用的取代基、保護(hù)基以及試劑用下列符號表示。
Me甲基Et乙基Bu丁基Ph苯基TC四氫噻唑-4(R)-酰胺基Tos 對甲苯磺?；鵆HO 甲?；鵅zl 芐基Cl2-Bzl2，6-二氯芐基Bom 芐氧甲基Z 芐氧羰基Cl-Z 2-氯芐氧羰基Br-Z 2-溴芐氧羰基Boc 叔丁氧基羰基DNP 二硝基苯酚Trt 三苯甲基Bum 叔丁氧基甲基Fmoc N-9-芴基甲氧基羰基HOBt 1-羥基苯并三唑HOOBt 3，4-二羥基-3-羥基-4-氧基-1，2，3-苯并三嗪
HONB 1-羥基-5-降冰片烯基-2，3-二羧基亞胺DCC N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺本說明書序列表中的序列編號(SEQ ID NO)分別表示如下[SEQ ID NO1]表示實施例1中所使用的引物堿基序列。
表示實施例1及實施例3中所使用的引物堿基序列。
表示本發(fā)明新前體蛋白質(zhì)(人型)的氨基酸序列。
表示在實施例1和實施例2中檢驗的編碼本發(fā)明新前體蛋白質(zhì)(人型)的cDNA片段的堿基序列。
表示實施例2及實施例4中所使用的引物堿基序列。
表示實施例4中所使用的引物堿基序列。
表示新多肽A鏈(人型)的氨基酸序列。
表示新多肽B鏈(人型)的氨基酸序列。
表示實施例2中所使用的引物堿基序列。
表示實施例2中所使用的引物堿基序列。
表示實施例2中所使用的引物堿基序列。
表示在實施例3中得到的編碼本發(fā)明新前體蛋白質(zhì)(人型)的cDNA片段中的開放讀框(ORF)堿基序列。

表示實施例3中所使用的引物堿基序列。
表示實施例3中所使用的引物堿基序列。
編碼A鏈(人型)DNA的堿基序列。
表示編碼B鏈(人型)DNA的堿基序列。
表示新前體蛋白質(zhì)(大鼠型)的氨基酸序列。
表示編碼SEQ ID NO17所示氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示A鏈(大鼠型·小鼠型)氨基酸序列。
表示編碼A鏈(大鼠型)氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示B鏈(大鼠型·小鼠型)氨基酸序列。
表示編碼B鏈(大鼠型)氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示本發(fā)明新前體蛋白質(zhì)(小鼠型)的氨基酸序列。
表示編碼SEQ ID NO23所示氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示編碼A鏈(小鼠型)氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示編碼B鏈(小鼠型)氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示后述實施例5所使用的引物R1的堿基序列。
表示后述實施例5所使用的引物R2的堿基序列。
表示后述實施例5所使用的引物L(fēng)1的堿基序列。
表示后述實施例5所使用的引物R8的堿基序列。
表示后述實施例5所使用的引物R9的堿基序列。
表示后述實施例5所使用的引物R6的堿基序列。
表示后述實施例5所使用的引物R7的堿基序列。
表示后述實施例5所使用的引物U1的堿基序列。
表示后述實施例5所使用的引物U2的堿基序列。
表示后述實施例6、實施例7所使用的引物UP的堿基序列。
表示后述實施例6所使用的引物RL的堿基序列。
表示后述實施例7所使用的引物ML的堿基序列。
表示后述實施例6所得到的包括大鼠ORF的DNA堿基序列。
表示后述實施例7所得到的包括小鼠ORF的DNA堿基序列。
在后述實施例5中證實的編碼大鼠型前體DNA中，表示其第1外顯子區(qū)域的堿基序列。
在后述實施例5中證實的編碼大鼠型前體DNA中，表示其第2外顯子區(qū)域的堿基序列。

在后述實施例5中證實的編碼小鼠型前體DNA中，表示其第1外顯子區(qū)域的堿基序列。
在后述實施例5中證實的編碼小鼠型前體DNA中，表示其第2外顯子區(qū)域的堿基序列。
表示本發(fā)明新前體蛋白質(zhì)(豬型)的氨基酸序列。
表示編碼SEQ ID NO45所示氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示A鏈(豬型)氨基酸序列。
表示編碼A鏈(豬型)氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示B鏈(豬型)氨基酸序列。
表示編碼B鏈(豬型)氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示本發(fā)明新前體蛋白質(zhì)(大鼠型變異體)的氨基酸序列。
表示編碼SEQ ID NO51所示氨基酸序列的DNA堿基序列。
表示后述實施例8所使用的有義鏈引物exlF1的堿基序列。
表示后述實施例8所使用的反義鏈引物exlR1的堿基序列。
表示從后述實施例8所得到的豬型前體蛋白N端起包括信號肽到B鏈肽編碼該部分的DNA堿基序列。
表示后述實施例8所得到的PCR產(chǎn)物的堿基序列。

表示后述實施例8所使用的寡DNA(PORexlF1)的堿基序列。
表示后述實施例8所使用的寡DNA(PORexlF2)的堿基序列。
在后述實施例8證實的編碼豬型前體的DNA中，表示其第1外顯子區(qū)域的堿基序列。
在后述實施例8證實的編碼豬型前體的DNA中，表示其第2外顯子區(qū)域的堿基序列。
表示在后述實施例9證實的編碼大鼠型前體變異體包括開放讀框(ORF)DNA的堿基序列。
表示在后述實施例9證實的編碼大鼠型前體變異體一部分的DNA堿基序列。
表示在后述實施例9證實的通過SEQ ID NO62所示DNA堿基序列編碼的氨基酸序列。
表示后述實施例19所使用的有義鏈引物的堿基序列。
表示后述實施例19所使用的反義鏈引物的堿基序列。
表示后述實施例19所使用的有義鏈引物的堿基序列。
表示后述實施例19所使用的反義鏈引物的堿基序列。
表示編碼后述實施例19所得到的結(jié)合蛋白的DNA堿基序列。
表示后述實施例19所得到的結(jié)合蛋白的氨基酸序列。

表示后述實施例23所使用的有義鏈的引物的堿基序列。
表示后述實施例23所使用的反義鏈引物的堿基序列。
表示后述實施例23所使用的TaqMan探針的部分寡DNA的堿基序列。
表示后述實施例23所使用的有義鏈的引物的堿基序列。
表示后述實施例23所使用的反義鏈引物的堿基序列。
表示后述實施例23所使用的TaqMan探針的部分寡DNA的堿基序列。
表示后述實施例23所使用的有義鏈的引物的堿基序列。
表示后述實施例23所使用的反義鏈引物的堿基序列。
表示后述實施例23所使用的TaqMan探針的部分寡DNA的堿基序列。
表示后述實施例29所使用的合成DNA的堿基序列。
表示后述實施例29所使用的合成DNA的堿基序列。
表示后述實施例29所使用的合成DNA的堿基序列。
表示后述實施例29所使用的合成DNA的堿基序列。
表示后述實施例29所使用的合成DNA的堿基序列。
表示后述實施例30所使用的合成DNA的堿基序列。
表示后述實施例30所使用的合成DNA的堿基序列。
表示后述實施例30所使用的合成DNA的堿基序列。
隨后實施例1描述的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體(Escherichiacoli)INVαF′/pVH7U5Lh于2000年4月12日保藏于日本國茨城縣茨城市東1-1-3的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-7130，于2000年4月18日保藏于日本國大阪府大阪市十三本町2-17-85的財團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16423。隨后實施例3描述的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體(Escherichia coli)INVαF′/pVHNC5Lh于2000年4月18日保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-7139，于2000年4月18日保藏于日本國大阪府大阪市十三本町2-17-85的財團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16424。在隨后實施例6得到的質(zhì)粒pVHUPTr于2000年7月3日保藏于日本國茨城縣茨城市東1-1-3的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-7204。在隨后實施例6得到的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體(Escherichia coli)TOP10/pVHUPTr于2000年7月17日保藏于日本國大阪府大阪市十三本町2-17-85的財團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16455。在隨后實施例7得到的質(zhì)粒pVHUPTm于2000年7月3日保藏于日本國茨城縣茨城市東1-1-3的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-7205。在隨后實施例7得到的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體(Escherichia coli)TOP10/pVHUPTm于2000年7月17日保藏于日本國大阪府大阪市十三本町2-17-85的財團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16454。在隨后實施例9得到的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體(Escherichiacoli)TOP10/pVHABDr于2000年8月10日保藏于日本國茨城縣茨城市東1-1-3的通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-7268。于2000年8月3日保藏于日本國大阪府大阪市十三本町2-17-85的財團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16461。在隨后實施例19得到的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體(Escherichia coli)BL21-Gold(DE3)/pETVHMMh于2001年2月1日保藏于日本國大阪府大阪市十三本町2-17-85的財團(tuán)法人發(fā)酵研究所(IFO)，保藏編號為IFO 16531。在隨后實施例14得到的雜交瘤HK4-144-10于2001年3月26日保藏于茨城縣茨城市東1-1-3的日本國經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)省產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(NIBH)，保藏編號為FERM BP-7520。
實施例下面，用實施例詳述本發(fā)明，但并非限制本發(fā)明的范圍。使用大腸桿菌(Escherichia coli)進(jìn)行基因操作按“分子克隆”的方法進(jìn)行。
實施例1 克隆編碼新多肽的cDNA編碼本發(fā)明新多肽的cDNA可以按照如下所述的PCR方法制得。首先以SEQ ID NO1所示的寡DNA(CTGGCGGTATGGGTGCTGAC)作為有義鏈，以SEQ ID NO2所示的寡DNA(ACTGGGGCATTGGTCCTGGTG)作為反義鏈，各自制備下列混合液(50μl)包括5pmol、100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH9.0)5μl、500mM氯化鉀溶液5μl、25mM氯化鎂溶液3μl、2.5mM脫氧核糖核酸溶液4μl、以Human Testis polyA+RNA(Clontech)為DNA模板制備的cDNA溶液1μl、以及TaKaRa TaqTM0.5μl。使用TaKaRaPCR Thermal Cycler MP(寶酒造(株))首先在95℃靜止1分鐘，再以95℃30秒、72℃1分為一個反應(yīng)周期，共擴(kuò)增35個周期循環(huán)，最后在72℃延長10分鐘，在這樣的PCR反應(yīng)程序中進(jìn)行。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳最后的反應(yīng)液，用溴乙錠染色，通過分子量標(biāo)記的換算在0.45kb附近位置上確認(rèn)為通過PCR反應(yīng)而擴(kuò)增得到的DNA相對應(yīng)的染色帶。接著用GENE CLEANAPIN KIT(BIO101)回收該DNA片段，再用pCR(注冊商標(biāo))2.1(In Vitrogen)克隆TA，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌INVαF′感受態(tài)細(xì)胞中用以確定堿基序列。在含有氨芐西林LB瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抗氨芐西林藥物的轉(zhuǎn)化體菌落中，從該菌落中選擇插入外源DNA片段的質(zhì)?？寺?，制備該質(zhì)粒DNA、pVH7U5Lh。為了鑒定所插入的DNA堿基序列，以pVH7U5Lh為DNA模板，將上述的SEQ ID NO1所示的寡DNA和SEQ ID NO2所示的寡DNA作為序列引物，按照說明書的要求用TaKaRa PCR Thermal Cycler MP(寶酒造(株))進(jìn)行包括ABI PRISMTMBigDye終止子循環(huán)測序(TerminatorCycle Sequencing)FS備好的反應(yīng)試劑盒(Ready Reaction Kit)(Perkin-Elmer)的序列反應(yīng)，然后，將該反應(yīng)材料用DNA序列儀ABI PRISMTM377(Perkin-Elmer)進(jìn)行分析。
其結(jié)果表明，在pVH7U5Lh中，編碼下列堿基序列SEQ ID NO4所示的第49位至第494位的堿基序列，也就是說在由SEQ ID NO3所示的142個氨基酸組成的新多肽之中，除了N末端的9個氨基酸殘基之外，編碼相當(dāng)與C末端的133個氨基酸殘基序列的區(qū)域。在該氨基酸序列中，發(fā)現(xiàn)了胰島素/胰島素樣生長因子/松弛素家族所具有的一級結(jié)構(gòu)特征(通過N末端的疏水區(qū)域、堿性氨基酸殘基所包裹，并且含有Cys殘基的A鏈(SEQ ID NO7)及B鏈(SEQ ID NO8))。
將如此獲得的質(zhì)粒pVH7U5Lh導(dǎo)入到大腸桿菌INVαF＇中，獲得大腸桿菌轉(zhuǎn)化體(Escherichia coli)INVαF′/pVH7U5Lh。
實施例2 解析編碼新多肽cDNA的5′RACE及3′RACE通過以下要領(lǐng)實施5′RACE(Rapid Amplification of cDNA End)PCR和3′RACE PCR并對編碼新多肽cDNA的全長進(jìn)行分析。對于RACE PCR的DNA模板來說，使用MarathonTM-Ready cDNA Human Testis(Clontech)。以實施例1得到的pVH7U5Lh插入到DNA序列中，以此為模板，在5′RACEPCR第一次PCR反應(yīng)中，分別使用了反義鏈SEQ ID NO9所示的寡DNA引物，有義鏈引物為MarathonTM-Ready cDNA Human Testis所附的AP1。在嵌套式聚合酶反應(yīng)(nested PCR)中，各使用了反義鏈SEQ ID NO10所示的寡DNA引物，有義鏈引物為MarathonTM-Ready cDNA Human Testis所附的AP2。反應(yīng)條件完全按照試劑盒上所附的說明書進(jìn)行，PCR循環(huán)第一次為35次，后續(xù)的嵌套式聚合酶反應(yīng)(nested PCR)為20次。用2.0％瓊脂糖凝膠分離擴(kuò)增的PCR片段，再電泳析出回收之后，將SEQ ID NO10所表示的合成DNA用于序列引物，直接確定了該P(yáng)CR片段的堿基序列。其結(jié)果顯示SEQ ID NO4所示的第1位至第48位的堿基序列以及SEQ ID NO3所示的第1位至第9位的氨基酸序列為新合成的序列。
按照以下要領(lǐng)實施以實施例1中得到的插入DNA序列的pVH7U5Lh為模板的3′RACE PCR，在第一次PCR反應(yīng)中，以SEQ ID NO5所示的寡DNA為有義鏈引物，以MarathonTM-Ready cDNA Human Testis所附的AP1為無義鏈引物，在后續(xù)的嵌套式聚合酶反應(yīng)(nested PCR)中，又以SEQ IDNO11所示的寡DNA為有義鏈引物，以MarathonTM-Ready cDNA HumanTestis所附的AP2為無義鏈引物。用2.0％瓊脂糖凝膠電泳最后的反應(yīng)液，用溴乙錠染色，恰好在0.7kb位置上檢測到RACE PCR產(chǎn)物的染色帶。進(jìn)而利用Quick Gel Extraction Kit(Qiagen)回收并純化該DNA片斷，用pCRTM2.1-Topo(In Vitrogen)克隆TA，將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α株的感受態(tài)細(xì)胞以測定堿基序列。在含有氨芐西林LB瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抗氨芐西林轉(zhuǎn)換體菌落中，并從菌落中選擇插入外源DNA片斷的質(zhì)?？寺?，再從同一克隆中制備各種質(zhì)粒之后來確定DNA插入片斷的堿基序列。從結(jié)果可知，在所有的克隆質(zhì)粒中，均插入下列DNA片斷繼SEQID NO4所示第413位至第1061位的堿基序列之后，進(jìn)一步在其3′端附加了poly A序列，所述堿基序列是以SEQ ID NO11所示嵌入引物(nestedprimer)為起點。以上結(jié)果表明，SEQ ID NO4的開放可讀框已經(jīng)被確定，從該開放可讀框編碼的SEQ ID NO3所示蛋白質(zhì)的特征(由信號序列、堿性氨基酸殘基所包裹并且A鏈(SEQ ID NO7)及B鏈(SEQ ID NO8)均具有Cys殘基)上來看，本發(fā)明新型蛋白質(zhì)是一種具有調(diào)節(jié)機(jī)體分泌功能的新前體蛋白質(zhì)，其屬于胰島素/胰島素樣生長因子/松馳素家族(圖1)。
實施例3 克隆編碼新型多肽(前體多肽)的全長cDNA按照以下5′RACE方法獲得編碼本發(fā)明新型多肽(前體多肽)的全長cDNA。
用5′RACE系統(tǒng)(GIBCO BRL)通過以實施例1得到的pVH7U5Lh插入DNA序列為模板制作的SEQ ID NO13所示寡DNA(GGGCAGGGGTCTCTGTGT)為引物，通過反轉(zhuǎn)錄而制備了cDNA溶液，該反轉(zhuǎn)錄是以Human Testis polyA+RNA(Clontech)為模板而進(jìn)行的。再以制備的cDNA為模板，以5′RACE系所附的AAP作為有義鏈引物，以SEQ IDNO13所示寡DNA作為反義鏈引物進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)。然后再以實施例1中得到的pVH7U5Lh插入DNA序列為模板制作的SEQ ID NO14所示寡DNA(TTCAAAGCATCTCCGTCCAGC)為有義鏈引物，以前面所述的SEQ ID NO2所示寡DNA(ACTGGGGCATTGGTCCTGGTG)為反義引物，進(jìn)行嵌套式聚合酶反應(yīng)(nested PCR)。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳最后的反應(yīng)液，用溴乙錠染色，恰好在0.5kb位置上檢測到染色帶。接著用GENECLEAN APIN KIT(BIO101)回收該DNA片段，用pCR(注冊商標(biāo))2.1(InVitrogen)克隆TA，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌系INVαF′感受態(tài)細(xì)胞中用以確定堿基序列。在含有氨芐西林LB瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抗氨芐西林藥物的轉(zhuǎn)化體菌落中，從該菌落中選擇插入外源DNA片段的質(zhì)?？寺。苽湓撡|(zhì)粒DNA、pVHNC5Lh。為了確定所插入的DNA堿基序列，以pVHNC5Lh為DNA模板，將上述的SEQ ID NO14所示的寡DNA(TTCAAAGCATCTCCGTCCAGC)和SEQ ID NO2所示的寡DNA(ACTGGGGCATTGGTCCTGGTG)作為序列引物，按照說明書的要求用TaKaRa PCR Thermal Cycler MP(寶酒造(株))進(jìn)行包括ABI PRISMTMBigDye終止子循環(huán)測序(Terminator Cycle Sequencing)FS備好的反應(yīng)試劑盒(Ready Reaction Kit)(Perkin-Elmer)的序列反應(yīng)，然后，將該反應(yīng)材料用DNA序列儀ABI PRISMTM377(Perkin-Elmer)進(jìn)行分析。
以上實驗結(jié)果證明，在pVHNC5Lh里，包含SEQ ID NO4所示第1位至第494位的堿基序列，即包含開放可讀框(ORF)，該開放可讀框(ORF)編碼SEQ ID NO3所示的由全部142個氨基酸組成的新型多肽(圖1)。
將由上述得到的質(zhì)粒pVHNC5Lh導(dǎo)入到大腸桿菌INCαF′并獲得轉(zhuǎn)化體Escherichia coli INCαF′/pVHNC5Lh。
實施例4 分析新型多肽在組織中表達(dá)的分布通過下列PCR法研究新型多肽在組織中的表達(dá)。首先，以SEQ ID NO5所示寡DNA(CCGGATGCAGATGCTGATGAA)為有義鏈引物，以SEQ IDNO6所示寡DNA(TGGTCAAAGGGCAGGGTTGG)為反義鏈引物，各自制備下列混合液25μl它包括2.5pmol、100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH9.0)2.5μl、500mM氯化鉀溶液2.5μl、25mM氯化鎂溶液1.5μl、2.5mM脫氧核糖核酸溶液2μl、作為DNA模型的Human multiple tissue cDNA(MTCTM)panels(Clontech)各種組織不同的cDNA溶液各1μl、以及TaKaRa TaqTM0.25μl，使用TaKaRa PCR Thermal Cycler MP(寶酒造(株))，首先在95℃靜止1分鐘后，再以95℃30秒、66℃1分、72℃1分為一個反應(yīng)周期，共擴(kuò)增35個周期進(jìn)行PCR反應(yīng)。用1.5％瓊脂糖凝膠電泳最后的反應(yīng)液，用溴乙錠染色，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生與否。其結(jié)果證實編碼新型多肽的DNA也就是0.45kb DNA片段，該片段主要是從胎盤、肺、睪丸、垂體等溶液中檢測出來的，由此可證明本發(fā)明新型多肽在該組織中進(jìn)行了表達(dá)(圖2)。
實施例5 對編碼新型多肽(前體多肽)的大鼠相似物和小鼠相似物的染色體基因和cDNA序列進(jìn)行分析為了克隆由cDNA編碼的在實施例3得到的人體新型多肽(前體多肽)大鼠相似物和小鼠相似物，首先，根據(jù)下述的基因組步移法(genome walking)來分析兩種動物的染色體基因結(jié)構(gòu)。用大鼠染色體DNA Rat GenomeWalkerTMKit(Clontech)作為被檢材料，同時用小鼠染色體DNA MouseGenome WalkerTMKit(Clontech)作為被檢材料。在該方法中，除了作為PCR反應(yīng)的酶為TaKaRa TaqTM(寶酒造(株))之外，其它各自按照試劑盒說明書的要求進(jìn)行實施。當(dāng)?shù)谝淮蜗?′上游方向進(jìn)行基因組步移的時候，首先，把編碼SEQ ID NO12所示人體新型多肽(前體多肽)cDNA的堿基序列作為問題提出來并從已經(jīng)公開的EST(Expressed Sequence Tag)數(shù)據(jù)庫中尋找，尋找到的EST、AW523625以及AW521175堿基序列被為包含cDNA3＇側(cè)的部分區(qū)域，該cDNA編碼多肽的大鼠相似物，再以所述序列為模板合成3種寡DNA序列[R1(SEQ ID NO27)、R2(SEQ ID NO28)、R3(SEQ IDNO29)]，作為特異引物(gene specific primer)，其中所述3種序列與上述堿基序列的一部分堿基序列互補(bǔ)。其結(jié)果，在大鼠染色體DNA的1st PCR反應(yīng)中使用L1，在嵌套式聚合酶(nested PCR)反應(yīng)中使用R2，而在小鼠染色體DNA的1st PCR反應(yīng)中使用R1，在嵌套式聚合酶(nested PCR)反應(yīng)中使用R2，從而各自獲得了特異的擴(kuò)增DNA片斷。關(guān)于這些DNA片段可以依據(jù)已經(jīng)敘述的實施例方法進(jìn)行確定，它們來自以末端引物(AP2)為末端側(cè)的每個基因組的堿基序列，再以該序列為模板，繼續(xù)第二次向5′上游方向進(jìn)行基因組步移從而設(shè)計了新的特異引物。也就是共有4種寡DNA，即在大鼠染色體DNA的1st PCR反應(yīng)中使用R8(SEQ ID NO30)，在接下一個PCR反應(yīng)中使用R9(SEQ ID NO31)，而在小鼠染色體DNA的1st PCR反應(yīng)中使用R6(SEQ ID NO32)，在嵌套式聚合酶(nested PCR)反應(yīng)中使用R7(SEQ ID NO33)。用這些引物再次以同樣的條件對Rat GenomeWalkerTMKit、Mouse Genome WalkerTMKit每個DNA標(biāo)樣進(jìn)行PCR反應(yīng)，大鼠和小鼠均從新獲得了特異擴(kuò)增DNA片段。因此，在前一次基因組步移法得到的DNA片段同時確定每個擴(kuò)增DNA片段的堿基序列，比較并分析了與實施例3中得到的編碼本發(fā)明人體新型多肽(前體多肽)cDNA的堿基序列之間的同源性。
其結(jié)果表明，新型多肽(前體多肽)的大鼠相似物是從以上實驗證明的基因組堿基序列和上述已經(jīng)公開的EST(AW523625以及AW521175)中得出，其為一種通過SEQ ID NO18所示420個堿基DNA編碼的SEQ ID NO17所示的140個氨基酸殘基組成的多肽，另外，還表明該基因在大鼠染色體上由2個外顯子(exon)所構(gòu)成其中包含1個中間序列，在420個堿基中，第1個外顯子由SEQ ID NO41所示184個堿基編碼，而第2個外顯子由SEQ ID NO42所示236個堿基所編碼。該多肽與人體新型多肽(前體多肽)一樣都具有胰島素/胰島素樣生長因子/松馳素家族的序列特征，即由信號序列和堿性氨基酸殘基所包裹并且A鏈(SEQ ID NO19)及B鏈(SEQ IDNO21)均具有Cys殘基。另外，該大鼠新型多肽與人體新型多肽具有75.0％的同源性。
還有，小鼠通過從上述實驗也被認(rèn)為是本申請新型多肽相似物基因的5′側(cè)區(qū)域的序列，進(jìn)一步將3′側(cè)的序列和mRNA的表達(dá)一起用于研究而進(jìn)行3′RACE PCR。在RACE PCR模板DNA中，用MarathonTM-Ready cDNA MouseTestis(Clontech)作為特異序列，通過第一次基因組步移法得到的第2外顯子的序列中設(shè)計2種寡DNA[U1(SEQ ID NO34)、U2(SEQ ID NO35)]并分別進(jìn)行了化學(xué)合成。在1st PCR反應(yīng)里，U1為有義鏈引物，MarathonTM-Ready cDNA Mouse Testis所附AP1為反義鏈引物，在嵌套式聚合酶(nested PCR)反應(yīng)里，U2為有義鏈引物，MarathonTM-Ready cDNA MouseTestis所附AP2為反義鏈引物。這些PCR反應(yīng)的結(jié)果，獲得最終擴(kuò)增產(chǎn)物的單一DNA片段，通過已知方法決定堿基序列，此時在該DNA片段里包含起點U2至小鼠第2外顯子區(qū)域的終止密碼子，而且在其3′側(cè)非翻譯區(qū)域的末端存在有poly A信號序列和poly A序列。從該cDNA部分序列和在本實施例中得到的小鼠染色體上DNA片段的一級結(jié)構(gòu)上來看，新型多肽(前體多肽)小鼠相似物為，由SEQ ID NO24所示423個堿基DNA所編碼的、并由SEQ ID NO23所示141個氨基酸殘基所組成的多肽，另外，還表明該基因同大鼠一樣，在染色體上由2個外顯子(exon)所構(gòu)成其中包含1個中間序列，在423個堿基中，第1個外顯子由SEQ ID NO43所示187個堿基編碼，而第2個外顯子由SEQ ID NO44所示236個堿基所編碼。該多肽不僅具有與人體新型多肽得結(jié)構(gòu)特征，同時還與上述大鼠新型多肽一樣都具有胰島素/胰島素樣生長因子/松馳素家族的序列特征，即在該小鼠多肽里包含由信號序列和堿性氨基酸殘基所包裹并且A鏈(SEQ ID NO19)及B鏈(SEQ ID NO21)均具有Cys殘基。另外，該小鼠新型多肽與人體新型多肽、大鼠新型多肽之間的同源性分別為77.3％，92.1％，A鏈及B鏈的氨基酸序列完全與上述的大鼠相同。
實施例6 克隆一種編碼新型多肽(前體多肽)的大鼠相似物全長cDNA按照以下要領(lǐng)實施PCR反應(yīng)并獲得編碼本發(fā)明新型多肽大鼠相似物全長的cDNA。
首先，以在實施例5中得到的新型多肽小鼠相似物基因的5′側(cè)非翻譯區(qū)域的堿基序列為模板化學(xué)合成的寡DNA(UP(SEQ ID NO36))為有義鏈引物，以實施例5所述公開EST、AW523625以及AW521175堿基序列為模板化學(xué)合成的寡DNA(RL(SEQ ID NO37))為反義鏈引物，各自制備下列混合液50μl它包括5pmol、100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)5μl、500mM氯化鉀溶液5μl、25mM氯化鎂溶液3μl、2.5mM脫氧核糖核酸溶液4μl、從模板DNA的SD大鼠(9周齡)睪丸的總RNA制備的cDNA溶液4μl、以及TaKaRa TaqTM0.5μl。然后對該混合液使用TaKaRa PCR Thermal CyclerMP(寶酒造(株))，首先在95℃靜止1分鐘后，再以95℃30秒、67℃1分、72℃1分為一個反應(yīng)周期，共擴(kuò)增40個周期，進(jìn)一步在72℃10分的反應(yīng)程序中進(jìn)行PCR反應(yīng)。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳最后的反應(yīng)液，用溴乙錠染色，通過分子量標(biāo)記的換算在0.45附近的位置上通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增的DNA確定所對應(yīng)的染色帶。接著用GENE CLEAN APIN KIT(BIO101)回收該DNA片段，用pCR(注冊商標(biāo))2.1-TOPO(In Vitrogen)克隆TA，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌TOP10菌株的感受態(tài)細(xì)胞(In Vitrogen)中以確定堿基序列。在含有氨芐西林LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)而出現(xiàn)的抗氨芐西林藥物的轉(zhuǎn)化體菌落中，從該菌落中選擇插入外源DNA片段的質(zhì)?？寺?，制備該質(zhì)粒DNA、pVHUPTr，確定插入的DNA片段堿基序列。
以上實驗結(jié)果證明，在pVHUPTr里，包含SEQ ID NO39所示470個堿基對的DNA片段，該片段包括由SEQ ID NO18所示420個堿基所組成的開放可讀框(ORF)，所述開放可讀框編碼由SEQ ID NO17所示140個氨基酸所組成的新型多肽前體大鼠相似物。
將上述得到的質(zhì)粒pVHUPTr，其中的DNA編碼大鼠新型多肽(前體多肽)，導(dǎo)入到大腸桿菌(Escherichia coli)TOP10菌株，獲得了轉(zhuǎn)化體Escherichia coli TOP10/pVHUPTr。
實施例7 克隆一種編碼新型多肽(前體蛋白質(zhì))的小鼠相似物全長cDNA按照以下要領(lǐng)實施PCR反應(yīng)并獲得編碼本發(fā)明新型多肽小鼠相似物全長的cDNA。
首先，以在實施例5中得到的新型多肽小鼠相似物基因的5′側(cè)非翻譯區(qū)域的堿基序列為模板化學(xué)合成的寡DNA(UP(SEQ ID NO36))作為有義鏈引物，再以實施例5所得到的小鼠cDNA部分序列為模板化學(xué)合成的寡DNA(ML(SEQ ID NO38))為反義鏈引物，各自制備下列混合液50μl它包括5pmol、100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)5μl、500mM氯化鉀溶液5μl、25mM氯化鎂溶液3μl、2.5mM脫氧核糖核酸溶液4μl、DNA模板MarathonTM-Ready cDNA Mouse Testis(Clontech)4μl、以及TaKaRa TaqTM0.5μl。然后對該混合液使用TaKaRa PCR Thermal Cycler MP(寶酒造(株))首先在95℃靜止1分鐘后，再以95℃30秒、67℃1分、72℃1分為一個反應(yīng)周期，共擴(kuò)增40個循環(huán)周期，進(jìn)一步在72℃10分的反應(yīng)程序中進(jìn)行PCR反應(yīng)。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳最后的反應(yīng)液，用溴乙錠染色，通過分子量標(biāo)記的換算在0.45kb附近的位置上通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增的DNA確定所對應(yīng)的色帶。接著用GENE CLEAN APIN KIT(BIO101)回收該DNA片段，用pCR(注冊商標(biāo))2.1-TOPO(In Vitrogen)克隆TA，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌TOP10菌株的感受態(tài)細(xì)胞(In Vitrogen)中以確定堿基序列。在含有氨芐西林LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)而出現(xiàn)的抗氨芐西林藥物的轉(zhuǎn)化體菌落中，從該菌落中選擇插入外源DNA片段的質(zhì)?？寺?，制備該質(zhì)粒DNA、pVHUPTm，確定插入的DNA片段堿基序列。
以上實驗結(jié)果證明，在pVHUPTm里，包含SEQ ID NO40所示475個堿基對的DNA片段，該片段包括由SEQ ID NO24所示423個堿基所組成的開放可讀框(ORF)，所述開放可讀框編碼由SEQ ID NO23所示141個氨基酸所組成的新型多肽前體小鼠相似物。
將攜帶編碼本發(fā)明所得小鼠新型多肽(前體蛋白質(zhì))質(zhì)粒pVHUPTm導(dǎo)入到大腸桿菌(Escherichia coli)TOP10菌株，獲得了轉(zhuǎn)化體Escherichia coliTOP10/pVHUPTm。
實施例8 對編碼新型多肽(前體蛋白質(zhì))豬的相似物染色體基因的分析首先，按照下述PCR法獲取編碼部分豬型新型多肽(前體蛋白質(zhì))的DNA片斷。也就是說，制備一種40μl的混合液，該混合液不僅包含20pmol的SEQ ID NO53(exlF1)所示寡DNA的有義鏈引物和20pmol的SEQ IDNO54(exlR1)所示寡DNA的無義鏈引物，而且，還包含20μl的PremixTaqTM(Ex TaqTMVersion寶酒造(株))、以及1μl的豬型基因DNA((Clontech)、#6651-1)作為模板DNA，再使用熱循環(huán)儀(GeneAmpTMPCR system model9700(PE Biosystems))循環(huán)30個周期，即先在94℃下進(jìn)行2分鐘，然后以94℃10秒、55℃10秒、72℃30秒的循環(huán)進(jìn)行。進(jìn)一步在72℃延長1分鐘30秒反應(yīng)，在這樣一種程序中進(jìn)行PCR反應(yīng)。用2.0％瓊脂糖凝膠使最后反應(yīng)液電泳，然后用溴乙錠染色，確定一條染色帶其對應(yīng)于通過PCR擴(kuò)增形成的DNA。使用QIA quick Gel Extraction Kit(Qiagen)回收該DNA片斷，用pCRTM2.1-Topo(In Vitrogen)克隆TA，將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α的感受態(tài)細(xì)胞(東洋紡織(株))以確定堿基序列。在含有氨芐西林LB瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)的抗氨芐西林轉(zhuǎn)換體菌落中，選擇插入外源DNA片斷的質(zhì)?？寺。俅卧诤邪逼S西林的條件下培養(yǎng)，以該培養(yǎng)的克隆制備得到的該質(zhì)粒DNA為模板，以市售的引物DNA(PRM-007，PRM-008(東洋紡織(株))為序列引物，按照所附商品說明ABI PRISMTMBigDye TerminatorCycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE Biosystems)的條件在熱循環(huán)儀(GeneAmpTMPCR system model 9700(PE Biosystems))上確定插有DNA的堿基序列，然后用DNA測序儀ABI PRISMTM377(PE Biosystems)分析反應(yīng)材料。
其結(jié)果證實，該P(yáng)CR產(chǎn)物在兩末端具有所述的引物，并且在其內(nèi)側(cè)不僅包含SEQ ID NO55所示的堿基序列，其堿基序列編碼豬型前體蛋白質(zhì)N末端經(jīng)由信號肽至B鏈肽的DNA片斷，該DNA片斷為SEQ ID NO56所示239個堿基對的DNA片斷。接著，關(guān)于編碼豬型前體蛋白質(zhì)的染色體基因，通過所述堿基序列進(jìn)一步進(jìn)行g(shù)enome walking以研究3′下游區(qū)的構(gòu)造。針對上述豬型基因DNA用Universal Genome WalkerTMKit(Clontech)加工的genome walking文庫DNA作為被檢材料，其操作方法遵循實施例5中的RatGenome WalkerTMKit和Mouse Genome WalkerTMKit(Clontech)。首先分別進(jìn)行g(shù)ene specific primer的化學(xué)合成，它包括相當(dāng)于SEQ ID NO56所示堿基序列一部分的2種寡DNA(PORexlF1(SEQ ID NO57)、PORexlF2(SEQ IDNO58))，在1st PCR反應(yīng)中先使用PORexl F1，然后在nested PCR反應(yīng)中使用PORexlF2。就這些反應(yīng)所得各種擴(kuò)增的DNA片斷來說，遵循所述方法確定堿基序列，起點部位為PORexlF2引物序列，并在比較編碼人、小鼠和大鼠前體蛋白的cDNA堿基序列之間的同源性的同時分析它們各自的堿基序列。結(jié)果表明，從確定的基因組一級構(gòu)造上來看，新型多肽(前體蛋白質(zhì))的豬型相似物為由SEQ ID NO45所示的140個氨基酸殘基所組成的多肽，所述多肽是由SEQ ID NO46所示420個堿基DNA編碼的；另外該基因由2個外顯子(exon)所組成其中包括1個中間序列，在420個堿基中，第1個外顯子由SEQ ID NO59所示193個堿基編碼，而第2個外顯子由SEQ ID NO60所示227個堿基所編碼。該多肽與人體新型多肽(前體蛋白質(zhì))一樣都具有胰島素/胰島素樣生長因子/松馳素家族的序列特征，即在該豬型多肽里包含由信號序列、堿性氨基酸殘基所包裹并且A鏈(SEQ ID NO47)及B鏈(SEQ ID NO49)均具有Cys殘基。另外，該豬型新型多肽與人體前體蛋白、小鼠前體蛋白和大鼠前體蛋白之間氨基酸水平的同源性分別為77.1％，70.0％，67.1％。
實施例9 克隆一種編碼大鼠腸系膜脂肪組織新型多肽(前體蛋白質(zhì))變異體的全長cDNA按照以下要領(lǐng)實施PCR反應(yīng)獲得編碼大鼠腸系膜脂肪組織新型多肽(前體蛋白質(zhì))變異體全長的cDNA。
首先，在實施例6中使用的寡DNA之中，以UP(SEQ ID NO36)為有義鏈引物，以RL(SEQ ID NO37)為反義鏈引物，各自制備下列混合液50μl它包括5pmol、100mM Tris-鹽酸緩沖液(pH8.3)5μl、500mM氯化鉀溶液5μl、25mM氯化鎂溶液3μl、2.5mM脫氧核糖核酸溶液4μl、以大鼠腸系膜脂肪組織總RNA為DNA模板而制備的cDNA溶液1μl、以及TaKaRa TaqTM0.5μl。然后對該混合液使用TaKaRa PCR Thermal CyclerMP(寶酒造(株))，首先在95℃靜止1分鐘后，以95℃30秒、67℃1分、72℃1分為一個反應(yīng)周期，共擴(kuò)增35個循環(huán)周期，然后進(jìn)一步在72℃10分的反應(yīng)程序中進(jìn)行PCR反應(yīng)。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳最后的反應(yīng)液，用溴乙錠染色，通過分子量標(biāo)記的換算在0.6kb附近的位置上通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增的DNA確定所對應(yīng)的色帶。接著用GENE CLEAN APIN KIT(BIO101)回收該DNA片段，用pCR(注冊商標(biāo))2.1-TOPO(In Vitrogen)克隆TA，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌TOP10菌株的感受態(tài)細(xì)胞(In Vitrogen)中以確定堿基序列。當(dāng)含有氨芐西林LB瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)抗氨芐西林藥物的轉(zhuǎn)化體菌落時，在該菌落中選擇插入外源DNA片段的質(zhì)?？寺。苽湓撡|(zhì)粒DNA、pVHABDr。以pVHABDr為DNA模板，市售的引物DNA(PRM-007，PRM-008(東洋紡織(株))為序列引物，按照所附商品說明ABI PRISMTMBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(Perkin-Elmer)的要求，在熱循環(huán)儀(GeneAmpTMPCR system model 9700(PE Biosystems))上測定插有DNA的堿基序列，然后用DNA測序儀ABI PRISMTM377(PEBiosystems)分析反應(yīng)材料。
以上實驗結(jié)果證明，在pVHABDr里，插有SEQ ID NO61所示572個堿基對的DNA片段，該片段包括開放可讀框(ORF)，所述開放可讀框編碼由SEQ ID NO51所示174個氨基酸組成的新型多肽(前體多肽)變異體，而所述變異體又由SEQ ID NO52所示522個堿基所組成的DNA編碼而來。該多肽變異體具有胰島素/胰島素樣生長因子/松馳素家族的序列特征，也就是說，與實施例5和6中所述的新型多肽(前體多肽)大鼠型相似物完全一樣，具有由信號序列和堿性氨基酸殘基所包裹并且A鏈(SEQ ID NO19)及B鏈(SEQ ID NO21)均具有Cys殘基，同時還具有如下所述的構(gòu)造，即在實施例5所述地新型多肽(前體多肽)大鼠型相似物的第1外顯子和第2外顯子之間有1個中間序列并插有一種多肽，該多肽由來自于該中間序列的一部分，由SEQ ID NO62所示102堿基組成的DNA所編碼并由SEQ ID NO63所示34個氨基酸殘基組成。
將如此得到的質(zhì)粒pVHABDr導(dǎo)入到大腸桿菌(Escherichia coli)TOP10菌株，獲得了轉(zhuǎn)化體Escherichia coli TOP10/pVHABDr。
實施例10 建立人體新型多肽基因表達(dá)AtT20細(xì)胞系用限制性內(nèi)切酶EcoRI消化在實施例3中得到的質(zhì)粒pVHNC5Lh，所述該質(zhì)粒中插有編碼新型多肽的DNA片段，用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳最終的反應(yīng)溶液，然后從該凝膠上回收2條帶其為0.15kb和0.35kb。通過EcoRI消化哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1(-)(Invitrogen)，用Calf intestinealkaline phosphatase(寶酒造(株))進(jìn)行脫磷酸化反應(yīng)，將反應(yīng)后的最后溶液再用1.5％的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后從該凝膠上回收相當(dāng)于約5.5kb的泳帶。用DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造(株))使上述的DNA片段進(jìn)行聯(lián)結(jié)反應(yīng)，把其反應(yīng)液加入到coli JM109 Competent Cells(寶酒造(株))中使之轉(zhuǎn)化。從得到的抗氨芐西林藥物的菌落中篩選一種質(zhì)?？寺?，該質(zhì)粒在載體插入部位的CMV啟動子一端插入0.15kb EcoRI片段，在poly A信號一端插入0.35kb EcoRI片段，共插入了0.5kb的DNA片段。用Plasmid Maxi Kit(QIAGEN)從再培養(yǎng)的菌體中大量地建立所述的質(zhì)粒。
利用Lipofectin(GIBCO-BRL)，按照所附使用說明書方法將上述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)至小鼠腦垂體腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)tT20(大日本制藥)。在含有10％FCS、青霉素(100單位/ml)、鏈霉素(100μg/ml)以及G418(500μg/ml)的DMEM中篩選能夠生長的菌落并得到人體新型多肽基因表達(dá)AtT20細(xì)胞系。
實施例11 制備一種包含新型多肽(人型)A鏈N端肽的免疫原及其免疫制備上述實施例3所得到的新型多肽(人型)A鏈N端肽AspValLeuAlaGlyLeuSerSerSerCys(SEQ ID NO7的N端(1-10))部分序列按照公知方法合成的)和血青蛋白(KLH)的復(fù)合物作為免疫原，也就是說，使20mg的KLH溶解于2.0ml的0.1M磷酸緩沖液(pH6.7)，與含有2.8mg的N-(γ-順丁烯二酰亞胺丁酰氧)琥珀酰亞胺(GMBS)的DMSO溶液200μl混合，室溫下反應(yīng)30分鐘。通過經(jīng)過含有2mM EDTA的0.1M磷酸緩沖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-25柱除去過量的GMBS試劑之后，將導(dǎo)入有順丁烯二酰亞胺的KLH(5mg)和溶解于0.1ml的DMSO中的A鏈N端肽(0.84mg)混合，4℃下過夜反應(yīng)。反應(yīng)后在4℃下用生理鹽水透析2天。
給8周齡的BALB/C小鼠(雌性)，同時皮下注射完全福氏佐劑和免疫上述的A鏈N端肽-KLH復(fù)合物(約0.1mg/只)。3周后與不完全福氏佐劑一起追加同樣量的免疫原，并在1周后采血。
實施例12 西洋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的A鏈N端肽的制備使上述的A鏈N端肽和HRP(用于酶免疫測定法，Boehringer Mannheim)偶聯(lián)，作為酶免疫測定法(EIA)的標(biāo)記物。也就是說，在2.3ml的0.1M磷酸緩沖液(pH6.7)中溶解23mg的HRP，并與含有1.6mg GMBS的DMF溶液(0.23ml)混合，室溫反應(yīng)30分鐘后，上樣于經(jīng)過含有2mM EDTA的0.1M磷酸緩沖液(pH6.5)平衡的Sephadex G-25柱。再混合已制備的攜有順丁烯二酰亞胺的KLH(2.3mg)和A鏈N端肽(1mg)，4℃下反應(yīng)1天。反應(yīng)完成后，通過用0.1M磷酸緩沖液(pH6.5)平衡的UltrogelAcA54(Pharmacia)Sephadex G-25柱分離，得到HRP標(biāo)記的A鏈N端肽。
實施例13 經(jīng)過A鏈N端肽免疫的小鼠抗血清抗體滴度的測定按照以下方法測定小鼠抗血清中的抗體滴度。首先，在96孔微量平板的小個孔里分別注入0.1ml的0.1M碳酸緩沖液(pH9.6)其中包含抗山羊小鼠免疫球蛋白抗體(IgG級分，Cappel)，4℃下靜止24小時以制備抗小鼠免疫球蛋白抗體結(jié)合微量平板。接著用磷酸生理鹽水緩沖液(PBS、pH7.4)洗滌平板，為了封閉孔中剩余的結(jié)合部位再分別向每個小孔中注入0.3ml的25％封閉劑(雪印乳業(yè))和含有0.05％NaN3的PBS(pH7.2)，4℃下至少處理24小時。
在抗小鼠免疫球蛋白抗體結(jié)合微量平板的每小孔里，加入用緩沖液-EC
稀釋的小鼠抗血清0.14ml，4℃下反應(yīng)16個小時。然后用PBS(pH7.4)洗滌該平板，再加入上述實施例12制備的HRP標(biāo)記A鏈N端肽(0.1ml)，4℃下反應(yīng)1天，所述HRP標(biāo)記A鏈N端肽是用緩沖液-C[1％BSA、0.4M NaCl以及含有2mM EDTA的0.02M磷酸緩沖液(pH7.0)]稀釋1000倍而成。接著用PBS(pH7.4)洗滌該平板，測定固相上的酶活性，該測定是通過在室溫下加入0.1ml的TMB微孔過氧化物酶底物系(KIRKEGAARD& PERRY LAB.Funakoshi藥品處理)反應(yīng)5分鐘。加入0.1ml的1M磷酸終止反應(yīng)，用平板讀取儀(MTP-120 Corona或Multiskan Ascent、Labsystems)檢測450nm的吸光值(Abs.450)。結(jié)果如圖4所示。經(jīng)過免疫的8只小鼠均顯示了A鏈N端肽抗體滴度的升高。
實施例14 抗A鏈N端肽單克隆抗體的制備對在實施例13中顯示比較高的抗體滴度小鼠No.1和No.7進(jìn)行最終免疫該免疫通過作為KLH的靜脈內(nèi)注射A鏈N端肽-KLH(0.08-0.1mg)而完成。最終免疫經(jīng)過3天，摘除小鼠脾臟，用不銹鋼篩網(wǎng)壓迫過濾，并懸浮于Eagle′s Minimum Essential medium(MEM)，得到脾臟細(xì)胞懸浮液。用BALB/C小鼠骨髓瘤細(xì)胞P3-X63.Ag8.U1(P3U1)作融合細(xì)胞(Current Topics inMicrobiology and Immunology 81，1(1978))。細(xì)胞融合按照原始方法[Natura256，495(1975)]進(jìn)行。也就是，用不含血清的MEM洗滌脾臟細(xì)胞及P3U1各3次，使之混合達(dá)到脾臟細(xì)胞的數(shù)量與P3U1之間的比值為6.6∶1，再750轉(zhuǎn)離心15分鐘，使細(xì)胞沉淀。徹底除去上清液，輕輕倒出沉淀加0.3ml的45％聚乙二醇(PEG)6000(Kochlight)，37℃水槽中靜止7分鐘進(jìn)行融合。把MEM漸漸地添加到融合后的細(xì)胞，一直加到MEM總共為15m時，再750轉(zhuǎn)離心15分鐘，除去上清液。把這個細(xì)胞沉淀物懸浮于含有10％牛胎兒血清的GIT培養(yǎng)基(和光純藥)(GIT-10％FCS)里使P3U1達(dá)到每1ml里有2×105個細(xì)胞，在24多孔盤(Linbro)的每個小孔里各自播種1ml，共播種168個小孔。播種后，在37℃溫度下5％的CO2溫箱中培養(yǎng)細(xì)胞。24小時后開始HAT選擇培養(yǎng)，該培養(yǎng)是通過在每個小孔內(nèi)各自加入1ml的、含有HAT(次黃嘌呤1×10-4M、氨嘌呤4×10-7M、胸腺嘧啶脫氧核苷1.6×10-3M)的GIT-10％FCS培養(yǎng)基(HAT培養(yǎng)基)。該HAT選擇培養(yǎng)在培養(yǎng)開始的5天、8天之后，傾去1ml廢液，然后繼續(xù)添加1ml HAT培養(yǎng)基，在細(xì)胞融合后的第9天取其上清液。
按照實施例13所述的方法進(jìn)行上清液中的抗體滴度測定。即在抗小鼠免疫球蛋白抗體結(jié)合微量平板的每個小孔里，加入0.07ml培養(yǎng)上清液和0.07ml的緩沖液-EC，4℃下過夜反應(yīng)。然后用緩沖液-C稀釋1000倍的HRP標(biāo)記的A鏈N端肽(0.1ml)在沒有標(biāo)記的A鏈N端肽(0.002mM)的存在下或不存在A鏈N端肽的情況下室溫反應(yīng)7個小時。用PBS洗滌該平板，按照實施例13所述的方法測定固相上的酶活性。其結(jié)果，168個孔中被確認(rèn)為具有特異性抗體滴度的有31個孔，冷凍保存雜交瘤。關(guān)于5個孔的雜交瘤即No.14、No.43、No.144、No.146以及No.149，通過稀釋法進(jìn)行克隆。當(dāng)克隆時，加入BALB/C小鼠胸腺細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞使之每個孔達(dá)到5×105個細(xì)胞?？寺『?，根據(jù)同樣方法測定了培養(yǎng)上清液中的抗體滴度，在下列編號中篩選出陽性克隆由No.14 33個孔中篩選2個孔，由No.43 28個孔中篩選1個孔，由No.144 25個孔中篩選23個孔，No.149 58個孔中篩選15個孔，No.146 288孔中篩選7個孔。
從這些克隆中篩選出No.144-10(雜交瘤HK4-144-10)作為抗A鏈N端肽單克隆抗體產(chǎn)生雜交瘤。
實施例15 雜交瘤的小鼠腹水以及單克隆抗體的純化注入雜交瘤No.144-10使小鼠腹水。首先向小鼠(BALB/C，雌性)腹腔內(nèi)注射0.5ml礦物油，然后針對該小鼠腹腔內(nèi)注射(1-3×106cell/只)雜交瘤之后，6-20天后采取含有抗體的小鼠腹水。從該腹水中用蛋白A柱純化單克隆抗體。也就是把約25ml的腹水用等量的結(jié)合緩沖液(3.5M NaCl、含有0.05％NaN3的1.5M甘氨酸(pH9.0))稀釋以后，再上樣于事先用結(jié)合緩沖液平衡的重組子蛋白A-瓊脂(Repligen)柱，用洗提緩沖液(含有0.05％NaN3的0.1M枸櫞酸緩沖液，pH3.0)析出特異性抗體。用PBS(pH7.4)的洗提液4℃下，透析2天，然后用0.22μm過濾器(Millipore)除菌過濾，4℃或-80℃下保存。將得到的單克隆抗體命名為HK4-144-10。
實施例16 自AtT20培養(yǎng)上清中純化新型多肽(人型)在含有10％FCS的DMEM或含有5％FCS的OPTI-MEM中添加0.5mg/ml的G418，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)實施例10所述新型多肽(人型)前體表達(dá)AtT20。將2L量的培養(yǎng)上清通過結(jié)合有HK4-144-10的Tresyl Toyopearl固相(3.2ml)，用PBS(pH7.4)洗滌之后，再用10ml的60％乙腈析出，該乙腈包含0.1％TFA(三氟乙酸)。結(jié)合有HK4-144-10的Tresyl Toyopearl固相按照所添附的使用說明書使125mg的HK4-144-10與5g的AF-Tresyl Toyopearl(TOSOH)結(jié)合。將洗提液凍干后，溶解于0.5ml的40％乙腈，該乙腈包含0.1％TFA(三氟乙酸)，進(jìn)而用含有0.1％TFA的乙腈(40％)并用其平衡的TSK G3000PW柱(7.8×300mm，TOSOH)的凝膠過濾分離，流速為0.25ml/min，收集2分鐘的作為級分1。
根據(jù)競爭法-EIA研究每個級分的免疫活性，該方法采用了上面所述實施例15的單克隆抗體、HK4-144-10以及實施例12所述的HRP標(biāo)記的A鏈N端肽。也就是說，在抗小鼠免疫球蛋白抗體結(jié)合微量平板上，加入通過含有0.05％的CHAPS緩沖液-C(緩沖液-CC)稀釋為3ng/ml的HK4-144-10(0.05ml)、通過緩沖液-CC進(jìn)行梯度稀釋(0，0.016，0.08，0.4，2，10ng/ml)的A鏈N端肽或者通過緩沖液-CC稀釋250倍的所述凝膠過濾級分(0.05ml)、以及HRP標(biāo)記的A鏈N端肽(用緩沖液-CC稀釋6000倍)(0.05ml)(，4℃下反應(yīng)1天。反應(yīng)后，PBS(pH7.4)洗滌，根據(jù)上述實施例13所述的方法對固相上的酶活性進(jìn)行測定。其結(jié)果是，級分No.19-21被檢測到了新型多肽(人型)的免疫活性(約1.8nmol)，該數(shù)值由A鏈N端肽的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算而來。
根據(jù)同樣的操作，除了新型多肽前體(人型)表達(dá)AtT20以外的培養(yǎng)上清(1L)中大約在0.8nmol也檢測到了新型多肽(人型)的免疫活性。
接著用TSK ODS-80TS柱(4.6×250mm，TOSOH)從總量為3L的培養(yǎng)上清中分離部分被純化的新型多肽(人型)(其免疫活性大約在2.6nmol)。洗提液的乙腈濃度的增高是在40分鐘內(nèi)以17％-38％的梯度濃度(含有0.05％TFA)而成。流速為1ml/min，收集0.5分鐘作為級分1，UV峰值的吸光值為215nm，并用所述競爭法-EIA檢測出免疫活性。其結(jié)果如圖5所示。主要的UV峰值No.1、No.2以及No.3分別與免疫活性級分編號No.56、No.64以及No.65一致。關(guān)于這些級分進(jìn)行了質(zhì)譜分析(LCQduo、ThermoQuest)以及氨基酸序列分析(491cLC、Applied Biosystems)。其結(jié)果是，從級分編號為No.56的質(zhì)譜分析上來看，得到了分子量為2459.9的值，從氨基酸分析上也得到了A鏈N端肽、AspValLeuAlaGlyLeuSerSerSer(SEQ ID NO7的N端(1-10)部分序列)。該分子量比A鏈還原型的分子量2463.8約小于4，因此可知，對于級分編號No.56來說，其氧化型A鏈為單獨(dú)分離出來的。另一方面，從級分編號No.64的質(zhì)譜分析上來看，得到了分子量為5500.5的值，從氨基酸分析上也得到了混合序列，即B鏈N端肽、ArgAlaAlaProTyrGlyValArgLeu(SEQ ID NO8的N端(1-9)部分序列)以及A鏈N端肽、AspValLeuAlaGlyLeuSerSerSer(SEQ ID NO7的N端(1-9)部分序列)。該分子量大致與新型多肽(人型)的分子量5500.4一致，所述多肽由包含SEQ ID NO7所示氨基酸序列的A鏈和包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列的B鏈所組成，由此可知，級分編號No.64就是所述該新型多肽(人型)本身所分離出來的。還有，從級分編號No.65的質(zhì)譜分析上來看，至少有2種成分被檢測出來，主要成分的分子量為5343.7，次要成分的分子量為5272.8。新型多肽(人型)B鏈的N端缺失氨基酸Arg，以及又缺失了Ala的分子量各自為5344.2和5273.1，與所看到的分子量大致相同，由此可推測主要成分為B鏈的N端缺失了氨基酸Arg，而次要成分又進(jìn)一步缺失Ala。
上述結(jié)果證實在AtT20細(xì)胞中，由新型多肽前體(人型)分泌并產(chǎn)生了一種新型多肽，實際上該多肽由包含SEQ ID NO7所示氨基酸序列的A鏈和包含SEQ ID NO8所示氨基酸序列的B鏈所組成。其結(jié)果又表明，氧化型A鏈可單獨(dú)分泌產(chǎn)生。
實施例17 對人體新型多肽純化標(biāo)樣的人體單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞(大日本制藥)的細(xì)胞內(nèi)腺嘌呤核苷環(huán)化單磷酸(cAMP)產(chǎn)生的促進(jìn)作用下列用作實驗的人體新型多肽純化標(biāo)樣形成如下，按照所述實施例16的方法，在新型多肽前體(人型)表達(dá)AtT20細(xì)胞的其他批號培養(yǎng)上清液3.5L中經(jīng)過其他用途純化得到的新型多肽(人型)，凍干包含該多肽的級分，加入200μl的緩沖液A(PBS、1％BSA、0.05％CHAPS)溶解(濃度為3.8μM)而成。將人體單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基A(DMEM/F12(1∶1)、10mM HEPES(pH7.5)、0.1％BSA、0.1mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX))使之細(xì)胞密度為106cell/ml，再將該細(xì)胞懸浮液分別注入(200μl)到1.5ml容積的微量試管中，37℃下溫育1個小時。進(jìn)一步用緩沖液A稀釋，其稀釋倍數(shù)分別為反應(yīng)溶液的102、103、104、105、106、107、108倍，將這樣稀釋而成的人體新型多肽純化標(biāo)樣溶液各為25μl添加至所述的細(xì)胞懸浮溶液中，再進(jìn)一步把溶解于培養(yǎng)基A的毛喉素(和光純藥)溶液(最終濃度為1μM)25μl添加到細(xì)胞懸浮液中，然后37℃下溫育30分鐘。3,000rpm，5分鐘4℃下離心使細(xì)胞沉淀，傾去上清液后，加1ml培養(yǎng)基A，懸浮細(xì)胞，離心分離(3,000rpm，5分鐘4℃)，棄去上清液后，把細(xì)胞懸浮于250μl的培養(yǎng)基A中。把20％高氯酸溶液50μl加入該懸浮液之后，4℃下靜止20分鐘。離心分離(15,000rpm、5分鐘、4℃)后，把250μl上清液移入到其他的1.5ml容積的微量試管中，加入60mM HEPES、1.5M KOH溶液，把這種中和了的溶液作為測定cAMP的樣品。
通過cAMP EIA System(Amersham Pharmacia)按照試劑盒所附的使用說明測定細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
其結(jié)果顯示了人體新型多肽純化標(biāo)樣對THP-1細(xì)胞的活性是隨著濃度的增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)生量也隨之增大(圖6)。
實施例18 用微量分析儀分析人體新型多肽純化標(biāo)樣對THP-1細(xì)胞系的細(xì)胞刺激作用人體新型多肽純化標(biāo)樣對THP-1細(xì)胞系的細(xì)胞刺激作用采用下述微量分析儀測定了細(xì)胞外的酸化率(Acidification Rat)。首先，在含有10％FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基上進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，將增殖的THP-1細(xì)胞懸浮于測定培養(yǎng)基(low buffered RPMI(Molecular Decices，Ltd.))(1×108cells/ml)，進(jìn)一步與瓊脂糖細(xì)胞截留培養(yǎng)基(Molecular Decices，Ltd.)以3∶1的比例混合，然后將混合液各分成7μl并分別注入到膠囊杯的中心處。瓊脂糖經(jīng)過固化后，浸入到測定培養(yǎng)基中，保持該狀態(tài)在膠囊杯之上按照順序插入墊片、膠囊插入片斷，最后用測定培養(yǎng)基將插入片斷完全埋住進(jìn)而制成了用于測定的膠囊。將該膠囊直接移入到傳感器內(nèi)，并放在細(xì)胞測定微量分析儀(CytosensorTMMicofhysiometer Molecular Decices，Ltd.)的主機(jī)上。傳感器內(nèi)的酸化率的測定以及數(shù)據(jù)分析均通過該裝置中的操作程序Cytosoft進(jìn)行。加速泵設(shè)定著測定培養(yǎng)基的流速，當(dāng)泵運(yùn)轉(zhuǎn)時其流速為100μl/min，酸化率的測定以2分30秒為一個泵周期，間歇時間為40秒。使用的待測材料是，把實施例16得到的人體新型多肽純化標(biāo)樣溶解于實施例17所述緩沖液A(PBS，1％BSA，0.05％CHAPS)之后再用測定培養(yǎng)基稀釋至500倍。把該稀釋液裝入設(shè)有2個程序的細(xì)胞測定儀流路，然后通過切換指示燈將人體新型多肽溶液一定時間劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫劫觀察到。并檢測到該肽的細(xì)胞刺激活性。
實施例19 表達(dá)人體新型多肽結(jié)合蛋白重組型大腸桿菌菌系的制作以實施例3得到的質(zhì)粒pVHNC5Lh為模板，該質(zhì)粒編碼人體新型多肽DNA片斷，以SEQ ID NO64所示寡DNA(CCGGATCCAGTCGGGCAGCGCCTTA)為有義鏈引物，以SEQ ID NO65所示寡DNA(ATCTCGACTGCCCCGAAGAACC)為無義鏈引物，還有以SEQ ID NO66所示寡DNA(CAGTCGAATGGATGTCCTGGCTGGC)為有義鏈引物，以SEQ ID NO67所示寡DNA(CCGGATCCTAGCAAAGGCTACTGATTTCA)為無義鏈引物，用LA-Taq聚合酶(寶酒造)分別進(jìn)行PCR反應(yīng)。用1.5％瓊脂糖凝膠電泳最后的反應(yīng)液，通過各自的反應(yīng)產(chǎn)生的0.3kb和0.1kb DNA片斷自凝膠回收。用限制性內(nèi)切酶BamHI和TaqI消化這些DNA片斷，在末端形成BamHI和TaqI位點。用BamHI消化pET-11a(STRATAGENE)表達(dá)載體，再用Calf intestinephosphatase(酒寶造)進(jìn)行脫磷酸，然后用1％瓊脂糖凝膠電泳最后的反應(yīng)液，5.5kb DNA片斷自凝膠回收。用DNA Ligation Kit ver.2(寶酒造)將這3條DNA片斷連接，連接后的反應(yīng)液加入Escherichia coli JM109 Competent Cells(寶酒造)中使之轉(zhuǎn)化。從所得抗氨芐西林藥物的菌落中篩選一種克隆其攜有上面所述的由0.1kb和0.3kb片斷直線相連而成的0.4kb DNA片斷所插入的質(zhì)粒(pETVHMMh)。該質(zhì)粒的構(gòu)建過程如圖7所示。
確認(rèn)所插入的DNA片斷堿基序列后，把該質(zhì)粒導(dǎo)入Epicurian ColiBL21-Gold(DE3)Competent Cells(STRATAGENE)中，從而獲得人體新型多肽結(jié)合蛋白表達(dá)的重組型大腸桿菌菌系Escherichia coli BL21-Gold(DE3)/pETVHMMh。該結(jié)合蛋白由SEQ ID NO68所示全部399個堿基序列編碼，并由符合下列順序連接而成的SEQ ID NO69所示133個氨基酸殘基所構(gòu)成，該連接順序為14個氨基酸組成的前導(dǎo)肽序列-Met-B鏈-加工蛋白酶識別序列(Arg-Trp-Arg-Arg)-C鏈-Met-A鏈之順序。
實施例20 人體新型多肽結(jié)合蛋白表達(dá)的重組型大腸桿菌菌系的結(jié)合蛋白之表達(dá)37℃下，在含有50μg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)實施例19得到的大腸桿菌菌系Escherichia coli BL21-Gold(DE3)/pETVHMMh，當(dāng)OD600達(dá)到0.5時添加異丙基-β-D-吡喃半乳糖(IPTG)使之最后濃度為1mM，再培養(yǎng)3個小時。把最后培養(yǎng)液經(jīng)過離心分離收集菌體，提取所有細(xì)菌的蛋白質(zhì)，然后再用SDS-PAGE進(jìn)行分析。
其分析結(jié)果如圖8所示，17KDa的蛋白質(zhì)帶在IPTG的誘導(dǎo)下被確認(rèn)為人體新型多肽結(jié)合蛋白?；厥毡緦嵤├囵B(yǎng)的大腸桿菌菌體作為該結(jié)合蛋白的包含體，并使之變性通過回復(fù)按照正確的組合使S-S鍵形成，然后再進(jìn)行Met殘基C末端溴化氰(CNBr)的化學(xué)切割，以及通過酶反應(yīng)把Arg-Trp-Arg-Arg序列C末端進(jìn)行限制性分解和由此分解產(chǎn)生的2個Arg切割反應(yīng)，從而可以得到人體新型多肽的成熟物。
實施例22 自人體新型多肽結(jié)合蛋白表達(dá)的重組型大腸桿菌菌系中制備人體新型多肽及其衍生物通過實施例20所述的方法培養(yǎng)實施例19所得大腸桿菌菌系Escherichiacoli BL21-Gold(DE3)/pETVHMMh的菌體，把該菌體懸浮于破碎緩沖液(50mM Tris-HCl(pH6.8)、5mM EDTA)中，超聲處理(1分×3次)，然后進(jìn)行離心分離(15,000rpm、20分鐘、4℃)。將沉淀物懸浮于洗滌用緩沖液(50mM Tris-HCl(pH6.8)、5mM EDTA、4％Triton-X-100)，進(jìn)行離心分離(15,000rpm、20分鐘、4℃)，將沉淀物再次懸浮于洗滌用緩沖液，同樣進(jìn)行離心分離。將沉淀物懸浮于蒸餾水中，同樣離心分離2次，如此得到的沉淀物就是含有人體新型多肽結(jié)合蛋白的包含體，并將其溶解于可溶性緩沖液(50mM Tris-HCl(pH6.8)、4M鹽酸胍、5mM 2-巰基乙醇)中，把該可溶性溶液用再生緩沖液(50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDTA、5mM還原型谷胱甘肽、0.5mM氧化型谷胱甘肽、0.8M精氨酸鹽酸鹽)稀釋20倍，然后4℃下攪拌過夜。離心分離(15,000rpm、15分鐘、4℃)該溶液，將得到的上清液用Sep-Pak C-18(Waters Inc.)濃縮凍干。根據(jù)實施例16所述方法用TSKgelODS-80Ts柱對包含人體新型多肽結(jié)合蛋白的凍干物分級分離，關(guān)于分級得到的主要峰值級分，按照實施例16的方法進(jìn)行了質(zhì)譜分析，其分析結(jié)果為，得到測定分子量的數(shù)值與SEQ ID NO69所示133個氨基酸構(gòu)成的多肽，其中N末端缺失1個氨基酸(Met)的多肽(2-133)的理論分子量數(shù)值相一致(質(zhì)譜分析值實測值14156.9、理論值14157.0)。
在0.1N鹽酸和5％溴化氰(CNBr)存在的條件下，室溫將前述多肽(2-133)置于暗處過夜溫育使之進(jìn)行化學(xué)分解，根據(jù)實施例16的方法通過TSKgelODS-80Ts柱由該化學(xué)分解產(chǎn)物分級得到的主要分解產(chǎn)物，對該級分按照實施例16的方法進(jìn)行質(zhì)譜分析，其分析結(jié)果，測定分子量的數(shù)值與SEQ ID NO8所示氨基酸序列B鏈的C末端上附加了11個氨基酸(ArgArgSerAspIleLeuAlaHisGluAlaHse)的肽和SEQ ID NO7所示氨基酸序列A鏈所構(gòu)成的多肽((16-53)/(110-133))的理論分子量數(shù)值相一致(質(zhì)譜分析值實測值6732.9、理論值6732.8)。
以所述多肽((16-53)/(110-133))為底物在胰蛋白酶(BoehringerMannheim)和羧肽酶B(CPB)(Boehringer Mannheim)存在下(酶/底物(重量比＝1/1000))，在含有0.1M Tris-HCl(pH8.5)的反應(yīng)液中，37℃溫育45分鐘，根據(jù)實施例16方法將溫育后的反應(yīng)產(chǎn)物上樣于TSKgel ODS-80Ts柱進(jìn)行分級分離(圖10)。關(guān)于在31.681分鐘的時候，分級分離的級分按照實施例16的方法進(jìn)行了質(zhì)譜分析，正好是測定分子量的數(shù)值與SEQ ID NO8所示氨基酸序列B鏈和SEQ ID NO7所示氨基酸序列A鏈所構(gòu)成的多肽((16-42)/(110-133))，也就是說，與人體新型多肽的理論分子量數(shù)值一致(質(zhì)譜分析值實測值5500.3、理論值5500.4)。關(guān)于該級分又進(jìn)行了氨基酸序列分析和還原后所產(chǎn)生的2條肽質(zhì)譜分析。其結(jié)果是，經(jīng)過分析該級分的氨基酸序列得到了B鏈N末端序列ArgAlaAlaProTyr((SEQ ID NO8的N末端(1-5)部分序列)和A鏈N末端序列AspValLeuAlaGly(SEQ ID NO7的N末端(1-5)部分序列)的混和序列。另外通過該級分還原后所產(chǎn)生的2條肽質(zhì)譜分析而得到的測定分子量的值與SEQ ID NO8所示氨基酸序列B鏈的理論分子量的值(質(zhì)譜分析值實測值3043.1、理論值3042.6)和SEQ IDNO7所示氨基酸序列A鏈的理論分子量的值(質(zhì)譜分析值實測值2463.1、理論值2463.8)一致。
從以上結(jié)果顯示，用胰蛋白酶和CPB處理((16-53)/(110-133))能夠得到由SEQ ID NO8所示氨基酸序列B鏈和由SEQ ID NO7所示氨基酸序列的A鏈組成的多肽((16-42)/(110-133))，即人體新型多肽。
另外，在后面將要敘述的實施例22所使用的SEQ ID NO8所示氨基酸序列B鏈的C末端上缺失了1個氨基酸，這種肽和SEQ ID NO7所示氨基酸序列的A鏈所構(gòu)成的多肽((16-41)/(110-133))通過上面的程序同樣也能獲得副產(chǎn)品。
實施例22 自人體新型多肽結(jié)合蛋白表達(dá)的重組型大腸桿菌菌系中制備的人體新型多肽及其衍生物對THP-1細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生cAMP的作用根據(jù)實施例17所述的方法，研究了自人體新型多肽結(jié)合蛋白表達(dá)的重組型大腸桿菌菌系中制備的人體新型多肽及其衍生物對THP-1細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)cAMP的產(chǎn)生效果。衍生物除了研究((16-53)/(110-133))之外，還研究了((16-41)/(110-133))。研究結(jié)果顯示，人體新型多肽((16-42)/(110-133))(圖11)及其衍生物(圖12)均依人體新型多肽濃度的提高而增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)生量。
如果比較人體新型多肽和B鏈C末端序列不同的人體新型多肽衍生物的活性強(qiáng)度時，其強(qiáng)弱順序為((16-53)/(110-133))＞((16-42)/(110-133))(人體新型多肽)＞((16-41)/(110-133))。
結(jié)果證實，B鏈C末端序列的活性非常重要。
實施例23 人體新型多肽在正常人的肺成纖維細(xì)胞系CCD-19Lu(ATCCCCL-210)中具有促進(jìn)間質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)以及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(VEGF)基因表達(dá)的作用將正常人的肺成纖維細(xì)胞系CCD-19Lu懸浮于培養(yǎng)基B(含有Earle’s鹽的極限必需培養(yǎng)基(GIBCO-BRL)、100μM MEM非必需的氨基酸(GIBCO-BRL)、10％FCS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素)中使其細(xì)胞密度為106cells/ml，在6孔平板的每個小孔內(nèi)分別注入2ml的該細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液，37℃下在5％CO2溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯集狀態(tài)時用2ml的培養(yǎng)基C(含有Earle’s鹽的極限必需培養(yǎng)基(GIBCO-BRL)、100μM MEM非必需的氨基酸(GIBCO-BRL)、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、0.025％CHAPS、0.2％BSA)洗滌細(xì)胞2次，然后各加入2ml的培養(yǎng)基C，37℃下在5％CO2溫箱中培養(yǎng)24小時。吸去培養(yǎng)基，各自加入1ml的培養(yǎng)基C之后，用培養(yǎng)基C調(diào)制使每個孔中的最終濃度為2倍時再分別加入1ml的人體新型多肽溶液，37℃下在5％CO2溫箱中再培養(yǎng)24小時。用Trisol試劑(GIBCO-BRL)按照廠家指定的約定書要求，從上述處理的細(xì)胞中提取總RNA，然后用TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1(寶酒造)，按照試劑盒所附的說明書，通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。CCD-19Lu細(xì)胞系中的MMP-1、VEGF以及看家基因即甘油醛3-磷酸脫氫酶(G3PDH)基因表達(dá)水平的測定是以反轉(zhuǎn)錄溶液作為模板并使用TaqMan PCR Core Reagents Kit with AmpliTaqGold(Applied Biosystems)根據(jù)試劑盒的操作要求，通過ABI PRISM7700(Applied Biosystems)，TaqMan PCR法進(jìn)行。此時，在測定人體MMP-1基因表達(dá)水平時以SEQ ID NO70所示寡DNA作為有義鏈引物，以SEQ IDNO71所示寡DNA作為反義鏈引物，并且在SEQ ID NO72所示寡DNA的5′末端把結(jié)合有報告色素Fam用作TaqMan探針，在3′末端結(jié)合有猝滅劑色素Tamra用作TaqMan探針。在測定人體VEGF基因表達(dá)水平時以SEQID NO73所示寡DNA作為有義鏈引物，以SEQ ID NO74所示寡DNA作為反義鏈引物，并且在SEQ ID NO75所示寡DNA的5′末端把結(jié)合有報告色素Fam用作TaqMan探針，在3′末端結(jié)合有猝滅劑色素Tamra用作TaqMan探針。在測定人體G3PDH基因表達(dá)水平時以SEQ ID NO76所示寡DNA作為有義鏈引物，以SEQ ID NO77所示寡DNA作為反義鏈引物，并且在SEQ ID NO78所示寡DNA的5′末端把結(jié)合有報告色素Fam用作TaqMan探針，在3′末端結(jié)合有猝滅劑色素Tamra用作TaqMan探針。
PCR反應(yīng)包括如下程序首先在50℃下保溫2分鐘，然后以90℃15秒以及60℃1分鐘為一個循環(huán)周期，共進(jìn)行了40個循環(huán)周期。
其結(jié)果是，人體新型多肽純化標(biāo)樣使MMP-1和VEGF的基因表達(dá)水平相對于G3PDH的基因表達(dá)水平增加(圖13)。由此表明，在正常人的肺成纖維細(xì)胞系CCD-19Lu里，人體新型多肽純化標(biāo)樣具有促進(jìn)MMP-1和VEGF的基因表達(dá)的功能。
實施例24 人體新型多肽純化標(biāo)樣對THP-1細(xì)胞系血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(VEGF)基因表達(dá)的促進(jìn)作用按照以下要領(lǐng)研究人體新型多肽純化標(biāo)樣對THP-1細(xì)胞系血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖因子(VEGF)基因表達(dá)的促進(jìn)作用。
首先，把處于增殖期的THP-1細(xì)胞懸浮于含有10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，使其細(xì)胞密度為5×104cell/ml，并且在24孔培養(yǎng)板的每個小孔中分別注入0.4ml。再用相同培養(yǎng)基將人體新型多肽純化標(biāo)樣稀釋至一定的濃度(與實施例21批號相同)，將稀釋的人體新型多肽純化標(biāo)樣分別添加到每個小孔(0.1ml)里，混和之后，在同一培養(yǎng)板上將該細(xì)胞于37℃下培養(yǎng)24小時。用RNease Mini試劑盒(Qiagen)直接從剛處理過的每個細(xì)胞中回收總RNA，再用THERMOSCRIPTTMRT-PCR System(Lifetech Oriental)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，先合成cDNA。根據(jù)實施例23所述的方法以cDNA為模板進(jìn)行TaqManTMPCR(Applied Biosystems)，用ABI PRISMTM7700 SequenceDetection Systems(Applied Biosystems)檢測生成的靶子特異性信號來定量基因的表達(dá)。
其結(jié)果如圖16所示，人體新型多肽純化標(biāo)樣使G3PDH的基因表達(dá)水平相對于的VEGF基因表達(dá)水平增加，其活性具有促進(jìn)VEGF基因的表達(dá)。
實施例25 人體新型多肽純化標(biāo)樣對正常人的皮膚成纖維細(xì)胞系NHDF細(xì)胞具有促進(jìn)cAMP產(chǎn)生的作用將正常人的皮膚成纖維細(xì)胞系NHDF細(xì)胞(BioWhittaker)懸浮于培養(yǎng)基D(成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基試劑盒(BioWhittaker))，其細(xì)胞密度為105cells/ml，并且在24孔培養(yǎng)板的每個小孔中分別注入1ml該細(xì)胞懸浮液，37℃下5％CO2溫箱中培養(yǎng)2天。用實施例17的培養(yǎng)基A(1ml)洗滌細(xì)胞2次，加培養(yǎng)基A 0.4ml之后，37℃下5％CO2溫箱中溫育1個小時。用實施例17所述的緩沖液A調(diào)制人體新型多肽純化標(biāo)樣50μl使其反應(yīng)時的最終濃度為10倍，同時將50μl的溶解于培養(yǎng)基A中的10μM毛猴素(和光純藥)添加于所述的細(xì)胞懸浮液，37℃下5％CO2溫箱中溫育30分鐘。用培養(yǎng)基A(1ml)洗滌細(xì)胞2次，加培養(yǎng)基A 0.5ml之后，再加100μl的20％高氯酸溶液，4℃下靜止20分鐘。將該細(xì)胞提取液移入到1.5ml容量的微量試管中，進(jìn)行離心分離(15,000rpm，10分，4℃)。把500μl的上清液轉(zhuǎn)移到另外的1.5ml容量的微量試管中，加60mM HEPES，1.5M KON溶液進(jìn)行中和反應(yīng)并用于測定cAMP的樣品。通過cAMP EIA System(Amersham Pharmacia)，按照試劑盒所附說明書測定細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)生含量。
其結(jié)果顯示的活性是，人體新型多肽純化標(biāo)樣對NHDF細(xì)胞依賴于其濃度的提高而增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)量(圖14)。
實施例26 人體新型多肽純化標(biāo)樣對大鼠垂體前葉第一代培養(yǎng)細(xì)胞具有促進(jìn)cAMP產(chǎn)生的作用在無麻醉的條件下，猝死32只Wistar rats(8周齡、雄性)，摘除垂體前葉，將垂體前葉放入盛有緩沖液B(137mM氯化鈉、5mM氯化鉀、0.7mM磷酸氫二鈉、25mM HEPES(pH7.3)、50μg/ml硫酸慶大霉素)玻璃皿中，用緩沖液B洗滌1次。用解剖剪子將其剪為4份，再洗滌2次，然后將下垂體塊放入30ml的酶液I中(0.4％膠原酶A(Boehringer Mannheim)、0.4％牛血清蛋白、10μg/ml脫氧核糖核酸酶I(Sigma)、含有0.2％葡萄糖的緩沖液B)一邊振蕩一邊37℃下保溫1個小時。用Komagome移液管分散組織切塊，離心分離(480×g、6分鐘)棄去上清液。把沉淀懸浮于30ml的酶液I(含有0.25％胰酶(Sigma)的緩沖液B)中，一邊振蕩一邊37℃下保溫8分鐘。添加2ml胎牛血清，再次離心分離(480×g、6分鐘)棄去上清液。在沉淀里加入10ml的培養(yǎng)基D(Dulbecco modified Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)其中包括10％胎牛血清、20mM HEPES(pH7.3)、50U/ml的青霉素G、50μg/ml鏈霉素的)并懸浮，用尼龍膜過濾。用10ml的培養(yǎng)基D洗滌2次，測定細(xì)胞數(shù)，使該細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基D中的細(xì)胞密度為1.8×105cells/ml。將細(xì)胞懸浮液分別注入到24孔平板中的每個小孔內(nèi)(1ml)，37℃下5％CO2溫箱中培養(yǎng)3天。用1ml培養(yǎng)基E(使實施例17所述的培養(yǎng)基A中的IBMX濃度為1mM的培養(yǎng)基)洗滌細(xì)胞2次，再加0.45ml培養(yǎng)基E，然后37℃下5％CO2溫箱中保溫1個小時。用實施例17所述的緩沖液A調(diào)制人體新型多肽純化標(biāo)樣溶液50μl使其反應(yīng)時的最終濃度為10倍，并加入所述細(xì)胞懸浮溶液中，然后37℃下5％CO2溫箱中保溫30分鐘。用1ml培養(yǎng)基E洗滌細(xì)胞2次，再加0.5ml培養(yǎng)基E，加100μl的20％高氯酸溶液，4℃下靜止20分鐘。將該細(xì)胞提取液移入到1.5ml容積的微量試管中，離心分離(15,000rpm，10分，4℃)。把500μl上述的上清液轉(zhuǎn)移到另外的1.5ml容積的微量試管中，加60mM HEPES，1.5M KON溶液進(jìn)行中和反應(yīng)并用于測定cAMP的樣品。通過cAMP EIA System(Amersham Pharmacia)，按照試劑盒所附說明書測定細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
其結(jié)果顯示的活性是，人體新型多肽純化標(biāo)樣對大鼠垂體前葉第一代培養(yǎng)細(xì)胞依賴于濃度的提高而增加細(xì)胞內(nèi)cAMP的產(chǎn)量。
實施例27 人體新型多肽純化標(biāo)樣對小鼠肺胞巨噬細(xì)胞具有促進(jìn)cAMP產(chǎn)生的作用小鼠肺胞巨噬細(xì)胞通過以下方式獲得，在戊巴比妥(Nembutal)(大日本制藥)麻醉劑的存在下，用公知方法回收BALB/C小鼠(8周齡、雌性)的Hank′s(Lifetech Oriental)肺胞洗滌液。該肺胞巨噬細(xì)胞播種于24孔培養(yǎng)板中使每孔為5×104，37℃下在含有10％FCS的RPMI-1640培養(yǎng)基中靜止2個小時，把細(xì)胞播種于培養(yǎng)皿的底部。然后用含有10％FCS和50μM IBMX的RPMI-1640培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基，向其中加入人體新型多肽純化標(biāo)樣(根據(jù)實施例16所述的方法由新型多肽前體(人型)表達(dá)AtT20細(xì)胞純化制備，再用實施例17所述的緩沖液A溶解其濃度為5.0μM)，使其最后濃度達(dá)到100nM，把細(xì)胞靜止于37℃45分鐘。通過cAMP EIA System(AmershamPharmacia)，按照試劑盒所附說明書測定如此經(jīng)過處理的細(xì)胞以及細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量。
其結(jié)果證實，添加有人體新型多肽純化標(biāo)樣的小鼠肺胞巨噬細(xì)胞與未添加人體新型多肽純化標(biāo)樣的小鼠肺胞巨噬細(xì)胞對照組相比，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP的含量大約增加了1.4倍。
實施例28 小鼠單克隆抗體、HK4-144-10型的亞型確定前面所述實施例15的小鼠單克隆抗體、HK4-144-10型的亞型確定通過市售的抗血清(Bio-Rad)EIA來確定，即IgG1、κ。
實施例29 構(gòu)建人體新型多肽基因動物細(xì)胞的表達(dá)載體為了使人體新型多肽基因在COS-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)而構(gòu)建其表達(dá)載體。為了不讓COS-7細(xì)胞表達(dá)處理多肽前體過程所必需的加工酶PC1，而將多肽前體A鏈之前的PC1識別序列(Arg-Xaa-Xaa-Arg)置換為由加工酶furin所能識別加工的序列(Arg-Xaa-Arg-Xaa-Arg-Arg)，進(jìn)而構(gòu)建一種同時表達(dá)人furin的表達(dá)質(zhì)粒。此時，為了能夠獲得furin表達(dá)產(chǎn)物的分泌蛋白質(zhì)，除去C末端部分的跨膜區(qū)域，為了更簡便地進(jìn)行檢測，在C末端導(dǎo)入由6個氨基酸組成的His-tag序列。
人furin cDNA以人體胰腺的cDNA(Clontech)為模板，使用下列所述的合成DNA和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件94℃1分→(98℃10秒→68℃3分30秒)×25次→72℃10分4℃)獲得了DNA片段。所述合成DNA包括人furin蛋白質(zhì)翻譯起始部分的DNA(SEQID NO79)和設(shè)計成為所連接的氨基酸是以furin蛋白質(zhì)595Ala為末尾并與His-His-His-His-His-His序列、終止密碼子相連的DNA(SEQ ID NO80)。用限制性內(nèi)切酶BlnI(寶酒造)消化該DNA片段，再導(dǎo)入pCAN618的BlnI部位上，先構(gòu)建了分泌型furin His-tag表達(dá)質(zhì)粒。
接著，以編碼人體新型多肽基因的cDNA為模板，使用下列所述的合成DNA和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件95℃1分→(98℃10秒→68℃35秒)×25次→72℃5分4℃)獲得了不僅包括人體新型多肽基因的ORF而且還置換了113Val→113Arg，117Ser→117Arg氨基酸的DNA片段。所述合成DNA設(shè)計成為一種包括位于翻譯起始密碼子ATG之前并包括MfeI限制性內(nèi)切酶位點的DNA(SEQ ID NO81)和設(shè)計成為所編碼人體新型多肽基因的C末端的序列，接著是終止密碼子的DNA(SEQ IDNO82)。用限制性內(nèi)切酶MfeI(New England Biolabs)消化該DNA片段，再導(dǎo)入所述的分泌型furin His-tag表達(dá)質(zhì)粒的EcoRI位點和末端平滑的NotI位點上，獲得的人體新型多肽前體/furin His-tag共表達(dá)載體pCAN618/hVH1，3其具有在A鏈之前還有由furin識別加工的序列(Arg-Leu-Arg-Gly-Arg-Arg)。
同時，作為對照組，不進(jìn)行氨基酸置換同前所述直接獲得人體新型多肽前體蛋白質(zhì)/furin His-tag共表達(dá)載體。
以編碼人體新型多肽基因的cDNA為模板，使用下列所述的合成DNA和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件95℃1分→(98℃10秒→68℃35秒)×25次→72℃5分4℃)獲得了包括人體新型多肽前提的ORF的DNA片段。所述合成DNA設(shè)計成為一種包括位于翻譯起始密碼子ATG之前并包括MfeI限制性內(nèi)切酶位點的DNA(SEQ ID NO81)和設(shè)計成為編碼人體新型多肽基因的C末端的序列，然后是終止密碼子NotI限制性內(nèi)切酶位點的DNA(SEQ ID NO83)。用限制性內(nèi)切酶MfeI(New England Biolabs)、NotI(New England Biolabs)雙重消化該DNA片段，再導(dǎo)入到所述的分泌型furin His-tag表達(dá)質(zhì)粒的EcoRI位點和NotI位點上，獲得人體新型多肽前體/furin His-tag共表達(dá)載體pCAN618/hVH1，4。
實施例30 構(gòu)建小鼠新型多肽基因動物細(xì)胞的表達(dá)載體為了使小鼠新型多肽基因在COS-7細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，采用實施例29所述的同樣方法構(gòu)建表達(dá)載體。
首先以編碼小鼠新型多肽基因的cDNA為模板，使用下列所述的合成DNA和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件95℃1分→(98℃10秒→68℃35秒)×25次→72℃5分4℃)獲得了不僅包括小鼠新型多肽前提的ORF而且還置換了112Val→112Arg，116Ser→116Arg的DNA片段。所述合成DNA設(shè)計成為一種包括位于翻譯起始密碼子ATG之前并包括EcoRI限制性內(nèi)切酶位點的DNA(SEQ ID NO84)和設(shè)計成為編碼小鼠新型多肽基因的C末端的序列，然后是終止密碼子NotI限制性內(nèi)切酶位點的DNA(SEQ ID NO85)。用限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI(New England Biolabs)雙重消化該DNA片段，再導(dǎo)入實施例29所得分泌型furin/His-tag表達(dá)質(zhì)粒的EcoRI位點和NotI位點上，獲得的小鼠新型多肽前體/furin His-tag共表達(dá)載體pCAN618/mVH1，3其具有在A鏈之前還有由furin識別加工的序列(RVRGRR)。
同時，作為對照組，不進(jìn)行氨基酸置換同前所述直接獲得小鼠新型多肽前體/furin His-tag共表達(dá)載體。
以編碼小鼠新型多肽基因的cDNA為模板，使用下列所述的合成DNA和Pfu DNA聚合酶(Stratagene)，進(jìn)行PCR反應(yīng)(反應(yīng)條件95℃1分→(98℃10秒→68℃35秒)×25次→72℃5分4℃)獲得了包括多肽前體的ORF的DNA片段。所述合成DNA設(shè)計成為一種包括位于翻譯起始密碼子ATG之前并包括EcoRI限制性內(nèi)切酶位點的DNA(SEQ ID NO84)和設(shè)計成為編碼小鼠新型多肽基因的C末端的序列，然后是終止密碼子NotI限制性內(nèi)切酶位點的DNA(SEQ ID NO86)。用限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI(NewEngland Biolabs)雙重消化該DNA片段，再導(dǎo)入到實施例29所得分泌型furin/His-tag表達(dá)質(zhì)粒的EcoRI位點和NotI位點上，獲得小鼠多肽前體/furinHis-tag共表達(dá)載體pCAN618/mVH1，2。
實施例31 新型多肽成熟物向COS-7細(xì)胞上清液中進(jìn)行分泌表達(dá)為了確認(rèn)新型多肽成熟物是否向COS-7細(xì)胞上清液中進(jìn)行了分泌表達(dá)，首先向COS-7細(xì)胞導(dǎo)入實施例29和30制備的人體多肽前體表達(dá)載體，根據(jù)EIA測定培養(yǎng)上清液中的成熟肽。在轉(zhuǎn)導(dǎo)實施例29制備的表達(dá)載體的前一天，先在6孔板上播種4×105cell/well表達(dá)載體，然后用含有10％FBS(Hyclone)的DMEM(Gibco-BRL)于CO2溫箱(incubator)中培養(yǎng)24小時。實施上述實施例29制備的表達(dá)載體和pCAN618與FuGENE6(Roche Diagnostics)的轉(zhuǎn)基因之后，24小時之后，更換培養(yǎng)基即，更換1ml的含有0.1mM 4-(2-氨基乙苯磺酰氟化物(pABSF)(和光純藥)和含有0.05％CHAPS(同仁化學(xué))的DMEM(Phenol Red)培養(yǎng)基(Gibco-BRL)，繼續(xù)培養(yǎng)48個小時。將培養(yǎng)上清液移入eppendorf樣品試管中進(jìn)行離心，除去懸浮的細(xì)胞，將原液直接用于EIA測定。EIA的測定按照實施例16的競爭法實施(圖17)。
其結(jié)果證明，在轉(zhuǎn)導(dǎo)有包括A鏈之前由furin識別加工的序列(RLRGRR)的人體多肽前體/furin-His-tag共表達(dá)載體的pCAN618/hVH1，3的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有約35nM的免疫反應(yīng)性的多肽存在，而在轉(zhuǎn)導(dǎo)有小鼠多肽前體/furin-His-tag共表達(dá)載體的pCAN618/mVH1，3的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中有約41nM的免疫反應(yīng)性的多肽存在。
實施例32 COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的新型多肽對THP-1細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生的作用在實施例31中，證明了具有免疫反應(yīng)原性的人體多肽在COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液中進(jìn)行了分泌表達(dá)，因此為了確定該生物活性，按照實施例17所示的方法利用細(xì)胞培養(yǎng)上清液原液觀察到對THP-1細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生的作用(圖18)。
其結(jié)果證實，當(dāng)加入轉(zhuǎn)導(dǎo)有包括A鏈之前由furin識別加工的序列(RLRGRR)的人體多肽前體/furin-His-tag共表達(dá)載體的pCAN618/hVH1，3的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液時，與對照組相比，對THP-1細(xì)胞具有促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)cAMP產(chǎn)生的作用約為1.8倍，而當(dāng)加入轉(zhuǎn)導(dǎo)有小鼠多肽前體/furin-His-tag共表達(dá)載體的pCAN618/mVH1，3的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液時，約為1.6倍的促進(jìn)作用；并證明產(chǎn)生了具有生物活性的新型多肽。
產(chǎn)業(yè)上的利用本發(fā)明多肽以及編碼該多肽的DNA可用作治療、預(yù)防或診斷碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂質(zhì)代謝等)紊亂(如糖尿病等)、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常(如硬皮癥等)、組織的纖維變性(如肝硬化、肺纖維變性、硬皮癥或腎纖維變性等)、循環(huán)系統(tǒng)障礙(外周動脈疾病、心肌梗塞或心功不全等)、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及過敏反應(yīng)等免疫系統(tǒng)疾病、血管再生障礙疾病等。本發(fā)明多肽還可用作試劑，該試劑有效篩選具有促進(jìn)或抑制本發(fā)明多肽活性的化合物或其鹽。本發(fā)明多肽的抗體還可進(jìn)一步特異地識別本發(fā)明的多肽，因此它可用于檢測、定量和中和待測溶液中的本發(fā)明多肽。
序列表序列表<110>武田藥品工業(yè)株式會社(Takeda Chemical Industries，Ltd.)<120>新型胰島素/胰島素樣生長因子/松弛素家族多肽及其DNA<130>P02-0082<150>JP 12-126340<151>2000-04-21<150>JP 12-205587<151>2000-07-03<150>JP 12-247962<151>2000-08-10<150>JP 12-395050<151>2000-12-22<160>86<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ctggcggtat gggtgctgac 20<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2actggggcat tggtcctggt g 21
<210>3<211>142<212>PRT<213>人(Human)<400>3Met Ala Arg Tyr Met Leu Leu Leu Leu Leu Ala Val Trp Val Leu Thr1 5 10 15Gly Glu Leu Trp Pro Gly Ala Glu Ala Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val20 25 30Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly35 40 45Gly Ser Arg Trp Arg Arg Ser Asp Ile Leu Ala His Glu Ala Met Gly50 55 60Asp Thr Phe Pro Asp Ala Asp Ala Asp Glu Asp Ser Leu Ala Gly Glu65 70 75 80Leu Asp Glu Ala Met Gly Ser Ser Glu Trp Leu Ala Leu Thr Lys Ser85 90 95Pro Gln Ala Phe Tyr Arg Gly Arg Pro Ser Trp Gln Gly Thr Pro Gly100 105 110Val Leu Arg Gly Ser Arg Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys115 120 125Cys Lys Trp Gly Cys Ser Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys130 135 140<210>4<211>1061<212>DNA<213>人(Human)<400> 4ttcaaagcat ctccgtccag catggccagg tacatgctgc tgctgctcct ggcggtatgg60gtgctgaccg gggagctgtg gccgggagct gaggcccggg cagcgcctta cggggtcagg 120ctttgcggcc gagaattcat ccgagcagtc atcttcacct gcgggggctc ccggtggaga 180cgatcagaca tcctggccca cgaggctatg ggagatacct tcccggatgc agatgctgat 240gaagacagtc tggcaggcga gctggatgag gccatggggt ccagcgagtg gctggccctg 300accaagtcac cccaggcctt ttacaggggg cgacccagct ggcaaggaac ccctggggtt 360cttcggggca gccgagatgt cctggctggc ctttccagca gctgctgcaa gtgggggtgt 420agcaaaagtg aaatcagtag cctttgctag tttgagggct gggcagccgt gggcaccagg 480accaatgccc cagtcctgcc atccactcaa ctagtgtctg gctgggcacc tgtctttcga 540gcctcacaca ttcattcatt catctacaag tcacagaggc actgtgggct caggcacagt 600ctcccgacac cacctatcca accctgccct ttgaccagcc tatcatgacc ctggccccta 660aggaagctgt gcccctgcct ggtcaagtgg ggaccccccc atcctgaccc ctgacctctc 720cccagcccta accatgcgtt tgcctggcct acacactcca ctgccacaac tgggtcccta 780
ctctacctag gctggccaca cagagacccc tgcccccttc ccagtccaaa ctgtggccat 840tgtcccctga ccagctaaaa tcaagcctct gtctcagtcc agcctttgca cgcacgcttc 900ctttgccctg ctttccatcc cctctccctc caactcccct gccagagttc caaggctgtg 960gaccccagag aaggtggcag gtggcccccc taggagagct ctgggcacat tcgaatcttc 1020ccaaactcca ataataaaaa ttcgaagact ttggcagaga g 1061<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5ccggatgcag atgctgatga a 21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6tggtcaaagg gcagggttgg20<210>7<211>24<212>PRT<213>人(Human)<400>7Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Lys Trp Gly Cys Ser1 5 10 15Lys Ser Glu Ile Ser Ser Leu Cys20<210>8<211>27<212>PRT<213>人(Human)
<400>8Arg Ala Ala Pro Tyr Gly Val Arg Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg1 5 10 15Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp20 25<210>9<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>9ggtgaagatg actgctcgga tga 23<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>10ccgcaaagcc tgaccccgta ag22<210>11<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11gggggtgtag caaaagtgaa a 21<210>12<211>426<212>DNA<213>人(Human)
<400>12atggccaggt acatgctgct gctgctcctg gcggtatggg tgctgaccgg ggagctgtgg 60ccgggagctg aggcccgggc agcgccttac ggggtcaggc tttgcggccg agaattcatc 120cgagcagtca tcttcacctg cgggggctcc cggtggagac gatcagacat cctggcccac 180gaggctatgg gagatacctt cccggatgca gatgctgatg aagacagtct ggcaggcgag 240ctggatgagg ccatggggtc cagcgagtgg ctggccctga ccaagtcacc ccaggccttt 300tacagggggc gacccagctg gcaaggaacc cctggggttc ttcggggcag ccgagatgtc 360ctggctggcc tttccagcag ctgctgcaag tgggggtgta gcaaaagtga aatcagtagc 420ctttgc 426<210>13<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>13gggcaggggt ctctgtgt 18<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
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<210>19<211>24<212>PRT<213>大鼠(Rat)，小鼠(Mouse)<400>19Asp Val Leu Ala Gly Leu Ser Ser Ser Cys Cys Glu Trp Gly Cys Ser1 5 10 15Lys Ser Gln Ile Ser Ser Leu Cys20<210>20<211>71<212>DNA<213>大鼠(Rat)<400>20gagtgctggc tggcctttcc agcagctgtt gcgagtgggg ctgtagtaag agccaaatta 60gcagcttgtg c71<210>21<211>27<212>PRT<213>大鼠(Rat)，小鼠(Mouse)<400>21Arg Pro Ala Pro Tyr Gly Val Lys Leu Cys Gly Arg Glu Phe Ile Arg1 5 10 15Ala Val Ile Phe Thr Cys Gly Gly Ser Arg Trp20 25<210>22<211>81<212>DNA<213>大鼠(Rat)<400>22aggcccgcgc cctatggggt gaagctctgc ggtcgggagt tcatccgcgc ggtcatcttc 60acctgcgggg gctcacgatg g 81<210>23<211>141<212>PRT
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<400>79ctccagccta ggcttttgca aaaaccacca tggagctgag gccctggttg ctat 54<210>80<211>66<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>80ttatttccta gggaattcat caatggtgat ggtgatgatg ggcctgactg gacgtgaggg 60tcttgc 66<210>81<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>81aacagtcaat tgccaccatg gcaagataca tgctgctgct gctcctggcg gtatgggtgc 60<210>82<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>82tcagcaaagg ctactgattt cacttttgct gcacccccac ttgcaacagg agctgctaag 60gccagccagg acatcgcggc ggccccgaag cctcccaggg gttccttgcc aggagggtcg 120<210>83<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>83tttattagcg gccgctcagc aaaggctact gatttcactt ttgctacacc cccacttgc59<210>84<211>70<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>84aggcatgaat tcccaccatg gcaatgctcg ggctgctgct gctggcttcc tgggctctcc 60tcggggctct 70<210>85<211>120<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>85caacgcggcc gctagcacaa gctgctaatt tggctcttgc tacagcccca ctcgcagcaa 60ctgctggaaa ggccagccaa cacatctctc ctgccccgaa cccttccagg tgacccttgc 120<210>86<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>86tcaacgcggc cgctagcaca agctgctaat ttggctcttg ctacagcccc actcgcagca 60ac 6權(quán)利要求
1.一種多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其含有與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中所述基本相同的序列是指SEQ ID NO19或SEQ ID NO47所示的氨基酸序列。
3.一種多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中含有與SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中所述基本相同的序列是指SEQ ID NO21或SEQ ID NO49所示的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求1或3所述的多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其含有與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同的序列以及含有與SEQ IDNO8所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
6.一種多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中含有與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同序列的多肽、其酰胺或其酯以及含有與SEQID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同序列的多肽、其酰胺或其酯它們通過二硫鍵相結(jié)合。
7.如權(quán)利要求5或6所述的多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中所述含有與SEQ ID NO7所示氨基酸序列相同或基本相同的序列為SEQ IDNO19或SEQ ID NO47所示的氨基酸序列，所述含有與SEQ ID NO8所示氨基酸序列相同或基本相同的序列為SEQ ID NO21或SEQ ID NO49所示的氨基酸序列。
8.一種DNA，其中含有編碼權(quán)利要求1或3所述多肽的DNA。
9.如權(quán)利要求1或3所述多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其含有與SEQ ID NO3所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
10.如權(quán)利要求9所述多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽，其中所述基本相同的氨基酸序列為SEQ ID NO17、SEQ ID NO23、SEQ ID NO45或SEQID NO51所示的氨基酸序列。
11.如權(quán)利要求8所述DNA，其中含有編碼權(quán)利要求9所述多肽的DNA。
12.如權(quán)利要求10所述的DNA，其中包含SEQ ID NO12、SEQ IDNO18、SEQ ID NO24、SEQ ID NO46或SEQ ID NO52所示的堿基序列。
13.一種重組載體，其中包含權(quán)利要求8所述的DNA。
14.一種轉(zhuǎn)化體，其用權(quán)利要求13所述重組載體轉(zhuǎn)化而成。
15.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1、3或6所述多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽的方法，其包含培養(yǎng)如權(quán)利要求14所述的轉(zhuǎn)化體，并從中生成權(quán)利要求1、3或6所述的多肽。
16.一種抗體，其針對權(quán)利要求1、3或6所述的多肽、其酰胺、或其酯或其鹽。
17.一種篩選化合物或其鹽的方法，所述化合物或其鹽具有促進(jìn)或抑制權(quán)利要求1、3或6所述多肽、其酰胺或其酯或其鹽的活性，該方法包括使用權(quán)利要求1、3或6所述的多肽、其酰胺或其酯或其鹽。
18.一種用于篩選化合物或其鹽的試劑盒，所述化合物或其鹽具有促進(jìn)或抑制權(quán)利要求1、3或6所述多肽、其酰胺或其酯或其鹽的活性，其中所述試劑盒包括權(quán)利要求1、3或6所述的多肽、其酰胺或其酯或其鹽。
19.一種化合物或其鹽，其具有促進(jìn)或抑制權(quán)利要求1、3或6所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽的活性，所述化合物或其鹽可通過使用權(quán)利要求17所述的篩選法或權(quán)利要求18所述的篩選試劑盒而獲得。
20.一種藥物，其包含具有促進(jìn)或抑制權(quán)利要求1、3或6所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽的活性的化合物或其鹽，所述化合物或其鹽可通過使用權(quán)利要求17所述的篩選法或權(quán)利要求18所述的篩選試劑盒而獲得。
21.一種藥物，其含有權(quán)利要求1、3或6所述的多肽、其酰胺或其酯、或其鹽。
22.一種藥物，其包含如權(quán)利要求16所述的抗體。
23.一種預(yù)防或治療如下疾病的藥物，該藥物包含①如權(quán)利要求1、3或6所述多肽、其酰胺、或其酯、或其鹽；②如權(quán)利要求19所述的化合物或其鹽；③如權(quán)利要求16所述的抗體，所述疾病包括代謝調(diào)節(jié)紊亂、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常、組織的纖維變性、循環(huán)系統(tǒng)障礙、內(nèi)分泌障礙、體液平衡異常、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血管再生障礙。
24.如權(quán)利要求23所述的藥物，其中所述藥物為治療或預(yù)防肝硬化或肺纖維變性、硬皮癥、腎纖維變性或外周動脈疾病的藥物。
25.一種診斷藥物，其包含如權(quán)利要求16所述的抗體。
26.①如權(quán)利要求1、3或6所述多肽、其酰胺或其酯、或其鹽；②通過使用權(quán)利要求17所述的篩選法或權(quán)利要求18所述的篩選試劑盒而獲得的、具有促進(jìn)或抑制如權(quán)利要求1、3或6所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽的活性的化合物或其鹽；或③如權(quán)利要求16所述的抗體，它們在制備治療或預(yù)防如下疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病包括代謝調(diào)節(jié)紊亂、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常、組織的纖維變性、循環(huán)系統(tǒng)障礙、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血管再生障礙。
27.一種治療或預(yù)防如下疾病的方法，該方法包括把①如權(quán)利要求1、3或6所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽；②通過使用權(quán)利要求17所述的篩選法或權(quán)利要求18的篩選試劑盒而獲得的、具有促進(jìn)或抑制如權(quán)利要求1、3或6所述多肽或其酰胺或其酯、或其鹽活性的化合物或其鹽；或③如權(quán)利要求16所述的抗體投藥于哺乳動物，所述疾病包括代謝調(diào)節(jié)紊亂、抑制組織的生長·增殖·分化、生殖功能降低、結(jié)締組織的形成異常、組織的纖維變性、循環(huán)系統(tǒng)障礙、內(nèi)分泌障礙、體液平衡紊亂、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血管再生障礙。
全文摘要
本發(fā)明涉及①具有與SEQ ID NO7所示氨基酸相同或基本相同的多肽(A鏈)；②具有與SEQ ID NO8所示氨基酸相同或基本相同的多肽(B鏈)；③A鏈和B鏈通過二硫鍵聯(lián)結(jié)形成的多肽或其鹽(2條鏈)；④編碼它們的DNA等。本發(fā)明多肽以及編碼該多肽的DNA，可用于診斷、治療、預(yù)防碳水化合物等能源代謝調(diào)節(jié)(糖代謝、脂肪代謝等)紊亂(如糖尿病等)等疾病。
文檔編號A61P9/00GK1633498SQ0181107
公開日2005年6月29日 申請日期2001年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月21日
發(fā)明者伊藤康明, 鈴木伸宏, 西一紀(jì), 木澤秀樹, 原田征隆, 大儀和宏 申請人:武田藥品工業(yè)株式會社