專利名稱：一種用于治療燒傷的生物制劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)用配制品及其制備方法，具體地說是屬于治療燒傷的生物制劑和生產該制劑的方法。
燒傷是一種常見病、多發(fā)病，也是致殘率較高的創(chuàng)傷性疾病。據地區(qū)抽樣調查表明，每年燒傷人群的發(fā)病率為2％人次，留疤率為30％左右。目前臨床治療燒傷常采用的方法，一般是在進行創(chuàng)面早期處理后，或采用包扎療法或采用暴露療法進行治療(《燒傷治療學》黎鰲主編，人民衛(wèi)生出版社出版)。包扎療法是用滅菌吸水的厚敷料包扎創(chuàng)面，使之與外界隔離，以保護創(chuàng)面。該方法的不足之處是，在包扎處理時，包扎內層敷料常常出現或是與創(chuàng)面粘著、交換困難，或是引流效果欠佳。在包扎治療過程中，還常常由于創(chuàng)面潮濕，誘發(fā)感染。暴露療法是將燒傷創(chuàng)面暴露于干燥空氣中，不用敷料覆蓋或包扎，使創(chuàng)面的滲液及壞死組織干燥成痂，以暫時保護創(chuàng)面。這種方法雖然創(chuàng)面不利于細菌的生長，但可使淤滯區(qū)組織干枯壞死，其損壞程度不亞于初期燒傷的損壞。暴露療法對外部環(huán)境條件要求高，且干痂時間長，一般在燒傷48小時后方可成痂?，F有的治療方法因缺少適合燒傷皮膚使用的藥物，因而療效不盡如人意。另外，無論是包扎療法還是暴露療法，在早期清創(chuàng)時，都要進行創(chuàng)面抗感染處理。清創(chuàng)所選用的抗感染藥物主要有三類一是中草藥制劑，如四季青、毛冬青、黃連、黃柏、桉樹葉等；二是化學藥物制劑，如雙氧水、新潔爾滅、甲磺滅膿等；三是抗生素制劑如青霉素、慶大霉素等。由于大多數藥物均可從創(chuàng)面吸收，因此大面積使用這些藥物，尤其是濃度過大或使用粉劑時常?？梢鹬卸净騼扰K損害。再則，這些藥物一般都有一定的刺激性，在使用時常常會給患者增加痛苦。
本發(fā)明的目的就是提供一種適合燒傷皮膚愈合、刺激性小、療效好的生物制劑，同時提供一種制備該制劑的方法。
本發(fā)明的目的是這樣實現的，所制備的生物制劑含有蠟狀芽孢桿菌CGMCC0601發(fā)酵液。
蠟狀芽孢桿菌CGMCC0601發(fā)酵液所用的微生物L-72(即本發(fā)明所用微生物)，經中國科學院微生物研究所(依據1、Krieg N.R.et al.Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology(Vol，2)p.1105-1138.1986.2、Colin R·Harwood，Bacillus，Plenum Press，1989.3、R·E·戈登等《芽孢桿菌屬》蔡妙英等譯，農業(yè)出版社1978.)鑒定為蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)。本發(fā)明所用微生物在本發(fā)明申請日前已提交中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC0601，保藏日為2001年7月12日。
本發(fā)明所用微生物呈革蘭氏陽性桿狀，大小為0.9-1.0×2.5-4.0μ；芽孢為橢圓形，近端生，不膨大；胞內有聚β-羥基丁酸鹽(PHB)顆粒的積累；接觸酶和氧化酶皆陽性，厭氧菌生長陽性，V-P反應陽性，對葡萄糖產酸，對阿拉伯糖、木糖、甘露醇不產酸，水解淀粉，分解酪朊，利用檸檬酸鹽和丙酸鹽，V-P反應終了，PH值為5.0，在7％NaCl中不生長。
本發(fā)明所用微生物生長條件有氧環(huán)境，PH值7.8-8.5；溫度28-32℃；培養(yǎng)狀態(tài)靜置、動態(tài)均可；生產周期靜置60-72小時，動態(tài)10-16小時。
本發(fā)明所用微生物具有良好的穩(wěn)定性。該微生物發(fā)現于1972年，因對霉菌有較強的抑制作用而分離留種，4℃保存?zhèn)溆?。每經兩個月倒管(傳代)一次；每一至二年篩選一次，挑選菌落大、粘稠、拉長絲、邊緣整齊、鏡下觀查有該菌的特殊花紋結構，即可選取，擴大培養(yǎng)，定為母種，用于制劑。
每五年做一次較系統(tǒng)的生理生化檢測(見表1)，經過二十多年的培養(yǎng)使用，未發(fā)現該菌有變異現象，每年不同時期所生產的制劑，藥效也無差異。
該微生物在使用、保存及多次傳代過程中，不易產生變異現象，故作為一個生產菌種是可靠而有前途的。
該微生物自發(fā)現至今，已有二十多年，總傳代一百多次，從生理生化反應及使用上，未發(fā)現有變異和衰退現象。其主要的生理生化反應檢測見表1。
表1蠟狀芽孢桿菌CGMCC0601主要生理生化反應檢測表檢測項目 檢測時間(年、月)72.5 77.5 82.8 88.5 93.7革蘭氏染色 +++++菌落粘稠拉長絲 +++++菌落特殊花紋 +++++液體培養(yǎng)形成菌膜 +++++淀粉酶 +++++酪朊 +++++硝酸鹽 +++++醋酸鹽 +++++V-P反應 +++++7.5％NaCI生長-----厭氧生長 -----葡萄糖產酸 +++++乳糖產酸 -----蔗糖產酸 +++++麥芽糖產酸 +++++甘露醇產酸 -----木糖產酸 -----過氧化酶 +++++本發(fā)明所含微生物其菌種的培養(yǎng)方法是1、母種培養(yǎng)基牛肉膏10g，蛋白胨5g，蔗糖10g，瓊脂18g，氯化鈉2.5g，普通水1000ml，PH值7.5，15P 30分鐘滅菌。降溫至60℃，傾注平板。
2、接種將接種環(huán)沾濕插入菌種(CGMCC0601)劃線于平板上，30℃恒溫培養(yǎng)24小時，選取單個、形大、乳白、粘稠、拉絲長、邊緣整齊、鏡下觀察保持獨特花紋結構的菌落作為生產菌種。
3、制母種將優(yōu)選的菌落接入斜面中30℃培養(yǎng)三天，向管中加入無菌水3ml，將菌膜洗下，然后鉤出培養(yǎng)基，將菌液煮沸三次后接入斜面管，30℃培養(yǎng)三天，4℃保存，備用。
4、制原種培養(yǎng)基為牛肉膏10g，蛋白胨5g，蔗糖10g，氯化納2.5g，水蒸200ml、15P 30分鐘滅菌。
5、將母種以一支接五瓶原種為準，向母種基中加入5.5ml原種基，用帶吸球的2ml吸管反復吹吸，將菌苔洗入溶液中，每毫升接原種一瓶，混合后30℃培養(yǎng)24小時，即為原種。
本發(fā)明生物制劑的制備方法，包括下列步驟a、制備培養(yǎng)基培養(yǎng)基含有楊葉粉25-35份，槐葉粉20-30份，玉米粉80-120份，黃豆粉20-30份，碳酸鈉8-10份，加水至膏狀，放置0.5-1小時，加水8000-10000份，用氫氧化鈉調PH值為8.0-8.5，攪拌、封口，15P 20-30分鐘滅菌；b、培養(yǎng)基溫度降至28-32℃，按培養(yǎng)基容量的5-12％接入原種；30±1℃培養(yǎng)2-3天，至白色菌膜形成；c、加入0.5-1％的苯酚，攪拌，加入0.5-1％的助濾劑，過濾，收集清亮透明液體。
為保證制劑具有更好的療效，其中楊葉粉最好選用小葉楊葉粉，槐葉粉最好選用洋槐葉粉。
本發(fā)明生物制劑與草酸鉀反應可以生成等大、均勻、分散、有光折性的球狀顆粒，所制備的生物制劑每毫升含球狀顆?？倲禐?0-20億，其療效尤佳。
本發(fā)明生物制劑可通過質量控制來確保其在治療燒傷疾病時的穩(wěn)定療效。
其定性檢測方法為取本品5ml加10％草酸鉀0.2ml混勻形成白色乳狀液體，其沉淀溶于0.2％稀硫酸，不溶于36％醋酸，干燥粉末溶于二甲苯。
本品與草酸鉀反應可生成不溶于水的固體物質，在顯微鏡下觀察系等大、均勻、分散、有折光性的球狀顆粒，其顆粒數目與有效成份成正相關系。
定量分析方法是取本品5ml，加10％草酸鉀0.2ml，混合后取1ml加蒸餾水至100ml混均，取少許置于血球計數板上，用400倍顯微鏡取四角的四個中方格(每個中方格有16個小方格)中的顆?？倲颠M行計算。
公式 例顆粒數328個。
計算
即本發(fā)明的生物制劑的特異性顆粒數為20.5億。
本發(fā)明的生物制劑的特異性顆粒帶有相同電荷，在溶液中可形成均勻分散的個體，能在血球計數板上進行計數。
本發(fā)明的生物制劑對燒傷創(chuàng)面的疼痛、滲出、感染、積濃、燒傷組織的進行性壞死以及深II°創(chuàng)面的疤痕性愈合，有良好的療效。使用本發(fā)明生物制劑，可使燙傷表面干燥，滲出減少，能加快新生肉芽組織生長，促進燙傷組織愈合，同時具有刺激性小、止痛快、可有效控制感染、療程短、不留疤痕等優(yōu)點。
本發(fā)明的CGMCC0601微生物在發(fā)酵過程中，使培養(yǎng)基中的葉綠素變成葉紅卟啉。葉紅卟啉上的羰基和羧基與苯酚的羥基反應，生成相應的脂或醚。這與正常皮膚表面存在的脂類物質相似，因而可與創(chuàng)傷皮膚表面的水分起乳化作用而產生脂類膜，能夠對皮膚創(chuàng)傷表面起到保護作用。
本發(fā)明的優(yōu)良效果通過下列實驗研究得到了進一步的證實。
藥效學研究1、實驗材料1.1藥物實驗組，本發(fā)明生物制劑，批號94025；對照組，燒傷靈，批號940766，石家莊樂仁堂制藥廠生產。
1.2動物昆明種小鼠24-25g，雌雄各半，由河北醫(yī)學院實驗動物中心提供。
1.3菌種金黃色葡萄球菌(26003)，大腸桿菌(44102)，糞鏈球菌(32221)、綠膿桿菌(10104)、白色念珠菌(10231)，均由北京藥品生物制品檢定所提供。
1.4培養(yǎng)基沙氏培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基和肉湯。
2、方法與結果2.1對小鼠燙傷創(chuàng)面愈合的影響取健康小鼠，背部脫毛24小時后，將動物用乙醚麻醉，置于80℃恒溫鋁板上，持續(xù)15秒，造成10％的II°燒傷。燒傷創(chuàng)面面積約(2×3cm2)(此條件是經預試驗由病理組織學檢查后確定)。將動物隨機分成四組，空白對照組，對照組，實驗組依據高、低兩個劑量分為實驗1組、實驗2組。每組12只，燙傷后立即噴藥，空白對照組噴水，對照組給燒傷靈0.5ml/次，實驗組給藥量0.5ml/次，各組2次/日，連續(xù)給藥14天，觀察各組動物給藥后結痂時間、脫痂時間及4天、8天、12天各組之間體重變化情況。結果見表2、表3。
表2本發(fā)明生物制劑對小鼠燒傷創(chuàng)面愈合的影響組別 結痂時間(天)痂皮脫落時間(天)空白對照組 7.0±1.315.6±4.2實驗1組(高量) 4.8±0.4*11.3±2.5*實驗2組(低量) 4.6±0.8*11.4±1.3*對照組 5.8±1.113.4±3.8x±s，n＝12，*P＞0.05表3本發(fā)明生物制劑對小鼠燒傷后體重的影響x±s，n＝12，克組別給藥前給藥后4天 8天 12天空白對照組 24.4±0.5 22.6±0.624.1±0.827.2±1.3實驗1組(高量) 24.5±0.6 25.8±0.9**25.7±1.4**27.2±1.4實驗2組(低量) 24.3±0.3 25.8±0.5**25.8±0.5**27.4±0.8對照組 24.4±0.4 24.6±0.925.2±1.0*27.4±1.4*P＞0.05**P＜0.01實驗表明實驗組能緩解燙傷動物因疼痛而引起的嘶叫、跳躍、顫抖等現象，實驗組的動物連續(xù)用藥后燙傷創(chuàng)面干燥、無感染，長出痂皮的時間及脫掉痂皮的時間均早于對照組，與對照組比較具有顯著性差異。從實驗中還可以觀察到，小鼠燙傷后，因劇痛而引起活動及攝食量的減少，使體重下降，給藥后，實驗組無論是高量組(生物制劑每毫升含球狀顆?？倲禐?0億)還是低量組(生物制劑每毫升含球狀顆?？倲禐?0億)，動物攝食及活動都很快恢復了正常，體重在給藥4天即明顯得到提高，與對照組相比較，具有顯著性差異。
2.2體外抑菌試驗抑菌試驗方法按照衛(wèi)生部《藥品衛(wèi)生檢驗方法》進行。
試驗結果見表4。
表4發(fā)本明生物制劑對致病菌的影響金黃色 白色時間(分)大腸桿菌綠膿桿菌對照葡萄球菌念珠菌0 卅 卅 卅 卅 卅2 艸 艸 - 艸 卅4 + + - 艸 卅6 - - - +卅8 - - - +卅10 - - -卅實驗表明，本發(fā)明的生物制劑10分鐘即可對燒傷創(chuàng)面感染率較高的5種致病菌產生顯著的抑制作用。
本生物制劑經皮膚用藥毒性實驗表明使用本發(fā)明生物制劑的各組動物，在用藥觀察期間，各組動物進食、排泄及活動均無異常，呼吸及四肢活動正常，體重各組之間無明顯變化，無死亡發(fā)生。
本生物制劑經皮膚用藥刺激實驗表明完整皮膚及破損皮膚組均未見紅斑和水腫等刺激反應。
本發(fā)明生物制劑其臨床研究取得良好的效果，臨床研究報告如下。
臨床觀察方法及項目1、觀察單位河北醫(yī)學院第三醫(yī)院、中國人民解放軍第二五六醫(yī)院、石家莊市長安區(qū)醫(yī)院、石家莊市佩英燒傷生物醫(yī)學開發(fā)研究所等。
2、觀察項目抗?jié)B出、止痛、抗感染、止癢、生肌、終止燒傷后的組織反應等。對不同燒傷因素、程度及就診時間遲早，觀察其痊愈時間及有無疤痕等。
3、用藥方法I°燒傷，創(chuàng)面間斷噴灑本發(fā)明生物制劑至疼痛消失。II°燒傷的創(chuàng)面清潔、無污物，未用其它藥物者，可直接噴灑該藥，每日2-6次，如有水泡可低位剪口排空。疼痛創(chuàng)面每隔5分鐘噴藥一次，疼止后改為正常用量。噴藥量以均勻不流動為宜。一般160cm2的面積，耗液1ml。如創(chuàng)面有污物或敷有其它藥物應先用生理鹽水沖洗干凈，然后用同樣的方法噴灑該藥。一般采取暴露療法。對易摩擦的創(chuàng)面及低溫環(huán)境可采用濕敷包扎法。對感染創(chuàng)面將積膿或壞死組織清除，用濕敷法，創(chuàng)面干凈后改為噴灑。
臨床觀察1、一般臨床資料從1987年至1993年10月共治療燒傷患者787例，男388例，占49.3％；女399例，占50.7％。最小年齡8個月，最大年齡65歲。燒傷面積在1～37％。II°燒傷756例，占96.06％，深II°燒傷31例，占3.94％。其中治療燒傷灼傷3例。燒傷部位有頭、面、頸、鼻、口、耳、前胸、后背、四肢、臀部、外生殖器、陰囊等。
2、治療效果II°燒傷84.5％的在5-10天痊愈；15.6％在10-15天痊愈，其中有3％的繼發(fā)感染(多為誤傷痂皮)。深II°面積10％以內燒傷的患者，80.5％在15-20天痊愈，19.4％在15-30天痊愈。不經植皮也能進行無疤痕愈合。
本發(fā)明的生物制劑對不同燒傷因素、用藥時間、止痛與痊愈的觀察見表5。
表5 本發(fā)明生物制劑對燒傷的用藥觀察痛止痊愈燒傷燒傷 致傷至用 燒傷％時間時間備注因素部位 藥時間例數(分)(天)沸液 四肢、前胸及時 200 25.4 5-10 2-5 脫痂、無疤痕蒸汽 后背、面等同上 同上 14～30分 105 13.3 5～155～10 同上同上 同上 1-7天 456 57.9 5～155～20 同上同上 同上 半月以上 6 0.8 10～20 15～30 同上赤鐵 手、臀 及時 2 0.3 5～152～9同上火焰 面、背部 15分 5 0.6 40～45 2～4同上硝酸 眼、手 10～15分 2 0.3 10～15 2～620分鐘消腫燒堿 陰囊 3天1 0.1 立即 8 脫薄皮一層同上 臀部 半月 1 0.1 立即 29 無疤痕電弧 手背、面 20分-1天 3 0.6 15 2～4無疤痕硫酸 腳面、上肢 6分-1天3 0.6 立即 3～6無疤痕瀝青 手、足 1-4天 3 0.6 30 10 無疤痕從觀察結果可以看出，燒傷創(chuàng)面用本發(fā)明生物制劑后10-20分鐘止痛(火焰燒傷45分鐘止痛)。痊愈與用藥早晚有關，用藥越早痊愈得越快。
對II°燒傷，就診在燒傷后30分鐘以內者，一般可在5-10天痊愈，脫薄皮一層，不留痕跡；燒傷已達6-48小時，創(chuàng)面形成水泡，有部分皮損者，治療5-12天痊愈；燒傷已超過一周，經其它藥物治療效果不佳者，改用本發(fā)明生物制劑治療，40％在10天內痊愈，45％在20天內痊愈，15％的(屬殘余創(chuàng)面)在30天內痊愈，且均無疤痕組織。
對化學灼傷、電弧傷的治療，由于灼傷程度及就診時間不同，治療一般在2-30天痊愈，不留疤痕。
抗?jié)B出的觀察燒傷創(chuàng)面噴涂本發(fā)明生物制劑在半小時內，可見皮損創(chuàng)面漿液滲出減少，1小時左右排除漿液的水泡不再鼓起，二小時可看到I°創(chuàng)面紅腫明顯消失。用藥后，創(chuàng)面無加深現象，表明本發(fā)明生物制劑有抗組織反應作用。
本發(fā)明生物制劑適用于開水、沸油、蒸汽、高溫物體、火焰、火藥、光電、強酸、強堿等各種理化因素引起的皮肉損傷。
本發(fā)明生物制劑的使用方法為1、清創(chuàng)(1)創(chuàng)面未感染化膿，并且未曾使用任何藥物者，如屬新鮮創(chuàng)面，可直接使用該藥；如不屬新鮮創(chuàng)面，可用生理鹽水沖洗后使用該藥。
(2)創(chuàng)面感染化膿者，先用少量3％雙氧水清洗干凈后再使用該藥。
(3)創(chuàng)面已使用其他藥物者，務必徹底清除后，方可使用該藥。
2、處理水泡完整水泡采用低位剪口排除滲液，但要保護好水泡皮。較大的水泡可多剪幾個口，將滲液加壓排除，使泡皮緊貼創(chuàng)面。皺縮或污染的泡皮要剪除。
3、用藥(1)涂布法用脫脂棉浸透藥液，輕柔均勻地涂于創(chuàng)面，每日3-4次。該法適用于清潔、污染及結痂面。
(2)噴灑法用噴霧裝置將藥液均勻地噴灑于創(chuàng)面，以不流動為宜，每日3-6次。該法適用于清潔及結痂的創(chuàng)面。
實施例1
制備小葉楊葉粉、洋槐葉粉選用5至10月份小葉楊的樹葉(帶葉柄)，洋槐葉(帶葉柄)，曬干，用小鋼磨磨成40-60目粉，備用。
稱取小葉楊粉3kg、洋槐葉粉2kg、玉米粉10kg、黃豆粉2kg、碳酸鈉1kg置于容器中，加水適量，攪成膏狀，放置半小時，加水1000kg，用5N NaOH調PH值達8.0，在充分攪拌下分裝于玻罐中，容量350ml，接入原種35ml，30℃培養(yǎng)三天，白色菌膜形成，菌液清亮透明，菌體長鏈形成芽孢，用特異性顆粒計數法進行計數，數量達20億/毫升，即制成CGMCC0601發(fā)酵液。按發(fā)酵液總量的1％加入苯酚，充分攪拌混合，以混合液總量為基數加入1％硅藻土作為助濾劑，攪拌1分鐘，用7#帆布常壓吊濾，收集清亮透明液體即為成品。
實施例2制備楊葉粉、槐葉粉選用5至10月份的楊樹葉、槐樹葉，曬干，用小鋼磨磨成40-60目粉，備用。
稱取楊葉粉2.5kg、槐葉粉3kg、玉米粉8kg、黃豆粉3kg、碳酸鈉1kg，置于容器中，加水適量，攪成膏狀，放置半小時，加水800kg，用5N NaOH調PH值達8.0，在充分攪拌下分裝于玻罐中，容量350ml，接入原種30ml，30℃培養(yǎng)三天，白色菌膜形成，菌液清亮透明，菌體長鏈形成芽孢，用特異性顆粒計數法進行計數，數量達15億/毫升，即制成CGMCC0601發(fā)酵液。按發(fā)酵液總量的0.5％加入苯酚，充分攪拌混合，以混合液總量為基數加入1％硅藻土作為助濾劑，攪拌1分鐘，用7#帆布常壓吊濾，收集清亮透明液體即為成品。
權利要求
1.一種用于治療燒傷的生物制劑，其特征在于它含有蠟狀芽孢桿菌CGMCC0601發(fā)酵液。
2.根據權利要求1所述的用于治療燒傷的生物制劑，其特征在于所說的發(fā)酵液中加有0.5-1.0％的苯酚。
3.根據權利要求1所述的用于治療燒傷的生物制劑，其特征在于所說的生物制劑與草酸鉀反應生成等大、均勻、分散、有折光性的球狀顆粒。
4.根據權利要求3所述的用于治療燒傷的生物制劑，其特征在于所述的生物制劑每毫升含球狀顆?？倲禐?0-20億。
5.一種根據權利要求2所述的用于治療燒傷的生物制劑的制備方法，其特征在于它包括有下列步驟a、制備培養(yǎng)基培養(yǎng)基含有楊葉粉25-35份，槐葉粉20-30份，玉米粉80-120份，黃豆粉20-30份，碳酸鈉8-10份，加水至膏狀，放置0.5-1小時，加水8000--10000份，用氫氧化鈉調PH值為8.0-8.5，攪拌、封口，15P 20-30分鐘滅菌；b、培養(yǎng)基溫度降至28-32℃，按培養(yǎng)基容量的5-12％接入CGMCC0601菌種；30±1℃培養(yǎng)2-3天，至白色菌膜形成；c、加入0.5-1％的苯酚，攪拌，加入0.5--1％的助濾劑，過濾，收集清亮透明液體。
6.根據權利要求5所述的用于治療燒傷的生物制劑的制備方法，其特征在于所說的楊葉粉是小葉楊葉粉。
7.根據權利要求5所述的用于治療燒傷的生物制劑的制備方法，其特征在于所說的槐葉粉是洋槐葉粉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種治療燒傷的生物制劑和生產該制劑的方法，該制劑含有蠟狀芽孢桿菌CGMCC0601發(fā)酵液。它對燒傷創(chuàng)面的疼痛、滲出、感染、積濃、燒傷組織的進行性壞死以及深II°創(chuàng)面的疤痕性愈合有良好的療效，使用本發(fā)明生物制劑可使燙傷表面干燥，滲出減少，能加快新生肉芽組織生長，促進燙傷組織愈合，同時具有刺激性小、止痛快、可有效控制感染、療程短、不留疤痕等優(yōu)點。
文檔編號A61K35/74GK1399971SQ0112358
公開日2003年3月5日 申請日期2001年8月3日 優(yōu)先權日2001年8月3日
發(fā)明者盧佩英 申請人:盧佩英