專利名稱：視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為醫(yī)藥或試劑在臨床上或研究上有用的、以具有視網(wǎng)膜電位圖(ERG)改善作用的蛋白質(zhì)為有效成分的視網(wǎng)膜機(jī)能改善約。
背景技術(shù)：
視覺是感覺機(jī)能中最重要的，外界信息的80％是通過視覺系統(tǒng)輸入的。因此，視力下降或失明等視機(jī)能障礙可以列為重大身體障礙之一。特別是若考慮在信息化社會中向高齡化推進(jìn)的現(xiàn)狀，則防止視機(jī)能障礙可以說是現(xiàn)在醫(yī)療的重要課題之一。實(shí)際上，最近提倡在引起日常生活障礙的疾病的治療時(shí)提高患者生活質(zhì)量(QOL)的重要性，但在眼科疾病方面，尤其對于包括視機(jī)能的改善和維持在內(nèi)的QOLV(生活質(zhì)量與視覺)的提高來說成為必須要件的、能達(dá)到這一點(diǎn)的治療法的確立，更是當(dāng)務(wù)之急。
重度視力下降或失明可能是由于種種原因引起的，但日本成年人中每年約16000人中途失明，其原因包括糖尿病視網(wǎng)膜癥、綠內(nèi)障、白內(nèi)障、視網(wǎng)膜色素變性癥、高度近視等。作為采用手術(shù)的治療法，對糖尿病視網(wǎng)膜癥可以實(shí)施采用激光器的光凝固術(shù)、玻璃體手術(shù)，對綠內(nèi)障可以實(shí)施小梁切除術(shù)，對白內(nèi)障可以實(shí)施眼內(nèi)透鏡插入術(shù)。對綠內(nèi)障也開發(fā)了能使眼壓降低的各種點(diǎn)眼藥，然而，對這些疾病的藥物療法尚未達(dá)到能十分令人滿意的水平。與伴隨著侵襲的手術(shù)相比，藥物療法有侵襲少、簡便這樣的大優(yōu)點(diǎn)，而且對日益增加的種種眼科疾病的治療的期待很大，因而人們迫切希望采用有用性高的藥劑的藥物療法的開發(fā)。
另一方面，近年來基礎(chǔ)研究和臨床研究的進(jìn)展，也推進(jìn)了眼科疾病中病理學(xué)的闡明。即，已經(jīng)變得清楚的是，視力障礙不僅是狹義的感覺器視網(wǎng)膜上視細(xì)胞的病變，而且與視細(xì)胞的代謝關(guān)系密切的視網(wǎng)膜色素上皮的病變、神經(jīng)纖維的障礙或視網(wǎng)膜的循環(huán)障礙、進(jìn)而脈絡(luò)膜的循環(huán)障礙也會引起視力障礙。
其中，尤其已經(jīng)判明視網(wǎng)膜色素上皮(RPEretinal pigmentepithelial)細(xì)胞在視細(xì)胞維持方面發(fā)揮重要作用。即，RPE細(xì)胞在視網(wǎng)膜最下位層的布魯赫膜上排列成一層，除吸收到達(dá)視網(wǎng)膜的光以防止反射外，還與布魯赫膜一起構(gòu)筑能使視細(xì)胞與脈絡(luò)膜血管板分開的血液-視網(wǎng)膜關(guān)(blood-retinal barrier)，而且還與各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)等，因而具有視細(xì)胞的維持或再生等物理上和生理上重要的機(jī)能。視細(xì)胞受到這些RPE細(xì)胞和繆勒細(xì)胞的保護(hù)。
此外，作為眼組織中重要的神經(jīng)傳遞因子，有谷氨酸、乙酰膽堿、多巴胺等，另一方面，據(jù)報(bào)告，作為與RPE細(xì)胞有關(guān)的、涉及眼內(nèi)恒常性的細(xì)胞因子，有白細(xì)胞介素類、TGFβ(轉(zhuǎn)化生長因子-β)總科、bFGF(基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長因子)、VEGF(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子)等(玉井信，日本眼科學(xué)會雜志，101，889-890，1997)。然而，這些因子能否積極地應(yīng)用于治療，還是未知數(shù)。此外，本發(fā)明者等人已經(jīng)確認(rèn)，以TFPI-2或PP-5為有效成分在視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜癥、黃斑疾病、視網(wǎng)膜剝離等眼科疾病治療中是有效的(特愿平7-203304和WO97-05893)。
已知TFPI-2(Sprecher等人，Proc.Natl.Acad.USA，91，3353-3357，1994)有VIIa凝血因子抑制活性。此外，這是作為T98G神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶抑制劑發(fā)現(xiàn)的，進(jìn)而，據(jù)報(bào)告，這和與血液凝固有關(guān)的PP5(Miyake等人，J.Biochem.，116，939-942，1994)有相同的氨基酸序列。然而，迄今為止尚無報(bào)告指出這些蛋白質(zhì)有視網(wǎng)膜機(jī)能改善活性。
如上所述，會引起重大視機(jī)能下降或失明的眼科疾病預(yù)料今后還會增加，而且尚未確立令人滿意的藥物療法，況且眼組織的細(xì)胞生物學(xué)研究好不容易才剛開始著手進(jìn)行。
如上所述，對于尚無有力藥物療法的眼科疾病來說，可以把能改善視網(wǎng)膜變性的因子作為治療藥的開發(fā)列為課題。在會引起重大視力障礙的眼科疾病中，例如，對綠內(nèi)障首先進(jìn)行能使眼壓降低的手術(shù)或者藥劑的給藥，雖然取得了一定成果，但已經(jīng)清楚的是，下降視力的恢復(fù)是有極限的，或者說對于正常眼壓綠內(nèi)障這樣的疾病不能只采用降低眼壓療法治療。進(jìn)而，在視網(wǎng)膜中心動靜脈的閉塞方面，即使循環(huán)障礙恢復(fù)后視力也不能充分恢復(fù)，或者有發(fā)生繼發(fā)性綠內(nèi)障的問題。
對于如上所述的眼科疾病，全都是視網(wǎng)膜機(jī)能有高度障礙，從而引起視力下降或視野缺損、失明等重大視機(jī)能障礙。顯然，只要有能適用這些疾病的有效藥劑，就會對實(shí)際醫(yī)療做出很大貢獻(xiàn)。本發(fā)明涉及作為醫(yī)藥或試劑在臨床上或研究上有用的、以具有ERG改善作用的蛋白質(zhì)為有效成分的視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥。
發(fā)明公開本發(fā)明是作為醫(yī)藥或試劑在臨尿上或研究上有用的、以具有ERG改善作用的蛋白質(zhì)、尤其組織因子途徑抑制劑-2(TFPI-2)或胎盤蛋白5(PP5)為有效成分的視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥。
附圖簡單說明

圖1顯示TFPI-2對使用SI障礙兔模型的ERGc波改善效果。
發(fā)明實(shí)施的最佳形態(tài)本因子是通過從人體培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中精制分離、或從采用本因子的cDNA并借助于所謂基因重組技術(shù)制作的細(xì)胞的提取液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中精制分離、進(jìn)而從本因子的cDNA以適當(dāng)載體系注入胎兒胚中得到的所謂轉(zhuǎn)基因動物的乳等體液成分中精制分離而得到的。人體培養(yǎng)細(xì)胞是以源于有產(chǎn)生本增殖因子的能力的各種正常組織的細(xì)胞或株化細(xì)胞中任何一種為對象的，但較好是上皮系細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。在利用基因重組技術(shù)制備本因子的情況下，可以采用CHO(中國倉鼠卵巢)細(xì)胞、小鼠C127細(xì)胞等哺乳動物細(xì)胞、蠶、夜盜蛾等昆蟲細(xì)胞，大腸菌、枯草菌、酵母等微生物等。進(jìn)而，在以轉(zhuǎn)基因動物為宿主的情況下，可以采用小鼠、大鼠、倉鼠、兔、山羊、綿羊、豬、牛等。
這樣制備的本因子可以借助于種種色譜法從作為原料的細(xì)胞培養(yǎng)上清液、蟲體提取液、菌提取液、生物體提取液中精制分離。采用的色譜法只要是對本增殖因子有親和性的，任何一種均可，例如，以二氧化硅(硅石)或磷酸鈣為吸附材料的柱、以肝素或色素或疏水基為配體的柱、金屬螯合柱、離子交換柱、凝膠過濾柱等。
此次采用的ERG(視網(wǎng)膜電位圖)已知能反映視網(wǎng)膜中存在的視細(xì)胞的生存所必須的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的機(jī)能，而且已知在引起視網(wǎng)膜變性或視機(jī)能障礙的眼科疾病、具體地說、綠內(nèi)障(原發(fā)性綠內(nèi)障、繼發(fā)性綠內(nèi)障)、視網(wǎng)膜血管閉塞癥(細(xì)動脈硬化癥、視網(wǎng)膜中心動脈閉塞癥、視網(wǎng)膜中心靜脈閉塞癥、視網(wǎng)膜靜脈分枝閉塞癥)等疾病中，當(dāng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的機(jī)能下降即視網(wǎng)膜機(jī)能下降時(shí)，ERG的振幅減少或消失(Brown，K.T.等人，J.Physiol.158，257-280，1961)。對于以上所示伴隨著視網(wǎng)膜變性的疾病來說，尚未發(fā)現(xiàn)顯示出ERG改善即視網(wǎng)膜機(jī)能改善效果的藥物。
本發(fā)明者等人，在如實(shí)施例中所示的藥物誘導(dǎo)視網(wǎng)膜障礙模型中，確認(rèn)了組織因子途徑抑制劑-2(TFPI-2)或胎盤蛋白5(PP5)能恢復(fù)ERG的c波振幅，改善視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的機(jī)能、防止視細(xì)胞障礙。
從以上所述，發(fā)現(xiàn)了本因子即組織因子途徑抑制劑-2(TFPI-2)或胎盤蛋白5(PP5)是作為視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥或作為試劑在臨床上或研究上有用的，對于廣泛引起視網(wǎng)膜變性或視機(jī)能障礙的眼科疾病來說，適合用來作為視機(jī)能改善用治療藥。
本因子可以以其原樣或作為與本身已知的藥理學(xué)上可接受載體、賦形劑等混合的醫(yī)藥組合物經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。
作為經(jīng)口給藥用劑型，具體地說，可以列舉片劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑等。這樣的劑型可以用本身已知的方法制造，而且是含有制劑領(lǐng)域通常使用的載體或賦形劑的。例如，作為片劑用載體、賦形劑，可以列舉乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉、硬脂酸鎂等。
作為非經(jīng)口給藥用劑型，可以列舉諸如軟膏劑、霜?jiǎng)?、注射劑、泥罨劑、涂布劑、栓劑、點(diǎn)眼劑、經(jīng)鼻吸收劑、經(jīng)肺吸收劑、經(jīng)皮吸收劑等，對于眼科局部給藥用途來說，特別好的是注射劑(全身給藥、玻璃體內(nèi)給藥、視網(wǎng)膜下給藥、眼球囊給藥、結(jié)膜下給藥等)、經(jīng)角結(jié)膜劑、點(diǎn)眼劑、眼軟膏等。溶液制劑是用本身已知的方法，例如將本因子溶解于通常用于注射劑的無菌水溶液中、或懸浮于提取液中、進(jìn)而乳化以呈包埋于脂質(zhì)體中的狀態(tài)制備得到的。作為制劑處方，可以將等張化劑(氯化鈉、氯化鉀、硼酸、甘油等)或緩沖劑(硼酸緩中液、磷酸緩中液、乙酸緩沖液等)、增溶劑(表面活性劑、環(huán)糊精類等)、穩(wěn)定劑(檸檬酸、乙二胺四乙酸、亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉等)、粘稠劑(合成高分子、纖維素類、多元醇類等)調(diào)合制作。進(jìn)而，還可以配制成高分子聚合物劑、微球制劑、溶膠、凝膠、軟膏等劑型。
作為固體制劑，可以用本身已知的方法，例如向本因子中添加甘露糖醇、繭蜜糖、山梨糖醇、乳糖、葡萄糖等作為賦形劑，制成冷凍干燥物。進(jìn)而，還可以將其制成粉末使用。作為凝膠化劑，可以用本身已知的方法，例如，將本因子制備成溶解于甘油、聚乙二醇、甲基纖維素、羧甲基纖維素、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等增粘劑或多糖中的狀態(tài)。
即使在任何一種制劑中，也可以添加人血清清蛋白、人免疫球蛋白、α2巨球蛋白、氨基酸等作為穩(wěn)定劑，而且在不損害本因子的生理活性的范圍內(nèi)還可以添加醇、糖醇、離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑等作為分散劑或吸收促進(jìn)劑。此外，必要時(shí)還可以添加微量金屬或有機(jī)酸鹽。
本發(fā)明的視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥的給藥可以以全身給藥或局部給藥方式進(jìn)行，有效給藥量和給藥次數(shù)因給藥劑型、給藥途徑、患者的年齡、體重、治療對象疾病、癥狀或嚴(yán)重程度而異，但通?？梢允浅扇嗣咳?.001～100mg、較好0.01～10mg每日一次或分?jǐn)?shù)次給藥。
實(shí)施例以下顯示實(shí)施例，以期更詳細(xì)地說明本發(fā)明。
實(shí)施例1使用RCS大鼠的藥理試驗(yàn)作為遺傳性視網(wǎng)膜障礙動物，使用已知從出生后25天左右開始發(fā)生視網(wǎng)膜組織變性的RCS大鼠(Ella，G等人，Nature 34783-86，1990)，考察TFPI-2的視網(wǎng)膜障礙保護(hù)效果。TFPI-2是用“以TFPI-2或PP-5為有效成分的視網(wǎng)膜色素變性、視網(wǎng)膜a疾病治療劑的發(fā)明”(特愿平7-203304和WO97-05893)中所示工藝產(chǎn)生的。雄性RCS(皇家外科醫(yī)生學(xué)院)大鼠在氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉下(氯胺酮∶甲苯噻嗪∶生理食鹽水＝10∶1∶1)用30號針向玻璃體內(nèi)給藥。TFPI-2給藥在3周齡和4周齡共進(jìn)行2次。一次給藥容量是10μl，給藥總蛋白量7μg。對照組給藥PBS(磷酸鹽緩沖劑食鹽水)。第5周齡時(shí)摘出眼球，按常法進(jìn)行戊二醛/福爾馬林固定后，制作病理切片。染色用蘇木精-曙紅法進(jìn)行。表1中列出其結(jié)果。〔表1〕TFPI-2對RCS大鼠的視網(wǎng)膜變性抑制效果

PBS給藥組觀察到構(gòu)成視細(xì)胞的外顆粒層減少，和桿體錐體細(xì)胞萎縮空泡化。TFPI-2給藥組抑制了外顆粒層的減少，也抑制了桿體錐體細(xì)胞的萎縮空泡化。另一方面，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，與PBS給藥組比較，尤其未觀察到增殖。這個(gè)結(jié)果表明TFPI-2沒有促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的增殖，而且保護(hù)了視細(xì)胞，因而預(yù)料TFPI-2給藥對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的機(jī)能有改善效果。
實(shí)施例2使用碘酸鈉(以下簡稱SI)障礙兔模型的藥理試驗(yàn)作為代表性藥物誘導(dǎo)視網(wǎng)膜障礙模型，使用SI障礙兔模型(Heike，M.等人，Documenta Ophthalmologica 7515-22，1990)，驗(yàn)證TFPI-2的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞機(jī)能改善效果。對有色兔(Dutchrabbits)經(jīng)靜脈內(nèi)給藥SI 15mg/kg，次日向玻璃體內(nèi)給藥TFPI-2。TFPI-2的一次給藥容量是100μl。給藥總蛋白量79μg。對照組采用同蛋白量的bFGF。然后，測定ERG的c波隨時(shí)間的變化。兔子在暗室中放置1.5小時(shí)以上，適應(yīng)黑暗之后用氯胺酮/甲苯噻嗪(5∶3)麻醉。將兔子俯伏固定，用散瞳藥散瞳之后，安裝接觸眼鏡型電極。借助于連接在電極上的白色LED電極發(fā)光裝置，進(jìn)行1000勒克司5.5秒鐘的光刺激。因刺激而發(fā)生的ERG的c波用直流增幅器增幅，并記錄在記憶示波器上。測定以5分鐘的間隔測定數(shù)次，對波形作加和平均，求出振幅。各時(shí)點(diǎn)的振幅與SI給藥前正常時(shí)的振幅比較，求出c波振幅的恢復(fù)率。據(jù)報(bào)告，視網(wǎng)膜電位圖的c波反映出視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的機(jī)能(Steinbarg，R.H.等人，Nature 227，728-730，1970)。本實(shí)施例的結(jié)果顯示在圖1中。TFPI-2給藥組與bFGF給藥組相比顯示出明顯的c波恢復(fù)效果。SI給藥28日后，bFGF給藥組只恢復(fù)到正常時(shí)的2成，但TFPI-2給藥組恢復(fù)到8成。
從以上實(shí)施例1和2可以看出，TFPI-2明顯地改善視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的機(jī)能，并防止視細(xì)胞的障礙。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明的有ERG(視網(wǎng)膜電位圖)改善作用的蛋白質(zhì)，作為視網(wǎng)膜機(jī)能障礙、具體地說、綠內(nèi)障、視網(wǎng)膜血管閉塞癥等眼科疾病的治療劑是有效的。
權(quán)利要求
1.視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥，包含有視網(wǎng)膜電位圖改善作用的蛋白質(zhì)作為有效成分。
2.權(quán)利要求1記載的視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥，其中，有視網(wǎng)膜電位圖改善作用的蛋白質(zhì)是組織因子途徑抑制劑-2(TFPI-2)。
3.權(quán)利要求1或2記載的視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥，是以綠內(nèi)障或視網(wǎng)膜血管閉塞癥為對象的。
全文摘要
本發(fā)明是以具有ERG(視網(wǎng)膜電位圖)改善作用的蛋白質(zhì)為有效成分的視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥。特別是以組織因子途徑抑制劑－2或胎盤蛋白5為有效成分者，可以在綠內(nèi)障、視網(wǎng)膜血管閉塞癥、視網(wǎng)膜機(jī)能障礙等眼科疾病中用來作為視網(wǎng)膜機(jī)能改善藥。
文檔編號A61K38/57GK1406134SQ01805844
公開日2003年3月26日 申請日期2001年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月29日
發(fā)明者武藤昌圖, 穗積香織, 須藤哲央, 內(nèi)海潤 申請人:東麗株式會社