專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療糖尿病潰瘍的藥的配方及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療糖尿病潰瘍，尤其是足部潰瘍的藥的配方及其制備方法。
糖尿病是危害人類(lèi)健康的三大殺手之一，同時(shí)它的并發(fā)癥，給患者的生理和心理都帶來(lái)極大的痛苦。潰瘍，尤其是足部潰瘍是常見(jiàn)的一種并發(fā)癥，據(jù)美國(guó)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在美國(guó)1600萬(wàn)糖尿病人中，有25％的人會(huì)發(fā)生足部潰瘍的并發(fā)癥。在中國(guó)，糖尿病病人的人數(shù)也因近年生活水平的提高而逐年增加。
一般人傷口可于一至兩周內(nèi)自行復(fù)元，但糖尿病患者，缺乏自行修補(bǔ)傷口能力，加上血糖極高，增加細(xì)菌感染機(jī)會(huì)，初期糖尿病患者，可能一至兩個(gè)月后傷口才會(huì)復(fù)元，長(zhǎng)期患者，傷口可能三個(gè)月以上亦未能復(fù)元，并有擴(kuò)散感染情況。
糖尿病患者一旦不慎出現(xiàn)潰瘍，由于身體高血糖及抵抗能力低，容易導(dǎo)致傷口不能復(fù)元，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重感染而須進(jìn)行切除腳部手術(shù)，以保存性命。
現(xiàn)時(shí)糖尿病患者接受治療較被動(dòng)，包括清理潰瘍傷口、服食抗生素消炎、定期控制血糖濃度及對(duì)嚴(yán)重感染者進(jìn)行切除手術(shù)。
本發(fā)明的目的在于根據(jù)我們已有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出一種治療糖尿病潰瘍的藥的配方及制備方法。
本發(fā)明解決了目前臨床上糖尿病潰瘍主要采用被動(dòng)治療的問(wèn)題，采取主動(dòng)治療以局部給藥的方式，1)利用VEGF促進(jìn)糖尿病潰瘍部位的血管生長(zhǎng)，UK促進(jìn)糖尿病潰瘍部位的血管和神經(jīng)生長(zhǎng)，氧化氟沙星的消炎作用，加快病患部位的修補(bǔ)，避免擴(kuò)散感染機(jī)會(huì)，取得理想的治療效果。
2)利用基因工程的方法生產(chǎn)VEGF和UK，減少天然提取帶來(lái)病毒污染的機(jī)會(huì)，降低生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式一、用酵母細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)pro-UK，pro-UK經(jīng)固定化的纖溶酶(plasmin)酶切獲得UK。
1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建以含有pro-UK編碼序列的pSAT-UK質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物15′-CTCTCGAGAAAAGAAGCAATGAACTTCATCAAGTTCCATCG-3′引物25′-AATCTAGATCAGAGGGCCAGGCCATTCTC-3′5′端引物包含XhoI限制性酶切位點(diǎn)，α-因子信號(hào)序列，和proUK的第一個(gè)密碼子前的Kex2切割位點(diǎn)，3′端的引物在終止子后包含了一個(gè)XhaI限制性酶切位點(diǎn)。以XhoI、XbaI雙酶切pro-UK DNA片段及pPICZα載體，純化，T4DNA連接酶連接構(gòu)建pPICZα-proUK表達(dá)載體。pPICZα載體含用甲醇調(diào)節(jié)的強(qiáng)啟動(dòng)子(AOX1)，α-因子信號(hào)序列(分泌作用)和Zeocin抗性基因。
2、酵母轉(zhuǎn)化proUK-pPICZα質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切線性化后，用EasyComptransformation kit(Invitrogen)轉(zhuǎn)化KM71或GS115酵母菌株，轉(zhuǎn)化后用YPDS平板(1％yeast extract，2％peptone，2％glucose，1Msorbitol，2％agar，100μg/ml Zeocin)篩選發(fā)生同源重組的克隆，監(jiān)測(cè)分泌物中的纖溶活性。
3、重組蛋白的表達(dá)及純化挑取表達(dá)proUK的克隆接種至BMGY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按以1/5體積的含甲醇0.5％的BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)96h后(每隔24h補(bǔ)加甲醇至0.5％)。收集BMMY培養(yǎng)上清加入50mM醋酸，0.2M NaCl，0.01％Tween 80預(yù)平衡的carboxymethyl cellulose柱，pro-UK用50mM HAc，0.5M NaCl，0.01％Tween80的緩沖液洗脫。二、用酵母細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)VEGF1651、重組質(zhì)粒的構(gòu)建以含有VEGF165編碼序列的TA3.1質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，5′端引物包含XhoI限制性酶切位點(diǎn)，α-因子信號(hào)序列，和VEGF165的第一個(gè)密碼子前的Kex2切割位點(diǎn)，3′端的引物在終止子后包含了一個(gè)XhaI限制性酶切位點(diǎn)。以XhoI、XbaI雙酶切VEGF165 DNA片段及pPICZα載體，純化，T4DNA連接酶連接構(gòu)建pPICZα-VEGF165表達(dá)載體。pPICZα載體含用甲醇調(diào)節(jié)的強(qiáng)啟動(dòng)子(AOX1)，α-因子信號(hào)序列(分泌作用)和Zeocin抗性基因。
2、酵母轉(zhuǎn)化VEGF165-pPICZα質(zhì)粒經(jīng)PmeI酶切線性化后，用EasyComptransformation kit(Invitrogen)轉(zhuǎn)化KM 71或GS115酵母菌株，轉(zhuǎn)化后用YPDS平板(1％yeast extract，2％peptone，2％glucose，1Msorbitol，2％agar，100μg/ml Zeocin)篩選發(fā)生同源重組的克隆。
3、重組蛋白的表達(dá)及純化挑取表達(dá)VEGF165的克隆接種至BMGY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，按以1/5體積的含甲醇0.5％的BMMY培養(yǎng)基誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)96h后(每隔24h補(bǔ)加甲醇至0.5％)。收集BMMY培養(yǎng)上清，用heparin-binding親和層析柱純化。三、生物活性的測(cè)定1、Bovine capillary endothelial cells(BCE)測(cè)定法取生長(zhǎng)良好的BCE細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌，胰酶消化，用含DMEM+1％GPS培養(yǎng)液配成25,000個(gè)/ml的懸液，加入24孔板，每孔0.5mL，37℃，10％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞貼壁后棄上清液，加入0.5mLDMEM+5％小牛血清+10％GPS及待測(cè)樣品，37℃培養(yǎng)20分鐘后，加入bFGF至終濃度1ng/ml。72小時(shí)后，XTT法測(cè)活細(xì)胞數(shù)。
2、Calf pulmonary arterial endothelial cells(CPAE)測(cè)定法方法同上。
3、Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVEC)測(cè)定法將在EBM+2％小牛血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞加至96孔板，每孔0.1mL(50,000 Cells)，37℃，10％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)，細(xì)胞貼壁后棄上清液，加入0.1mL EBM+2％小牛血清+4ng/mL bFGF，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)，棄上清，加入0.1mL EBM+2％小牛血清及待測(cè)樣品，37℃培養(yǎng)20分鐘后，補(bǔ)加0.1ml培養(yǎng)基(EBM+2％小牛血清+2ng/mL bFGF)，24小時(shí)后，XTT法測(cè)活細(xì)胞數(shù)。
4、小鼠模型測(cè)定法取8周齡的C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠(Jackson Lab，Bar Harbor，ME USA)，麻醉后，在其背部中央造成8mm深的創(chuàng)口，并在整個(gè)研究過(guò)程中讓其暴露在外，連續(xù)用藥5天，用經(jīng)校正的Jameson caliper測(cè)定其傷口愈合程度。對(duì)照組采用C57BL/KsJ(db+/+m)小鼠。四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用糖尿病的小鼠C57BL/KSJ(db+/db+)和正常非糖尿病的小鼠C57BL/KSJ(db+/+m)比較了含0.5％氧氟沙星凝膠與含0.01％VEGF、0.01％UK和0.5％氧氟沙星凝膠對(duì)傷口愈合的影響。
結(jié)果表明糖尿病的小鼠C57BL/KSJ(db+/db+)用含0.5％氧氟沙星凝膠與含0.01％VEGF、0.01％UK和0.5％氧氟沙星凝膠連續(xù)用藥5天后，傷口愈合的百分率分別為7.5％和35.2％。對(duì)照組正常非糖尿病的小鼠C57BL/KSJ(db+/+m)用含0.5％氧氟沙星凝膠與含0.01％VEGF、0.01％UK和0.5％氧氟沙星凝膠連續(xù)用藥5天后，傷口愈合的百分率分別29.7％和60.8％。
權(quán)利要求
1.一種用于治療糖尿病潰瘍的藥的配方，其特征在于含有血管上皮生長(zhǎng)因子(VEGF，Vascular Endothelial Growth Factor)、尿激酶(UK，urokinase)、氧氟沙星三種活性成分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療糖尿病潰瘍的藥的配方含有上述活性成分中的一種或任意二種的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方中VEGF的含量為0.001～0.5％，UK的含量為0.001～0.5％，氧氟沙星的含量為0.2％～1.0％。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方采用局部給藥，劑型可以是藥液、藥膏、藥膜、氣霧劑、透皮吸收劑等。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方中的VEGF或者是天然提取的，或者是基因重組方法采用原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真核細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的配方中的UK或者是天然提取的，或者是基因重組方法采用原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞或真核細(xì)胞系統(tǒng)生產(chǎn)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的VEGF用基因重組方法采用酵母系統(tǒng)生產(chǎn)，其特征在于PCR擴(kuò)增基因，克隆至pPICZα質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化KM71或GS115酵母細(xì)胞，在所述培養(yǎng)液中誘導(dǎo)表達(dá)，用heparin-binding親和層析柱純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的UK用基因重組方法采用酵母系統(tǒng)生產(chǎn)，其特征在于PCR擴(kuò)增基因，克隆至pPICZα質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化KM71或GS115酵母細(xì)胞，在所述培養(yǎng)液中誘導(dǎo)表達(dá)，用carboxymethyl cellulose柱純化目標(biāo)蛋白質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥劑用Bovine capillary endothelialcells(BCE)、Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVEC)、Calf pulmonary arterial endothelial cells(CPAE)等細(xì)胞及C57BL/KsJ(db+/db+)小鼠進(jìn)行其生物活性測(cè)定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療糖尿病潰瘍,尤其是足部潰瘍的藥的配方及其制備方法,屬于生物技術(shù)制藥中的基因工程生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物的技術(shù)領(lǐng)域。其目的是創(chuàng)造出含有血管上皮生長(zhǎng)因子(VEGF,Vascular Endothelial Growth Factor)、尿激酶(UK,urokinase)、氧氟沙星三種活性成分,具有促進(jìn)血管生長(zhǎng)、神經(jīng)生長(zhǎng)和消炎作用的藥物,用于治療糖尿病潰瘍,尤其是糖尿病足部潰瘍。其中VEGF和UK是用基因工程方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì),利用酵母細(xì)胞系統(tǒng)高效表達(dá),經(jīng)分離純化獲得目標(biāo)蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)A61P17/02GK1389267SQ0112278
公開(kāi)日2003年1月8日 申請(qǐng)日期2001年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月5日
發(fā)明者劉建寧, 劉蓓鈁, 張菁 申請(qǐng)人:劉建寧