專利名稱：分子材料透皮或皮內(nèi)輸遞的方法
本申請要求已在2000年2月25日提交的美國臨時申請(申請?zhí)枮?0/184,918)的優(yōu)先權(quán)，在此全文并入本文以供參考。發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明一般涉及分子材料的輸遞系統(tǒng)領(lǐng)域。更具體的說，本發(fā)明提供了一種透皮或皮內(nèi)輸遞分子材料的方法，包括對皮膚應(yīng)用這些分子材料和一種脂質(zhì)體成分，相應(yīng)地同時或相繼在皮膚上進行電穿孔處理。相關(guān)技術(shù)的討論
與其它輸遞方法相比，透皮或皮內(nèi)地藥物輸遞有許多潛在的優(yōu)點。除了方便和無損害性外，它提供了一種可使引入的分子材料避免被腸胃道或肝臟降解或代謝的輸遞途徑。皮膚同時還提供了一個“儲藏庫”，可使引入的分子材料的輸遞保持數(shù)天之久(Cullander，1992，Advanced Drug Delivery Reviews 9119-135)。另外，它提供了多個輸遞位點以避免局部刺激和中毒，同時，它可以在局部富集藥物以避免不適宜的全身性反應(yīng)。
局部使用的藥物有許多用途，包括治療骨關(guān)節(jié)炎、軟組織風濕癥、腱炎、局部發(fā)炎、美容藥膏、以及各種皮膚癌等。同時，皮膚也是疫苗的輸遞部位。然而，在目前的情況下，只有很少的藥物、藥劑、核酸、或其它化學試劑可以藥用相關(guān)速率進行透皮輸遞，所以透皮輸遞的臨床應(yīng)用受到了限制。這是由于對大多數(shù)分子材料而言，皮膚是一層有效的屏障，且?guī)缀踹€沒有發(fā)現(xiàn)什么無損害性的方法可以明顯有助于通過這一層屏障。
哺乳動物的皮膚是由兩層構(gòu)成的，即表皮和真皮。表皮是一種分層的鱗片狀的角質(zhì)化上皮。表皮的最外層叫做角質(zhì)層(SC)，它由大約20層扁平的、無細胞核的、充滿角質(zhì)素的角質(zhì)細胞構(gòu)成，外面包圍著平均約8層脂雙層薄層。該脂雙層主要含有固醇、游離的脂肪酸和神經(jīng)酰胺。SC總的厚度大約在10微米至40微米之間，平均厚度為20微米(Chizmadzhev等，1995；Biophysical Journal，68749-765；Bouwstra等，1995，J.Lipid Res.36685-695；Swartzendruber等，1989，Journal of Investigative Dermatology，92251-257)。角質(zhì)層構(gòu)成了皮膚的主要電阻層，也是和物質(zhì)傳遞的一個主要屏障。皮膚電阻值RS的典型值為5-15kOhm/cm2，電容值CS為1-20nF/cm2(DeNuzzio和Berner，1990，Joural ofControlled Release 11105-112)。皮膚還含有各種附屬物，像毛囊、頂泌汗腺、頂外泌汗腺，在人類還有外泌汗腺，所有的這些都是高度脈管化的。這些附屬物也是與外界進行物質(zhì)交換的途徑(Scott等，1993，Pharmaceutical Research101699-1709)。
目前，大多數(shù)的透皮輸遞都是通過附屬物進行的消極擴散，使用皮膚膏藥、洗劑、霜劑等。有各種不同的途徑可以提高化學藥品的透皮輸遞速率。比方離子電滲法，它采用一個弱而持久的直流電場并通過SC的附屬物或細胞間隙來運輸分子材料。SC的不通透性限制了擴散和離子電滲在長時間(比如說幾十分鐘到幾天)運輸小分子材料(比如小于400道爾頓)方面的運用。
另外一種透皮輸遞分子材料的途徑是通過使用單一或復合的短時持續(xù)脈沖(比如幾微秒或幾毫秒)使膜或皮膚暫時通透。這會穿過非導電性的原生質(zhì)膜建立一個穿過細胞的占優(yōu)勢的電壓梯度，同樣的，通過非導電性的SC建立穿過皮膚的電壓梯度。如果電壓梯度超過了屏障擊穿電位，就會形成孔洞，根據(jù)所使用的脈沖電場和持續(xù)時間孔洞會重新封閉。在孔洞形成時，物質(zhì)就可以穿過這一屏障進行輸遞。這一過程通常被稱為電穿孔。另外一種透皮輸遞方法是通過脂質(zhì)體進行的。脂質(zhì)體已經(jīng)被用于局部的透皮給藥以產(chǎn)生不同的藥效，但其機理仍然有爭議。有報道說，當用在組織培養(yǎng)的小鼠皮膚表面時，中性的脂質(zhì)體會聚集在毛囊通道中(Li等，1992，In Vitro Cell Dev.Biol.28A679-681；Li等，1993，In Vitro Cell Dev.Biol.29A258-260)。只含有磷脂酰膽堿，或含有磷脂酰膽堿、磷脂酯酰乙醇胺和膽固醇的混合物的各種脂質(zhì)體已被用來輸遞含有l(wèi)acZ報告基因的質(zhì)粒，以轉(zhuǎn)染毛囊的上皮組織(Li等，1995，Nature Medicine I(7)705-706)。Alexander等人(1995，Human Molecular Genetics 4(12)2279-2285)曾報道在小鼠的皮膚表面使用與pIRV-neo-K5質(zhì)粒結(jié)合的含有陽離子脂類二油酰-三甲胺丙烷(DOTAP)的脂質(zhì)體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)包括毛囊間的上皮和毛囊在內(nèi)的皮膚成纖維細胞有廣泛的轉(zhuǎn)染。在聯(lián)用合適的電場時，Vutla等人(1996，Journal of Pharmaceutical Sciences85(1)5-8)用Franz室測量了被荷電的和中性的脂質(zhì)體包裹的腦啡肽穿過植入的人體皮膚的“離子電滲”運輸。他們發(fā)現(xiàn)使用帶電脂質(zhì)體并不能提高離子電滲輸遞，但是卻能幫助藥物抵制降解作用而保持穩(wěn)定。Hofmann等人(1995，Bioelectrochemistry & Bioenergetics 38209-222)，Zhang等人(1996，Biochemical and Biophysical Research Communication 220633-636)和美國專利第5,464,386號、5,688,233號、5,462,520號都建議使用一個或更多的電脈沖來輸遞被囊泡或微球體包裹的或是與粒子混合的大分子材料通過SC。在這里將美國專利第5,464,386號、5,688,233號、5,462,520號全文并入，以供參考。
在美國5,318,514、5,968,066、6,009,345、6,132,419各專利號和WO 00/09205、WO 00/02621、WO 00/02620等資料中也有對物質(zhì)(包括藥物，化學物質(zhì)以及核酸)經(jīng)電穿孔進入或通過SC和皮膚的描述，所有的這些都屬于Genetronics公司，這里列出了所有這些專利的全文以供參考。
除了已經(jīng)作出的改進以外，現(xiàn)在正需要發(fā)展各種能提高所需分子材料透皮輸遞的方法。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了一種分子材料透皮或皮內(nèi)輸遞的方法。這種方法包括使用各種分子材料和一種含有帶負電荷脂質(zhì)體成分的脂類組合物并同時或相繼使用電脈沖。這類脂質(zhì)體成分被用來提高分子材料輸遞靶位點的通透性。通過電穿孔法，本發(fā)明可使分子材料的運輸變得比較容易，這些分子材料包括目前較難輸遞的大型中性分子材料。在本發(fā)明的一個實施方案中，這種脂質(zhì)體成分包括磷脂類，其中包括(但不局限于)二油酰磷脂酰甘油(DOPG)和二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)。這些脂類組合物可以(但不一定)形成脂質(zhì)體或其它結(jié)構(gòu)以提供更高的效率。另外，與常規(guī)實踐相反，在這一發(fā)明中，被輸遞的分子材料沒有被任何此類結(jié)構(gòu)包裹。
這項發(fā)明的一個實施方案是一種能加快分子材料輸遞至/或通過個體皮膚上的輸遞位點的方法，這一方法包括以下幾個步驟
(a)同時或相繼使用被輸遞至皮膚上輸遞位點的分子材料與含有負電荷脂類的脂質(zhì)體成分，其中被輸遞的分子材料不需要被脂質(zhì)體成分包裹；
(b)在皮膚上的輸遞位點與(a)項中的分子材料和脂質(zhì)體組合物分別同時或相繼使用至少一次的電脈沖，其中電脈沖要有足夠的持續(xù)時間和電壓，以產(chǎn)生電穿孔并能輸遞分子材料進入或穿過皮膚，同時，當脂質(zhì)體成分存在時被輸遞的分子材料的數(shù)量要比脂質(zhì)體成分不存在時多。
在上述實施方案的一個變化中，被輸遞的分子材料沒有被脂質(zhì)體成分包裹。
這項發(fā)明的另一個實施方案是一種能加快分子材料輸遞至/或通過皮膚上的輸遞位點的方法，這一方法包括以下幾個步驟
(a)同時或相繼使用被輸遞至皮膚上輸遞位點的分子材料與含有負電荷磷脂類的脂質(zhì)體成分，其中被輸遞的分子材料不需要被脂質(zhì)體成分包裹；
(b)在皮膚上的輸遞位點與(a)項中的分子材料和脂質(zhì)體成分分別同時或相繼使用1至300次電脈沖，其中電脈沖的持續(xù)時間約為10微秒至200毫秒，脈沖電壓約為80至200V，以產(chǎn)生電穿孔并能輸遞分子材料進入或穿過皮膚，同時，當脂質(zhì)體成分存在時被輸遞的分子材料的數(shù)量較脂質(zhì)體成分不存在時要多。
在上述實施方案的一個變化中，被輸遞的分子材料沒有被脂質(zhì)體成分包裹。
本發(fā)明的另一個方法是一種提高皮膚SC層通透性的方法，包括與含有負電荷脂類的脂質(zhì)體成分一起對皮膚的SC層同時或相繼使用至少一次的電脈沖，其中脂質(zhì)體成分沒有包裹將被輸遞至SC層的分子材料，其中SC層的通透性是通過孔洞的存在時間來確定的，脂質(zhì)體成分存在時其通透性要高于沒有脂質(zhì)體成分時。附圖簡介


圖1顯示了在使用DOPG∶DOPC脂質(zhì)體成分時，亞甲基藍(MB)通過新鮮剝離的豬角質(zhì)層時相對運輸量的提高。圖中顯示了在施加10、20、30分鐘負脈沖以及10分鐘沒有脈沖以后MB的相對運輸量，其中，(■)表示DOPG∶DOPC脂質(zhì)體成分存在而(●)表示DOPG∶DOPC脂質(zhì)體成分不存在。
圖2顯示了DOPG∶DOPC MLV對MB通過豬的SC層的作用，圖中的電穿孔法分別使用了10，20和30分鐘負脈沖以及10分鐘沒有脈沖。圖中的數(shù)據(jù)分別是在脂質(zhì)類存在(■)與不存在(●)時得到的值。
圖3顯示了用電穿孔法(負脈沖)在DOPG∶DOPC脂質(zhì)體成分存在(■)與不存在(●)時原卟啉IX(PP-IX)通過豬SC層時的相對運輸量。PP-IX的運輸量是在10、20和30分鐘脈沖后測得的。最后的一個值是在脈沖結(jié)束10分鐘以后測得的。
圖4顯示了使用電穿孔法用(■)和不用(●)DOPG∶DOPC MLVs處理時甲基化PP-IX(MPP-IX)的相對運輸量。加在豬SC層上的脈沖時間總共為30分鐘，最后的一個值是在脈沖結(jié)束10分鐘以后測得的。
圖5顯示了當不同分子量的FITC-葡聚糖通過豬SC層的運輸量，圖中空心柱與實心柱分別表示在電穿孔時使用與不使用脂質(zhì)類。
圖6顯示了中性葡聚糖Texas-Red葡聚糖(3kDa)和羅丹明-葡聚糖(10kDa、40kDa、和70kDa)通過豬SC層的運輸量，空心柱與實心柱分別表示在電穿孔時添加與不添加脂質(zhì)類。
圖7顯示了在添加(●)和不添加(■)脂類制劑時SC層的初始電阻隨負脈沖數(shù)量增加的變化曲線。
圖8顯示了在添加(●)和不添加(■)脂類制劑時，施加180次150V脈沖后SC層阻力的恢復百分值。
圖9顯示了在不添加脂質(zhì)類時，分別加60次的80V(◆)、104V(□)、116V(△)、160V(×)、188V(▲)和300V(●)脈沖后SC層電阻的恢復百分值。
圖10顯示了在添加脂質(zhì)類時，分別加60次的80V(◆)、120V(□)、128V(△)、156V(×)、188V(▲)和308V(●)脈沖后SC層電阻的恢復百分值。發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了一種分子材料透皮或皮內(nèi)輸遞的方法。這個方法包括在皮膚與分子材料和脂質(zhì)體成分接觸的區(qū)域在使用分子材料和脂類成分時同時或相繼使用電脈沖。這種脂質(zhì)體成分含有帶負電荷的脂質(zhì)類，優(yōu)選磷脂類。在一個優(yōu)選的實施方案中，磷脂類是DOPG和DOPC，比例為1∶1。
脂質(zhì)類成分不必形成脂質(zhì)體或其它的結(jié)構(gòu)以提高效率。在一個優(yōu)選的實施方案中，被輸遞的分子材料不需要被任何此類結(jié)構(gòu)包裹。相反，脂質(zhì)體成分無論是否形成固定結(jié)構(gòu)都可用來提高分子材料輸遞靶位點的通透性。所謂的“不形成包裹”是指分子材料不必被脂質(zhì)體成分包裹。如果少于10％的脂質(zhì)體成分含有分子材料，由于在混合或其它處理時不可避免的包裹作用，對本發(fā)明而言它仍舊是“不形成包裹”的。
這一發(fā)現(xiàn)(指脂質(zhì)體成分能提高效率與脂質(zhì)體運送分子材料的能力是分開的)與一般的想法是不同的，一般認為包裹著分子材料的脂質(zhì)體被完整地運輸進皮膚并在靶細胞或組織處釋放該分子材料。不必拘泥于任何具體的理論，它顯示出脂質(zhì)類成分可以延長電穿孔時形成的孔洞的壽命，并且正是這個原因使它們可以在電穿孔后提高分子材料的總運輸量。當孔洞保持開發(fā)的時間較長時不僅可以使更多的分子材料通過SC，而且較長的孔洞壽命也提高了那些較難輸遞的分子材料穿過SC的能力。較長的孔洞壽命還可以降低產(chǎn)生電穿孔及輸遞所需的電脈沖的總數(shù)量。
用本發(fā)明的方法輸遞中性分子材料得到的提高值通常較高，而中性分子材料一般是較難電穿孔的。若使用的電脈沖極性正確(與分子材料的性質(zhì)有關(guān))，本發(fā)明還有助于帶電分子材料輸遞至/或穿過SC。所以，本發(fā)明有助于通過電穿孔法輸遞分子材料，這些分子材料包括(但不局限于)那些以往比較難以輸遞的大型中性分子材料。
本方法包括在使用分子材料和一種含有帶負電荷脂質(zhì)體成分的脂類組合物時同時或相繼使用電脈沖，對每一種成分都可以同時或相繼使用。在一個實施方案中，這種被輸遞的分子材料可以僅與脂質(zhì)體成分相混合。這樣可以節(jié)省時間和開支。
在皮膚上的輸遞位點使用的分子材料、脂質(zhì)體成分和至少一次的電脈沖選自下表的輸遞模式
*數(shù)字1、2、3、4、5代表在連續(xù)事件中第一、二、三、四、五的順序。如果每一格中的數(shù)字相同(比如(o)格)就表示各事件同時進行。如果每一格中的數(shù)字不同(比如(c)、(d)格)就表示各事件相繼進行。如果一格中出現(xiàn)了多個數(shù)字，則該事件就要多次進行，“na”表示該事件不適用。
上述表格說明可以使用多種不同的模式進行輸遞。表中缺少的輸遞模式不能解釋為超越了本發(fā)明的范圍。本發(fā)明期望能以任何組合方式同時或相繼使用分子材料、脂質(zhì)體成分和電荷來進行電穿孔技術(shù)介導的輸遞。
通過實施例，下面對前表中的幾種輸遞模式進行了相應(yīng)的文字描述
(a)先對皮膚使用分子材料，再對皮膚使用脂質(zhì)體成分，最后對皮膚使用至少一次電脈沖；
(b)先對皮膚使用分子材料，接著對皮膚使用至少一次電脈沖，再對皮膚使用脂質(zhì)體成分，最后再對皮膚使用至少一次電脈沖；
(k)將脂質(zhì)體成分與分子材料混合并對皮膚使用該混合物，接著再對皮膚使用至少一次電脈沖；
這個方法包括在電穿孔過程中使用電脈沖。電穿孔技術(shù)被認為可在SC層上形成孔洞，這樣，所需的分子材料便可以經(jīng)皮內(nèi)輸遞通過孔洞或到達皮膚下層的組織中。本發(fā)明中，電穿孔技術(shù)和皮膚接觸脂質(zhì)體成分相結(jié)合可以提高分子材料穿過皮膚的輸遞能力。提高輸遞能力是指，電穿孔技術(shù)和皮膚接觸脂質(zhì)體成分相結(jié)合將使輸遞至/或通過皮膚的分子材料的數(shù)量比沒有脂質(zhì)體成分時要多。電脈沖、分子材料以及脂質(zhì)體成分可以同時或相繼使用。對電穿孔而言，負極脈沖可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何專用的標準設(shè)備產(chǎn)生。通常，可在一個選定的皮膚區(qū)域至少使用一個正電極和一個負電極?？赡艿脑?，皮膚可以被削薄或去除毛發(fā)。
在本發(fā)明中優(yōu)選使用的表面電極有(但不局限于)彎曲電極(meanderelectrodes)、微型插接電極(micropatch electrodes)、卡規(guī)(caliper)或其它小型板狀電極(plate electrodes)。優(yōu)選使用的侵入式電極(invasive electrode)有微針體陣列(microneedle arrays)。當使用侵入式電極(invasive electrode)時，應(yīng)盡可能減小損傷。
對本發(fā)明有效的脂質(zhì)體成分含有帶負電的脂質(zhì)類。適用的例子有二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、磷脂酰絲氨酸和二磷脂酰甘油(心磷脂)。此外，各種游離脂肪酸因帶有負電荷也可以使用。帶有負電荷的脂質(zhì)類可以單獨使用也可以與其它帶有負電荷或中性的脂質(zhì)類結(jié)合使用。對發(fā)明有效的中性脂質(zhì)類的例子是二油酰磷脂酰膽堿(DOPC)。脂質(zhì)體的制備工藝已是本領(lǐng)域眾所周知的。其中一種脂質(zhì)體的制備步驟如下將溶于三氯甲烷的脂質(zhì)類溶液按所需比例混合。再在惰性氣體流(如氮氣)中將溶液干燥。將干燥后的脂質(zhì)類置于真空中以除去殘留的溶劑。在干的脂質(zhì)類中加入一定量的緩沖液。通過漩渦處理、超聲裂解或微孔濾膜抽濾可以使脂質(zhì)類分散在緩沖液中。當含有脂類化合物的脂質(zhì)體成分形成MLV時，就可以接著用例1中的步驟來制備脂質(zhì)體成分了。
值得注意的是，對本發(fā)明而言，并不需要分子材料被脂質(zhì)體包裹，甚至也不需要形成這種脂質(zhì)體或其它結(jié)構(gòu)。當然，在這里明確一下，當脂質(zhì)體成分存在時施加電脈沖可以提高SC的通透性，無論分子材料以何種方式輸遞都是與脂質(zhì)體成分有關(guān)的。
為了規(guī)范以及要求權(quán)利，我們在此使用的“脂質(zhì)體成分”，“脂類成分”，“脂質(zhì)體組分”或“脂質(zhì)體”等術(shù)語，是指一種含帶有負電荷脂質(zhì)類的組合物，無論是形成脂質(zhì)體、粒子、囊泡、微球體、單層或多層的脂質(zhì)囊泡還是不形成這些結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中使用的脂質(zhì)體成分不需要包裹被輸遞的分子材料。在一個優(yōu)選的實施方案中，這種脂質(zhì)體成分就不包裹被輸遞的分子材料。
“分子材料”、“藥物”、“被輸遞的分子材料”、“藥劑”、“所需的分子材料”等術(shù)語和類似的術(shù)語是指藥物(如，化學治療藥劑)、核酸(如，多核苷酸)、肽和多肽(包括抗體，免疫調(diào)節(jié)劑和其它的生物反應(yīng)修飾劑)。被輸遞的藥劑可以為使用這種處理方案的個體提供治療性、預防性、美容性、基因治療或其它預期的療效。
這里使用的“抗體”這一術(shù)語包括完整的分子材料，也包括其中的片段，如Fab和F(ab′).sub.2。多核苷酸包括DNA、cDNA以及RNA序列，也包括天然或人工的反義核酸?！吧锓磻?yīng)修飾劑”包括能參與改變免疫反應(yīng)的物質(zhì)。免疫應(yīng)答修飾劑的例子包括各種淋巴因子等化合物。淋巴因子包括腫瘤壞死因子，白細胞介素l、2、3，淋巴毒素，巨噬細胞活化因子，移動抑制因子，集落刺激因子和干擾素-α，干擾素-β，干擾素-γ以及它們的亞型。此外，“膜激活”類藥劑也可包含在“被輸遞的分子材料”和類似的術(shù)語的定義中。這些藥劑也可以是那些主要起著破壞細胞膜作用的物質(zhì)。膜激活藥劑的例子有N-烷基三聚氰胺和對氯苯甲酸汞。
“同時(concurrently)”一詞是指兩件事情在同一時間發(fā)生?！跋嗬^(sequentially)”是指兩件事情先后發(fā)生，而不論這兩件事情之間的時間間隔是長是短。
被輸遞的藥劑或分子材料的化學成分將決定藥劑施用的最佳時間，這也與電脈沖的施用有關(guān)。例如(我們并不希望拘泥于具體理論)，據(jù)信，對等電點較低的藥物(如新制癌菌素，IEP＝3.78)實施后電穿孔(post-electroporation)將更有效，這樣可以避免這一區(qū)域內(nèi)的高電荷藥物發(fā)生靜電反應(yīng)。另外，如博萊霉素這類藥物，有很大的logP值(P是指在辛醇和水之間的分配系數(shù))和很大的尺寸(MW＝1400)，且具有親水性，它在腫瘤細胞中擴散很慢，通常是先于電脈沖或和電脈沖幾乎同時施用。此外，有些藥劑通常需要被修飾，以便更有效的進入細胞。例如，紫杉酚這種藥劑被修飾后在水中的溶解度會增加，從而能使它更有效的進入細胞。
對于本發(fā)明的方法而言，可以在皮膚上的選定區(qū)域同時或相繼使用分子材料、一種脂質(zhì)體成分和電脈沖。皮膚上的輸遞位點可以是適合個體的任何區(qū)域，即分子材料被輸遞且在輸遞后能被有效找到。手臂、腿、頸部或其它區(qū)域都是合適的輸遞位點。在同時使用時，需要用一個有貯液槽的電極。用在本發(fā)明中的優(yōu)選的表面電極包括(但不局限于)彎曲電極(meander electrodes)、微型插接電極(micropatchelectrodes)、卡規(guī)(caliper)或其它小型板狀電極(plate electrodes)。優(yōu)選的侵入式電極(invasive electrode)有微針體陣列(microneedle arrays)。當使用侵入式電極(invasive electrode)時，應(yīng)盡可能減小損傷。電極的直徑可以在0.1至10毫米或更大。比較合適的電極有Ag/AgCl皮膚電極，市場上有這類電極供應(yīng)(IVM公司，Healdsburg，CA)
含有分子材料的脂質(zhì)體成分被加在負電極的貯液槽中。正負電極被分別安置在皮膚上選定的區(qū)域中并隔開一定的距離。一個標準脈沖發(fā)生器(如AVTECH的AVR-G1-C-RPCIB1型或BTX的ECM 830型方波脈沖發(fā)生器)被用來在電極之間產(chǎn)生電勢。建議加在電極下每一個皮膚通道上的電壓降為60-80V。脈沖時間可以是10微秒到200毫秒。優(yōu)選的脈沖時間為1毫秒。可以使用一次或更多次的脈沖。合適的范圍是用1-180次頻率為1Hz的脈沖。每次脈沖優(yōu)選的電場強度約為0.05-5kV/cm。
為確定個別分子材料的通量和輸遞參數(shù)，可以在分離的SC層上采用本發(fā)明的方法。此外，也可以在血液中檢測該分子材料的含量以便對參數(shù)進行標準化處理。
本發(fā)明可以用以下的實施例來闡明，列舉這些實施例的意圖只是進行論述而不是對本發(fā)明進行限制。
實施例1
這一實施方案證明可使用本發(fā)明的方法輸遞帶電荷與不帶電荷分子材料。在分離的SC上研究了三種分子材料的輸遞情況，這三種分子材料是亞甲基藍(MB；分子量為374Da)，原卟啉IX(PP-IX；分子量為563Da)和甲基原卟啉IX(MPP-IX；分子量為593Da)。
角質(zhì)層是用以下的熱處理法從豬皮中獲得的。將新鮮的豬皮用鋁箔包裹并在60℃的水浴中放置5分鐘。這樣就可將SC從其它組織中輕輕剝離。SC可以直接使用，也可置于顯微鏡玻璃載玻片中于4℃保存。再將SC置于Hanson垂直擴散室(Hanson Vertical Diffusion chamber)中，這種簡單的設(shè)備對那些熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是研究透皮輸遞的模式系統(tǒng)。這套裝置包括兩個充滿合適緩沖液(10mM Tris，100mM NaCl，1mM EDTA，pH＝8.0)的小室。其中的一個作為供體另一個作為受體。脂質(zhì)體和受試分子材料被加到供體室中。皮膚的最外層，SC是生物分子材料輸遞的一層有效的屏障。上室被當做皮膚的外表面而下室被看成是緊貼著SC的皮膚。將鉑絲作為電極，一個放在上室，另一個放在下室。通過脈沖發(fā)生器可以在SC上通過電脈沖。
脂質(zhì)類制劑可以通過以下方法制備。將二油酰磷脂酰甘油和二油酰磷脂酰膽堿以約1∶1的克分子比例混合，并通過強漩渦處理使其分散在緩沖液中，這樣可以得到多層脂質(zhì)囊(MLV)。受檢分子材料的分子量分布在200-600之間。樣品分子材料是根據(jù)它們的電荷以及各自的溶解度來選定的。MB帶有正電荷且是水溶性的。PP-IX有兩個羧酸基團，在pH8時帶有負電荷。PP-IX的溶解度很低。MPP-IX不帶電荷且僅在去污劑存在時才可溶。
脂質(zhì)類制劑被置于上室中并施加10分鐘的負脈沖(375V，脈沖持續(xù)時間為1毫秒，脈沖重復頻率為1Hz)。然后將溶于緩沖液中的樣品分子材料加到上室中，再繼以10分鐘不加脈沖。從下室(受體室)取出一份緩沖液。然后再加10、20和30分鐘的脈沖，并在第10、20、30分鐘的時候從下室分別取出同樣量的緩沖液進行分析，以測定樣品分子材料的輸遞量。脈沖結(jié)束后10分鐘再從下室取出一份緩沖液。在對照試驗中，在僅有緩沖液(沒有脂質(zhì)類)時先對SC加10分鐘脈沖，再將樣品分子材料加到上室中，并加上三次脈沖，每次均為10分鐘。
用熒光光譜學的方法測量不同時間的取出液，可以得到輸遞至受體室的樣品分子材料的數(shù)量。MB，PP-IX和MPP-IX都是熒光物質(zhì)，這種方法要求被測量的樣品分子材料濃度較低。圖1顯示了電穿孔處理后MB通過經(jīng)脂質(zhì)類制劑預處理或沒有預處理的豬SC的時間過程。在沒有脂質(zhì)類制劑時，即便在加了30分鐘的脈沖后受體室中的MB依然很少。當用脂質(zhì)類制劑預處理SC以后，有大量的MB被運輸通過SC。即使在電脈沖停止以后下室中MB的濃度仍舊會持續(xù)增加，這說明有MB通過SC擴散。由于MB帶有正電荷而使用的脈沖是負極性的，所以不會有MB通過電泳作用穿過SC。這說明MB是經(jīng)SC上因脈沖產(chǎn)生的孔洞擴散的。這種擴散很可能發(fā)生在兩次連續(xù)的脈沖之間。
當使用的脈沖極性為正時，所得結(jié)果與使用負脈沖時恰好相反(圖2)。在適合MB電泳的條件下，脂質(zhì)類制劑的存在可抑制MB的輸送(■)，其數(shù)據(jù)近似于脂質(zhì)類制劑不存在時的結(jié)果(●)。
當使用帶有負電荷的PP-IX模式分子材料時，其結(jié)果(圖3)顯示當脂質(zhì)類制劑不存在時，PP-IX穿過SC的輸送十分明顯。而在添加脂質(zhì)類制劑后其輸送量仍有增加。這是由于PP-IX所帶電荷使其在施加脈沖時可以發(fā)生電泳，這種在脂質(zhì)類制劑存在時獲得的增量很可能來自于兩次脈沖之間發(fā)生的擴散。以至30分鐘后看到的飽和現(xiàn)象是一種假象，因為在30分鐘的脈沖處理時間內(nèi)上室中的溶液已經(jīng)空了。
當用脂質(zhì)類制劑預處理SC時，MPP-IX樣品(即PP-IX的不帶電荷的類似物)的輸送量有所增加，若僅用緩沖液(不含脂質(zhì)類制劑)預處理SC，所得結(jié)果就要低的多(圖4)。這是由于不帶電荷的MPP-IX不能進行電泳，所觀察到的MPP-IX的輸送很可能是經(jīng)SC上因電脈沖產(chǎn)生的孔洞而擴散的。所以當用脂質(zhì)類制劑處理SC后，MPP-IX通過孔洞的擴散量較高。
用含有中性或正電荷脂質(zhì)類的脂質(zhì)體作類似的試驗，當脂質(zhì)體存在時，通過SC的輸遞量沒有增加。
這些數(shù)據(jù)說明，先用脂質(zhì)類制劑預處理SC再添加樣品分子材料可以使分子材料的輸送量有明顯的增加。在所有受檢的樣品分子材料中都可以看到這種增加，而不論樣品分子材料的帶電性及水溶性如何。當用脂質(zhì)類制劑處理SC后所見到的輸送量增加的原因可能來自以下幾個方面(1)電穿孔數(shù)量的增加；(2)產(chǎn)生了較大的孔洞；(3)孔洞的開放時間延長。不必局限于任何具體的理論，這種脂質(zhì)類誘導性增量(lipid-induced enhancement)的機制可能是帶有負電荷的脂質(zhì)類與SC的脂質(zhì)薄層區(qū)域相結(jié)合。這種脂質(zhì)類的結(jié)合很可能會增加SC脂質(zhì)類的流動性。
實施例2
這一實施方案證明了脂質(zhì)類制劑在輸送帶及不帶電荷的不同分子量的葡聚糖方面的作用。為說明這一實施方案，我們用例1中所用的Hanson垂直擴散室(HansonVertical Diffusion chamber)來測量分子量分別為3,900、9,000和154,200的FITC-葡聚糖的輸送情況。脂質(zhì)類制劑(DOPG∶DOPC 1∶1，10mg/ml)和一定量不同分子量的FITC-葡聚糖一起被加到上室中。對上室(供體室)加1ms的負脈沖，下面的受體室接地即可。加脈沖后15分鐘內(nèi)兩室保持不受干擾，再用注射器從下室(受體室)中取出含有通過SC的葡聚糖的緩沖液，將全部緩沖液用真空離心濃縮機濃縮至3ml，再測量其熒光強度以便得知緩沖液中FITC-葡聚糖的量。將測得的熒光強度與用已知量的FITC-葡聚糖在相同的熒光分光裝置下測得的值相比較。再根據(jù)SC的截面積就可計算出FITC-葡聚糖的總流通量。如圖5和圖6中所示，只有一種葡聚糖(即分子量為3,900的那種)在電穿孔后添加脂質(zhì)類的情況下能明顯地透過豬SC。對于大型葡聚糖(MW＞9,000)，在該試驗條件下沒有觀察到明顯的可重現(xiàn)的輸送。
實施例3
這一實施方案證明，脂質(zhì)類制劑的存在能影響皮膚SC層上因電穿孔而產(chǎn)生的孔洞的壽命。為闡明這一實施方案，通過測量電脈沖后SC的電阻恢復情況可以確定孔洞的壽命?？梢允褂美?中的Hanson垂直擴散室(Hanson Vertical Diffusionchamber)來進行測量?？梢杂玫蛪褐绷髅}沖測量SC的電阻。首先，在脂質(zhì)類制劑(DOPG∶DOPC 1∶1)存在與不存在兩種情況下加1至180次150V的脈沖，然后測量SC的電阻。結(jié)果顯示在圖7中。在最先的幾次脈沖之后，SC的電阻下降得最快。隨后的脈沖只使電阻另有一點降低。在脂質(zhì)類存在時SC電阻的下降值比沒有脂質(zhì)類時要大。施加180次脈沖后的30分鐘內(nèi)沒有再加任何脈沖，以便測量SC的電阻的恢復率(圖8)。無論是否添加脂質(zhì)類SC的電阻都有所恢復。然而，脂質(zhì)類存在時的電阻恢復較沒有脂質(zhì)類時要少。即沒有脂質(zhì)類時SC恢復較快。
還測定了在脂質(zhì)類存在與不存在時，脈沖電壓對脈沖處理后SC恢復的作用。我們在豬SC上總共加了60次1毫秒，頻率為1Hz的脈沖，并于脈沖處理前后測量SC的電阻。脈沖處理停止后用20分鐘讓電阻恢復。圖9和圖10顯示了脂質(zhì)類存在與不存在時的結(jié)果。不添加脂質(zhì)類時，若脈沖電壓小于200V則SC的電阻可以完全恢復。當電壓超過200V時無法測出SC電阻的恢復，這說明SC的結(jié)構(gòu)有嚴重破壞。當在SC中添加脂質(zhì)類制劑后，脈沖電壓最大為80V時SC的電阻可以完全恢復。當電壓超過80V并低于200V時在測量時間內(nèi)SC的電阻能部分恢復。當脈沖電壓為200V或更高時，SC的電阻無法恢復。
這些結(jié)果說明，只有在少數(shù)幾個脈沖之后SC是明顯可透的。恢復時間決定于所使用的脈沖電壓和脈沖次數(shù)。脂質(zhì)類制劑的使用可以分別減少使SC可透所需的脈沖數(shù)目并延長恢復時間。
實施例4
這一實施方案描述了本發(fā)明方法在現(xiàn)場中應(yīng)用的方法。將被輸遞的分子材料與含有(比如)DOPG∶DOPC(1∶1，10mg/ml)的脂質(zhì)體成分在普通的緩沖液中混合。加到脂質(zhì)體成分中的分子材料的數(shù)量將由被輸遞分子材料的所需濃度所決定。分子材料/脂質(zhì)類混合物被加到(比如)有表面型電極(surface-type electrodes)的板狀電極裝置(electrical patch electrode device)的貯液槽中。制備人體材料，將合適的皮膚位置(如手臂)上的毛發(fā)除去。將片狀電極(patch electrode)置于輸遞位點并將分子材料/脂質(zhì)類混合物放在該皮膚上。用單一的或多個周期的電穿孔處理(約1-300個脈沖)，電壓約為50-100V，頻率為1Hz，脈沖時間1-20毫秒。在脈沖周期之間或每一周期的各個脈沖之間可以形成被動擴散作用，分子材料就被輸遞。
這里列出的數(shù)據(jù)可以證明用本發(fā)明的方法可以提高分子材料的透皮輸遞。前面所描述的具體的實施方案只是為了證明而不是限定。從本發(fā)明的教導中，那些熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該承認，本發(fā)明中所使用的裝置以及提到的特定條件，在不背離該發(fā)明精神的條件下是可以修改的。
權(quán)利要求
1.一種提高分子材料輸遞至/穿過個體皮膚上輸遞位點的方法，它包括以下步驟
(a)同時或相繼使用被輸遞至皮膚上輸遞位點的分子材料與含有負電荷脂質(zhì)類的脂質(zhì)體成分；
(b)在皮膚上的輸遞位點與(a)項中的分子材料和脂質(zhì)體組合物分別同時或相繼至少使用一次的電脈沖，其中電脈沖要有足夠的持續(xù)時間和電壓，以產(chǎn)生電穿孔并能輸遞分子材料進入或穿過皮膚，同時，當脂質(zhì)體成分存在時被輸遞的分子材料的數(shù)量要比脂質(zhì)體成分不存在時多。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中被輸遞的分子材料沒有被脂質(zhì)體成分包裹。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中帶有負電荷的脂質(zhì)類是磷脂類。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中磷脂類選自DOPC與DOPG。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中DOPG與DOPC的比例為1∶1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中至少使用一次的電脈沖的持續(xù)時間約為10微秒至200毫秒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中電脈沖的持續(xù)時間為1毫秒。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每一個脈沖的電場強度約為0.05至5kV/cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中電脈沖的電壓約為80至200V。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中電脈沖的數(shù)目約為1至300。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中分子材料選自藥物、核酸、肽、多肽、抗體、免疫調(diào)節(jié)劑以及生物反應(yīng)修飾劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中被輸遞的有效的分子材料選自治療劑、預防劑、化妝品、基因治療劑和預防用藥。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中被輸遞的有效的分子材料選自治療劑、預防劑、化妝品、基因治療劑和預防用藥。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在皮膚上的輸遞位點使用的分子材料、脂質(zhì)體成分和至少一次的電脈沖選自下表(a)至(p)的一系列輸遞模式
表中，(i)數(shù)字1、2、3、4、5表示相繼事件中第一、二、三、四、五的順序，(ii)每一格中出現(xiàn)的數(shù)字相同就表示各事件同時進行，(iii)每一格中出現(xiàn)的數(shù)字不同就表示各事件相繼進行，(iv)在一種輸遞模式中一個事件可以多次發(fā)生，(v)“na”表示該事件不適用。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一次的電脈沖通過表面電極輸遞。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中表面電極選自彎曲電極(meanderelectrodes)、微型插接電極(micropatch electrodes)、卡規(guī)(caliper)或其它小型板狀電極(plate electrodes)。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中至少一次的電脈沖通過侵入式電極(invasive electrode)輸遞。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中侵入式電極(invasive electrode)是一種微針體陣列。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中脂質(zhì)體成分選自脂質(zhì)體、粒子、囊泡、微球體、單層和多層的脂質(zhì)囊泡結(jié)構(gòu)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中脂質(zhì)體成分沒有形成選自脂質(zhì)體、粒子、囊泡、微球體、單層和多層的脂質(zhì)囊泡的結(jié)構(gòu)。
21.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中脂質(zhì)體成分選自脂質(zhì)體、粒子、囊泡、微球體、單層和多層的脂質(zhì)囊泡。
22.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中脂質(zhì)體成分沒有形成選自脂質(zhì)體、粒子、囊泡、微球體、單層和多層的脂質(zhì)囊泡的結(jié)構(gòu)。
23.一種提高分子材料輸遞進入或穿過個體皮膚上輸遞位點的方法，它包括以下步驟
(a)同時或相繼使用被輸遞至皮膚上輸遞位點的分子材料與含有負電荷脂質(zhì)類的脂質(zhì)體成分；
(b)在皮膚上的輸遞位點與(a)項中的分子材料和脂質(zhì)體成分分別同時或相繼使用1至60次電脈沖，其中電脈沖的持續(xù)時間約為10微秒至200毫秒，脈沖電壓約為80至200V，以產(chǎn)生電穿孔并能輸遞分子材料進入或穿過皮膚，同時，當脂質(zhì)體成分存在時被輸遞的分子材料的數(shù)量較脂質(zhì)體成分不存在時要多。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中被輸遞的分子材料沒有被脂質(zhì)體成分包裹。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中分子材料選自藥物、核酸、肽、多肽、抗體、免疫調(diào)節(jié)劑以及生物反應(yīng)修飾劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中被輸遞的有效的分子材料選自治療劑、預防劑、化妝品、基因治療劑和預防用藥。
27.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中在皮膚上的輸遞位點使用的分子材料、脂質(zhì)體成分和至少一次的電脈沖選自下表(a)至(p)的一系列輸遞模式
表中，(i)數(shù)字1、2、3、4、5表示相繼事件中第一、二、三、四、五的順序，(ii)每一格中出現(xiàn)的數(shù)字相同就表示各事件同時進行，(iii)每一格中出現(xiàn)的數(shù)字不同就表示各事件相繼進行，(iv)在一種輸遞模式中一個事件可以多次發(fā)生，(v)“na”表示該事件不適用。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中至少一次的電脈沖通過表面電極輸遞。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中表面電極選自彎曲電極(meanderelectrodes)，微型插接電極(micropatch electrodes)，卡規(guī)(caliper)或其它小型板狀電極(plate electrodes)。
30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中至少一次的電脈沖通過侵入式電極(invasive electrode)輸遞。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中侵入式電極(invasive electrode)是一種微針體陣列。
32.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中脂質(zhì)體成分選自脂質(zhì)體、粒子、囊泡、微球體、單層和多層的脂質(zhì)囊泡結(jié)構(gòu)。
33.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中脂質(zhì)體成分沒有形成選自脂質(zhì)體、粒子、囊泡、微球體、單層和多層的脂質(zhì)囊泡的結(jié)構(gòu)。
34.一種提高皮膚SC層通透性的方法，它包括將至少一次的加在皮膚SC層的電脈沖與含帶負電荷脂質(zhì)類的脂質(zhì)體成分同時或相繼使用，其中脂質(zhì)體成分沒有包裹將被輸遞至SC層的分子材料，SC層的通透性是由孔洞形成的時間測定的，且這個值要高于不含脂質(zhì)體成分時的值。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中電場強度約為0.05至5kV/cm。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中電脈沖的持續(xù)時間約為10微秒至200毫秒。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中帶有負電荷的脂質(zhì)類是磷脂類。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中磷脂類選自DOPC和DOPPOG。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中DOPG與DOPC的比例為1∶1。
40.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中脂質(zhì)體成分選自脂質(zhì)體、粒子、囊泡、微球體、單層和多層的脂質(zhì)囊泡結(jié)構(gòu)。
41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中脂質(zhì)體成分沒有形成選自脂質(zhì)體、粒子、囊泡、微球體、單層和多層的脂質(zhì)囊泡的結(jié)構(gòu)。
42.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中帶有負電荷的脂質(zhì)類是游離脂肪酸。
43.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中帶有負電荷的脂質(zhì)類是游離脂肪酸。
44.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中帶有負電荷的脂質(zhì)類是游離脂肪酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種透皮輸遞分子材料的方法。該包括將電脈沖同時或相繼施加于分子和含有帶負電荷脂質(zhì)體成分的脂類組合物。使用脂質(zhì)體成分是為了提高供分子輸遞的靶位點的通透性。
文檔編號A61K48/00GK1406125SQ0180546
公開日2003年3月26日 申請日期2001年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月25日
發(fā)明者A·森, 許錫云, 趙雅麗, 張蕾 申請人:健康研究股份有限公司