專利名稱：調節(jié)肺炎球菌莢膜多糖的生產的制作方法
本研究得到了美國政府資金的部分資助(美國公共衛(wèi)生服務授權編號AI38436和AI44231)，因此，美國政府可以擁有本發(fā)明的部分權利。
背景技術：
本發(fā)明總體上涉及用鏈球菌生物生產莢膜多糖材料，并且涉及用所述材料生產疫苗。
肺炎鏈球菌(有時候被稱為肺炎球菌)一般是寄居在人類鼻咽的粘膜表面上的共生生物。當宿主因素容許該生物進入下呼吸道時，會導致嚴重的炎性反應。引起一種密集的固結化，即肺泡空氣間隙中充滿了溢泌物，這種癥狀通常被稱為肺炎(Tuomanen et al.，1995)。肺炎球菌感染的最嚴重的表現是菌血癥，它可能并發(fā)膿毒癥、腦膜炎、或這兩者。在成年人體上，菌血癥通常是肺炎的并發(fā)癥(Raz et al.，1997)。
肺炎球菌抵抗將該生物從血液中清除的主要機制(即調理吞噬)的能力需要表達該生物的主要毒力因子，該因子是多糖莢膜(Avery et al.，1931；Watson et al.，1990)。肺炎球菌能夠合成不少于90種的在結構上獨特的莢膜多糖(CPSs)。
肺炎球菌CPS具有抗吞噬特性，并且能抑制與宿主細胞的粘附。它是運載(即該生物從一個受感染的、但不一定有癥狀的個體傳播到另一個個體)以及有可能在疾病病理學的隨后方面的一個關鍵步驟(Ring etal.，1998)。在其他有莢膜的生物(例如，流感嗜血菌、腦膜炎萘瑟氏菌、釀膿鏈球菌和無乳鏈球菌)上的類似的發(fā)現，業(yè)已使人們理解了CPS的量為什么必須臨時改變，以便能夠實現與宿主細胞的粘附性相互作用，以及對體液免疫力的抗性(Hammerschmidt et al.，1996；Levin et al.，1998；Schrager et al.，1996；Sellin et al.，1995；St.Geme III et al.，1991)。
即使在同一種菌株內，由肺炎鏈球菌所表達的CPS的量也不同。調節(jié)CPS表達的調控機制以前尚不完全了解。大多數肺炎球菌分離物能在至少兩種形式之間發(fā)生表型變化，這兩種形式可以通過菌落的不透明性進行區(qū)分(Weiser，1998；Weiser et al.，1994)。不透明型(O)菌落與相同菌株的透明(T)變體在所合成的CPS的量方面不同，O-型的菌落通常能產生更大量的CPS(Kim et al.，1998)。
由肺炎球菌變體所產生CPS量的相對小的差異，可能對毒力產生重要影響(MacLeod et al.，1950)。與T-型菌落相比，O-型菌落所產生的CPS的量高出1.2-5.6倍，這種提高與肺炎球菌細胞對免疫血清的調理吞噬提高了的抗性相關(Kim et al.，1999)。在系統感染的鼠類模型上，只有若干種肺炎球菌菌株O變體能引起膿毒癥(Kim et al.，1998)。相反，所述T型能表達較大量的其他細胞表面多糖——磷壁酸。肺炎球菌細胞壁磷壁酸與CPS共價連接，并且含有一種不常見的宿主樣成分-磷酸膽堿。這種多糖導致了肺炎球菌細胞通過血小板活化因子的受體與上皮細胞粘附(Cundell et al.，1995；Cundell et al.，1995；Kim et al.，1998)。T型還表現出包括CbpA在內的細胞表面膽堿結合蛋白的改變了的分布，這種改變起著促進粘附和寄居的作用(Rosenow et al.，1997)。在由幼小的大鼠模型攜帶期間，選擇表現出T，而不是O表現型的肺炎球菌變體(Weiser et al.，1994)。以上觀察表明，肺炎球菌可以在具有更強的粘附和攜帶能力的形式(即T型)和更適合在入侵性感染型的非粘附形式(O型)之間變化。
由肺炎球菌所表達的CPSs的鑒定構成了血清分類的基礎，這是一種用于區(qū)分肺炎鏈球菌變體的診斷方法。由于不同的變體可能具有不同的生理學特征(例如，對抗微生物制劑的易感性或肺炎發(fā)作或發(fā)展的特有速度)，區(qū)分肺炎球菌變體的能力在醫(yī)學上是有利的。另外，由于人類(或其他脊椎動物)免疫系統識別并攻擊肺炎球菌變體的能力取決于它專一性識別各種變體的CPS的能力，獲得肺炎球菌變體專一性CPS的能力，能顯著影響用于緩解與肺炎球菌感染相關疾病的治療和預防方法以及組合物的開發(fā)。例如，已知的肺炎球菌疫苗包括從多種肺炎球菌變體中獲得的CPS。
仍然存在著對用于與肺炎球菌感染相關的疾病的診斷、預測、治療和預防組合物和方法的明顯的需求。很多上述組合物和方法包括、采用或依賴于對分離的肺炎球菌CPS的開發(fā)。現有用于從肺炎球菌中分離CPS的方法的特征通常是產量低。本發(fā)明包括改良可以從肺炎球菌變體中獲得的CPS產量的方法，和提高產量，以及與肺炎球菌相關的診斷預測、治療和預防組合物和方法的應用。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及一種通過在一種生長培養(yǎng)基中維持肺炎球菌，改良由該肺炎球菌產生莢膜多糖的方法。在一方面，其改進在于包括保持一種具有亞大氣濃度的氧氣的氣體與所述生長培養(yǎng)基接觸(例如，氧氣濃度不超過大約16％或不超過大約0.1％)。所述肺炎球菌可以是鏈球菌屬的生物，如肺炎鏈球菌的生物(例如，肺炎鏈球菌變體6A、6B、18C和9V中的一種)。在另一方面，其改進在于包括維持一種具有超大氣濃度(例如，至少大約3％或10％)的二氧化碳的氣體與所述生長培養(yǎng)基接觸。在第三方面，其改進在于包括保持一種具有超大氣濃度的二氧化碳和亞大氣濃度的氧氣的氣體與所述生長培養(yǎng)基接觸。在另一方面，其改進在于包括將所述生長培養(yǎng)基的二氧化碳濃度保持在至少等于在相同溫度下用含有5％二氧化碳的氣體平衡的相同生長培養(yǎng)基中二氧化碳的濃度。
本發(fā)明還涉及一種緩解動物體內肺炎球菌感染的方法。該方法包括保持所述動物(例如，至少是該動物的肺)與一種具有超大氣濃度(例如，25％、50％或100％)的氧氣的氣體接觸?？梢杂迷摲椒ň徑獾母腥镜睦影ǚ窝?、菌血癥、膿毒癥、和腦膜炎。
本發(fā)明還涉及一種制備用于給有發(fā)生肺炎球菌感染的危險的動物服用的免疫原性制劑的方法。該方法包括在其氧氣含量低于在相同溫度下用普通空氣平衡的相同培養(yǎng)基中的氧氣含量的生長培養(yǎng)基中維持肺炎球菌細胞，并從該細胞中分離由該細胞所產生的莢膜多糖。所述莢膜多糖構成了所述免疫原性制劑。
本發(fā)明還涉及一種生產肺炎球菌多糖的方法。該方法包括在其氧氣含量低于在相同溫度下用普通空氣平衡的相同培養(yǎng)基中的氧氣含量的生長培養(yǎng)基中維持肺炎球菌細胞，例如，基本上缺乏氧氣的培養(yǎng)基。在一種實施方案中，所述培養(yǎng)基的二氧化碳含量高于在相同溫度下用普通空氣平衡相同培養(yǎng)基中的二氧化碳含量，例如，由二氧化碳飽和的培養(yǎng)基或含有碳酸鹽或碳酸氫鹽的培養(yǎng)基。
本發(fā)明包括一種評估測試化合物是否可用于緩解動物體內的肺炎球菌感染的方法。該方法包括(a)在有所述測試化合物的條件下維持的肺炎球菌細胞中CpsD的磷酸化程度，和(b)在沒有所述測試化合物的條件下維持的相同類型細胞中CpsD的磷酸化程度。
如果在有所述測試化合物的條件下維持的細胞中的CpsD的磷酸化程度，低于在沒有所述測試化合物的條件下維持的所述細胞中的CpsD的磷酸化程度的話，該測試化合物就可用于緩解所述感染。例如，CpsD的磷酸化程度可以通過測定存在于CpsD上的磷酸化酪氨酸殘基的數量或通過測定具有至少一個磷酸化的酪氨酸殘基的CpsD的比例進行評估。


圖1，包括圖1Ai-Avi和1Bi-1Bvi，它們是表明通過Quellung反應評估的環(huán)境氧和二氧化碳濃度對菌落形態(tài)影響的圖像。在37℃下，在大氣條件下(圖1Ai，1Aiv，1Bi和1Bvi)，在含有較高二氧化碳濃度的大氣條件下(圖1Aii，1Av，1Bii和1Bv)，在含有較高二氧化碳濃度的厭氧條件下(圖1Aiii，1Avi，1Biii和1Bvi)，在補充了過氧化氫酶的T營養(yǎng)瓊脂上生長6A型肺炎球菌分離物的不透明的(圖1Ai，1Aii，1Aiii、1Bi、1Bii和1Biii)和透明的(圖1Aiv，1Av，1Avi、1Biv、1Bv和1Bvi)變體。在圖1Ai-1Avi中的照片上的菌落是通過偏振透射光照射觀察的，并且以放大56倍的形式顯示。圖1Bi-1Bvi中的照片中的莢膜材料是通過Quellung反應和類型專一性抗血清觀察的，并且以放大4000倍的形式顯示。
圖2，包括圖2A-2D，它是表示通過捕捉ELISA評估的環(huán)境氧氣和二氧化碳濃度以及不透明性表現型對以每單位蛋白為基礎的CPS產量的影響的四聯棒圖。讓四種類型肺炎球菌分離物(圖2Ai和2Aii中的變體6B；圖2Bi和2Bii中的變體6A；圖2Ci和2Cii中的變體18C；圖2Di和2Dii中的變體9V)的不透明的(圖2Ai、2Bi、2Ci和2Di)和透明的(圖2Aii、2Bii、2Cii和2Dii)變體在曲線圖上面所標明的氧氣和二氧化碳濃度下，生長到中對數期(實心柱)或穩(wěn)定期(點劃線柱)。在超聲波處理的細胞沉淀和培養(yǎng)上清液(加斜線的柱)中測定CPS產量，并且以相對總細胞蛋白量的形式表達?！?”表示該變體在該條件下不生長。有關數值表示重復進行的兩個獨立實驗的平均值。
圖3，包括圖3A和3B，它是表示在Western分析中環(huán)境氧氣和二氧化碳濃度以及不透明性表現型對CpsD的酪氨酸磷酸化的影響的一對照片。在固體培養(yǎng)基上生長之后，除去肺炎球菌變體P303的O型(泳道1-4)和T型(泳道5-8)的全細胞裂解物，并調整到相等的密度。圖3A中的照片表示所述樣品中的蛋白，這些蛋白是通過SDS-PAGE分離的，轉移到一種膜上，并且用被稱為4G10的單克隆抗體進行免疫吸印，這種抗體能專一性地結合磷酸化的酪氨酸。圖3B中的照片表示用抗完整肺炎球菌的抗血清進行免疫吸印的復制的膜的照片，以便證實加樣量相等。相應于裂解的細胞和加樣到各泳道中的生長條件如下在泳道1和5中，小于1％氧氣/10％二氧化碳；在泳道2和6中，16％氧氣/3％二氧化碳；在泳道3和7中，21％氧氣/小于0.1％二氧化碳；而在泳道4和8中，19％氧氣/10％二氧化碳。圖3A中的箭頭表示25kD CpsD帶的位置。大小標記物以千道爾頓為單位。
圖4，表示通過Northern分析評估的環(huán)境氧氣和二氧化碳濃度以及不透明性表現型對CpsD的轉錄的影響的照片。在甲酰胺凝膠上分離從肺炎球菌變體P303的O型(泳道1和2)或T型(泳道3和4)中獲得的總RNA，并且用放射性標記過的由血清型4肺炎球菌中獲得的CpsD的片段進行檢測。在小于0.1％氧氣/10％二氧化碳(泳道1和3)或1％氧氣/小于0.1％二氧化碳(泳道2和4)的條件下生長用于分離RNA的細菌。大小標記物是以前道爾頓為單位的RNA標準物。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及本發(fā)明人的發(fā)現，即由肺炎球菌所產生的莢膜多糖(CPS)的量可以通過控制用于維持該細菌的培養(yǎng)基中的氧氣和二氧化碳含量來進行調節(jié)。本發(fā)明人業(yè)已發(fā)現，肺炎鏈球菌中的CPS產量是由CpsD蛋白的存在以及該蛋白的翻譯后修飾調控的?；谏鲜霭l(fā)現，本發(fā)明包括用于調節(jié)肺炎球菌的CPS產量的方法(例如，用于生產抗肺炎球菌疫苗和其他免疫原性制劑)，用于緩解肺炎球菌感染的方法，以及鑒定可用于緩解肺炎球菌感染的制劑的方法。
定義在本文中，下面的每一個術語具有在本節(jié)與它相關的含義。
本文所使用的冠詞“一個”(“a”“an”)表示一個或一個以上(即至少一個)該冠詞的語法賓語。舉例來說，“一個因子”表示一個因子或一個以上因子。
“普通”空氣表示在特定部位大體上具有大氣的平均含量的氣體，不考慮濕度(即以干重為基礎)。大氣的平均含量為大約78％的氮氣，21％的氧氣，1％的氬氣，以及各自低于0.04％的二氧化碳、氫氣、氦氣、氖氣、氪氣和氙氣。
說明業(yè)已發(fā)現，肺炎球菌莢膜多糖(CPS)的產量受該細胞環(huán)境中所存在的氧氣和二氧化碳的存在和濃度的影響。具體地講，CPS的產量隨著環(huán)境中氧氣含量的降低而提高；CPS的產量還會隨著環(huán)境中二氧化碳含量的提高而提高。盡管以上發(fā)現是利用肺炎鏈球菌的培養(yǎng)物作出的，還可將其應用于具有類似于諸如其他鏈球菌的(例如，無乳鏈球菌)的鏈球菌的生物的莢膜和莢膜基因特性的生物，應用于諸如金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、約氏不動桿菌的其他有莢膜的生物，以及具有與上述一種或多種特性類似的表現型、基因型或同時具有這兩者的生物。當所述生物是肺炎鏈球菌時，它可以是任何一種已知的或以后發(fā)現的它的變體，包括根據其CPS的性質鑒定的變體，如變體6A、6B、18C和9V中的一種。
以上發(fā)現可用于與任何已知的培養(yǎng)肺炎球菌的方法組合，或者與以后開發(fā)的任何方法組合，以便提高(或者降低，如果需要的話)由所述方法所培養(yǎng)的肺炎球菌的CPS產量。本發(fā)明包括一種提高通過按照已知方法培養(yǎng)肺炎球菌獲得的CPS的產量的方法。這種改良的方法包括降低在它里面或在它上面維持所述肺炎球菌的培養(yǎng)基中的氧氣的含量，這種降低是相對在培養(yǎng)所述肺炎球菌期間正常情況下出現在該培養(yǎng)基中的氧氣含量而言。例如，通常是在明膠或半固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)肺炎球菌，其中，保持該培養(yǎng)基與經過過濾的(或以其他方式滅菌)的普通空氣接觸。
通過降低與所述培養(yǎng)基保持接觸的氣體中的氧氣含量(以干重為基礎)，可以提高肺炎球菌的CPS產量。氧氣含量降低的程度并不重要，不過，一般來說，氧氣含量降低的越多，CPS的產量就提高的越多。所述氣體的氧氣含量優(yōu)選低于16％，或者降低到使該氣體基本上成為厭氧的程度(例如，使它含有小于0.1％的氧氣)，使所述氣體中氧氣含量降低的方式并不重要。將氣體中氧氣含量降低到低于普通空氣中氧氣含量程度的常見方法，包括用一種具有所需氧氣含量的氣體沖洗培養(yǎng)容器(至少在開始進行沖洗，或者間歇性沖洗、定期沖洗或連續(xù)沖洗)。例如，可以用含有大約71％氮氣、19％氧氣和10％二氧化碳的氣體混合物或者用含有95％氬氣和5％二氧化碳的氣體混合物沖洗培養(yǎng)容器。
還可以通過提高與在它上面或里面維持的肺炎球菌的培養(yǎng)基接觸的氣體的二氧化碳含量提高肺炎球菌的CPS產量。所述氣體二氧化碳提高的程度并不重要，不過，一般來說，二氧化碳含量提高的越多，CPS的產量就提高的越多。所述氣體的二氧化碳含量優(yōu)選至少為大約5％，或至少為大約10％，不過，二氧化碳的濃度還可以高到使培養(yǎng)基被二氧化碳飽和的程度。如上文所述，理想的二氧化碳含量可以通過用具有所需二氧化碳含量的氣體沖洗用來培養(yǎng)所述肺炎球菌的容器而獲得。另外，還可以通過將碳酸鹽或碳酸氫鹽摻入培養(yǎng)基中或者將所述鹽添加到培養(yǎng)基中為所述培養(yǎng)基提供二氧化碳。
本發(fā)明包括通過提高用于維持肺炎球菌的培養(yǎng)基中的二氧化碳含量、提高與所述培養(yǎng)基接觸的氣體的二氧化碳含量、降低所述培養(yǎng)基的氧氣含量、降低與所述培養(yǎng)基接觸的氣體的氧氣含量、或這些措施的任意組合來提高肺炎球菌的CPS產量。在一種實施方案中，所述培養(yǎng)基(或與該培養(yǎng)基接觸的氣體的)的氧氣/二氧化碳含量可以進行調節(jié)，以便能夠在一個時期提高肺炎球菌細胞的產量，然后可以再次調節(jié)，以便提高在第二個時期中的CPS產量。
降低與所述培養(yǎng)基接觸的氣體中的氧氣含量會導致在它上面或里面維持肺炎球菌的培養(yǎng)基的氧氣含量，這是因為溶解的和非溶解的氣體的平衡作用。改變氣體的二氧化碳含量具有類似的作用。所述氣體溶解在培養(yǎng)基中以及非溶解氣體平衡的速度，取決于本領域已知的多種因素，例如，包括培養(yǎng)基-氣體界面的面積，培養(yǎng)基的粘度，以及培養(yǎng)基的攪動程度。
可以在培養(yǎng)基(例如，液體培養(yǎng)基)中維持肺炎球菌，其中，培養(yǎng)基和任何氣相之間的界面(如果有的話)是最小化的。在這種培養(yǎng)系統中，改變氣相的含量可能對液體培養(yǎng)基的氣體含量產生相對較小的影響，因為只有有限的氣體從所述氣相中擴散到液體中。在所述系統中，所述液體培養(yǎng)基的氣體含量可以受到用于制備該培養(yǎng)基的方法的影響。例如，通過以下方法可以制備大體上為厭氧的液體培養(yǎng)基制備液體培養(yǎng)基，在高壓滅菌器中滅菌(高壓滅菌器中的熱量可以排除液體中的幾乎所有的氧氣)，并且在沒有氧氣的環(huán)境中冷卻高壓滅菌的培養(yǎng)基，如在有穩(wěn)定的、不合氧氣的氣流通過的密封容器中冷卻。合適的不含氧氣的氣體的例子包括純氬氣，與5-10％二氧化碳混合的氬氣，純的氮氣，或氮氣、氬氣和二氧化碳的某種組合。在需要很高程度的厭氧條件時([氧氣]＜＜0.1％＝，利用本領域已知方法，讓通過加熱的銅線圈或濾網或從它上面經過的不含氧氣的氣體從冷卻中的培養(yǎng)基上通過。當然，可以用類似方法制備具有需要的氣體含量的固體、凝膠和半固體培養(yǎng)基。
還可以通過選擇合適的肺炎球菌變體并將其制成用于接種其氧氣含量、二氧化碳含量或這兩種含量受到調控的培養(yǎng)基的接種物，來提高CPS產量?？梢岳斫獾氖?，肺炎球菌的不同變體可能產生結構上不同的CPS。本文所披露的方法可用于利用任何肺炎球菌變體提高CPS產量。還應當理解的是，很多肺炎球菌至少具有兩種表現形式。這些形式可以包括不透明型(O)和透明型(T)，其中，不透明型的特征通常是能產生更大數量的CPS。因此，通過篩選以更大的CPS產量為特征的肺炎球菌變體作為接種物可以進一步提高CPS產量。
利用本文所披露的一種或多種方法所生產的CPS可以用于(單獨或者與其他類型的肺炎球菌的CPS組合)通過本領域已知的方法制備肺炎球菌疫苗和其他免疫原性制劑。所述方法通常包括從肺炎球菌細胞中分離CPS，選擇性地將其余的肺炎球菌細胞滅活，并且將所述CPS與一種可以藥用的載體(以及選擇性的免疫學佐劑)組合。所述制劑可以給動物服用，以便增強該動物對肺炎球菌感染的免疫反應。
由于肺炎球菌CPS被認為使得肺炎球菌能逃脫動物(例如人)體內的免疫防御，可以將抑制CPS生產的方法用于緩解動物體內的肺炎球菌感染。可以用這種方法緩解的肺炎球菌感染(以及由此產生的并發(fā)癥)包括肺炎(特別是肺炎球菌肺炎)、菌血癥、膿毒癥、腦膜炎細菌性心臟內膜炎，鏈球菌滲出性咽炎，蜂窩織炎和內臟潰瘍。
業(yè)已發(fā)現，提高環(huán)境中的氧氣含量能降低肺炎球菌CPS產量，從而提高肺炎球菌對免疫系統的感染性。類似的，業(yè)已發(fā)現降低環(huán)境中的二氧化碳含量，能降低肺炎球菌CPS產量。
通過保持受所述感染困擾的動物與具有超大氣濃度的氧氣的氣體接觸可以緩解肺炎球菌感染及其副作用和并發(fā)癥。另外，可以相對感染部位的普通氧氣含量提高該感染部位{例如，與肺炎球菌相關的內臟潰瘍}的氧氣含量(例如，通過向位于動物體內的感染部位直接提供純氧氣或滅菌過的空氣)。例如，當所述身體部位是肺(例如，具有肺炎球菌肺炎的肺)時，所述普通氧氣含量就是普通空氣的氧氣含量。例如，通過使用呼吸器或標準氧氣面罩給患者肺提供超大氣濃度的氧氣，可以緩解肺炎球菌性肺炎。
還可以通過將動物體內的感染部位的二氧化碳含量降低到低于正常情況下出現在該感染部位的二氧化碳含量，并且優(yōu)選低于正常情況下出現在該身體部位的二氧化碳含量(即使在沒有肺炎球菌感染的情況下也是如此)，緩解肺炎球菌感染及其副作用和并發(fā)癥。降低除了肺以外的體內部位的二氧化碳含量的方法，可能包括提供一個穿過通過、經過該身體部位的無菌氣體流。當感染部位是肺時，可以通過提高呼吸速度降低二氧化碳含量，呼吸速度的提高是患者的自愿行為或人工行為(例如，使用呼吸器或呼吸加快藥物)。
正如在實施例中更詳細地說明的，肺炎球菌中CPS產量的提高與CpsD基因的低水平表達相關，并且與CpsD蛋白的低度磷酸化相關。因此，CPS產量可以通過能增強CpsD表達、增加CpsD的磷酸化程度的制劑或這兩者來提高。相反，CPS產量可以通過能抑制或降低CpsD表達、抑制CpsD磷酸化、增強磷酸化CpsD的脫磷酸化或它們的某種組合的制劑而受到抑制。正如上文所披露的，與動物感染相關的肺炎球菌中CPS產量的降低，能夠使得這種肺炎球菌更容易受到所述動物免疫系統的攻擊。
本發(fā)明包括評估一種測試化合物是否是肺炎球菌CPS生產的抑制劑的方法，以及評估一種測試化合物是否是肺炎球菌CPS生產的增強劑的方法。在上述每一種方法中，在存在所述測試化合物的條件下，以及分別，但優(yōu)選在缺乏相同的測試化合物的條件下維持肺炎球菌細胞?？梢酝ㄟ^測定在有和沒有所述測試化合物的條件下，由細胞所產生的CPS的量評估該測試化合物對CPS生產的直接影響。另外，評估了CpsD的表達水平(通過測定相應的RNA或相應的蛋白的產生評估)，或CpsD的磷酸化程度(通過測定存在于CpsD中的磷酸化酪氨酸殘基的數量或至少具有一個磷酸化酪氨酸殘基的CpsD的比例)，并按照上述方法將它與CPS生產的抑制或增強相關聯。
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肺炎鏈球菌的莢膜多糖表達的氧氣依賴性與CpsD的翻譯后修飾相關本實施例所提供的實驗證實，肺炎球菌之間透明度表現型的差異(即O型與T型)受環(huán)境氧氣濃度的影響，并且，諸如可能出現在肺炎球菌上的厭氧生長條件，會影響O型肺炎球菌增強CPS表達的能力，并逃脫免疫清除。
下面將介紹在本實施例的實驗中所使用的材料和方法。
細菌菌株和生長條件用于本研究中的肺炎鏈球菌菌株如表1所示，并且包括以前公開的臨床分離物P303(6A型)、P324(6B型)、P68(18C型)和P10(9V型)的O和T變體(Kim et al.，1998；Weiser et al.，1994)。按公開方法在37℃下，在不進行搖動的條件下，在非密封容器中，在半合成(C+Y培養(yǎng)基，pH8.0)或胰化大豆培養(yǎng)基中生長細菌(Tomasz，1964)。將液體培養(yǎng)液鋪平板到含有1％(w/v)瓊脂的胰化大豆瓊脂(TSA)平板上，在該平板上涂有5000單位的過氧化氫酶(購自WorthingtonBiochemical，Freehord，NJ)。在37℃下，在燭罐中培養(yǎng)接種過的培養(yǎng)基，除非另有說明。按公開方法，在顯微鏡和偏振透射光下確定該TSA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)(Weiser et al.，1994)。
表I肺炎球菌菌株和變體與能專一性結合磷酸酪氨酸的單克隆抗體的反應性

7對每一種菌株/突變體來說，測定了在有氧條件下生長的O表現型?！?’，表示具有單一的25-27kD的帶的反應性。
在通氣條件下，用二氧化碳培養(yǎng)箱控制環(huán)境二氧化碳濃度。厭氧生長條件是按照生產商的說明利用BBL GasPakTM系統獲得的(BectonDickinson，Cockeysville，MD)。在某些實驗中，在該系統中使用碳酸氫鈉成分，以便產生10％的二氧化碳氣體，而在其他實驗中，不使用該成分。在收獲所述細菌之后，測定生長培養(yǎng)基的pH，以便證實其pH沒有受到所述不同培養(yǎng)條件的影響。
用類似方法對臨床樣品進行分析。一共檢查了患有腦膜炎的502位患者，其中大約20％在細菌學上被證實為肺炎球菌性腦膜炎。從在臨床診斷中被推測為肺炎球菌性腦膜炎的患者體內收集鼻咽洗漱液樣品，將該樣品馬上鋪平板到5％綿羊血瓊脂和含有5000個單位的過氧化氫酶的胰化大豆瓊脂上，并在含有5％二氧化碳的空氣環(huán)境中，在37℃下培養(yǎng)所述平板。與培養(yǎng)存在肺炎球菌的患者血液樣品的做法相同，將腦脊液(CSF)樣品同樣鋪平板到血液瓊脂和透明平板上，按照標準通氣培養(yǎng)方法培養(yǎng)48小時。首先通過格蘭氏染色和Quellung反應證實在血液瓊脂上表現出典型的形態(tài)特征的分離物是肺炎球菌。所有分離物在-80℃下在細菌保存器中保存，并按本文所披露的方法測定菌落形態(tài)學。用Fisher’sExact Test檢查鼻咽和入侵部位培養(yǎng)物的T和O表現型比例之間的統計學差異。
遺傳轉化按公開方法使得膠囊化的和非膠囊化的肺炎球菌成為天然轉化感受態(tài)(Weiser et al.，1999)。通過從含有紅霉素(1微克/毫升)的培養(yǎng)基中篩選將雙成分信號轉導系統(TCSTSs)中的突變轉入菌株P303。篩選具有改變了的菌落形態(tài)的膠囊化的轉化體，并且用類型專一性抗血清(購自Statens Seruminstitut，哥本哈根，丹麥)通過Quellung反應證實CPS表達。
Quellung反應觀察在各種條件下，在半合成培養(yǎng)基中生長到中對數期的細菌中的肺炎球菌莢膜。為了進行Quellung反應，按照公開方法將等體積的培養(yǎng)物和含有6型抗血清和1％(w/v)購自Statens Seruminstitut(哥本哈根，丹麥)的亞甲基蘭的組合物在玻璃載玻片上混合1分鐘(Neufeld，1902)。
CPS的定量讓O和T型肺炎球菌變體在半合成的生長培養(yǎng)基上生長到中對數期(A620＝0.3)或生長16小時(此時細胞處于穩(wěn)定期)。通過以2000xg的速度離心收集細胞，用磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)洗滌，在0℃下超聲波處理3次，每次10秒，并在-20℃下保存。按公開方法用捕捉ELISA技術測定存在于在特定條件下生長的變體中的CPS的量(Kim et al.，1998)。類型專一性兔抗血清(購自Statens Seruminstitut，哥本哈根，丹麥)是以1∶5000的稀釋比例用0.05摩爾碳酸鈉(pH9.6)稀釋之后使用的，并且在室溫下用一夜時間使其固定在微量滴定板的孔的壁上。在每一個培養(yǎng)步驟之間，用Tris緩沖液(含有10mMTris，150mM氯化鈉，0.05％BrijTM35，和0.02％(w/v)疊氮化鈉)洗滌5次。BrijTM35(聚氧乙烯(23)月桂基酯C12H25(OCH2CH2)23OH)是一種洗滌劑。在已知濃度下使用從6B、6A、18C或9V型肺炎球菌中獲得的純化CPS，并且是從美國典型組織保藏所(Rockville，MD)購買的，將其作為標準物。用被命名為HASP4(它能專一性結合6A和6B型CPSs)、HASP22(它能專一性結合18C型CPS)和HASP33(它能專一性結合9V型CPS)的單克隆抗體檢測超聲波處理過的細胞樣品中的CPS，所述抗體是以在中試實驗中確定的濃度使用的。用能與小鼠IgM專一性起反應的并且與堿性磷酸酶結合的抗血清檢測單克隆抗體與CPS的結合。該制劑是按公開方法使用的(Kim和Weiser，1998)。利用微量二辛可酸試劑盒，按照生產商的說明(Pierce Chemical Co，Rockford，IL)用超聲波處理過的細胞提取物進行總細胞蛋白測定。上清液級份中的CPS的量取決于相應的細胞超聲處理級份中的蛋白濃度(即為了以每單位蛋白為基礎統一CPS含量)。
業(yè)已披露了用于比較細胞超聲處理物中的總的磷壁酸的含量的捕捉ELISA方法(Kim et al.，1998)。所有實驗都成雙地進行，并且重復至少3次。結果以每一種總的細胞蛋白濃度的平均值形式表示。
Western分析按上述方法在添加了過氧化氫酶的胰化大豆瓊脂上生長細菌。在37℃下，在特定條件下生長16小時之后，用消毒的DacronTM刷將細胞從培養(yǎng)基表面上取出，重新懸浮在PBS中，并且用PBS洗滌，以便將細胞密度調節(jié)到A620＝0.5。在離心之后，將細胞沉淀重新懸浮在Laemmli凝膠加樣緩沖液中，并且加熱到100℃，保持5分鐘。然后在12.5％(w/v)的聚丙烯酰胺凝膠上通過SDS-PAGE分離所述樣品，并按公開方法轉移到Immobilon-PTM膜上(Wani et al.，1996)。
用以1∶2000的稀釋比例稀釋在TSBP緩沖液(Wani et al.，1996)中的被稱為4G10(Upstate Biotechnology Inc.，Waltham，MA)的單克隆抗體進行免疫吸印，按公開方法用與堿性磷酸酶結合的小鼠IgG抗血清檢測吸印的樣品與該抗體的反應性(Kim et al.，1999)。通過用以前披露的抗完整肺炎球菌的抗血清(Wani et al.，1996)對復制的膜進行免疫吸印，證實添加了大體上相等數量的細菌。
Northern分析按公開方法從在半合成培養(yǎng)基中，在大氣和厭氧條件下生長到中對數期的菌株P303細胞的O和T變體中分離總RNA并進行純化(Weyand等，2000)。在甲酰胺凝膠上分離RNA之后，對用溴化乙錠染色的RNA進行照相，并將其圖像數字化，以便與RNA大小標記物進行比較。使用VacuGeneTMXL系統，按照生產商(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden)的說明將所述DNA轉移到一種膜上。在65℃下，在含有0.5M磷酸鈉，pH7.2，1.5mM EDTA和7％(w/v)SDS的溶液中將所述膜預雜交15分鐘。探針是用cps4D基因的內部片段制備的，并且用具有以下序列的引物通過PCR進行擴增。
5’-CCGGAATTCG TACAAATATA CAGTTGAGCG GAGATAAAC-3’(SEQ ID NO1)和5’-CGCGGATCCT GTTGCTGTTA CCAAGATGGA CG-3’(SEQ IDNO2)而基因組DNA獲自4型菌株。該菌株與基因組研究所用于進行全基因組測序的菌株相同。用限制性內切酶BamHI和EcoRI消化所述PCR產物，然后克隆到在多接頭兩側具有轉錄終止子的載體上，以便能夠克隆鏈球菌序列。該載體是按照以下方法由pJDC9構建的將pUK4K(Pharmacia，Uppsala，Sweden)的平端卡那霉素抗性框插入平端ClaI位點，以便能夠在大腸桿菌中篩選該標記(Chen和Morrison，1988)。將cps4D片段插入BamHI和EcoRI消化過的載體，并轉入大腸桿菌菌株DH5α?？俁NA是從在大氣和厭氧條件下，在胰化大豆培養(yǎng)基中生長到中對數期的菌株P303的肺炎球菌的O和T變體中提取的。
下面將披露在本實施例中提供的實驗的結果。
在人體中篩選表現型變體為了驗證是否對載體和人類菌血癥中的不同肺炎球菌表現型進行了選擇，從表現出膿毒癥癥狀的患者的鼻咽和血液中獲得相同血清類型的成對的分離物。由于菌株與菌株之間在與不透明性無關的菌落形態(tài)學方面存在異質性，必須獲得成對的分離物。一旦開始抗生素治療，就不能從菌血癥患者的鼻咽中分離肺炎球菌。因此，鼻咽和血液的培養(yǎng)物基本上是同時獲得的。這種制約因素需要該研究在具有肺炎球菌菌血癥高發(fā)的地區(qū)進行，以便可以獲得足夠數量的成對的分離物。
從住在Blantyre、Malawi地區(qū)的19位成年患者體內獲得血液和鼻咽分離物，并且只有在這些分離物隨后在用類型專一性抗血清進行Quellung反應中證實為相同類型的時候才被認為是成對的分離物。大部分成對的分離物是1型的，在該地區(qū)的最常見的類型如表II所示。檢測還證實了大多數患者的人類免疫缺陷病毒感染成陽性，這種感染被認為是造成在這些患者中出現高的侵入性肺炎球菌疾病的原因。在19對分離物中，有17(89％)對在鼻咽中是T表現型的，而12(63％)對在血液中是O表現型的。有10對分離物在從兩種部位獲得的肺炎球菌的表現型方面不一致，都表現出在鼻咽中更像是T表現型(p＜0.001)。這證實了一般存在對表現型變體的選擇，由此導致了來自主要為T樣群體的更像是O樣表現型的血液在天然菌血癥感染的鼻咽中的存在。
表II從人類攜帶者和侵入性感染中獲得的不透明性表現型

注14/19侵入性分離物是從腦脊液中獲得，而不是從血液中獲得的。
2N/A表示不存在的臨床癥狀。
氧氣對CPS數量的影響研究了在感染期間能促進O變體篩選，并且在攜帶期間促進T變體篩選的宿主和細菌因素。據推測，在固結肺中出現的較低的氧氣含量會促進從T到O表現型的轉變。6A型臨床分離物P303在較低氧氣濃度下的生長對T型向O型自動轉變的速度沒有影響。不過，如圖1A所示，在厭氧條件下的生長(存在較高濃度的二氧化碳)與向更大和更多類粘蛋白菌落形態(tài)的轉變相關，這種現象對于O變體來說特別明顯。
由于具有O表現型的肺炎球菌所表達的CPS的量高于具有T表現型的肺炎球菌所表達的CPS的量。因此認為，與O型相關的更大的菌落體積有可能是這種材料的產量增加所導致的(Kim et al.，1998)。在初步研究中，通過Quellung反應和6型抗血清觀察細菌菌落周圍的CPS的折射區(qū)，如圖1B所示。與相同表現型在有氧氣的條件下的生長或T變體在包括缺乏氧氣在內的任何實驗過的條件下的生長相比，在有10％二氧化碳的厭氧條件下生長的O變體的該區(qū)更大。相反，當所述細菌是在大氣條件下培養(yǎng)的時，在T型肺炎球菌的菌落周圍檢測不到莢膜材料區(qū)。這一結果證實了O型合成較大數量CPS的能力，并且表明較低的氧氣含量、較高的二氧化碳含量，或者這兩者能夠促進CPS產量的提高。
利用為了測定CPS的量而開發(fā)的一種方法定量測定環(huán)境氧氣和二氧化碳濃度的作用，并且表示在圖2中(Kim et al.，1998)。用本文所披露的捕捉ELISA測定的每毫克總細胞蛋白的CPS量與菌落表面積相關，并且與根據通過Quellung反應觀察到的區(qū)域計算出的莢膜體積值和菌落表面積相關，如表III所示。與T型生物相比，在中對數期或穩(wěn)定期生長的O型細菌表現出較大量的與細胞相關的CPS。與在大氣條件下培養(yǎng)的相同細胞中的CPS產量相比，O型6A變體在有10％二氧化碳的厭氧條件下的生長會導致CPS的產量提高7.9倍。
與在有10％二氧化碳的厭氧條件下生長的T變體相比，O變體的CPS產量提高了29倍。利用從兩種不相關的臨床分離物獲得的O和T分離物獲得了類似結果(即使用6B和18C型)。
表III在各種條件下生長的肺炎球菌的特征分析

3對于相同的6A型臨床分離物的O和T變體而言。
4這些值是基于在生長16小時之后所觀察到的菌落。這些值表示用3個單一的孔分離的菌落進行的測定的平均值。
5這些值是基于用Quellung反應觀察到的莢膜材料計算的值，用于計算球形橢圓形的體積的公式為V＝(π/6)LW2。有關數值表示由兩個相應的單細胞分裂的三種雙球菌形式測定的平均值?！癠D” 表示莢膜材料區(qū)檢測不到。
6這些值基于對在液體培養(yǎng)基中生長到中對數期的生物的捕捉ELISA測定。有關數字是兩次獨立測定的平均值。
在生長到穩(wěn)定期之后，測定18C型肺炎球菌的培養(yǎng)上清液中的CPS產量。發(fā)現在O型變體的培養(yǎng)上清液中多糖的產量隨著氧氣濃度的降低以及二氧化碳濃度的提高而增加，這表明較高的CPS產量是因為在較低的氧氣/較高的二氧化碳條件下細胞的CPS合成增加而導致的，而不是因為在較高的氧氣/較低的二氧化碳條件下由細胞中釋放出的CPS減少所致。用9V型分離物確定CPS合成的增加是由于氧氣的減少所致還是由于二氧化碳的增加所致。與有10％二氧化碳以及存在氧氣的條件下生長的相同的細胞相比，在有10％二氧化碳和在沒有氧氣的條件下生長到穩(wěn)定期的9V型細菌的CPS產量提高了12倍。這證實了氧氣含量，而不是二氧化碳含量是影響CPS產量程度的主要環(huán)境因素。
與CpsD/CpsD改變相關的CPS產量的變化本研究下一階段的目的是了解氧氣影響CPS產量的機理。檢驗了用于傳感并轉導氧氣含量/存在的雙成分信號轉導系統的作用。按公開方法將以前披露的出現在3型分泌物基因組中的雙成分信號轉導系統的12種標記突變中的11種導入P303(Throup等，2000)。制備了在響應調節(jié)子同系物上具有突變的10種結構，以及在組氨酸激酶同系物上具有突變的7種結構。對在P303中實驗的這17種突變型同系物中的每一種來說，在細胞在厭氧條件下生長的實驗中，用Quellung反應測定時這些突變對菌落體積的增加或莢膜區(qū)的形成沒有影響。這一結果表明，氧氣的作用不可能是通過TCSTS介導的，不過，在肺炎球菌中的上述系統中的一種無法檢查，因為該基因似乎是必需基因。
然后，檢驗已知是CPS表達所需要的基因座的的基因。由于在多種類型的菌株中觀察到了氧氣對CPS量的影響，因此，在不同類型之間保守的基因被認為最有可能是候選基因。在莢膜基因座上的基因中，只有頭4個基因cpsA-D是不同類型的肺炎球菌所共有的(Iannelli et al.，1999)。如表I所示，在大氣條件下生長時，通過Quellung反應測定了解到3型肺炎球菌能形成類粘蛋白菌落并具有大的莢膜(Knecht et al.，1970)。與所有其他實驗過的類型的肺炎球菌不同，相對在大氣條件下培養(yǎng)時的體積而言，在厭氧條件下培養(yǎng)時，3型菌株沒有表現出菌落體積或莢膜的增加。根據這一發(fā)現，確定了3型cpsA-D和其他類型基因座之間的差別。
編碼一種推測的轉錄弱化劑的cpsA的同系物和編碼一種具有未知功能的蛋白的cpsB出現在3型膠囊化基因座上(GenBank保藏號Z47210；Arrecubieta，1995)。血清型2肺炎球菌中編碼CpsC的基因在3型膠囊化基因座之間是高度保守的，不過，血清型3肺炎球菌中推測的CpsD在69號氨基酸之后截短了(截短了226個氨基酸)。CpsC和CpsD是肺炎球菌莢膜表達所需要的，并且它們都與在大腸桿菌中表達的一種蛋白(Wzc)同源，這種蛋白與鏈長調控和被稱為colanic酸的細胞外多糖的輸出相關(Morona et al.，1999；Stevenson et al.，1996)。
在大腸桿菌中，Wzc在酪氨酸殘基上發(fā)生可恢復的自發(fā)磷酸化(Vincent et al.，1999)，將被稱為4G10的能專一性結合磷酸化的酪氨酸殘基的單克隆抗體用于Western分析，測定出現在肺炎球菌中的磷酸化的酪氨酸。在6A型分離物的全細胞裂解物中出現了大約為26kD的單一的帶，這是CpsD的推測的大小。同樣在用于本研究中的6B、18C和9V菌株的全細胞裂解物中出現了相同大小的單一的帶，但是，3型肺炎球菌中缺乏這條帶(它具有截短的CpsD)。以上發(fā)現證實，CpsD是可以在酪氨酸殘基上磷酸化的。通過比較菌株D39(一種非膠囊化的突變體)和R6x(一種具有跨越cps2A-H的7504個堿基對的缺失的菌株，其中，只有A-D是其他類型所共有的；Iannelli et al.，1999)，獲得了4G10是由具有磷酸化的酪氨酸殘基的CpsD識別的進一步的證據。在某些實驗中，通過用從(2型)D39親本菌株或三種菌株獲得的DNA轉化有關細菌糾正了R6x型肺炎球菌中的所述突變，從而得到了具有2型D39遺傳背景的具有3型或2型莢膜的膠囊化的菌株。
4G10不能與R6x和3型R6x轉化體起反應，以及該抗體能夠與2型R6x轉化體起反應的事實，證實了與該帶相關的蛋白的表達需要所述膠囊化基因座上頭4個共有基因中的一個，并且需要完整拷貝的CpsD。根據大小確定，4G10反應性蛋白不可能是CpsA或B。在2型和3型CpsC之間，只有15個保守氨基酸的變化，其中沒有酪氨酸。在3型菌株中4G10反應性蛋白的缺乏表明，4G10不是CpsC。因此，得出的結論是，在所述肺炎球菌中CPS蛋白包括可以磷酸化的酪氨酸殘基。
檢驗了在各種濃度的氧氣和二氧化碳下的生長對CpsD的酪氨酸磷酸化的影響。將在各種濃度的氧氣和二氧化碳條件下生長的被稱為P303的6A型肺炎球菌分離物的O和T型全細胞的裂解物調整到相同的密度，并且用磷酸酪氨酸專一性單克隆抗體4G10通過Western分析進行檢驗。該實驗的結果如圖3所示。在有氧條件下生長的O變體中檢測到了具有CpsD的預期大小的單一的帶。如圖3中的泳道2-4的結果所示，二氧化碳含量在低于0.1％到10％之間的變化所產生的影響沒有明顯差別。在實驗過的所有條件下(氧氣＜0.1％至21％，二氧化碳＜0.1％至10％)，所述抗體與T變體的細胞提取物的反應都是微弱的。用其他菌株獲得了類似結果。因此，所得出的結論是，CpsD的酪氨酸磷酸化受不透明性表現型的影響，并且需要在有氧氣的條件下生長。
酪氨酸磷酸化的差別可以影響CpsD的活性，并且導致了在有氧氣的條件下O型肺炎球菌中CPS表達的減弱。厭氧生長的O或T型肺炎球菌都不能表達磷酸化的酪氨酸，不過，這兩種表現型形式在CPS生產的程度方面存在很大差別。
通過Northern分析確定O和T變體之間的差別是否是由于CpsD轉錄水平的差別所導致的。以上實驗的結果如圖4所示。從在大氣條件下或者在有10％二氧化碳的厭氧條件下生長的肺炎球菌菌株P303的O和T型中獲得總細胞RNA。用克隆的CpsD片段檢測所述RNA。通過測定放射性標記過的探針與mRNA上的CpsD的雜交并且將該測定值相對存在于雜交分析混合物中的RNA的總量進行調整，確定了轉錄活性方面的定量差別。以上實驗證實，氧氣濃度對CpsD轉錄的水平沒有明顯影響。不過，與O型細胞相比，T型細胞中CpsD的轉錄水平提高了3.4倍。因此，所得出的結論是，CpsD的轉錄調控決定肺炎球菌的不透明性表現型。
不希望受任何特定操作理論的約束，相信CpsD控制CPS的產生。在CpsD的酪氨酸磷酸化程度方面出現的差別和在CPS產量方面的差別之間的相關性支持這種理論。據信CpsD起著酪氨酸激酶的作用，這是部分基于其氨基酸序列與大腸桿菌中的酪氨酸自發(fā)磷酸化酶的相似性，這種酶與鏈長調控和細胞外多糖colanic酸的輸出相關。Cps23FD與Wzc在229個氨基酸中的188個上面具有30％的相同性和49％的相似性。血清型23f肺炎球菌的CpsD含有一種異常的羧基末端氨基酸序列(YGSYGNYNNYGKNKK；SEQ ID NO3)，該序列含有包括酪氨酸殘基在內的重復特征(YGX)4。與CpsD的其余部分相比，該羧基末端區(qū)在肺炎球菌變體之間表現出明顯更大的氨基酸序列雜合性。據信，肺炎球菌菌株之間CPS產量的波動性是由于在這些菌株之間該羧基末端部分的波動性所致，這種序列波動影響了該蛋白的磷酸化能力。業(yè)已鑒定了多種其他的細菌蛋白激酶，并且這些激酶同樣擁有具有富含酪氨酸的重復特征的C-末端(Ilan et al.，1999)。不能產生在CpsD上具有突變的肺炎球菌菌株，同時保持該菌株生產CPS的能力這一事實是該基因在CPS和莢膜生產中的重要性的進一步的證據。
下面提供了根據菌落不透明性表現型和氧氣含量調控CPS生產的機制的模型，該模型包括CpsD的轉錄調控和CpsD的翻譯后修飾。
CpsD是一種負調控因子，它作用在參與肺炎球菌類型專一性CPS生物合成的基因上。較弱的CpsD轉錄是導致在厭氧條件下O型肺炎球菌中CPS的表達量較高的原因。除了造成顯著水平的CPS表達調控的CpsD的轉錄調控之外，還涉及到第二種水平的調控，即在CpsD上的酪氨酸殘基的磷酸化或自發(fā)磷酸化。CpsD的磷酸化只影響O變體，并且需要在通氣條件下生長。只能在O變體中檢測到在一個或多個酪氨酸殘基上磷酸化的CpsD的能力，可能是因為在T肺炎球菌中具有較高的磷酸酶活性。酪氨酸磷酸化增強了CpsD的負調控活性，因此，磷酸化的CpsD降低了在通氣條件下CPS的合成。結果，O變體在通氣條件下產生的CPS少于在厭氧生長條件下產生的CPS。T型肺炎球菌中較低的CPS產量，即使是在沒有明顯的CpsD的酪氨酸磷酸化的情況下也是這樣，是因為T型肺炎球菌中CpsD表達的增強。
以前業(yè)已披露的改進在厭氧條件下的生長的做法，事實上可能是增強的CPS合成導致較大菌落體積的作用(Modde，1978)。
在能表達表面多糖的很多其他細菌種中存在與Wzc具有更大相似性的CpsD的同系物。所述細菌種的例子包括無乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、約氏不動桿菌。由于莢膜及其大小是毒粒的關鍵決定因素，基于這種類型基因/蛋白的轉錄和翻譯后修飾來調控CPS量的能力，在促進膠囊化的細菌在適應寄居和感染的不同的要求方面的能力方面可能是重要的。
在本文中所引用的所有專利、專利申請和出版物的公開內容，以其全文形式收作本文參考。
盡管業(yè)已結合具體實施方案對本發(fā)明進行了說明，顯而易見的是，本領域其他技術人員在不超出本發(fā)明的實際構思和范圍的前提下，可以提出本發(fā)明的其他實施方案和改變。所附權利要求書包括所有諸如此類的實施方案和等同的變化。
權利要求
1.一種通過在一種生長培養(yǎng)基中維持肺炎球菌，由該肺炎球菌產生莢膜多糖的方法，其改進在于包括保持一種具有亞大氣濃度的氧氣的氣體與所述生長培養(yǎng)基接觸。
2.如權利要求1的改進，其中，所述氣體的氧氣濃度不超過大約16％。
3.如權利要求2的改進，其中，所述氣體的氧氣濃度不超過大約0.1％。
4.如權利要求1的改進，其中，所述肺炎球菌是鏈球菌屬的生物。
5.如權利要求4的改進，其中，所述肺炎球菌是肺炎鏈球菌的生物。
6.如權利要求1的改進，其中，所述肺炎球菌是選自肺炎鏈球菌變體6A、6B、18C和9V的肺炎鏈球菌的變體。
7.一種通過在一種生長培養(yǎng)基中維持肺炎球菌，由該肺炎球菌產生莢膜多糖的方法，其改進在于包括維持一種具有超大氣濃度的二氧化碳的氣體與所述生長培養(yǎng)基接觸。
8.如權利要求7的改進，其中，所述氣體的二氧化碳濃度至少為大約3％。
9.如權利要求8的改進，其中，所述氣體的二氧化碳濃度至少為大約10％。
10.如權利要求7的改進，其中，所述氣體具有亞大氣濃度的氧氣。
11.一種緩解動物體內肺炎球菌感染的方法，該方法包括保持所述動物與一種具有超大氣濃度的氧氣的氣體接觸。
12.如權利要求11的方法，其中，保持所述動物的肺與所述氣體接觸。
13.如權利要求11的方法，其中，所述氣體的氧濃度至少為大約25％。
14.如權利要求13的方法，其中，所述氣體的氧濃度至少為大約50％。
15.如權利要求14的方法，其中，所述氣體基本上是純氧氣。
16.如權利要求11的方法，其中，所述感染選自肺炎、菌血癥、膿毒癥、和腦膜炎。
17.一種制備用于給有發(fā)生肺炎球菌感染的危險的動物服用的免疫原性制劑的方法，該方法包括在其氧氣含量低于在相同溫度下用普通空氣平衡的相同培養(yǎng)基中的氧氣含量的生長培養(yǎng)基中維持肺炎球菌細胞；和從該細胞中分離由該細胞所產生的莢膜多糖，因此，所分離的多糖構成了所述免疫原性制劑。
18.一種通過在一種生長培養(yǎng)基中維持肺炎球菌生產肺炎球菌多糖的方法，其改進在于包括將所述生長培養(yǎng)基的二氧化碳濃度保持在至少等于在相同溫度下用含有5％二氧化碳的氣體平衡的相同生長培養(yǎng)基中二氧化碳的濃度。
19.一種生產肺炎球菌多糖的方法，該方法包括在其氧氣含量低于在相同溫度下用普通空氣平衡的相同培養(yǎng)基中的氧氣含量的生長培養(yǎng)基中維持肺炎球菌細胞。
20.如權利要求19的方法，其中，所述培養(yǎng)基基本上缺乏氧氣。
21.如權利要求19的方法，其中，所述培養(yǎng)基的二氧化碳含量高于在相同溫度下用普通空氣平衡相同培養(yǎng)基中的二氧化碳含量。
22.如權利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)基是由二氧化碳飽和的。
23.如權利要求21的方法，其中，所述培養(yǎng)基含有碳酸鹽或碳酸氫鹽。
24.一種評估測試化合物是否可用于緩解動物體內的肺炎球菌感染的方法，該方法包括比較。在有所述測試化合物的條件下維持的肺炎球菌細胞中CpsD的磷酸化程度，和在沒有所述測試化合物的條件下維持的相同類型細胞中CpsD的磷酸化程度，其中，如果在有所述測試化合物的條件下維持的細胞中的CpsD的磷酸化程度，低于在沒有所述測試化合物的條件下維持的所述細胞中的CpsD的磷酸化程度的話，該測試化合物就可用于緩解所述感染。
25.如權利要求24的方法，其中，所述CpsD的磷酸化程度可以通過測定存在于CpsD上的磷酸化酪氨酸殘基的數量進行評估。
26.如權利要求24的方法，其中，所述CpsD的磷酸化程度可以通過測定具有至少一個磷酸化的酪氨酸殘基的CpsD的比例進行評估。
全文摘要
本發(fā)明涉及調節(jié)諸如肺炎鏈球菌的肺炎球菌中莢膜多糖生產的方法。本發(fā)明還涉及緩解動物體內肺炎球菌感染的方法，以及鑒定能夠在動物體內調節(jié)肺炎球菌感染的制劑。圖(1)包括圖1Ai－Avi和1Bi－1Bvi，它們是表明通過Quellung反應評估的環(huán)境氧氣和二氧化碳濃度對菌落形態(tài)影響的圖像。
文檔編號A61P31/04GK1429276SQ01809654
公開日2003年7月9日 申請日期2001年3月16日 優(yōu)先權日2000年3月16日
發(fā)明者J·N·韋澤 申請人:費城兒童醫(yī)院