專利名稱：樹突狀細(xì)胞特異的抗原結(jié)合片段、組合物及其使用方法、被其識(shí)別的抗原及由其獲得的細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及樹突狀細(xì)胞(DCs)亞群特異性的抗體及其衍生物。本發(fā)明還提供了組合物及其使用方法，包括DCs及其亞群的分離和純化以及抗體或配體介導(dǎo)的免疫治療方法。本發(fā)明還提供了基本上分離的DC亞群。本發(fā)明提供的組合物的使用方法包括基于DC的免疫治療方法、多種疾病的鑒定以及體內(nèi)用例如flt3-配體進(jìn)行DC數(shù)量上的擴(kuò)增。
背景技術(shù)：
樹突狀細(xì)胞(DCs)(有效的抗原呈遞細(xì)胞(APCs))的造血發(fā)育是明顯不同的，并且可以遵循幾條前體途徑，其中一些途徑與單核細(xì)胞緊密相連。DCs可由淋巴樣前體衍生(Thomas等人(1993)免疫學(xué)雜志J.Immunol.150821-834)。在胸腺中類似于在血液中，可存在有三種不同的DCs亞類1)漿細(xì)胞樣的CD4+CD11c-DCs；2)CD4+CD11c+DCs；以及3)交錯(cuò)突DCs。業(yè)已提出胸腺DCs和T細(xì)胞來自于共同干細(xì)胞(Thomas等人(1996)干細(xì)胞(Stem Cell)14196-206)。
近來通過體外用細(xì)胞因子培養(yǎng)祖代已產(chǎn)生了大量的DCs，以用于潛在的臨床用途。業(yè)已采納不同的策略，將抗原引入樹突狀細(xì)胞內(nèi)，以便在共刺激的情況下，抗原可被更有效地呈遞給T細(xì)胞。同樣已經(jīng)表明，樹突狀細(xì)胞能夠影響T細(xì)胞對(duì)抗原的應(yīng)答。該應(yīng)答是遵循體液或全身途徑。
T細(xì)胞不能應(yīng)答未加工的蛋白，相反，它們需要輔助細(xì)胞以肽表位來呈遞抗原，其中所述肽表位與MHC分子結(jié)合而呈現(xiàn)在細(xì)胞表面。在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)內(nèi)源性產(chǎn)生的抗原通常以I類途徑呈遞，且刺激細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的反應(yīng)，而外源性蛋白質(zhì)在MHC II類區(qū)內(nèi)被加工，且誘導(dǎo)輔助(CD4)T細(xì)胞的應(yīng)答。對(duì)原初T細(xì)胞的刺激需要存在共刺激分子，其中共刺激分子作為初次免疫激活中的第二信號(hào)。APCs(例如B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)一般不能誘導(dǎo)初次應(yīng)答。相反，樹突狀細(xì)胞從共刺激分子、粘附分子和MHC I類和II類分子的組成型不可調(diào)型表達(dá)來挖掘潛能，其中所述共刺激分子、粘附分子和MHC I類和II類分子對(duì)引發(fā)有效的細(xì)胞免疫是必須的。綜述參見Avigan(1999)血液評(píng)論Blood Rev.)1351-64。
DCs是引發(fā)初次免疫應(yīng)答和耐受性發(fā)育所必需的APC。DCs表達(dá)對(duì)原初T細(xì)胞群刺激所必需的MHC。DCs的造血發(fā)育是明顯不同的，并且可遵循幾條前體途徑，而其中一些途徑是與單核細(xì)胞緊密相連的(參見Avigan(1999)血液評(píng)論1351-64)。不同DC亞類具有不同的發(fā)育途徑。這個(gè)新興概念是，一種DC亞類具有可在誘導(dǎo)對(duì)自身抗原的耐受性中發(fā)揮作用的調(diào)節(jié)功能(Austyn(1998)血液學(xué)最新觀點(diǎn)Curr.Opin.Hematol.53-15)。相反，DCs或其亞類也可參與誘導(dǎo)對(duì)自身蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。人們認(rèn)為，某些自身免疫應(yīng)答是由于微環(huán)境組織損傷導(dǎo)致局部DC的激活，然后與T細(xì)胞相互作用，從而引發(fā)免疫應(yīng)答(Ibrahim等人(1995)今日免疫學(xué)(Immunol.Today)16181-186)。
DCs引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的能力正被用于DC癌癥疫苗中(Hart等人(1999)血液學(xué)研究(Sem.Hematol.)3621-25)。例如，體外用腫瘤衍生的肽或旦白質(zhì)脈沖CD34+細(xì)胞或單核細(xì)胞，產(chǎn)生DCs，然后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)，用作癌癥特異的T細(xì)胞誘導(dǎo)中的APCs(Brugger等人(1999)紐約科學(xué)院紀(jì)事(Ann.N.Y.Acad.Sci.)872363-371)。動(dòng)物模型已經(jīng)證實(shí)，DC腫瘤疫苗使T細(xì)胞的無反應(yīng)性逆轉(zhuǎn)并導(dǎo)致接下來的腫瘤排斥(Avigan(1999)；還參見Tarte等人(1999)白血病(Leukemia)13653-663；Colaco(1999)今日分子醫(yī)學(xué)(Molec.Med.Today)514-17；Timmerman等人(1999)醫(yī)學(xué)年鑒(Ann.Rev.Med.)50507-529；Hart等人(1999)血液學(xué)研究3621-25；Thurnher等人(1998)國際泌尿科學(xué)(Urol.Int.)6167-71；以及Hermans等人(1998)新西蘭醫(yī)學(xué)雜志(N.Z.Med.J.)111111-113)。一種方法業(yè)已通過服用flt-配體來增加體內(nèi)的DCs。這對(duì)VEGF誘導(dǎo)的DC抑制具有補(bǔ)償作用(Ohm等人(1999)免疫學(xué)雜志1633260-3268)。業(yè)已提出將DCs用作接種和重組疫苗中的佐劑(Fernandez等人(1998)Cyto.Cell.Mol.Ther.453-65；以及Gilboa等人(1998)癌免疫和免疫治療(CancerImmunol.Immunother.)4682-87)。還已經(jīng)提出將DC用于增強(qiáng)干細(xì)胞移殖后的免疫性(Brugger等人(1999)紐約科學(xué)院紀(jì)事363-371)。DCs在免疫學(xué)中起許多潛在的作用。例如，DCs與人免疫缺陷病毒(HIV)的感染有關(guān)(Zoeteweij等人(1998)生的醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志(J.Biomed.Sci.)5253-259)。還業(yè)已提出，DCs適用于HIV治療(Weissman等人(1997)臨床微生物學(xué)評(píng)論(Clin.Microbiol.Rev.)10358-367)。
與DCs有關(guān)的其它免疫功能諸如對(duì)Th1或Th2應(yīng)答、自身免疫反應(yīng)和變態(tài)反應(yīng)的不同誘導(dǎo)(Rissoan等人(1999)科學(xué)(Science)2831183-1186；Hermans等人(1998)新澤西醫(yī)學(xué)雜志111111-113；以及De Palma等人(1999)免疫學(xué)雜志1621982-1987)。
在SLE病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)循環(huán)IFN-α和IFN-α誘導(dǎo)因子的水平升高(類似于抗-DNA抗體與DNA的復(fù)合物)，并且這些因子與疾病的活動(dòng)度有關(guān)。而且，用IFN-α治療非自身免疫紊亂的病人經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生自身抗體并偶爾會(huì)產(chǎn)生SLE。Ronnblom等人的幾篇論文(Ronnblom等人(1999)臨床和實(shí)驗(yàn)微生物學(xué)(Clin.Exp.Immunol.)115196-202；(1999)免疫學(xué)雜志1636306-6313；以及(2000)免疫學(xué)雜志1653519-3526)表明，由病人衍生的IFN-α誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)來自健康供體的PBMC分泌IFN-α，并且它們選擇性激活天然IFN-A產(chǎn)生細(xì)胞(NIPC＝漿細(xì)胞樣DC)。
對(duì)血液中的DC的研究業(yè)因?yàn)镈C細(xì)胞的稀少及DC特異性細(xì)胞表面標(biāo)記的相對(duì)缺少而受阻礙。用于DC分離的方法為基于一段短的培養(yǎng)期之后成熟的變化(像低浮力密度的獲得)或者基于DC激活/成熟抗原(CD83、CMRF-44以及CMRF-56)的表達(dá)(Young等人(1988)細(xì)胞免疫(CellImmunol.)111167；Van Voorhis等人(1982)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志(J.Exp.Med.)1551172；Zhou等人(1995)免疫學(xué)雜志1543821-3835；Fearnley等人(1997)血液893708-3716；Mannering等人(1988)J.Immunol.Met.21969-83；Hock等人(1999)Tiss.Antigens 53320-334；以及Hock等人免疫學(xué)(Immunol.)83573-581)。
功能CD1a+DCs一般是由單核細(xì)胞以及CD34+造血祖細(xì)用離體法產(chǎn)生的(Bender等人(1996)J.Immunol.Met.196121-135；Pickl等人(1996)免疫學(xué)雜志1573850-3859；Romani等人(1994)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志18083-93；Sallusto等人(1994)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1791109-1118；Caux等人(1992)自然(Nature)360258-261；Mackensen等人(1995)血液862699-2707；Szabolcs等人(1995)免疫學(xué)雜志1545851-5861；Herbst等人(1996)血液882541-2548；de Wynter等人(1998)干細(xì)胞16387-396；Strunk等人(1996)血液871292-1302；US專利號(hào)6,010,905以及6,004,807)。還不知道體外由單核細(xì)胞以及造血祖細(xì)胞產(chǎn)生的DCs是否保留或者得到體內(nèi)DCs的所有特性。
另外，產(chǎn)生特異于人DC的mAb的一些嘗試都失敗了，而只產(chǎn)生了與DC和其它白細(xì)胞均表達(dá)的抗原相結(jié)合的mAb。人DC與其它血細(xì)胞一樣擁有大量的免疫原性細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)(包括HLA分子、CD18、CD29、CD31、CD43、CD44、CD45、CD54以及CD58)。對(duì)所注射的DC，這些抗原將支配免疫應(yīng)答到這樣的水平，在該水平，特異于DC特異性抗原的B細(xì)胞根本不存在或者在能夠與骨髓瘤細(xì)胞融合的B細(xì)胞中只存在少數(shù)。
許多研究者業(yè)已試圖通過以下措施來解決這個(gè)難題即，給成年小鼠注射非DC和環(huán)磷酰胺，以便消除特異于共享抗原的B細(xì)胞；或者給新生小鼠注射非DC，以便耐受特異于共享抗原的B細(xì)胞(O’Doherty等人(1993)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)進(jìn)展(Adv.Exp.Med.Biol.)329165-172；以及Yamaguchi等人(1995)J.Immunol.Met.181115-124)。
稱為CMRF44的mAb業(yè)已被用來監(jiān)測干細(xì)胞移殖病人體內(nèi)的DCs(Fearnley等人(1999)血液93728-736)。有人提出，這些CMRF44+細(xì)胞適合用來引發(fā)、維持和指導(dǎo)免疫應(yīng)答(Fearnley等人(1997))。常用細(xì)胞表面標(biāo)記的組合體來最經(jīng)常地分離DCs。例如，US專利號(hào)5,972,627將“富集人造血樹狀祖細(xì)胞的造血細(xì)胞”描述成具有“至少80％表達(dá)CD34、CD45RA以及CD10，但沒有CD19、CD2、CD3、CD4、CD8、CD20、CD14、CD15、CD16、CD56和血型糖蛋白”。
從血液中分離DCs依賴于大量的免疫表型標(biāo)準(zhǔn)，諸如白細(xì)胞譜系(lin)特異抗原(例如CD3、CD14、CD19和CD56)系列的缺乏以及HLA-DR、CD4或CD33的存在(Romani等人(1996)J.Immunol.Met.196137-151；Thomas等人(1993)免疫學(xué)雜志150821-834；Thomas等人(1994)免疫學(xué)雜志1534016-4028；O’Doherty等人(1994)免疫學(xué)82487-493；O’Doherty等人(1993)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1781067-1076；Nijman等人(1995)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志182163-174；Ferbas等人(1994)免疫學(xué)條志1524649-4662；Heufler等人(1996)歐洲免疫學(xué)雜志(Eur.J.Immunol.)26659-668；Ito等人(1999)免疫學(xué)雜志1631409-1419；Cella等人(1999)自然醫(yī)學(xué)(Nature Med.)5919-923；Robinson等人(1999)歐洲免疫學(xué)雜志292769-2778；Olweus等人(1997)美國國家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9412551-12556；Robert等人(1999)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志189627-636以及Kohrgruber等人(1999)免疫學(xué)雜志1633250-3259)。
通過分析從未培養(yǎng)血中分離的DC，顯示出血液DC不是均一的細(xì)胞群而是至少兩個(gè)群體的混合物(Thomas等人(1994)；O’Doherty等人(1994)；Ito等人(1999)；Cella等人(1999)；Robinson等人(1999)；Olweus等人(1997)；Kohrgruber等人(1999)；Strobl等人(1998)免疫學(xué)雜志161740-748以及Rissoan等人(1999)科學(xué)2831183-1186)。第一種血液DC亞群是擁有漿細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)和有效的T細(xì)胞刺激功能的CD123亮CD11c-DC。第二種血液DC亞群是CD123暗CD11c亮，它在外表上是單核細(xì)胞樣的，并且表達(dá)CD45RO，而且甚至在沒有任何外源細(xì)胞因子培養(yǎng)時(shí)也能自動(dòng)發(fā)育成典型的成熟CDs。漿細(xì)胞樣的CD123亮CD11c-DC顯示出一些特性例如前-T細(xì)胞受體α鏈的表達(dá)，這些特性表明它們來自淋巴樣的前體(Strobl等人(1998)；Rissoan等人(1999)以及Bruno等人(1997)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志185875-884)。CD123暗CD11c亮DC顯示出髓樣DCs的所有標(biāo)準(zhǔn)(O’Doherty等人(1994)以及Ito等人(1999).Robinson等人(1999)；Kohrgruber等人(1999)以及Strobl等人(1998))。已經(jīng)在淋巴組織的T細(xì)胞富集區(qū)檢測到了的類似漿細(xì)胞樣CD123亮CD11c-DC的DCs，并且由于這些細(xì)胞的形態(tài)學(xué)和表型，最初被錯(cuò)誤地稱為漿細(xì)胞樣T細(xì)胞或者漿細(xì)胞樣單核細(xì)胞(Grouard等人(1997)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志1851101-1111；Lennert等人(1975)柳葉刀(Lancet)11031-1032；Lennert等人(1984)在白細(xì)胞類型專用單克隆抗體檢測人白細(xì)胞分化抗層(in Leukocyte Typing).(HumanLeukocyte differentiation antigens detected by monoclonal antibodies.)Bernard等人編輯.Springer-Verlag，Berlin；以及Facchetti等人(1998)美國病理學(xué)雜志(Am.J.Pathol.)13315)。在生發(fā)中心的暗區(qū)和亮區(qū)業(yè)已發(fā)現(xiàn)類似CD123暗CD11c亮的血液DC的DCs(Grouard(1996)自然384364-367)。
剪接變體據(jù)估計(jì)，被表達(dá)基因的總數(shù)在40,000到大于150,000的范圍內(nèi)。這個(gè)數(shù)目并沒有準(zhǔn)確反映被編碼的蛋白質(zhì)的數(shù)目，這是由于在許多情況下，由這些基因產(chǎn)生了多于一個(gè)來自mRNAs(轉(zhuǎn)錄體)的剪接變體。評(píng)估還可以改變，也許在人體內(nèi)可產(chǎn)生多達(dá)500,000個(gè)不同的mRNAs。據(jù)估計(jì)，至少30％的人類基因具有若干剪接變體(Mironov等人(1999)基因組研究(Genome Research)91288-1293)。一些人相信這些數(shù)目是保守的。類似數(shù)目據(jù)信在小鼠和大鼠體內(nèi)也存在，并且在較低級(jí)的生物體內(nèi)也存在其它剪接(例如黃猩猩果蠅(Drosophila melanogaster)和秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans))。由不同剪接變體翻譯成的蛋白質(zhì)可具有明顯不同的功能(正如日益增多的研究論文所顯示的)。在不同的組織、不同的發(fā)育階段和不同的疾病狀態(tài)中可表達(dá)不同的剪接變體。
C-型凝集素C-型凝集素是一族糖蛋白，這些糖蛋白在其糖類識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD)顯示出氨基酸序列的相似性并以Ca2+依賴的方式結(jié)合到所選擇的糖類上。C-型凝集素業(yè)已被分成四亞類(Vasta等人1994；以及Spiess 1990)。第一組包括II型膜整合蛋白(例如脫唾液酸糖蛋白受體、巨噬細(xì)胞半乳糖特異的凝集素、N-乙酰葡糖胺(GlcNac)特異的凝集素)以及CD23(FcεRII)。這一組中的許多成員都表現(xiàn)出對(duì)半乳糖/巖藻糖、半乳糖胺/GalNac或GlcNac殘基的特異性。第二組包括軟骨以及成纖維細(xì)胞粘蛋白的核心蛋白。第三組包括所謂的“膠原凝集素”例如血清甘露糖結(jié)合蛋白、肺表面活性劑蛋白SP-A以及膠固素。第四組包括某些公知為LEC-CAMs的粘附分子(例如Mel-14、GMP-140和ELAM-1)。
已知C-型凝集素可用作凝集素、調(diào)理素、補(bǔ)體激活劑以及細(xì)胞相關(guān)的識(shí)別分子(Vasta等人1994；Spiess 1990；以及Kery 1991)。例如，巨噬細(xì)胞甘露糖受體可起清除劑的作用(Shepherd等人，1990)，并且介導(dǎo)致病有機(jī)體(包括卡氏肺孢子蟲(Pneumocystis carinii)(Ezekowita等人，1991)和白色念珠菌(Candida albicans)(Ezekowitz等人(1990))的攝取。血清甘露糖結(jié)合蛋白模擬Clq通過經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體的能力。該凝集素的基因突變易導(dǎo)致嚴(yán)重的復(fù)發(fā)感染、腹瀉并且不能茁壯成長(Reid等人1994)。這樣，C-型凝集素顯示出具有生物意義的多樣功能。
C-型凝集素的“天然”配體并不一定是糖類組成成分。例如，現(xiàn)在公知，CD23(FCεRII)以不依賴于糖類的方式來識(shí)別IgE，而正如通過其與Gal-Gal-Nac(Kijimoto-Ochiai等人1994)的結(jié)合以及通過其CDR序列所驗(yàn)證的，CD23(FCεRII)屬于C-型凝集素族；IgE的酶促去糖基化形式以及在大腸桿菌(E.Coli)中產(chǎn)生的重組(非糖基化的)IgE均可結(jié)合CD23(Vercelli等人1989)。因此，一些C-型凝集素識(shí)別它們的天然配體中的多肽序列。
在DCs表面上已經(jīng)鑒定出若干C-型凝集素。首先，Jiang等人克隆了被NLDC-145 mAb所識(shí)別的蛋白質(zhì)，其中所述NLDC-145 mAb是最廣泛使用的針對(duì)鼠DC的mAb之一(Jiang等人1995)。該蛋白質(zhì)(現(xiàn)在稱作DEC-205)發(fā)現(xiàn)是C-型凝集素家族的一個(gè)新成員，其含有10個(gè)不同的CRD。其次，Sallusto等人報(bào)道，人DC表達(dá)巨噬細(xì)胞甘露糖受體(MMR)，這些受體還含有多個(gè)CRD(Sallusto等人，1995)?；谝韵掠^察，業(yè)已提出這些受體可介導(dǎo)由DC進(jìn)行的糖基化分子的胞吞作用a)抗DEC-205的多克隆兔抗體不僅結(jié)合到DC表面的DEC-205上，而且其次還被內(nèi)化；b)這些DC有效激活了可與兔IgG反應(yīng)的T細(xì)胞系；以及c)用甘露聚糖(甘露糖受體競爭劑)可有效封閉由DC導(dǎo)致的FITC-葡聚糖的內(nèi)化(Jiang等人1995；以及Sallusto等人1995)。關(guān)于細(xì)胞類型特異性，現(xiàn)在已知胸腺、腸道和肺內(nèi)的B細(xì)胞以及上皮細(xì)胞以較低水平表達(dá)DEC-205(Witmer-Pack等人1995；以及Inaba等人1995)，而巨噬細(xì)胞甚至還更充足地表達(dá)MMR(Stahl 1992)。在DC表面還發(fā)現(xiàn)了其它C-型凝集素，包括DCIR、MDL-1、NURPIA、Dectin-2、CLEC-1、CLEC-2、Langerin以及DC-標(biāo)志物。
變態(tài)反應(yīng)變應(yīng)性應(yīng)答(包括那些變應(yīng)性哮喘和變應(yīng)性鼻炎)的特征在于早期應(yīng)答，它出現(xiàn)在變應(yīng)原暴露的幾秒到幾分鐘內(nèi)，并且其特征在于嗜伊紅性粒細(xì)胞浸潤至變應(yīng)原暴露位點(diǎn)。具體地說，在變應(yīng)性應(yīng)答的早期，Th2-型淋巴細(xì)胞的激活刺激了抗原特異性IgE抗體的產(chǎn)生，而后者又引發(fā)肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺和其它炎癥介質(zhì)。在后期應(yīng)答中，由CD4+Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL-4和IL-5的量升高。這些細(xì)胞因子對(duì)募集嗜伊紅性粒細(xì)胞至變應(yīng)原暴露位點(diǎn)時(shí)似乎起到重要作用，在該位點(diǎn)處導(dǎo)致組織損傷和功能紊亂。
目前，對(duì)變應(yīng)性紊亂的抗原免疫治療方法包括在稱作脫敏治療的方法中皮下注射少量但卻是逐漸增大的抗原量。抗原免疫治療方法現(xiàn)在只能達(dá)到減輕病情的目的但卻不能達(dá)到治療目的(Weber(1997)美國醫(yī)學(xué)會(huì)雜志(JAMA)2781881-1887；Stevens(1998)比利時(shí)臨床學(xué)報(bào)(Acta ClinicaBeligica)5366-72以及加拿大過敏反應(yīng)和臨床免疫學(xué)學(xué)會(huì)(CanadianSociety of Allergy and Clinical Immunology)(1995)加拿大醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)雜志(Can.Med.Assoc.J.)1521413-1419)。
開始接受這種治療的許多病人不能完成所規(guī)定的方案，并且如果超過一個(gè)星期不進(jìn)行注射，病人就必須再重新開始整個(gè)治療方案。業(yè)已鑒定了許多抗原并通過重組方式產(chǎn)生了它們(參見Baldo等人(1989)變態(tài)反應(yīng)(Allergy)4481-97；Baldo(1991)免疫學(xué)最新觀點(diǎn)(Curr.Opin.Immunol.)3841-850；Blaser(1994) Ther.Umsch 5119-23；以及Valenta等人(1996)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)生物學(xué)進(jìn)展409185-196)。
抗原免疫治療方法存在誘導(dǎo)潛在致死的IgE介導(dǎo)的過敏反應(yīng)的危險(xiǎn)，但不實(shí)施細(xì)胞因子介導(dǎo)的變應(yīng)性后期應(yīng)答。這種治療方法已被描述成“具有導(dǎo)致災(zāi)難的可能性”(Weber(1997))?？乖庖咧委煼椒ǖ牧硪粋€(gè)重大問題是，副反應(yīng)特別是過敏反應(yīng)的危險(xiǎn)顯蓍減少了抗原劑量，其中所述抗原劑量為每次施用的量及一段時(shí)間所施用的量。于是，傳統(tǒng)的變態(tài)反應(yīng)的免疫治療方法是延長的，并因此而費(fèi)時(shí)、不便利并且昂貴。
另一種治療IgE相關(guān)的紊亂(例如變態(tài)反應(yīng))的方法包括服用抑制組胺釋放的化合物。許多此類藥物是當(dāng)作非處方藥物來購得的。其它藥物包括抗IgE結(jié)合抗體。然而，這種方法的不足之處是，它只能掩蔽癥狀，而不能達(dá)到永久治愈或者保護(hù)的目的。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及富含DCs及其亞類的造血細(xì)胞群的富集方法。本發(fā)明還提供了從其得到的富含細(xì)胞和細(xì)胞群的合物。還提供了制備遺傳修飾DCs的方法。還提供了遺傳修飾DCs的組合物。還包括這些細(xì)胞的使用方法。還提供了特異的BDCA-2和BDCA-3抗原結(jié)合片段以及由此識(shí)別的抗原。
本發(fā)明包括由抗體AC144、AD5-1311、AD5-20E5、AD5-17F6、AD5-4B8、AD5-5E8、AD5-14H12或AD5-8E7特異識(shí)別的DCs亞類特異性抗原結(jié)合片段。本發(fā)明包括特異于抗原BDCA-2(SEQ ID NO2)表位的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明包括特異于抗原BDCA-3的表位的抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明包括基本上被分離或被濃縮的DC群或亞群，這些DC群或亞群被本發(fā)明的抗原結(jié)合片段特異性識(shí)別。這些抗原結(jié)合片段可以是AC144、AD5-1311、AD5-20E5、AD5-17F6、AD5-4B8、AD5-5E8、AD5-14H12或AD5-8E7中的任一個(gè)，或BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4的特異性抗原結(jié)合片段中的任一個(gè)。識(shí)別神經(jīng)纖毛蛋白-1的抗原結(jié)合片段也識(shí)別BDCA-4并且在本文中是適用的。
本發(fā)明還包括DCs群或者亞群，其中基本上所有的細(xì)胞都表達(dá)或者基于對(duì)BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的至少之一的表達(dá)而分離、濃縮或計(jì)數(shù)。這些細(xì)胞可懸浮在任一生理可接受的賦形劑中。優(yōu)選的是，該賦形劑為藥理學(xué)可接受的。
本發(fā)明還包括獲得富集DCs的造血細(xì)胞組合物的方法，該方法包括使人造血細(xì)胞的混合物分離成一個(gè)組分，而在該組分中至少80％的細(xì)胞為BDCA-1+。
本發(fā)明還包括獲得富集DCs的造血細(xì)胞組合物的方法，該方法包括使人造血細(xì)胞的混合物分離成一個(gè)組分，而在該組分中至少80％的細(xì)胞為BDCA-2+。
本發(fā)明還包括獲得富集DCs的造血細(xì)胞組合物的方法，該方法包括使人造血細(xì)胞的混合物分離成一個(gè)組分，而在該組分中至少80％的細(xì)胞為BDCA-3+。
本發(fā)明還包括獲得富集DCs的造血細(xì)胞組合物的方法，該方法包括使人造血細(xì)胞的混合物分離成一個(gè)組分，而在該組分中至少80％的細(xì)胞為BDCA-4+。
本發(fā)明還包括分離出基本上純的DCs亞類的方法，該方法包括以下步驟a)得到人造血細(xì)胞混合物；以及b)基本上將細(xì)胞從混合物中分離出來，其中所述細(xì)胞特異性地被稱為BDCA-2的抗原特異性抗原結(jié)合片段識(shí)別。
本發(fā)明還包括分離出基本上純的DCs亞類的方法，該方法包括以下步驟a)得到人造血細(xì)胞混合物；以及b)基本上將細(xì)胞從混合物中分離出來，其中所述細(xì)胞特異性地被稱為BDCA-3的抗原特異性抗原結(jié)合片段識(shí)別。
本發(fā)明還包括分離出基本上純的DCs亞類的方法，該方法包括以下步驟a)得到人造血細(xì)胞混合物；以及b)基本上將細(xì)胞從混合物中分離出來，其中所述細(xì)胞特異性地被稱為BDCA-4的抗原特異性抗原結(jié)合片段識(shí)別。
本發(fā)明還包括DCs的計(jì)數(shù)方法，包括以下步驟a)獲得細(xì)胞混合物；以及b)用抗原結(jié)合片段標(biāo)記細(xì)胞，而抗原結(jié)合片段特異于抗原BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一個(gè)或多個(gè)。
本發(fā)明還包括調(diào)節(jié)DCs的免疫能力的方法，該方法包括分離出基本上純的DCs群或者亞群；以及調(diào)節(jié)DCs的鈣動(dòng)員。
本發(fā)明還包括用于篩選受試劑，得到藥學(xué)有效試劑的方法，該方法包括用抗原結(jié)合片段分離出基本上純的DCs群或者亞群，該抗原結(jié)合片段特異于抗原BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一個(gè)或多個(gè)；用受試試劑篩分所分離的細(xì)胞；監(jiān)測細(xì)胞對(duì)受試試劑的應(yīng)答；將細(xì)胞對(duì)受試試劑的應(yīng)答與暴露于對(duì)照劑的細(xì)胞進(jìn)行比較；以及確定受試試劑是否調(diào)節(jié)所分離細(xì)胞的任一免疫特性。
本發(fā)明還包括通過改變DC動(dòng)員鈣的能力來調(diào)節(jié)DCs的免疫特性的方法。
本發(fā)明還包括最好是在生理上可接受的賦形劑中的免疫原的和免疫調(diào)節(jié)的DCs組合物。
本發(fā)明還包括治療生理?xiàng)l件的方法，該方法包括給需要接受治療的受試者施用有效量的免疫原的或免疫調(diào)節(jié)的DCs組合物。
本發(fā)明還包括制備DC細(xì)胞因子的方法，該方法包括用抗原結(jié)合片段分離基本上純的DCs群或者亞群，該抗原結(jié)合片段特異于BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一個(gè)或多個(gè)；以及將細(xì)胞因子從細(xì)胞或者細(xì)胞產(chǎn)物或上清液中分離出來。
本發(fā)明還包括調(diào)節(jié)DC細(xì)胞因子產(chǎn)量的方法，該方法包括用抗原結(jié)合片段分離基本上純的DCs群或者亞群，該抗原結(jié)合片段特異于BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一個(gè)或多個(gè)；以及用調(diào)節(jié)DC細(xì)胞因子產(chǎn)量的試劑處理細(xì)胞。
本發(fā)明還包括體內(nèi)調(diào)節(jié)DC細(xì)胞因子產(chǎn)量的方法，該方法包括給需要接受調(diào)節(jié)的受試者施用有效量的調(diào)節(jié)DC細(xì)胞因子產(chǎn)量的試劑。
本發(fā)明還包括產(chǎn)生特異于抗原的抗體的方法，該方法包括給所需受試者施用有效量的基本上純的載有抗原DCs群或者亞群，并且用抗原結(jié)合片段進(jìn)行分離，該抗原結(jié)合片段特異于BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一個(gè)或多個(gè)，其中DCs被調(diào)節(jié)，以便誘導(dǎo)Th2應(yīng)答。
本發(fā)明還包括產(chǎn)生特異于抗原的T細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的方法，該方法包括給所需受試者施用有效量的基本上純的載有抗原的DCs群或者亞群，并且用抗原結(jié)合片段進(jìn)行分離，該抗原結(jié)合片段特異于BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任何一個(gè)或多個(gè)，其中細(xì)胞被調(diào)節(jié)以便誘導(dǎo)Th1應(yīng)答。
本發(fā)明還包括如下制備的多肽首先于重組宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽，然后將被表達(dá)的多肽從總的重組宿主細(xì)胞成分中純化出來，其中所述多肽含有約5個(gè)來自SEQ ID NO2的連續(xù)氨基酸殘基。
本發(fā)明還包括純化的多肽及其組合物，其中所述多肽含有約5個(gè)來自SEQ ID NO2的連續(xù)氨基酸殘基。
本發(fā)明還包括連接到不是SEQ ID NO2的多肽氨基酸序列上的多肽氨基酸序列的融合蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列含有約5個(gè)來自SEQ IDNO2的連續(xù)氨基酸殘基。
本發(fā)明還包括含有BDCA-2的至少一個(gè)剪接變體的多肽。
本發(fā)明還包括多核苷酸或其互補(bǔ)序列，它們編碼BDCA-2其剪接變體或片段的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
本發(fā)明還包括含有多肽或其互補(bǔ)系列的重組宿主細(xì)胞，所述多核苷酸或互補(bǔ)序列編碼BDCA-2、其剪接變體或片段的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
本發(fā)明還包括抑制DC與T細(xì)胞的相互作用的方法，該方法包括使含有DC和T細(xì)胞的組合物與有效量的抑制BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4與T細(xì)胞相互作用的試劑接觸。
本發(fā)明還包括治療炎癥的方法，該方法包括給所需受試者施用一定量的試劑，該試劑可有效抑制BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4與T細(xì)胞的相互作用，從而減輕受試者體內(nèi)的炎癥。
本發(fā)明還包括通過在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)BDCA-2反義多核苷酸而抑制細(xì)胞內(nèi)的BDCA-2表達(dá)的方法。
本發(fā)明還包括含有多核苷酸或其互補(bǔ)系列的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，所述多核苷酸或其互補(bǔ)序列編碼BDCA-2、其剪接變體或片段的至少5個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。
附圖簡述

圖1是來自用菲可帕克密度梯度離心技術(shù)分離的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的流血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析的點(diǎn)繪圖。在圖1中，示出了PBMC上的BDCA-2、BDCA-3和CD1c(BDCA-1)的表達(dá)。
圖1A表示分別用FITC結(jié)合的抗BDCA-2 mAb(AC144)、抗BDCA-3mAb(AD5-5E8)和抗CD1c mAb(AD5-8E7)以及PE結(jié)合的抗TCRαβ異源二聚體、CD14、CD19和CD56的mAb對(duì)PBMC染色。數(shù)字表示各自象限中的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。碘化丙錠的熒光和光散射信號(hào)可用于選通活細(xì)胞。
圖1B示出了(a)PBMC，(b)選通的BDCA-2+細(xì)胞，(c)選通的BDCA-3+細(xì)胞以及(d)選通的CD1c+細(xì)胞的散射曲線。
圖2表示在三種不同的血液DC亞類上表達(dá)了BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4和CD1c(BDCA-1)。通過耗竭CD3、CD11b和CD16陽性細(xì)胞、隨后富集CD4陽性細(xì)胞而將血液DC從PBMC中分離出來。利用光散射特性(上-左點(diǎn)繪圖)和抗-HLA-DR-Cy5染色與抗-Lin-FITC(抗-TCRαβ、CD14、CD19和CD56)染色對(duì)比(上-中點(diǎn)繪圖)可證實(shí)血液DC的純度。注意，只有極少數(shù)lin+細(xì)胞存在。血液DC上BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4和CD1c的表達(dá)特征是，用PE結(jié)合的以及FITC結(jié)合的抗CD11c、CD123和自身抗原的mAb進(jìn)行一系列的雙色染色。注意，BDCA-2、BDCA-3、BDCA-4和CD1c每一個(gè)都專門僅僅表達(dá)在三個(gè)不同血液DC亞類之一上。按照用CD123-PE和CD11c-FITC對(duì)血液DC進(jìn)行的染色(上-左點(diǎn)繪圖)來定義這些亞類CD11c-CD123亮血液DC；CD11c亮CD123暗血液DC；以及CD11c暗CD123-血液DC。
圖3繪出了PBMC上BDCA-4的表達(dá)。示出的是用FITC結(jié)合的抗BDCA-2的mAb(AC144)和PE結(jié)合的抗BDCA4的mAb(AD5-17F6)給PBMC進(jìn)行雙色染色。注意，檢測到一些單一陽性(BDCA-2+BDCA-4-)和(BDCA-2-BDCA-4+)PBMC。
圖4示出了純化的血液DC在存在IL-3的時(shí)，培養(yǎng)不同時(shí)間后BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4的表達(dá)。純化的血液DC在存在r1L-3存在時(shí)，培養(yǎng)0小時(shí)、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、9小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)、24小時(shí)、36小時(shí)和48小時(shí)，然后進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，分析CD11c、BDCA-3、BDCA-2和BDCA-4的表達(dá)。(A)直方圖示表示分別用PE結(jié)合的抗-BDCA-2mAb(AC144)和抗-BDCA-4mAb(AD5-17F6)(粗線)以及PE結(jié)合的同種型匹配的對(duì)照mAb(淡線)給通選CD11c-和CD11c+血液DC進(jìn)行染色。點(diǎn)繪圖示出了用CD11c-PE與抗-BDCA-3(AD5-5E8)生物素/鏈親和素-APC對(duì)血液DC進(jìn)行染色的對(duì)比。(B)曲線圖示出了抗-BDCA-2-PE、抗-BDCA-4-PE以及抗-BDCA-3生物素/鏈親和素-APC分別對(duì)CD11c-(▲)和CD11c+(■)DC進(jìn)行染色而得到的平均熒光強(qiáng)度(MFI)值。對(duì)于BDCA-2和BDCA-4，通過分別從用AC144和AD5-17F6得到的值中減去用同種型對(duì)照mAb得到的值而計(jì)算出MFI值。對(duì)于BDCA-3，通過從用AD5-5E8得到的值中減去無任何染色mAb(自發(fā)熒光)而得到的值而計(jì)算出MFI值。
圖5示出了所有六個(gè)外顯子均被表達(dá)的一種BDCA-2同工型的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖6表示BDCA-1特異的mAb AD5-8E7阻斷CD1c mAb M241與MOLT-4細(xì)胞的結(jié)合。MOLT-4細(xì)胞與飽和量的AD5-8E7 mAb(粗線)或者同位素對(duì)照mAb(淡線)一起預(yù)溫育，然后用PE結(jié)合的CD1c mAb(M241)進(jìn)行染色。
圖7示出了在Mo-DC和來自CD34+細(xì)胞的DC(CD34-DC)上BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4的表達(dá)。通過分別用CD14和CID34 mAb結(jié)合的微珠直接進(jìn)行磁標(biāo)記而免疫磁性純化CD14+單核細(xì)胞以及CD34+造血祖細(xì)胞。在rGM-CSF和rIL-4存在時(shí)，對(duì)純化的單核細(xì)胞培養(yǎng)7小時(shí)，并且在rflt3-配體、rTGF-β1、rTNF-α、rSCF和rGM-CSF的存在下，對(duì)純化的CD34-DC培養(yǎng)11小時(shí)。培養(yǎng)期之后，用CD1a-FITC、CD1c-PE(AD5-8E7)、抗-BDCA-2-PE(AC114)、抗-BDCA-3-PE(AD5-5E8)和抗-BDCA-4-PE(AD5-17F6)給細(xì)胞染色。直方圖分別示出了(A)Mo-DC和(B)CD34-DC(粗線)的染色。淡線表示用同種型對(duì)照mAb進(jìn)行的染色。除了最左面的直方圖外(CD1a染色)，在(B)中示出了通選的CD1a+細(xì)胞。
圖8表示對(duì)抗-BDCA-2 mAb標(biāo)記的BDCA-2+細(xì)胞的培養(yǎng)導(dǎo)致快速的mAb內(nèi)化。于4℃用FITC結(jié)合的抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)標(biāo)記PBMC.在所指示的時(shí)間段于37℃下進(jìn)行溫育，然后在4℃用PE結(jié)合的兔抗-小鼠IgG1 mAb(X56)和Cy5-結(jié)合的CD123 mAb(AC145，IgG2a)染色。示出的是通選的BDCA-2+CD123+細(xì)胞的抗-BDCA-2-FITC(■)和兔抗-小鼠IgG1 mAb-PE(▲)染色的MFI值。
圖9表示免疫磁性純化的CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+血液DC的形態(tài)學(xué)。通過用PE結(jié)合的一級(jí)mAb(AD5-8E7、AC144和AD5-5E8)和抗-PE mAb結(jié)合的微珠直接進(jìn)行磁標(biāo)記，然后用MACS富集被標(biāo)記細(xì)胞，可以從PBMC中分離出CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+細(xì)胞。這些點(diǎn)繪圖表示在磁富集CD1c+(上部點(diǎn)繪圖)、BDCA-2+(中部點(diǎn)繪圖)和BDCA-3+(下部點(diǎn)繪圖)之前(左邊的點(diǎn)繪圖)和之后(右邊的點(diǎn)繪圖)，分別用HLA-DR-FITC和PE結(jié)合的mAb給PBMC染色。右側(cè)的這三個(gè)圖表示細(xì)胞離心之后，被分離的CD1c+(上圖)、BDCA-2+(中圖)和BDCA-3+(下圖)的May Grunwald/吉姆薩染色。注意，在富含CD1c+細(xì)胞的圖中可看到小淋巴細(xì)胞。這些是CD1c+B細(xì)胞。
圖10表示培養(yǎng)后CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+上的MHCII類、CD83和共刺激分子的上調(diào)。所純化的CD1c+(A)、BDCA-2+(C)和BDCA-3+(B)分別在培養(yǎng)基(CD1c+和BDCA-3+BDC)中培養(yǎng)1天或者在含Ril-3和在CD32-轉(zhuǎn)染的L細(xì)胞(BDCA-2+DC)上的抗-CD40 mAb的培養(yǎng)中培養(yǎng)兩天。單核細(xì)胞于含rGM-CSF和rIL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，可產(chǎn)生“未成熟的”Mo-DC(D)。將未成熟的Mo-DC于含TNFα的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)3天，可產(chǎn)生“成熟的”Mo-DC(E)。直方圖表示分別用CD1a-FITC、CD80-PE、CD83-PE、CD86-PE和HLA-DR-PE染色的細(xì)胞(粗線)。淡線表示用同種型和熒光發(fā)色團(tuán)配對(duì)的對(duì)照mAb染色的細(xì)胞。
圖11表示與純化的CD3+T細(xì)胞相比，新鮮分離的CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+血液DC的胞吞能力。所分離的CD1c+DC(◆)、BDCA-2+BDC(▲)、BDCA-3+DC(■)和CD3+T細(xì)胞(*)于37℃在含1mg/mlLucifer Yellow(LY)的培養(yǎng)基中溫育0.1 5、45和75分鐘，用冰冷的PBS/EDTA/BSA洗滌三次，然后利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)方法進(jìn)行分析。示出的是在減去于4℃無LY時(shí)溫育之后得到的MFI值之后的LY熒光的MFI值。
圖12繪出了BDCA-2的cDNA序列(seq id no 1)。
圖13表示僅用抗-BDCA-2 mAb(A)和/或抗-BDCA-2加交聯(lián)的二級(jí)mAb(B、D、E)，可誘導(dǎo)免疫磁性純化的BDCA-2+BDCA-4+血液DC(A、B)和BDCA-2轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞(D)胞內(nèi)的Ca2+動(dòng)員，但是卻不能在非轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞(E)中做到這一點(diǎn)。用抗-BDCA-4 mAb和交聯(lián)的二級(jí)mAb將BDCA-4連接至免疫磁性純化的BDCA-2+BDCA-4+BDC上不誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員。示出的是Indo-1-熒光(Y-軸)針對(duì)時(shí)間(X-軸，1024值對(duì)應(yīng)于204,80秒)的依賴于Ca2+的504nm/525nm之比。A是BDCA-2+BDCA-4+血液DC、抗-BDCA-2(AC144，IgG1)。B是BDCA-2+BDCA-4+血液DC、抗-BDCA-2(AC144，IgG1)加兔抗-小鼠IgG1(X56)。C是BDCA-2+BDCA-4+血液DC、抗-BDCA-4(AD5-17F6，IgG1)加兔抗-小鼠IgG1(X56)。D是BDCA-2轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞、抗-BDCA-2(AC144，‘IgG1)加兔抗-小鼠IgG1(X56)。E是未轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞、抗-BDCA-2(AC144，‘IgG1)加兔抗-小鼠IgG1(X56)。
圖14表示將BDCA-2而不是BDCA-4與特異性mAb連接，隨后用二級(jí)交聯(lián)mAb抑制I型干擾素的分泌，其中所述I型干優(yōu)素是由來自血液或扁桃體的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC對(duì)流感病毒株P(guān)R8的刺激反應(yīng)而分泌的。在以下物質(zhì)的存在下，來自新鮮分離的血液(A)或扁桃體(B)的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC被培養(yǎng)24小時(shí)只存在IL-3(對(duì)照)；IL-3、抗-BDCA-2 mAb和兔抗-小鼠IgG1 mAb(AC144+RamG1)；IL-3、抗-BDCA-2 mAb、兔抗-鼠IgG1 mAb和流感病毒株P(guān)R8(AC144+RamG1+FLU)；IL-3和流感病毒株P(guān)R8(FLU)；IL-3、抗-細(xì)胞角蛋白mAb、兔抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株P(guān)R8(CK13+RamG1+FLU)；IL-3、抗-BDCA-4 mAb、兔抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株P(guān)R8(17F6+RamG1+FLU)。參照標(biāo)準(zhǔn)的I型干擾素(U/ml)曲線，用生物分析法測定培養(yǎng)上清液中的所分泌的I型干擾素(U/ml)。
圖15表示利用所分離的表達(dá)BDCA-2和BDCA-4的漿細(xì)胞樣DC，將抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)呈遞給特異于小鼠IgG1的T細(xì)胞克隆。與抗-ILT-3mAb(ZM3.8，IgG1，▲)和抗-細(xì)胞角蛋白mAb(CK3-11D5，IgG1，●)相比，BDCA-2+BDCA-4+漿細(xì)胞樣DC能夠更有效地將抗-BDCA-2mAb(AC144，IgG1，■)呈遞給T細(xì)胞。
圖16示出了BDCA-2和BDCA-4在扁桃體漿細(xì)胞樣CD123+DC上的表達(dá)。
圖17表示用抗-BDCA-4mAb AD5-17F6(抗-NRP-1(ML))將神經(jīng)纖毛旦白-1(GenBank登記號(hào)003873)從神經(jīng)纖毛旦白-1-轉(zhuǎn)染的PEA細(xì)胞(NP)而不是未轉(zhuǎn)染的PAE細(xì)胞(P)的細(xì)胞裂解物中免疫沉淀出來。用BDCA-4特異的mAb AD5-17F6(ML)或神經(jīng)纖毛旦白-1特異的mAb(來自麻省波士頓兒童醫(yī)院Shay Soker(Shay Soker，Children’s Hospital，Boston，MA(S)))通過SDS-PAGE和Western印跡來分析所沉淀的蛋白質(zhì)。
圖18表示將BDCA-2而不是BDCA-4與特異性mAb連接，隨后用二級(jí)交聯(lián)mAb抑制IFN-X的分泌，其中所述IFN-X是由來自血液或扁桃體的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC響應(yīng)poly IC的刺激反應(yīng)而分泌的。來自血液的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC與10μg/ml的AC144 mAb(2和4)或小鼠IgG1 mAb(CF6B，抗-TPO，1和3)在37℃下培養(yǎng)30分鐘。
圖19表示來自CLONTECH的人多組織cDNA系列的分析(泳道1心臟；泳道2腦；泳道3胎盤；泳道4肺；泳道5肝；泳道6骨骼肌；泳道7腎；泳道8胰腺；泳道9脾；泳道10胸腺；泳道11睪丸；泳道12卵巢；泳道13小腸；泳道14淋巴結(jié)；泳道15骨髓；泳道16胎兒肝臟；泳道17扁桃體)，以及對(duì)血液白細(xì)胞的不同群體所制備的cDNAs的分析(泳道18T細(xì)胞；泳道19B細(xì)胞；泳道20NK細(xì)胞；泳道21單核細(xì)胞；泳道22CD11亮CD123低BDC；泳道23用于BDCA-2 cDNA的CD11c-CD123亮漿細(xì)胞樣DC)。對(duì)照為G3PDH。
圖20示出了BDCA-2轉(zhuǎn)錄本的剪接變體。利用表達(dá)分析中所用的BDCA-2的特異性引物、通過RT-PCR來分析剪接變體。將所擴(kuò)增片段克隆到質(zhì)粒載體上并測序。
圖21示出了Dectin-2轉(zhuǎn)錄本的剪接變體。
圖22表示BDCA-2和小鼠Dectin-2的mRNA序列對(duì)比，示出了所扣除的內(nèi)含子的精確部位。在圖23中，*代表在所有對(duì)比序列中的相同保守殘基，代表保守取代，·代表半保守取代，陰影部分表示保守的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD)，斜體表示推定的跨膜結(jié)構(gòu)域。下列符號(hào)著重指出在C型凝集素間CRD中的強(qiáng)烈保守殘基

圖23示出了人BDCA-2、人DCIR和小鼠Dectin-2的氨基酸序列對(duì)比。
圖24示出了用BDCA-3特異的mAb AD5-14H12(IgG1)從表面生物素化的HD-MY-Z細(xì)胞的細(xì)胞裂解物中免疫沉淀出的BDCA-3。為控制特異性，使用了CD19特異的mAb SJ25-C1(IgG1)。利用鏈親和素-過氧化物酶通過SDS-PAGE(4-12％)和Western印跡來分析所沉淀的蛋白質(zhì)。注意，BDCA-3特異的mAb AD5-14H12從HD-MY-Z細(xì)胞中特異性免疫沉淀出大約100kD的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。于是，BDCA-3具有100kD的表觀分子量。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及富集富含DCs及其亞類的細(xì)胞群的方法。本發(fā)明還提供了由該方法獲得的富含DCs和細(xì)胞群的組合物。還提供了用于修飾細(xì)胞的方法及組合物。還提供了修飾細(xì)胞(包括遺傳修飾細(xì)胞)的組合物。還提供了這些修飾和未修飾細(xì)胞的使用方法。還提供了抗原結(jié)合片段以及被其識(shí)別的抗原。
此處所描述的是針對(duì)免疫磁性純化的CD4+lin-DC的新mAb系列，該系列可鑒定三種DC抗原BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4。BDCA-2和BDCA-3是新的。對(duì)于BDCA-4，雖然以前沒有將其描述成DC特異的抗原，但是該抗原已經(jīng)被鑒定為神經(jīng)纖毛旦白-1，即腦衰蛋白/semaphorin家族的一種介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向的受體，(He等人(1997)細(xì)胞(Cell)90739-751)。
在未培養(yǎng)的人血液中，BDCA-2和BDCA-4被嚴(yán)格限定為漿細(xì)胞樣的CD123亮CD11c-DC所表達(dá)，而BDCA-3被限定為一小群CD123-CD11c暗DC所表達(dá)。該BDCA-3+DC群與經(jīng)典的CD123暗CD11c亮DC一樣享有許多免疫表型特性，但是卻不象CD123暗CD11c亮DC，該BDCA-3+DC缺乏對(duì)CD1c(BDCA-1)、CD2和若干Fc受體的表達(dá)。
未純化的DCs來源可以是本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何一種來源，例如骨髓、胎兒、新生兒或成人或其他造血細(xì)胞來源(諸如胎兒的肝臟、外周血或者臍帶血、扁桃體、淋巴結(jié)、鼻粘膜、脾、皮膚、氣道上皮、肺、肝內(nèi)臟、集合淋巴小結(jié)等)。還可從培養(yǎng)細(xì)胞中分離出DCs(諸如由祖細(xì)胞衍生的DCs)。可用多種技術(shù)來分離細(xì)胞。例如，陰性選擇方法可最早除去非DCs。mAbs尤其可用于鑒定與特定細(xì)胞譜系和/或分化階段相關(guān)的標(biāo)記物，用于陽性和陰性選擇。
如果需要的話，可用相對(duì)粗略的陰性細(xì)胞分選法來最早除去大比例的終末分化細(xì)胞。例如，開始時(shí)可用磁珠分離法來除去大量的無關(guān)細(xì)胞。在分離DCs之前將除去至少約80％、通常是至少約70％的總量細(xì)胞。優(yōu)選地，利用陽性選擇將DC直接從細(xì)胞源中分離出來。
用于分離的方法包括(但不限于)密度梯度離心；形成玫瑰花結(jié)；與調(diào)節(jié)細(xì)胞密度的微粒的偶聯(lián)；利用抗體包被的磁珠或者抗體包被的鐵液(nonoporticles)進(jìn)行的磁分離；親和色譜；與mAb結(jié)合的細(xì)胞毒試劑或用于與mAb連接的細(xì)胞毒試劑(包括但不限于補(bǔ)體和細(xì)胞毒素)；以及用附著在固相基質(zhì)(例如板)上的抗體進(jìn)行的淘選，以及淘析或者任何其他便利的技術(shù)。
提供準(zhǔn)確分離和分析的技術(shù)包括(但不限于)磁珠分離和流式細(xì)胞術(shù)，其中流式細(xì)胞術(shù)可具有不同的復(fù)雜程度例如各種顏色通道、低角度以及鈍角光散射檢測通道、阻抗通道等等。
通過采用與死細(xì)胞相關(guān)的染料例如碘化丙啶(PI)，可針對(duì)死細(xì)胞來選擇細(xì)胞。優(yōu)選的是，將細(xì)胞收集在含2％血清(例如胎牛血清(FCS))或人血清白蛋白(HSA)的培養(yǎng)基，或任一其他合適的最好是無菌等滲的培養(yǎng)基。對(duì)于生理指征，優(yōu)選HAS。細(xì)胞的遺傳修飾可以在其維持過程中的任何時(shí)候通過以下方式獲得用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)基本上均一的細(xì)胞組成、用RNA轉(zhuǎn)染、細(xì)胞融合、負(fù)載抗原以及本領(lǐng)域公知和/或本文所描述的多種方法。
對(duì)于細(xì)胞的修飾，可采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，但也可使用任一其他適宜的載體、遞送系統(tǒng)或者細(xì)胞修飾法。這些包括例如腺病毒、腺相關(guān)病毒、人工染色體(由酵母衍生的)以及由抗原源(例如腫瘤)衍生的RNA。這種遺傳修飾即便有，也不用是永久的，因?yàn)槌墒斓腄Cs的壽命是有限的。遺傳方法可用來表達(dá)外源(腫瘤的、病毒的、寄生物等的)抗原或者DCs中的自身抗原，以便誘導(dǎo)免疫性或耐受性。也可用自殺基因控制修飾的壽命，以限定治療(類似于采用T細(xì)胞)。
轉(zhuǎn)導(dǎo)方法包括本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法，它包括(但不限于)諸如用由Bregni等人描述的方法(Bregni等人(1992)血液801418-1422)直接將細(xì)胞與生產(chǎn)者細(xì)胞共培養(yǎng)，或者諸如用由Xu等人描述的方法(Xu等人(1994)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)(Exp.Hemant.)22223-230；以及Hughes等人(1992)臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)891817)，將細(xì)胞與單獨(dú)的病毒上清液一起培養(yǎng)，或與含有或不含有合適生長因子和聚陽離子的病毒上清液一起培養(yǎng)。
將正在表達(dá)抗原或已載有抗原的修飾細(xì)胞重新導(dǎo)入宿主，以呈遞該抗原，此后T細(xì)胞被激活、無反應(yīng)或者缺失，并且是專門針對(duì)該抗原的。通常，合適的抗原包括那些被病毒感染的細(xì)胞、或者癌細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、原生動(dòng)物表達(dá)的抗原、自身抗原(耐受原)以及變應(yīng)原所表達(dá)的抗原。更具體地說，合適的抗原包括(但不限于)病毒蛋白質(zhì)、癌細(xì)胞的蛋白質(zhì)、組織特異的蛋白質(zhì)或者耐受原蛋白質(zhì)。T細(xì)胞的“誘導(dǎo)”包括諸如利用缺失或變態(tài)反應(yīng)使抗原特異的T細(xì)胞失活。失活尤其可用來分別在例如器官移殖和自身免疫紊亂中建立或者重新建立耐受性?？捎帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的任一方法施用經(jīng)修飾的DCs，這些方法包括(但不限于)靜脈施用、皮下施用、結(jié)節(jié)內(nèi)施用并直接到達(dá)胸腺。優(yōu)選靜脈施用(IV)。
通常，細(xì)胞免疫治療方法包括從人類宿主中移出骨髓白細(xì)胞收獲體或者其他細(xì)胞源，然后將細(xì)胞從來源中分離出來。同時(shí)，如果宿主將進(jìn)行造血干細(xì)胞移殖，可處理宿主，使其天生的造血能力部分、基本上或者完全被消除。在該期間可修飾被分離細(xì)胞，以便提供具有目的修飾的細(xì)胞。在完全消除造血能力的情形下，還將需要增多干細(xì)胞。然后將細(xì)胞或修飾細(xì)胞重新返回到宿主中，以便提供新的造血能力。細(xì)胞移出、宿主消除以及干/祖細(xì)胞再生的方法在本領(lǐng)域內(nèi)都是公知的。
可用任一生理上可接受的載體施用(通常為血管內(nèi)的、結(jié)節(jié)內(nèi)的和皮下的施用)修飾細(xì)胞。通常施用至少1x105個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選的是1x106個(gè)細(xì)胞或更多。可用注射、導(dǎo)管等方式施用這些細(xì)胞。如果需要的話，也可包含因子，這些因子包括(但不限于)白細(xì)胞介素(例如IL-2、IL-3、IL-4、IL-12和flt-配體以及其他白細(xì)胞介素)、集落刺激因子(諸如G、M-和GM-CSF)、干擾素(諸如γ-干擾素)。
術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以互換使用，它們是指任何長度的氨基酸殘基聚合物。該聚合物可是線性的或者分支的，它可包括修飾的氨基酸殘基或者氨基酸類似物，并且可被非氨基酸殘基的化學(xué)成分所間斷。這些術(shù)語還包括被天然修飾或者被間插修飾的氨基酸聚合物；這些方法包括(但不限于)二硫鍵的形成、糖基化、脂化、乙?；⒘姿峄蛘咂渌魏尾僮骰蛐揎椃椒?諸如與標(biāo)記物或生物活性成分結(jié)合)。除非另外指明或者暗示，否則術(shù)語“抗原結(jié)合片段”包括具有免疫特異性的任何多肽單體或者聚合物，包括完整的抗體，以及較小或者較大的功能等同的多肽(正如本文所描述的)。
1.抗原結(jié)合片段及其組合物在本發(fā)明包括特異識(shí)別DCs的抗原結(jié)合片段。即，在DCs上可找到這種抗原，從而識(shí)別該抗原的抗原結(jié)合片段優(yōu)選地識(shí)別DCs或其亞類或者與DCs或其亞類結(jié)合。或者，正如BDCA-4那樣，在其他細(xì)胞類型中可找到該抗原；但是在造血細(xì)胞內(nèi)，該抗原主要存在于DCs上。
本發(fā)明還包括包含被分離的抗原結(jié)合片段的物質(zhì)的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段可特異性結(jié)合到至少一種DC抗原上。優(yōu)選的是，該抗原結(jié)合片段為稱為AC144、AD5-13A11、AD5-20E5、AD5-17F6、AD5-4B8、AD5-5E8、AD5-14H12以及AD5-8E7的mAb，或者是由這些mAb衍生的。表1示出了每種DC特異的mAb和該mAb同種型所識(shí)別的抗原和表位。
表1

在未培養(yǎng)的人血液中，BDCA-2和BDCA-4由CD123亮CDC11c-DC群來表達(dá)。該DC群現(xiàn)在通稱為漿細(xì)胞樣DC。用BDCA-2或BDCA-4作為漿細(xì)胞樣DC的免疫磁性分離和/或流式細(xì)胞術(shù)鑒定的表面標(biāo)記物，本文以這些細(xì)胞的頻率、免疫表型、形態(tài)學(xué)、胞吞能力以及成熟來表示的結(jié)果與以前的報(bào)告完全一致，其中使用了大量的白細(xì)胞抗原。這清楚地表明，這兩種抗原都可用作未培養(yǎng)的人血液中漿細(xì)胞樣DC的標(biāo)記物?；贐DCA-2和BDCA-4的表達(dá)，對(duì)扁桃體細(xì)胞的染色表明(圖16)，外周淋巴器官中的T細(xì)胞區(qū)域相關(guān)的漿細(xì)胞樣DC還可與其他淋巴組織相關(guān)的DC群(例如生發(fā)中心DC、交錯(cuò)突DC以及濾泡DC)區(qū)別開。
與BDCA-2不同，BDCA-4還在一些體外分化的DC群上表達(dá)(1)與BDCA-2相反，BDCA-4在Mo-DC和CD34-DC上都表達(dá)；(2)一旦漿細(xì)胞樣DC在培養(yǎng)時(shí)存在IL-3介導(dǎo)的成熟，那么其上BDCA-2的表達(dá)就完全被下調(diào)了，而在所培養(yǎng)的漿細(xì)胞樣DC上BDCA-4的表達(dá)實(shí)際上是上調(diào)的；以及(3)與BDCA-2相反，BDCA-4由大部分所培養(yǎng)的CD11c+DC在12小時(shí)之內(nèi)表達(dá)，但是否只是較大的CD1c+CD11c亮群如此，還是較小的CD1c-CD11C暗CD123-群也如此，還不是十分清楚。在未培養(yǎng)的人血液中不存在BDCA-4+細(xì)胞，而存在漿細(xì)胞樣DC，這一發(fā)現(xiàn)實(shí)際上指明，在血液中不存在以上所提到的體外分化的BDCA-4+DC的對(duì)應(yīng)細(xì)胞。
通過抗-BDCA-2 mAb而進(jìn)行的BDCA-2的交聯(lián)可誘導(dǎo)抗原-Ab復(fù)合物的迅速內(nèi)化。這類似于DC成熟后被下調(diào)的其他胞吞受體諸如Langerin(Valladeau等人(2000)免疫(Immunity)1271-81)。因此，BDCA-2可能是具有抗原捕獲功能的受體。BDCA-2為C-型凝集素，可以在連接之后被迅速內(nèi)化(圖8)，并且BDCA-2配體被加工和呈遞給T細(xì)胞(圖15)。這樣，與DEC-205類似，BDCA-2具有抗原攝入和將配體呈遞至T細(xì)胞的功能。
在未培養(yǎng)的人血液中，BDCA-3的表達(dá)被限制在一小群CD1c-CD11C暗CD123-DC上。關(guān)于表型、形態(tài)學(xué)、胞吞能力以及成熟條件，該DC群與CD1c+CD11C亮CD123暗DC群非常類似。然而，免疫表型分析除了顯示BDCA-3和CD1c的表達(dá)外，還顯示了一些顯著的區(qū)別與CD1c+BDC相反，BDCA-3+BDC不表達(dá)Fc受體CD32、CD64和EcoRI，并且它們也不表達(dá)CD2。Fc受體表達(dá)的缺乏指明，BDCA-3+BDC不象CD1c+BDC，它不具有Ig介導(dǎo)的抗原攝取能力(Fanger等人(1996)免疫學(xué)雜志157541-548；Fanger等人(1997)免疫學(xué)雜志1583090-3098；以及Maurer等人(1996)免疫學(xué)雜志157607-616)。如本文所示，BDCA-3為100kD蛋白質(zhì)。
有證據(jù)表明，CD1c+CD11c亮DC與CD1c-CD11c暗DC相反，當(dāng)前者與GM-CSF、IL-4和TGF-β1一起培養(yǎng)時(shí)則具有獲得朗格漢斯細(xì)胞特征的能力(表達(dá)Lag抗原、E-鈣粘著蛋白和Langerin，以及存在伯貝克顆粒)。如果BDCA-3+DC和CD1c+DC代表相同細(xì)胞類型的成熟階段，那么這也許表明，BDCA-3+DC已經(jīng)失去或者還沒有獲得分化成朗格漢斯細(xì)胞的能力。
與本文所示的結(jié)果相反，Ito等人(1999)報(bào)道，CD1c+CD11c亮DC不象CD1c-CD11c暗DC，前者表達(dá)CD1a。兩種mAb BL-6和B-B5可用于CD1a的染色，并且當(dāng)將這兩種mAb進(jìn)行比較時(shí)確實(shí)可觀察到染色強(qiáng)度的差異(用B-B5染色可能更亮些)。如本文所示，用CD1a mAb BL-6和HI149的最佳滴度染色DC明顯為陰性，而用B-B5染色DC則為陽性。而且，不象BL-6和HI149，B-B5能對(duì)血液中高比例的CD19+B細(xì)胞染色。這樣，B-B5的染色模式顯然映射的是CD1c mAb而不是CD1a mAb，并且實(shí)際上，CD1c mAb AD5-8E7抑制B-B5與MOLT-4細(xì)胞的結(jié)合。因此，我們得出結(jié)論，B-B5識(shí)別CD1c且CD1c+DC不表達(dá)CD1a。
對(duì)CD1c+DC進(jìn)行CD1c、CD2和CD14的染色揭示出，極小比例的DC以不同程度表達(dá)CD14，并且在這些細(xì)胞上CD1c和CD2的表達(dá)水平與CD14的表達(dá)水平成反比。該觀察與線性分化模型一致，其中CD1c+CD2+CD11c亮CD14-DC是CD14+CD1c-CD1c-CD2-單核細(xì)胞的子代，而不是這兩種細(xì)胞類型共同前體的子代。這個(gè)概念發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步被以下觀察所支持相當(dāng)比例的CD14+單核細(xì)胞已經(jīng)表達(dá)非常低水平的CD2，并且當(dāng)與GM-CSF和IL-4一起培養(yǎng)時(shí)具有迅速分化為成熟DC的能力，其中所述成熟DC具有典型的樹突狀形態(tài)學(xué)和強(qiáng)大的T細(xì)胞刺激功能(Crawford等人(1999)免疫學(xué)雜志1635920-5928)。
CD1c(BDCA-1)、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4 mAb的使用提供了一種便利有效的方式，從而將DC群從PBMC、白細(xì)胞采集物材料、全血、扁桃體等中迅速檢測、計(jì)數(shù)和分離出來，而沒有明顯的功能干擾。這對(duì)它們的進(jìn)一步的功能和分子特征研究是非常有幫助的，并且對(duì)于闡明它們之間的相互關(guān)系也是有用的。而且，易于將DC群分離為均一群體的能力大大促進(jìn)了它們的臨床應(yīng)用?？乖Y(jié)合片段還可用于將DCs從組織，包括非造血組織(包括但不限于氣道上皮、皮膚、腸、肺和肝臟)和造血組織(包括但不限于扁桃體、脾、淋巴結(jié)和胸腺)中檢測、計(jì)數(shù)和/或分離出來。
正如表達(dá)其抗原結(jié)合片段的其他細(xì)胞那樣，分泌抗體的雜交瘤也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明還包括特異性識(shí)別BDCA-2或BDCA-3或BDCA-4的任何抗原結(jié)合片段。如表1和本文所提供的實(shí)施例所示，可產(chǎn)生特異性識(shí)別這些抗原的多種類型的mAbs。正如從本文所表示的結(jié)果中看到的，抗原結(jié)合片段無需識(shí)別相同抗原上的相同表位。本發(fā)明包括所有此類抗原結(jié)合片段及其組合物。
術(shù)語“抗原結(jié)合片段”包括優(yōu)選地結(jié)合到DC或其亞群上的任何部分。適宜的部分包括(但不限于)作為結(jié)合到目標(biāo)靶分子上的公知為aptomer的寡核苷酸(Hermann和Pantel(2000)科學(xué)289820-825)、糖類、凝集素、Ig片段例如Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv(包括單體和聚合體形式)以及被分離的H和L鏈。雖然親合力和/或親和力可被改變，但抗原結(jié)合片段仍保留了完整IgG的特異性。
本文所描述的某些化合物、組合物和方法通常涉及抗體及其衍生物，這些物質(zhì)已經(jīng)提供了本文的抗原決定蔟，并且可用標(biāo)準(zhǔn)的免疫化學(xué)技術(shù)按常規(guī)制備。這些物質(zhì)包括(但不限于)諸如通過化學(xué)結(jié)合作用將抗原結(jié)合片段與另一化合物偶聯(lián)，或者通過與賦形劑或佐劑混合而締合。特定的結(jié)合配偶體及其制備方法在本文有所描述，也是本領(lǐng)域內(nèi)公知的。
雖然還可用其他方法以及這些方法的組合來得到抗原結(jié)合片段(也包括其“衍生物”)，但一般通過基因工程來制備它們。該分類包括(但不限于)工程肽片段和融合肽。優(yōu)選的化合物包括含有抗-DC CDRs的多肽片段、含有細(xì)胞因子效應(yīng)子成分的抗體融合蛋白質(zhì)、含有佐劑或藥物的抗體融合蛋白質(zhì)、含有腫瘤細(xì)胞衍生的抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲抗原、酵母抗原、自身抗原或由它們衍生的抗原肽(T細(xì)胞表位)的抗體融合蛋白質(zhì)，以及單鏈V區(qū)蛋白質(zhì)。如果抗原結(jié)合片段是從人類源分離出來的，并且在其他細(xì)胞類型及其衍生物或者整個(gè)人類的染色體或其部分染色體(例如具有編碼VH、DH、JH、VL、JLL、CH、CL基因段的人類染色體的小鼠)中直接使用或克隆和表達(dá)，那么這些抗原結(jié)合片段被認(rèn)為是人類來源的。
“融合多肽”是在不同部位包括鄰接肽區(qū)域的多肽，其不是天然存在的。這些區(qū)域通常存在于分別的蛋白質(zhì)中并且被一起置于融合多肽中；它們通常可存在于相同的蛋白質(zhì)中但以一種新的重排方式被置于融合蛋白中；或者以合成方式排列它們。例如，本發(fā)明包括由抗原結(jié)合片段的功能部分和另一肽(例如毒素)組成的重組蛋白質(zhì)(以及編碼該蛋白質(zhì)的多核苷酸或其互補(bǔ)序列)。制備這些融合蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的并且例如在WO93/07286中有所描述。
多肽的“功能等同的片段”雖然保留了上下文中所用的相關(guān)片段的至少一個(gè)功能特性，但是可以與天然序列不同，它們可存在添加、刪除或替換。
抗原結(jié)合片段可用于改善與免疫紊亂有關(guān)的臨床情況。本發(fā)明還包括抗原結(jié)合片段的多肽衍生物以及在診斷、治療和新試劑的產(chǎn)生中使用這些組合物的方法。
本發(fā)明還包括與化學(xué)官能組分結(jié)合的抗原結(jié)合片段。通常該組分是能夠產(chǎn)生可檢測信號(hào)的標(biāo)記物。結(jié)合抗原結(jié)合片段的這些標(biāo)記物可用于例如檢測系統(tǒng)中，諸如在多種組織、多種疾病、干細(xì)胞移殖以后和免疫毀損治療(例如化學(xué)療法和放射)之后定量DCs，以及諸如在化學(xué)療法或自身免疫治療之后使DCs成象。此類標(biāo)記物在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的并且包括(但不限于)放射性同位素、酶、熒光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、生物發(fā)光化合物、底物輔因子、抑制劑以及磁性顆粒。指導(dǎo)使用這些標(biāo)記物的一些專利諸如有US專利號(hào)3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；以及4,366,241。這些組分可通過二級(jí)試劑(例如第二抗體、蛋白質(zhì)A或生物素-親和素復(fù)合物)而進(jìn)行共價(jià)連接、重組連接或結(jié)合(共價(jià)或非共價(jià))。
其他功能組分包括(但不限于)信號(hào)肽、增強(qiáng)免疫反應(yīng)性的試劑、促進(jìn)和固相載體偶聯(lián)的試劑、疫苗載體、生物應(yīng)答修飾劑、順磁標(biāo)記物以及藥物。信號(hào)肽包括原核和真核的形式。增強(qiáng)免疫反應(yīng)性的試劑包括(但不限于)細(xì)菌超抗原和佐劑。促進(jìn)與固相載體偶聯(lián)的試劑包括(但不限于)生物素、親和素或其衍生物。免疫原載體包括(但不限于)任何生理上可接受的緩沖劑。生物應(yīng)答修飾劑包括(但不限于)細(xì)胞因子，特別是腫瘤壞死因子(TNF)、IL-2、白細(xì)胞介素-4(IL-4)、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGF-β以及某些干擾素和趨化因子(MIP-3β、SDF-1、Lymphotactin、DC-CK1、Eotaxins、IP-10、TARC、Rantes、MIP-1x、MIP-1B、SLC、1-TAC、MIG、MDC、MCP-1、TCA-3、MCP-2、-3、-1)(還參見US專利號(hào)5,750,119；以及WO專利公開號(hào)96/10411；98/34641；98/23735；98/34642；97/10000；97/10001以及97/06821)。這些趨化因子可用來吸引其他細(xì)胞例如T細(xì)胞。
“信號(hào)肽”或“前導(dǎo)序列”是一段短的氨基酸序列，它指導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜(通常是真核細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)，以及細(xì)菌的內(nèi)膜或細(xì)菌的內(nèi)膜和外膜)。信號(hào)肽一般位于多肽的N-端，并且在多肽生物合成與從細(xì)胞內(nèi)分泌之間或穿過ER膜時(shí)被酶切去除。因此，信號(hào)肽不存在于所分泌的蛋白質(zhì)中而僅僅存在于蛋白質(zhì)產(chǎn)生的過程中。
可通過重組方式制備免疫毒素(包括單鏈結(jié)合物)。多種免疫毒素的制備在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，并且這些方法例如在Thorpe等人(1982)，臨床醫(yī)學(xué)中的單克隆抗體(Monoclonal Antibodies in Clinical Medicine)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，一書中的“Monoclonal Antibody-toxinConjugatesAiming the Magic Bullet，”168-190頁；Vitatta(1987)科學(xué)2381098-1104；以及Winter and Milstein(1991)自然349293-299)。合適的毒素包括(但不限于)蓖麻毒蛋白、放射性核素、商陸抗病毒蛋白、假單胞菌(Pseudomonas)外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A鏈、霉菌毒素例如霉菌核糖體滅活蛋白(諸如白樹素、局限曲菌素和磷脂酶酶類)(一般參見“嵌合毒素(Chimeric Toxins)，”O(jiān)lsnes和Pihl，藥物治療(Pharmac.Ther.)15355-381(1981)；以及“用于腫瘤檢測和治療的單克隆抗體(Monoloclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)，”eds.Baldwin和Byers，159-179頁，224-266，學(xué)術(shù)出版社(1985))。
例如通過產(chǎn)生融合基因而重組制備化學(xué)功能組分，其中所述融合基因偏碼抗原結(jié)合片段和來自其它基因(如酶類)的功能區(qū)。在基因融合中，這兩個(gè)成分存在于同一基因內(nèi)。另外，利用各種公知的化學(xué)工藝的任一種將抗原結(jié)合片段化學(xué)鍵合到組分上。例如，當(dāng)該組分是蛋白質(zhì)時(shí)，該鍵合可以借助同-或異-雙官能交聯(lián)銜接物(例如SPDP、SMCC、碳二亞胺戊二醛等)。該組分可通過二級(jí)試劑進(jìn)行共價(jià)連接或結(jié)合，所述二級(jí)試劑包括(但不限于)二級(jí)抗體、蛋白A或生物素-親和素復(fù)合物。順磁組分及其與抗體的結(jié)合在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(參見例如Miltenyi等人(1990)細(xì)胞計(jì)量術(shù)(Cytometry)11231-238)。
在此處，我們利用最近描述的對(duì)側(cè)足墊免疫方法(Yin等人(1997)血液905002-5012)解決了本領(lǐng)域內(nèi)所描述的難題(O’Doherty等人(1993)；以及Yamaguchi等人(1995))。該系統(tǒng)利用天然抗原特異的T細(xì)胞和B細(xì)胞，這些細(xì)胞只要不遇到抗原就可在外周淋巴器官中不斷地再循環(huán)，但是一旦它們被抗原激活，就立即在外周淋巴器官內(nèi)滯留一些天(如果不是幾個(gè)星期的話)(Picker等人(1992)免疫學(xué)年鑒(Annu.Rev.Immunol.)10561-591；Butcher等人(1996)科學(xué)27260-66；Bradley等人(1996)免疫學(xué)最新觀點(diǎn)(Curr.Opin.Immunol.)8312320；Watson等人(1998)細(xì)胞粘附通訊(Cell.Adhes.Commun.)6105-110；Kearney等人(1994)免疫1327-339；Jacob等人(1992)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志176679-687；Ridderstddd等人(1998)免疫學(xué)雜志1604688-4695；以及Tarlinton(1998)免疫學(xué)最新觀點(diǎn)10245-251)。在本文所提供的例子中，小鼠的左足墊于第-3、0、4、7、11和14天注射Bristol-8 B淋巴母細(xì)胞，而右足墊在第0、4、7、11和14天注射DC。對(duì)共有抗原(例如HLA II類分子)具有特異性的天然B和T細(xì)胞，在左腘淋巴結(jié)中于第-3和0天之間被Bristol-8細(xì)胞激活并隨即滯留在那兒，而對(duì)DC專有的抗原具有特異性的所有淋巴細(xì)胞應(yīng)該在第0天后仍可于右腘淋巴結(jié)中被激活。
這種免疫技術(shù)與用于快速分離大量DC的得力方法組合并允許制備一系列識(shí)別三種新DC抗原(BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4)的mAb。在制備其它DC特異的抗體時(shí)使用抗原可使更多傳統(tǒng)的用于制造抗體的方法具有更大的成功機(jī)會(huì)。
抗體的制備和分離方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(參見例如，Harlow和Lane(1988)抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約(AntibodyALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York))。通用的抗體純化方法包括(但不限于)鹽沉淀(例如用硫酸銨)；離子交換色譜(例如，在中性pH下在陽離子或陰離子交換柱上運(yùn)行并用離子強(qiáng)度增大的階段梯度進(jìn)行洗脫)；凝膠過濾色譜(包括凝膠過濾HPLC)；以及親和樹脂(如蛋白A、蛋白G、羥基磷灰石或抗-IgG)色譜。還可在含有DCs或其抗原部分的親和柱上純化抗原結(jié)合片段。優(yōu)選的是，先用蛋白-A-CL-瓊脂糖凝膠TM4B色譜、再用DEAE-瓊脂糖凝膠TM4B離子交換柱色譜來純化片段。
本發(fā)明還包括雜交抗體，其中從第一種抗體得到一對(duì)H和L鏈，而從第二種不同的抗體得到另一對(duì)H和L鏈。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，一對(duì)L和H鏈來自于抗-DC抗體。在一個(gè)例子中，每對(duì)L-H鏈結(jié)合到DC特異性抗原的不同表位上。也可用人源化H或L鏈形成這樣的雜交。本發(fā)明還包括其他雙特異抗體例如含有通過其恒定區(qū)而將兩個(gè)獨(dú)立的抗體共價(jià)相連所得到的抗體。
本發(fā)明包括的其他抗原結(jié)合片段是H或L鏈已經(jīng)被修飾從而可提供其他性質(zhì)的抗體。例如，氨基酸序列的變化可導(dǎo)致最終的多肽的免疫原性減小。該變化的范圍從改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基到完全重新設(shè)計(jì)一個(gè)區(qū)域例如C區(qū)結(jié)構(gòu)域。通常的變化包括(但不限于)那些與補(bǔ)體固定有關(guān)的變化、與膜受體的相互作用有關(guān)的變化以及其他效應(yīng)子功能有關(guān)的變化。也可設(shè)計(jì)重組抗體，以有助于物質(zhì)(細(xì)胞因子)特異遞送至細(xì)胞。本發(fā)明還包括肽，在這些肽中已經(jīng)以一定次序放置了多種非天然存在的Ig結(jié)構(gòu)域生成。
抗原結(jié)合片段的大小可僅僅是為了提供所需功能而需要的最小尺寸。它隨機(jī)地包括其他氨基酸序列，這對(duì)于抗原結(jié)合片段既可是天然的，也可是來自異源(正如所期望的)?？?DC抗原結(jié)合片段可以只含有來自抗體V區(qū)序列的5個(gè)連串的氨基酸殘基。還包括具有來自抗體L或H鏈V區(qū)的7個(gè)氨基酸殘基的多肽，其中氨基酸殘基的數(shù)目更優(yōu)選的是大約10個(gè)、更優(yōu)選的是大約15個(gè)、更優(yōu)選的是大約25個(gè)、更優(yōu)選的是大約50個(gè)、更優(yōu)選的是大約75個(gè)。甚優(yōu)選的是，多肽包括整個(gè)抗體L或H鏈V區(qū)。
替換的范圍從改變或修飾一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基到完全重新設(shè)計(jì)區(qū)域例如V區(qū)。氨基酸殘基替換如果存在的話，優(yōu)選的是不會(huì)有害影響肽的折疊或功能性質(zhì)的保守替換。在功能上相關(guān)的氨基酸殘基組中，可進(jìn)行保守取代的是甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸/蛋氨酸；賴氨酸/精氨酸；以及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸?？乖Y(jié)合片段可以是糖基化或非糖基化的，可以被翻譯后修飾(例如乙?；土姿峄?或者可以被合成修飾(例如連接標(biāo)記基團(tuán))。
包括L鏈和H鏈兩者的多肽衍生物可用單獨(dú)的L和H鏈形成后組裝得到，或者利用這兩條鏈的表達(dá)系統(tǒng)原位組裝而形成。通過用包含分開的L和H鏈的可轉(zhuǎn)錄區(qū)的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染或者通過用具有每條鏈的質(zhì)粒使同一細(xì)胞共轉(zhuǎn)染，可創(chuàng)立這樣的表達(dá)系統(tǒng)。在第三種方法中，用具有H鏈編碼區(qū)的合適質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入H鏈缺失的突變體。
按照供應(yīng)商的說明書用熒光素標(biāo)記的兔抗-小鼠IgG(H鏈特異的，DAKO Corporation，Carpinteria，CA)處理抗-DC抗體生成細(xì)胞，可以得到H鏈缺失突變體。用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)染色或未染色細(xì)胞群進(jìn)行分析。將未染色的細(xì)胞收集在無菌管中并通過有限稀釋，以1個(gè)細(xì)胞/孔的數(shù)量置于96-孔板中。然后用山羊抗-小鼠IgG(H鏈特異的)和山羊抗-小鼠κ通過ELISA法，測定培養(yǎng)物上清液。具有κ-陽性、IgG-陰性表型的克隆至少亞克隆3次，從而得到穩(wěn)定的抗-DC(-H)突變體。從推定的H鏈缺失突變體中分離mRNA，并測定L鏈V區(qū)cDNA的序列。用兩組5’-和3’-引物進(jìn)行VH的mRNA反相PCR，并用于克隆抗-DC(-H)cDNA。H鏈缺失突變體用這些引物產(chǎn)生檢測不到的DNA條帶。用合適的H鏈質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
本發(fā)明所包括的另一抗原結(jié)合片段衍生物是一種抗體，在這種抗體內(nèi)，H或L鏈的恒定區(qū)已經(jīng)被修飾，從而提供了其他性質(zhì)。例如，氨基酸序列的變化可導(dǎo)致最終多肽的免疫原性被改變。這些變化范圍從一個(gè)或多個(gè)氨基酸到完全重新設(shè)計(jì)恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域。這些變化估計(jì)會(huì)影響補(bǔ)體固定、與膜受體的相互作用以及其它效應(yīng)子功能。也可設(shè)計(jì)重組抗體，以利于將物質(zhì)(例如淋巴因子或由腫瘤、病毒、寄生蟲、細(xì)菌或耐受原(自身抗原)衍生的抗原或抗原肽)特異遞送到細(xì)胞上。本發(fā)明還包括蛋白質(zhì)，在這些蛋白質(zhì)中已經(jīng)以一定次序放置了多種非天然存在的Ig結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明還包括抗-DC抗體的單鏈V區(qū)片段(“scFv”)。通過用一段短的連接肽連接L和/或H鏈的V區(qū)，可制備單鏈V區(qū)片段(Bird等人(1988)科學(xué)242423-426)。具有足夠柔性和長度的任何肽都可用作scFv中的連接子。通常選擇幾乎沒有或沒有免疫原性的連接子。連接肽的一個(gè)例子是(GGGGS)3，它在一個(gè)V區(qū)的羰基端和另一個(gè)V區(qū)的氨基端之間橋連了大約3.5nm。也可使用其他連接子序列，并且其可提供其他功能例如附著到藥物或固相載體上或者將物質(zhì)(例如淋巴因子或者由腫瘤、病毒、寄生蟲或細(xì)菌或耐受原(自身抗原)衍生的抗原或抗原肽)特異遞送到細(xì)胞上。
H或L鏈的全部或任何部分都可以任何組合來使用。一般整個(gè)V區(qū)被包括在scFv內(nèi)。例如，L鏈V區(qū)與H鏈V區(qū)連接?；蛘呤?，一部分L鏈V區(qū)被連接到H鏈V區(qū)或其一部分上。還預(yù)計(jì)scFvs中的H鏈V區(qū)是來自本文所描述的抗體，而L鏈V區(qū)是來自另一Ig。可以構(gòu)建一種雙相scFs，其中一種成分是抗原結(jié)合片段，而另一種成分是不同的多肽例如T細(xì)胞表位。
可以任何次序(例如VH-(連接子)-VL或VL-(連接子)-VH)來組裝scFvs。這兩種構(gòu)型在特定表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平具有差異，其中這兩個(gè)形式之一是優(yōu)選的。還可構(gòu)建串聯(lián)的scFvs，例如(X)-(連接子)-(X)-(連接子)-(X)，其中X是scFvs或具有其他多肽的組合體。在另一實(shí)施方案中，單鏈抗體多肽沒有連接子多肽或者僅僅有一段短的無柔性的連接子。可能的構(gòu)型是VL-VH和VH-VL。該鍵合太短以致于鏈內(nèi)的VL和VL之間不能發(fā)生相互作用，并且這些鏈在每一末端與VL/VH抗原結(jié)合位點(diǎn)形成同源二聚體。這些分子可稱作“雙抗體”。
scFvs可以重組或合成的方法來制備。對(duì)于scFv的合成制備，可用自動(dòng)合成儀。對(duì)于scFv的重組制備，可將一種含有編碼scFv的多核苷酸的合適質(zhì)粒導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞(既可是真核的諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，也可是原核的諸如大腸桿菌(Escherichia coli))中，并且用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)來分離被表達(dá)的蛋白質(zhì)。還可從噬菌體展示文庫獲得scFvs。
用于制備scFvs的一種特別有用的系統(tǒng)是質(zhì)粒pET-22b(+)(Novagen，Madison，WI)。大腸桿菌pET-22b(+)含有由6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基組成的鎳離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它使表達(dá)的蛋白質(zhì)可在合適的親和樹脂上純化。合適載體的另一個(gè)例子是pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)。
基因表達(dá)的條件優(yōu)選可確保scFv擁有最佳三級(jí)結(jié)構(gòu)的條件。依據(jù)所用的質(zhì)粒(啟動(dòng)子活性)以及宿主細(xì)胞，需要調(diào)節(jié)制備速率。例如，使用較弱的啟動(dòng)子或者在低溫下進(jìn)行表達(dá)，這都是在原核系統(tǒng)中制備正確折疊的scFv所必需的優(yōu)化；或者，它可用于在真核細(xì)胞中表達(dá)scFv。
本發(fā)明還包括抗原結(jié)合片段的聚合形式，其含有多個(gè)DC特異的抗原結(jié)合片段。一個(gè)實(shí)施方案是任意結(jié)合到載體上的抗原結(jié)合片段的線性聚合物。這些線性聚合物可包括單個(gè)抗原結(jié)合片段多肽的多個(gè)拷貝或者為不同多肽的組合體，并且可具有串聯(lián)多肽或者被其他氨基酸序列分開的多肽。
另一實(shí)施方案是多個(gè)抗原肽(MAPs)。MAPs具有一個(gè)小的免疫惰性核心，該核心具有放射狀分支的賴氨酸樹突，在其上共價(jià)附著有許多抗原結(jié)合片段多肽(參見例如，Posnett等人(1998)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)2631719-1725；以及Tam(1989)Met.Enz.1687-15)。結(jié)果得到了一個(gè)大型的高分子，該分子的抗原結(jié)合片段多肽與核心的摩爾比較高。MAPs是有效的免疫原并且對(duì)于免疫分析是有用的抗原。用于創(chuàng)建MAPs的核心可用標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)來制備或者從商業(yè)上得到(Quality ControlledBiochemicals，Inc.，Hopkinton，MA)。一般的核心基質(zhì)是由三個(gè)水平的賴氨酸和8個(gè)氨基酸殘基組成。
本發(fā)明還包括針對(duì)本發(fā)明的DC特異的抗原結(jié)合片段的抗-獨(dú)特型抗原結(jié)合片段。這種抗-獨(dú)特型可用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法來制備。
癌癥病人經(jīng)常是免疫抑制的，并且對(duì)一些腫瘤相關(guān)抗原(TAA)是耐受的。觸發(fā)對(duì)這些TAA的活性免疫應(yīng)答在癌癥治療中是一個(gè)重要的挑戰(zhàn)。用特定抗原進(jìn)行的免疫可產(chǎn)生包括CTL應(yīng)答(最好是強(qiáng)的CTL)應(yīng)答的免疫應(yīng)答。如果腫瘤細(xì)胞被ADCC(抗體依賴的細(xì)胞的細(xì)胞毒性)殺死，那么產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體是有幫助的。本發(fā)明包括DCs的用途，其用于通過本領(lǐng)域公知的方法誘導(dǎo)特異的免疫應(yīng)答，其中所述DCs是用本發(fā)明的抗原結(jié)合片段鑒定和分離的。這些免疫應(yīng)答對(duì)任何抗原都是特異的，這些抗原包括(但不限于)與癌癥、傳染性病毒、傳染性細(xì)菌、傳染性寄生蟲、傳染性酵母以及自身免疫疾病(誘導(dǎo)耐受性)有關(guān)的那些抗原。分離適于獨(dú)特誘導(dǎo)這些應(yīng)答的亞群的能力導(dǎo)致對(duì)比亞群混合物更有效的DCs的制備。雜交細(xì)胞(例如DC/腫瘤細(xì)胞)也可用作癌癥特異的治療物質(zhì)。本發(fā)明還包括修飾細(xì)胞(包括但不限于，相對(duì)于它們的T輔助細(xì)胞極化能力(Th1 v Th2 v Th3/rh-R)而被激活、體外成熟、被調(diào)理，以及相對(duì)于它們的T細(xì)胞刺激或無反應(yīng)或缺失能力而被調(diào)理)，這些細(xì)胞包括(但不限于)遺傳修飾的轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以及已經(jīng)與適合抗原呈遞或內(nèi)化的肽或蛋白質(zhì)一起溫育的細(xì)胞。亞群包括(但不限于)在一個(gè)譜系內(nèi)的特定分化階段以及單獨(dú)的分化譜系。
本發(fā)明還提供了DCs、其亞群及其混合物。用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任一分離方法使用本文所提供的抗原結(jié)合片段來選擇這些細(xì)胞。本發(fā)明還包括含有所分離的細(xì)胞的組合物。這些組合物包括含有所分離的細(xì)胞的藥物和治療組合物以及任何其他組合物。利用本文所描述的方法分離的Ds亞群優(yōu)選地基本上是均一的。即利用BDCA特異的抗原結(jié)合片段分離的細(xì)胞優(yōu)選大于約80％的細(xì)胞為BDCA+，更優(yōu)選的是大于約90％的細(xì)胞為BDCA+，最優(yōu)選的是大于約95％的細(xì)胞為BDCA+。當(dāng)然，細(xì)胞與其他DCs或者其他造血細(xì)胞的后續(xù)組成都可減小BDCA+細(xì)胞的百分比，這些組成也包括在本發(fā)明內(nèi)。
同樣，利用本文所描述的方法得到的DCs適用于本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何治療方法。本發(fā)明還包括為了實(shí)現(xiàn)這些方法而被改變的DCs。這些方法包括(但不限于)
a)治療利用所分離的DCs來誘導(dǎo)自身免疫疾病、變態(tài)反應(yīng)、移植物抗宿主病(GvHD)、同種移殖排斥中的特異性T細(xì)胞的耐受性(殺死或無反應(yīng)而不是刺激)。例如，可修飾特異于這些T細(xì)胞的DCs，以使經(jīng)修飾的DCs含有裂解、失活或者死亡誘導(dǎo)組分，從而例如可通過抗原標(biāo)記或遺傳修飾(如通過CD95L轉(zhuǎn)染)來特異性靶向不想要的免疫應(yīng)答中所涉及的T細(xì)胞。DC的T細(xì)胞特異性主要是由MHC I和II呈遞合適的T細(xì)胞表位(肽類)而引起的。具有耐受性誘導(dǎo)功能的特定DCs亞類可直接施與病人?？衫眯揎桪Cs來介導(dǎo)外周的耐受性，以便誘導(dǎo)T細(xì)胞的缺失(殺死)、無反應(yīng)性和抑制/調(diào)節(jié)；b)免疫調(diào)節(jié)治療利用所分離的DCs來誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞中的特定的細(xì)胞因子表達(dá)分布。這對(duì)于影響Th1(用于特異性炎癥免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子)、Th2(用于特異性體液免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子)或Th3(用于特異性免疫抑制的細(xì)胞因子)細(xì)胞因子的產(chǎn)生尤其有用。例如在變態(tài)反應(yīng)和哮喘中，Th1應(yīng)答的誘導(dǎo)可減小或消除產(chǎn)生癥狀的Th2應(yīng)答；c)治療利用呈遞抗原的DCs進(jìn)行的治療，其中所呈遞的抗原包括(但不限于)腫瘤抗原、病毒抗原和細(xì)胞抗原d)治療用足以調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的DCs(呈遞或不呈遞抗原)和多種輔因子的用量和條件下而進(jìn)行的治療，其中所述輔因子包括(但不限于)細(xì)胞因子、共刺激分子和效應(yīng)子分子；以及e)體外刺激T細(xì)胞，以便得到抗原特異的T細(xì)胞。
本文所描述的抗原結(jié)合片段還適用于許多治療方法。這些方法包括(但不限于)a)抗體模擬諸如自身免疫中所涉及的DCs的配體或配體介導(dǎo)的免疫治療，或者為了最佳及選擇性攝取/轉(zhuǎn)染而在體內(nèi)使抗原或核酸(病毒、質(zhì)粒DNA、RNA等)靶向DCs。BDCA-2在該上下文中尤其有用，因?yàn)樗磥硎蔷哂锌乖瓟z取和處理功能的分子；以及b)免疫監(jiān)測例如對(duì)多種疾病中BDCA-2+、BDCA-3+和BDCA-4+的計(jì)數(shù)和鑒定以及在諸如用增殖誘導(dǎo)配體(如flt3-配體或G-CSF)進(jìn)行動(dòng)員后對(duì)BDCA-2+、BDCA-3+和BDCA-4+進(jìn)行計(jì)數(shù)和鑒定。
對(duì)宿主無害的任何載體都可用于DCs。合適的載體一般是大的且代謝慢的大分子例如蛋白質(zhì)類；多糖類(諸如膠乳功能化瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、纖維素、纖維素珠等)；聚合氨基酸殘基類(諸如聚谷氨酸、聚賴氨酸等)；氨基酸共聚物類；以及失活的病毒顆?；驕p毒細(xì)菌(諸如沙門氏菌(Salmonella))。
2.獲得其他DC特異的抗原結(jié)合片段的方法本發(fā)明包括獲得DC特異的抗原結(jié)合片段的方法。
如下詳述了制備新的DC特異的抗原結(jié)合片段的方法，其包括(但不限于)1)采用噬菌體展示技術(shù)，通過該技術(shù)、用PCR和特異于樣本特異的V區(qū)的寡核苷酸引物，使編碼抗體庫的cDNA由淋巴細(xì)胞或脾RNA優(yōu)選地被擴(kuò)增；2)用抗原免疫哺乳動(dòng)物并產(chǎn)生多克隆或mAbs；以及3)用噬菌體展示而不用事先免疫，通過在噬菌體上展示很大且不同的V基因庫來制備抗體。(一般參見，Hoogenboom等人(1998)免疫技術(shù)(Immunotechnol.)41-20)。優(yōu)選的是，為了達(dá)到治療目的，如果待用的是非人抗原結(jié)合片段，那么可以利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法對(duì)這些片段進(jìn)行人源化。
可以采用Medez等人描述的方法(Medez等人(1997)自然遺傳學(xué)(Nature Genetics)18410)。簡要地說，將純化抗原用來免疫轉(zhuǎn)基因小鼠，其中所述轉(zhuǎn)基因小鼠的種系表型缺乏天然的鼠抗體庫，取而代之的是具有大多數(shù)的人抗體V基因。其次通過鼠B細(xì)胞制備人抗體。通過PCR文庫選擇技術(shù)或經(jīng)典的雜交瘤技術(shù)從B細(xì)胞中獲得抗體基因。
另外，在用純化的DC特異性抗原注射小鼠(例如BALB/c)之后可從小鼠獲得抗體。用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)可產(chǎn)生mAbs(Maiti等人(1997)Biotechnol.Int.185-93(人雜交瘤)；以及Kohler和Milstein(1975)自然256495-497(小鼠雜交瘤))。接下來諸如利用Rosok等人描述的方法可對(duì)鼠抗體人源化(Rosok等人(1996)生物化學(xué)雜志27122611-22618；Baca等人(1997)生物化學(xué)雜志27210678-10684；Rader等人，美國國家科學(xué)院院報(bào)958910-8915；以及Winter和Milstein(1991)自然349293-299)。
還可以利用噬菌體展示技術(shù)來迅速產(chǎn)生抗DCs的人抗體。該技術(shù)可采用Henderikx等人描述的方法(Henderikx等人(1998)癌研究(CancerRes.)584324-32)。從含有不同單鏈抗體的大的天然噬菌體抗體/片段文庫中，通過分離那些結(jié)合到固定抗原或DCs上的抗體片段而選擇噬菌體上所展示的抗體片段。從種系V結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的天然庫或者從合成的在構(gòu)架和CDR區(qū)中存在許多突變(利用同源基因重配或易錯(cuò)PCR來靶向的突變)的構(gòu)架庫中選擇人抗體片段。通過篩選抗腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞(如本文所述)可鑒定與DCs發(fā)生特異性反應(yīng)的抗原結(jié)合片段，以便鑒定DC特異的抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明還包括鑒定特異于DCs的抗原結(jié)合片段的方法，該方法包括首先產(chǎn)生一個(gè)適宜的噬菌體展示文庫；其次分離DC特異的抗原；按照標(biāo)準(zhǔn)的免疫化學(xué)技術(shù)用抗原篩分噬菌體展示文庫，以便得到展示特異結(jié)合DCs的抗原結(jié)合片段的噬菌體；或者通過篩分抗DCs和抗其他相關(guān)細(xì)胞(例如APCs)并選擇優(yōu)選地結(jié)合DCs的噬菌體，從而對(duì)所得到的噬菌體展示文庫篩分DC特異的抗原結(jié)合片段。利用噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生抗原結(jié)合片段的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的(Hoogenboom等人(1998))。
通常用淋巴細(xì)胞(PBL)或脾RNA制備抗體片段庫。用同源重配或易錯(cuò)PCR進(jìn)行的誘變?cè)黾恿硕鄻有?。可以采用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法。
用PCR可從免疫小鼠或人擴(kuò)增抗體基因庫，且可克隆并在細(xì)菌噬菌體表面表達(dá)由此得到的scFv或Fab抗體片段。用PCR和特異于針對(duì)宿主動(dòng)物特異的V區(qū)的寡核苷酸引物，從淋巴細(xì)胞或脾RNA擴(kuò)增抗體基因庫。還可以用噬菌體展示而不用事先免疫，通過在噬菌體上展示很大且不同的V基因庫來制備抗體。用PCR擴(kuò)增可分離PBL內(nèi)存在的天然V基因庫，并且可用PCR將VH和VL區(qū)隨機(jī)剪接到一起。利用同源基因重配或易錯(cuò)PCR可使突變靶向V結(jié)構(gòu)域基因(Zhao等人(1998)自然生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)15258；以及Hoogenboom等人(1998))。還可創(chuàng)建完全合成的人類文庫并用于對(duì)DC特異的抗體片段進(jìn)行篩分。不管用何種方法來操作噬菌體展示文庫，每個(gè)得到的噬菌體都具有在其表面上展示的功能抗體片段并在噬菌體基因組中含有編碼該抗體片段的基因(參見例如，WO97/02342)。
用來將結(jié)合抗體從未結(jié)合的抗體中分出的親和層析法已建立了一些時(shí)候(Nissim等人(1994)EMBO J.13692-698；以及Vaughan等人(1996)自然生物技術(shù)14309-314)。影響成功的關(guān)鍵參數(shù)是所產(chǎn)生的抗特定抗原的抗體片段的數(shù)量和親和力。直到最近，大且多樣的文庫的創(chuàng)建在某種程度上仍然是困難的。以前由VH和VL RT-PCR產(chǎn)物來直接組裝scFv庫。RNA的有效性以及PT-PCR的效率是可得到的V基因數(shù)量的限制因素。而且，組裝需要連接三個(gè)片段即VH和VL以及連接子區(qū)域(Marks等人(1991)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)222581-579)。
一種改進(jìn)的文庫構(gòu)建方法是在分別的質(zhì)粒載體中克隆VH和VL基因庫，以便為scFv的組裝提供穩(wěn)定的和無限的材料(Sheets等人(1998)美國國家科學(xué)院院報(bào)956175-6162)。而且，編碼連接子區(qū)域的DNA位于VL文庫的5’端，因此增大了效率。于是，只有兩個(gè)(而不是三個(gè))片段被連接。
還可衍生或操縱抗-DC-抗原結(jié)合片段。例如，通過制備一系列短的，連起來可跨越整個(gè)V區(qū)氨基酸序列的多肽，可篩分L和H鏈的V區(qū)免疫原活性。用一系列長度為20或50個(gè)氨基酸殘基的多肽，可考查每個(gè)V區(qū)的有用的功能性質(zhì)。也可對(duì)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，以鑒定潛在的免疫原多肽。然后合成并測試這些多肽。
本發(fā)明還包括將本文所述抗原結(jié)合片段以不同方式組合而得到的多種適應(yīng)型，以便產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的其他抗-DC抗原結(jié)合片段。例如，在MAPs內(nèi)可包括具有修飾殘基的抗原結(jié)合片段。在另一例子中，將scFv與細(xì)胞因子(例如IL-2)融合。所有這些組合物都包括在本發(fā)明中。
可用任何適宜的工藝(包括蛋白酶解、重組方法或化學(xué)合成)制備這些抗原結(jié)合片段。這些方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的因此無需詳細(xì)描述。蛋白水解酶的例子包括(但不限于)胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、枯草蛋白酶、纖溶酶以及凝血酶。完整的抗原結(jié)合片段與一種或多種蛋白酶同時(shí)或順序溫育?；蛘呤?，另外用二硫化物還原劑處理完整的抗體。然后用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)使肽彼此分離，這些技術(shù)包括(但不限于)凝膠過濾色譜、凝膠電泳以及反相HPLC。還可通過利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法在適宜的表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)由編碼肽的多核苷酸進(jìn)行表達(dá)，而制備抗-DC抗原結(jié)合片段。一般在合適的啟動(dòng)子的控制下，將編碼適當(dāng)多肽的多核苷酸連接到表達(dá)載體上，并用于遺傳上改變預(yù)期的宿主細(xì)胞?？墒褂谜婧思霸怂拗飨到y(tǒng)。然后將這些多肽從裂解細(xì)胞分離或從培養(yǎng)基中分離出來并純化到預(yù)期使用所需的程度。適用于本發(fā)明的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)以及任何其它適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞。真核宿主細(xì)胞的例子包括(但不限于)酵母、禽、昆蟲、植物以及動(dòng)物細(xì)胞(例如COS7、HeLa以及CHO細(xì)胞)。
任選的是，可包括基質(zhì)涂覆的通道或珠以及細(xì)胞共培養(yǎng)，以便增強(qiáng)產(chǎn)生抗原結(jié)合片段的細(xì)胞的生長。為了生成大量的mAbs，獲得腹水一般是更便利的。得到腹水的方法一般包括將雜交瘤細(xì)胞注射到免疫天然的、組織相容的或免疫耐受的哺乳動(dòng)物(特別是小鼠)體內(nèi)。為了制備腹水，可以通過事先施用適宜的組合物(例如降植烷)來致敏哺乳動(dòng)物。將腹水從動(dòng)物體內(nèi)取出并處理，以分離抗體。
另外，可用本公開文本中提供的氨基酸序列數(shù)據(jù)以及其它信息、結(jié)合蛋白質(zhì)合成的標(biāo)準(zhǔn)方法來化學(xué)合成抗原結(jié)合片段。適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ枪滔郙errifield技術(shù)。自動(dòng)肽合成儀為商業(yè)上可購得的，例如由AppliedBiosystems，Inc.(Foster City，CA)制造的那些設(shè)備。
獲得抗-DC抗原結(jié)合片段的另一方法是用BDCA-2、BDCA-3和/或BDCA-4免疫合適的宿主動(dòng)物，隨后實(shí)施用于制備和分離多克隆或mAb的標(biāo)準(zhǔn)方法。利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的技術(shù)可以使如此制備的mAbs“人源化”。于是，本發(fā)明包括人源化mAbs。
在“人源化”抗體中，至少部分序列已經(jīng)從其初始形式被改變，從而使其具有更類似于人的Ig。在一種版本中，H鏈和L鏈C區(qū)被人的序列所取代。這是包括抗-DC V區(qū)及異源Ig(C)區(qū)的融合多肽。在另一種版本中，CDR區(qū)包括抗-DC氨基酸序列，而V構(gòu)架區(qū)也被轉(zhuǎn)換為人的序列(參見例如，EP0329400)。在第三種版本中，通過設(shè)計(jì)人和小鼠V區(qū)的共有序列并轉(zhuǎn)換CDRs外共有序列間不同的殘基，可使V區(qū)人源化。
在制備人源化抗體時(shí)，構(gòu)架殘基的選擇有助于保留高的結(jié)合親和力。原則上，來自任何人類抗體的構(gòu)架序列可用作CDR接枝的模板；然而，業(yè)已證實(shí)，這些構(gòu)架內(nèi)的直接CDR替換可導(dǎo)致抗原結(jié)合親和力明顯喪失(Glaser等人(1992)免疫學(xué)雜志1492606；Tempest等人(1992)生物技術(shù)(Biotechnol.)9266；以及Shalaby等人(1992)免疫學(xué)雜志17217)。人類抗體與原始的鼠抗體越同源，人類構(gòu)架就越不可能將可減小親和力的變形引入鼠CDTs內(nèi)?；趯?duì)抗體序列數(shù)據(jù)庫所進(jìn)行的序列同源性檢索，雖然人類抗體IC4提供了與muM4TS.22好的構(gòu)架同源性，其它高度同源的抗體也是合適的，特別是來自人類亞組I的κL鏈或者來自人類亞組III的H鏈(Kabat等人(1987))。多種計(jì)算機(jī)程序(例如ENCAD)可為V區(qū)預(yù)測理想的序列(Levitt等人(1983)分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)168595)。本發(fā)明于是包括具有不同V區(qū)的人類抗體。測定適當(dāng)?shù)腣區(qū)序列并使這些序列最佳，這在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。獲得免疫原性降低的抗體的方法在US專利號(hào)5,270,202和EP699,755中也有所描述。
在某些應(yīng)用中，諸如當(dāng)抗原結(jié)合片段或DCA在適宜的貯存介質(zhì)(諸如植物種子)中表達(dá)時(shí)，無需純化就可貯存抗原結(jié)合片段(Fiedler等人(1995)生物技術(shù)131090-1093)。對(duì)于大多數(shù)應(yīng)用，一般優(yōu)選的是，多肽至少部分地被從其它細(xì)胞組分中純化出來。優(yōu)選的是，所純化出來的肽至少約為總蛋白質(zhì)重量百分比的50％純。更優(yōu)選的是，該肽至少約為50-75％純。對(duì)于臨床應(yīng)用，優(yōu)選的是，該肽至少約為80％純。
如果給個(gè)體施用這些肽，那么肽的純度優(yōu)選地至少為80％，更優(yōu)選地至少為90％，甚優(yōu)選地至少為95％，并且沒有熱原和其它污染物。在上下文中，百分純度是以制備物占總蛋白質(zhì)內(nèi)容物的重量百分比來計(jì)算的，并不包含特意加入到組合物純化過程中的成分。
本發(fā)明還包括檢測、計(jì)數(shù)和/或鑒定生物樣品中的DCs及其亞類的方法以及測定體液中諸如可溶性BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4抗原和/或DCs的方法。這些方法包括獲得生物樣品；然后在允許抗體-抗原結(jié)合的條件下使樣品與本文所述的抗原結(jié)合片段接觸，并且如果存在結(jié)合的話，檢測抗體與樣品的結(jié)合以及抗體與對(duì)照生物樣品的結(jié)合進(jìn)行比較。
例如通過對(duì)DC濃度或抗原濃度進(jìn)行濃縮而適當(dāng)制備生物樣品之后，在可使DCs或抗原與抗體之間形成復(fù)合物的條件下，使樣品與過量的抗原結(jié)合片段混合。然后測定所形成的復(fù)合物的量或者承載DCs的復(fù)合物的數(shù)目，并最終將其與用標(biāo)準(zhǔn)樣品所形成的復(fù)合物進(jìn)行比較，其中該標(biāo)準(zhǔn)樣品在預(yù)期或已知的DC濃度范圍內(nèi)含有已知量的靶抗原。利用免疫沉淀法或濁度法可觀察復(fù)合物的形成，但是該形成一般對(duì)諸如用放射性同位素(例如125I)、酶(例如過氧化物酶和β-半乳糖苷酶)或熒光發(fā)色團(tuán)(熒光素)這些標(biāo)記物標(biāo)記的試劑更靈敏。檢測細(xì)胞或抗原的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。對(duì)于細(xì)胞檢測，流式細(xì)胞術(shù)尤其有用，而對(duì)于抗原檢測，ELISA是優(yōu)選的。
利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何免疫分析法可以測試抗-DC抗原結(jié)合片段對(duì)抗原的特異性識(shí)別。任何形式的直接結(jié)合分析方法都是適宜的。在一種這樣的分析方法中，結(jié)合對(duì)成分之一、抗原或推定抗原結(jié)合片段之一被標(biāo)記。合適的標(biāo)記物包括(但不限于)放射性同位素(例如125I)、酶(例如過氧化物酶)、熒光標(biāo)記物(例如熒光素)以及化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。一般參考結(jié)合的另一方是不溶的(例如通過包被在固相諸如微滴板上)，從而易于除去未結(jié)合的可溶性結(jié)合方。當(dāng)標(biāo)記的結(jié)合方與未標(biāo)記的結(jié)合方進(jìn)行結(jié)合之后，洗滌固相并測定結(jié)合標(biāo)記物的量。
當(dāng)用于免疫治療時(shí)，本文所述的抗原結(jié)合對(duì)可用治療劑標(biāo)記或不標(biāo)記(正如本文所述以及本領(lǐng)域內(nèi)所公知的)。這些試劑可直接或間接偶聯(lián)到本發(fā)明的抗原結(jié)合片段上。直接偶聯(lián)的一個(gè)例子是使用間隔組分。這些間隔組分既是可溶的也可是不溶的(Diener等人(1986)科學(xué)231148)，并選擇這些組分以便能夠在靶位點(diǎn)釋放藥物。用于免疫治療的、能夠偶聯(lián)抗原結(jié)合片段的治療劑的例子包括(但不限于)抗原(包括腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲衍生的抗原以及自身抗原)、生物應(yīng)答修飾劑、藥物、放射性同位素、凝集素和毒素。生物應(yīng)答修飾劑包括細(xì)胞因子和趨化因子，其中這些細(xì)胞因子和趨化因子包括(但不限于)IL-2、IL-3、IL-4、G-CSF、GM-CSF、IL-10、IL-12、TGF-β、MTP-AB、SDF-1、淋巴細(xì)胞激活素、DC-CK1、Eotoxins、IP-10、TACR、Rantes、MIP-1α、MIP-1β、SLC、ITAC、MIE、MDC、MCP-1、TCA-3、MCP-2、-3、-4和干擾素。標(biāo)記抗原結(jié)合片段的干擾素包括IFN-α、IFN-β和IFN-γ以及它們的亞類。
在為了免疫治療而使用放射性同位素結(jié)合的抗原結(jié)合片段時(shí)，某些同種型與其它型相比是更優(yōu)選的，這取決于諸如同種型的穩(wěn)定性和發(fā)射性這些因素。如果需要的話，可利用下述的體內(nèi)診斷技術(shù)來評(píng)估由抗原結(jié)合片段進(jìn)行的細(xì)胞群識(shí)別。通常，釋放α和β粒子的同位素在免疫治療中是優(yōu)選的。例如，能夠穿透組織若干毫米的高能β發(fā)射體(90Y)是優(yōu)選的。另一方面，短范圍的高能α發(fā)射體(212Bi)也是優(yōu)選的。用于治療目的的，能夠結(jié)合到本發(fā)明的抗原結(jié)合片段上的同位素的例子包括(但不限于)125I、131I、90Y、67Cu、212Bi、211At、212Pb、47Sc、109Pd以及188Re。
凝集素通常為從植物材料中分離出來的蛋白質(zhì)，其與特定的糖組分結(jié)合。許多凝集素還能夠凝集細(xì)胞并刺激淋巴細(xì)胞。然而，蓖麻毒蛋白是一種已經(jīng)在免疫治療上使用的有毒凝集素。優(yōu)選地通過將蓖麻毒蛋白的α肽鏈與抗體分子結(jié)合而獲得，該肽鏈負(fù)責(zé)對(duì)抗體的毒性，從而能夠?qū)Χ拘宰饔眠M(jìn)行位點(diǎn)特異性遞送。
毒素是由植物、動(dòng)物或微生物產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，其在足夠劑量時(shí)通常是致命的。白喉毒素是一種由可在治療上使用的白喉棒桿菌(Corynebacterium diphtheria)產(chǎn)生的物質(zhì)。這種毒素由在適當(dāng)條件下可分離的α和β亞單位構(gòu)成。有毒的A鏈成分可結(jié)合到本文所述的抗原結(jié)合片段上并用于位點(diǎn)特異性遞送到DCs的特定亞類上。
重組方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。除非另外指出，否則本發(fā)明實(shí)際上利用的是分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在諸如以下文獻(xiàn)中得到充分的解釋“分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”，第二版(“MolecularColningA Laboratory Manual”，second edition)(Sambrook等人，1989)；“寡核苷酸合成”(“Oligonucleotide Synthesis”)(Gait，ed，1984)；“動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)”(“Animal Cell Culture”)(Freshney，edd.，1987)；“酶學(xué)方法”(“Methods in Enzymology”)(Academic Press，Inc.)；“實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)手冊(cè)”(“Handbook of Experimental Immunology”)(Wei和Blackwell，eds.)；“哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體”(“Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells”)(Miller和Calos，eds.，1987)；“分子生物學(xué)最新方法”(“Current Protocols in Molecular Biology”)(Ausubel等人，eds.，1987)；“PCR聚合酶鏈反應(yīng)”(“PCRThe Polymerase ChainReaction”)，(Mullis等人，eds.，1994)；以及“免疫學(xué)最新方法”(“CurrentProtocols in Immunology”)(Coligan等人，eds.，1991)。這些技術(shù)可用來制備多核苷酸和多肽，并因此被認(rèn)為可以再現(xiàn)和實(shí)施本發(fā)明。特別有用的技術(shù)將在以下部分討論。
本發(fā)明提供了多種編碼BDCA抗原的多核苷酸。本發(fā)明還包括為這些抗原的功能上等同的變體和衍生物及其功能上等同的片段進(jìn)行編碼的多核苷酸，這些多核苷酸可增強(qiáng)、減小或不顯著地影響由其編碼的多肽的性質(zhì)。這些功能上等同的變體、衍生物和片段可展示出特異性結(jié)合到其各自抗體上的能力。例如，不會(huì)顯著影響被編碼多肽的性質(zhì)的變化包括(但不限于)不改變被編碼氨基酸序列的DNA序列的變化，以及導(dǎo)致氨基酸殘基被保守替換的DNA序列的變化，一個(gè)或一些氨基酸殘基缺失或添加，以及氨基酸殘基被氨基酸類似物所替換。保守的替換是那些保守的氨基酸替換，包括甘氨酸/丙氨酸；纈氨酸/異亮氨酸/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨酸/谷氨酸；絲氨酸/蘇氨酸/蛋氨酸；賴氨酸/精氨酸；以及苯丙氨酸/酪氨酸/色氨酸。
本發(fā)明的多核苷酸可包括其它序列諸如在同一轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的其它編碼序列、控制元件(例如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及聚腺苷酸化位點(diǎn))、在相同或不同的啟動(dòng)子控制下的其它轉(zhuǎn)錄單位、可對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行克隆、表達(dá)和轉(zhuǎn)化的序列，以及諸如可提供本發(fā)明的實(shí)施方案的任何結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明包括與編碼BDCA-2和BDCA-3的多核苷酸(最好是圖12所示的cDNA序列)形成穩(wěn)定雜交體的多核苷酸，該多核苷核至少有大約15個(gè)連續(xù)核苷酸，而且優(yōu)選的是至少大約20個(gè)核苷酸，更優(yōu)選的是至少大約25個(gè)連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選的是至少大約35個(gè)連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選的是至少大約50個(gè)連續(xù)的核苷酸，甚優(yōu)選的是至少大約75個(gè)核苷酸，更甚優(yōu)選的是至少大約100個(gè)核苷酸，更甚優(yōu)選的是至少大約200個(gè)核苷酸，還更優(yōu)選的是至少大約300個(gè)核苷酸。只要存在至少一組條件，其中測試多核苷酸顯示了所需特異性，那么任何系列組條件都可用于這種測試。可在不同的“嚴(yán)緊”條件下進(jìn)行雜交反應(yīng)。增大雜交反應(yīng)嚴(yán)緊性的條件已經(jīng)被公開(參見例如，Sambrook和Maniatis)。相關(guān)條件的例子包括(為了增大嚴(yán)緊性)25℃、37℃、50℃和68℃的溫育溫度；10xSSC、6xSSC、1xSSC、0.1xSSC(其中SSC是0.15M的NaCl和15mM的檸檬酸緩沖液)的緩沖液濃度，以及它們用其它緩沖系統(tǒng)的等同物；0％、25％、50％和75％的甲酰胺濃度；5分鐘至24小時(shí)的溫育時(shí)間；1次、2次或更多的洗滌步驟；1分鐘、2分鐘或15分鐘的洗滌溫育時(shí)間；以及6xSSC、1xSSC、0.1xSSC或去離子水洗滌液。
本發(fā)明還提供了編碼BDCA多肽的多核苷酸。優(yōu)選的是，這些多肽是圖12中的那些或者是由其衍生的。
本發(fā)明還包括與可檢測的標(biāo)記物共價(jià)連接的多核苷酸。這樣的多核苷酸是有用的，例如可用作檢測相關(guān)核苷酸序列的探針。
利用化學(xué)合成、重組克隆方法、PCR或這些方法的任何組合可得到本發(fā)明的多核苷酸?；瘜W(xué)多核苷酸合成方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的，并且在本文中無需詳細(xì)描述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用本文提供的序列數(shù)據(jù)、通過利用DNA合成儀或者從商業(yè)服務(wù)部門訂貨，可得到所需的多核苷酸。
另外，編碼BDCAs的核苷酸以及由其編碼的肽可以從生成細(xì)胞系、克隆載體或表達(dá)載體中得到。利用標(biāo)準(zhǔn)的重組技術(shù)可分離、擴(kuò)增和處理編碼所需序列的RNA或DNA。這些技術(shù)包括用限制性核酸酶的消化方法以及用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的擴(kuò)增方法或者這些方法的適當(dāng)組合。PCR技術(shù)在US專利號(hào)4,683,195；4,800,159；4,754,065；和4,683,202以及PCR聚合酶鏈反應(yīng)(PCRThe Polymerase Chain Reaction)，Mullis等人編輯.Birkauswer Press，Boston(1994)中有所描述?？梢岳帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法來分離和純化由其編碼的肽。
可將包括所需序列的多核苷酸插入適當(dāng)?shù)妮d體內(nèi)，而載體又被導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)，以便進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增?？衫帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的任何方式將多核苷酸插入宿主細(xì)胞內(nèi)。可通過直接攝取、胞吞作用、轉(zhuǎn)染作用、f-交配或電穿孔法導(dǎo)入外源多核苷酸來轉(zhuǎn)化細(xì)胞。外源多核苷酸一旦被引入，就可作為非整合載體(如質(zhì)粒)或者被整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)而在細(xì)胞內(nèi)存在。利用標(biāo)準(zhǔn)的方法將所擴(kuò)增的DNA從宿主細(xì)胞中分離出來(參見例如，Sambrook等人(1989))。還可從所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中得到RNA，可用依賴于DNA的RNA聚合酶可得到RNA.
本發(fā)明還包括具有編碼BDCA-2和/或BDCA-3的多核苷酸的各種載體。這些載體可用于重組多肽的表達(dá)以及編碼BDCA的多核苷酸的來源。克隆載體可用來獲得多核苷酸的復(fù)制拷貝，或者用于將多核苷酸貯存在貯藏體中以便將來回收時(shí)使用。表達(dá)載體(以及含有這些表達(dá)載體的宿主細(xì)胞)可用來獲得由所包含的多核苷酸產(chǎn)生的多肽。它們還可用來在個(gè)體中表達(dá)BDCA-2和/或BDCA-3，并因此具有能夠合成多肽的完整細(xì)胞(諸如在基因治療中)。適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體包括本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何載體，例如用于細(xì)菌、哺乳動(dòng)物、酵母和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)的那些載體。特定的載體和適宜的宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的并且在本文中無需詳細(xì)描述(參見例如，Gacesa和Ramji，載體(Vectors)，John Wiley和Sons(1994))。
克隆和表達(dá)載體一般含有可選擇的標(biāo)記物(例如，對(duì)用載體所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的存活和生長所需的蛋白質(zhì)進(jìn)行編碼的基因)，雖然這樣的標(biāo)記基因可以在共導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)的另一個(gè)多核苷酸序列上。只有那些已經(jīng)導(dǎo)入可選擇基因的宿主細(xì)胞將在選擇性條件下生長。典型的選擇性基因(a)對(duì)抗生素或其它有毒物質(zhì)(例如氨芐青霉素、新霉素、氨甲蝶呤)具有抗性；(b)補(bǔ)體營養(yǎng)缺陷；或者(c)供給不可從復(fù)合培養(yǎng)基中得到的關(guān)鍵營養(yǎng)物。適宜標(biāo)記基因的選擇取決于宿主細(xì)胞，并且用于不同宿主的適宜基因在本領(lǐng)域內(nèi)都是公知的。載體一般還含有由宿主識(shí)別的復(fù)制系統(tǒng)。
合適的克隆載體可按照標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)來構(gòu)建，或者從本領(lǐng)域內(nèi)可得到的大量克隆載體中選擇。雖然所選擇的克隆載體可根據(jù)待用的宿主細(xì)胞來改變，但是有用的克隆載體通常具有自我復(fù)制的能力，并且具有特定限制性內(nèi)切核酸酶的單一靶位點(diǎn)，或者攜帶用于標(biāo)記的基因，該標(biāo)記可用于選擇含有載體的克隆。適當(dāng)?shù)睦影ㄙ|(zhì)粒和細(xì)菌病毒(例如pUC18、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌體DNAs)以及穿梭載體(例如pSA3和pAT28)。這些以及許多其它克隆載體可從來自BioRad，Stratagene和Invitrogen的商業(yè)載體中得到。
表達(dá)載體通常是含有編碼感興趣的BDCA的多核苷酸的可復(fù)制多核苷酸構(gòu)建體。編碼BDCA的多核苷酸可操縱地連接到適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄控制元件(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和終止子)上。為了進(jìn)行表達(dá)(即翻譯)，通常還需要一個(gè)或多個(gè)翻譯控制元件(例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)和終止密碼子)。這些控制元件(轉(zhuǎn)錄和翻譯的)可由編碼BDCA的基因衍生，或者是異源的(即，由其它基因或其它有機(jī)體衍生的)。也可包括編碼信號(hào)肽的多核苷酸序列，以便使BDCA穿過或滯留在細(xì)胞膜，或者從細(xì)胞中分泌出來。適于在真核細(xì)胞(包括酵母、禽和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中表達(dá)的許多表達(dá)載體在本領(lǐng)域內(nèi)都是公知的。表達(dá)載體的一個(gè)例子是pcDNA3(Invitrogen，San Diego，CA)，在該載體中，轉(zhuǎn)錄由巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)。該載體還含有多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，用于插入感興趣的多核苷酸。表達(dá)載體(系統(tǒng))的另一個(gè)例子是桿狀病毒/昆蟲系統(tǒng)。適用于抗體靶向的基因治療的其它載體包含編碼BDCA的多核苷酸。合適的系統(tǒng)例如在Brown等人(1994)病毒學(xué)(Virol.) 198477-488；以及Miyamura等人(1994)美國國家科學(xué)院院報(bào)918507-8511中有所描述。
利用許多適當(dāng)?shù)姆绞?包括電穿孔、用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)進(jìn)行的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；以及感染)將含有感興趣的多核苷酸的載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)。載體或編碼BDCAs的多核苷酸的導(dǎo)入方式的選擇經(jīng)常取決于宿主細(xì)胞的性質(zhì)。
一旦導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)，就可利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何分析方法來測定BDCA的表達(dá)。例如，用RIA或ELISA檢測培養(yǎng)上清液(如果該多肽是被分泌的話)或細(xì)胞裂解物中它的存在。
本發(fā)明的載體可含有一種或多種編碼BDCA的多核苷酸。它還可含有編碼其它多肽的多核苷酸序列，其中這些多肽可增強(qiáng)、促進(jìn)或調(diào)節(jié)所需的結(jié)果例如細(xì)胞因子(包括但不限于IL-2、IL-4、GM-CSF、TNF-α和IFN-γ)。本發(fā)明還包括編碼重組BDCAs的疫苗載體。
本發(fā)明的其它實(shí)施方案是，用編碼BDCAs的多核苷酸轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及包括多核苷酸序列的載體(如上所述)。可使用原核及真核宿主細(xì)胞。原核宿主包括(但不限于)細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌和分枝桿菌(mycobacteria))。真核宿主包括(但不限于)酵母、昆蟲、禽、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。宿主系統(tǒng)在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的并且無需在本文中詳細(xì)描述。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的例子包括(但不限于)CHO和NS0，它們是從歐洲細(xì)胞保藏中心(European Collection of Cell Cultrues)(英國)得到的。例如，用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NS0細(xì)胞，隨后使用谷氨酰胺合成酶擴(kuò)增該質(zhì)粒，這為蛋白質(zhì)制備提供了有用的系統(tǒng)。(Cockett等人(1990)生物/技術(shù)(Bio/Technology)8662-667)。
此外，本發(fā)明的宿主細(xì)胞還可用作編碼BDCAs的多核苷酸庫，或者用作制備這些庫的載體。它們還可用作體內(nèi)表達(dá)BDCAs的載體。
本發(fā)明的多核苷酸具有若干用途。它們?cè)诶缬糜谥苽銪DCA的表達(dá)系統(tǒng)中是有用的。它們還可用作雜交探針，以便用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知的方法來測定樣品中編碼BDCAs或相關(guān)序列的多核苷酸的存在。而且，這些多核苷酸還可用作有效擴(kuò)增預(yù)期多核苷酸的引物。本發(fā)明的多核苷酸在包括疫苗的藥物組合物以及基因治療中都是有用的。
這些多核苷酸還可用作檢測BDCA編碼序列的雜交探針。合適的雜交樣品包括用于基因治療的體外被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在一個(gè)示例中，將DNA或RNA從樣品中提取出來，并在凝膠上隨機(jī)運(yùn)行和/或用限制性核酸酶進(jìn)行消化。所處理的樣品多核苷酸一般被轉(zhuǎn)移到適于洗滌的介質(zhì)中。然后使樣品多核苷酸與編碼BDCA的多核苷酸探針在允許穩(wěn)定的雙體形成(如果樣品含有互補(bǔ)多核苷酸序列的話)的條件下進(jìn)行接觸。利用適當(dāng)?shù)姆绞絹頇z測所形成的任何穩(wěn)定的雙體。例如，以標(biāo)記形式提供多核苷酸探針，并且洗滌之后與樣品保留在一起的標(biāo)記物將直接反映所形成的穩(wěn)定雙體的量。在第二個(gè)示例中，雜交是在原位進(jìn)行的。用標(biāo)記探針覆蓋適當(dāng)制備的組織樣品，以便指示出編碼BDCA的序列的部位。
短的多核苷酸還可用作PCR反應(yīng)的引物，從而尤其可用來擴(kuò)增包括與引物雜交區(qū)域的較長序列。這可以制備的方式進(jìn)行，以便產(chǎn)生用于進(jìn)一步的遺傳操縱的多核苷酸。它還可以分析的方式進(jìn)行，以便確定例如診斷的感興趣樣品中是否存在編碼BDCA的多核苷酸。
多核苷酸的另一用途是用于疫苗和基因治療中。一般原理是多核苷酸的施用或促進(jìn)或弱化由其編碼的多肽的表達(dá)。于是，本發(fā)明包括誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法以及包括給個(gè)體施用有效量的編碼BDCAs的多核苷酸的治療方法。在這些方法中，以直接的方式或通過用多核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方式，給個(gè)體施用編碼BDCA的多核苷酸。優(yōu)選的是，多核苷酸為環(huán)狀質(zhì)粒形式，優(yōu)選地為超螺旋構(gòu)型的環(huán)狀質(zhì)粒。優(yōu)選的是，在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制該多核苷酸。于是，多核苷酸可操縱地與適宜的啟動(dòng)子(例如在靶組織型的細(xì)胞中內(nèi)在活化的異源啟動(dòng)子)相連。優(yōu)選的是，一旦在細(xì)胞核內(nèi)，質(zhì)粒一直為環(huán)狀非復(fù)制的附加型分子?？捎觅|(zhì)粒構(gòu)建體進(jìn)行體外突變，以便例如編碼具有較大親和力和/或親合力的分子。
為了測定含有BDCA多核苷酸的質(zhì)粒是否能夠在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染諸如COS-7、CHO或HeLa這些細(xì)胞。然后利用免疫測定法(例如Western印跡法)測定表達(dá)。例如通過構(gòu)建質(zhì)粒以便用標(biāo)志(諸如靶表位或酶標(biāo)記物)融合所得到的多肽，可以檢測較小的BDCAs。通過純化這種肽、然后實(shí)施本文所述的功能測定法中的一種，可獲得被表達(dá)的多肽的其它特征。
在基因治療的一種方式中，本發(fā)明的多核苷酸用于體外遺傳改變細(xì)胞。在這種策略中，用BDCA載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)從供體中取出的細(xì)胞或者從細(xì)胞系中得到的細(xì)胞，然后給受體施用這些細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)染的適宜細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞。
在另一治療方式中，本發(fā)明的多核苷酸用于體內(nèi)遺傳改變細(xì)胞。該目的包括(但不限于)治療多種類型的癌癥。
這些多核苷酸還可用來產(chǎn)生不表達(dá)BDCA-2的細(xì)胞以及表達(dá)BDCA-2的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
從本發(fā)明還可得到BDCA-2不表達(dá)或以明顯下降的水平表達(dá)的工程化細(xì)胞。通過選擇細(xì)胞(最好是DC)并向細(xì)胞提供一個(gè)包括編碼BDCA-2基因的多核苷酸的表達(dá)構(gòu)建體，可制備這樣的細(xì)胞，其中該多核苷酸以與啟動(dòng)子反義并與之操縱連接的方式就位。這樣的多核苷酸的表達(dá)有效地產(chǎn)生了缺少BDCA-2的細(xì)胞。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，提供了一種用于制備重組宿主細(xì)胞的方法，該宿主細(xì)胞產(chǎn)生顯著減小的BDCA-2量或者甚至“敲除”BDCA-2的產(chǎn)生。利用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員公知的一種或多種方式可制備這些重組宿主細(xì)胞。例如，通過將反義DNA或RNA的構(gòu)建體摻入基因組內(nèi)，可抑制基因表達(dá)。內(nèi)源BDCA-2基因的刪除或突變可使其非功能化。將編碼核酶-RNA切割酶(特異性切割BDCA-2 mRNA)的核酸導(dǎo)入重組宿主細(xì)胞內(nèi)。
術(shù)語“敲除”是指，部分或完全抑制細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源DNA序列(諸如BDCA-2)編碼的蛋白質(zhì)的至少一部分的表達(dá)。術(shù)語“敲除構(gòu)建體”是指一核酸序列，該序列被設(shè)計(jì)用來減小或抑制細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源DNA序列編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)。
這些重組構(gòu)建體可摻入敲除的哺乳動(dòng)物中，以便在DCs中抑制BDCA-2的產(chǎn)生。敲除和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制備是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所公知的并且在5,434,340、5,530,179和5,557,032中有所描述。
本發(fā)明還提供了用于制備動(dòng)物的方法以及如此制備的過表達(dá)BDCA-2的動(dòng)物。這些方法一般包括將動(dòng)物細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，其中所述動(dòng)物細(xì)胞已于體外處理，插入了編碼BDCA-2多肽的DNA片段，該動(dòng)物細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)BDCA-2。
D.試劑盒本發(fā)明包括含有抗-DC特異的抗原結(jié)合片段的試劑盒，該試劑盒用于測定血清或其它來源中的包含可溶性BDCA-2(包括其同種型)的BDCA-2。通過診斷實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)室、專業(yè)人員或私人個(gè)體來實(shí)施使用這種試劑盒的診斷過程。對(duì)臨床樣品進(jìn)行隨機(jī)預(yù)處理，以便富集待測試的靶物。然后使用者加入試劑盒中所含的試劑，以便檢測診斷成分中的變化水平或改變。
任選的是，試劑還可與標(biāo)記物結(jié)合，以便檢測與樣品中的靶物所形成的任何復(fù)合物。在另一種任選方式中，提供了第二試劑，該試劑在發(fā)現(xiàn)靶物后能夠與一級(jí)試劑結(jié)合并借此提供可檢測的標(biāo)記物。例如，標(biāo)記的抗-鼠IgG可用作二級(jí)試劑。當(dāng)一級(jí)試劑為與生物素結(jié)合時(shí)，標(biāo)記的親和素可用作二級(jí)試劑。
試劑盒可用于各種生物樣品中，這些樣品包括液體樣品、細(xì)胞懸浮液和組織樣品。能夠以試劑盒形式提供的適當(dāng)分析方法包括本文所述的那些方法。
每種試劑以固體形式或溶于/懸浮于液體緩沖劑的形式來提供，以便適合庫存貯藏，并且隨后當(dāng)進(jìn)行測試時(shí)可用于交換或加入到反應(yīng)介質(zhì)中。還提供了合適的包裝。試劑盒可任意提供用于分析過程的其它成分。這些任意成分包括(但不限于)緩沖劑、捕獲試劑、展開劑、標(biāo)記物、反應(yīng)表面、用于檢測的裝置、對(duì)照樣品、說明書以及說明資料。
E、治療組合物1.物質(zhì)的組合物按照用于制備藥物制劑的通?？山邮艿墓に嚪椒▉磉M(jìn)行本文所述的藥物組合物的制備(參見例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences 18thEdition(1990)，E.W.Martin ed.，Mack Publishing Co.，PA)。根據(jù)預(yù)計(jì)使用和施用形式，還需要處理藥物組合物制備中的活性成分。合適的處理方法包括消毒、與適宜的非毒性和非干擾成分的混合、分成劑量單位以及封閉在配送裝置中。在一實(shí)施方案中，治療組合物含有DCs、其亞群或它們的混合物。在另一實(shí)施方案中，這些組合物中含有本文所述的抗原結(jié)合片段。優(yōu)選的是，抗原結(jié)合片段是表1中的mAbs或由其衍生的。優(yōu)選的是，DC組合物含有用這些抗原結(jié)合片段之一分離的DCs。
(a)施用的一般方式本發(fā)明的藥物組合物可利用適合于組合物劑型的方式來服用。一般的給藥途徑包括靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、口服、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)以及肺內(nèi)施用(即通過氣霧劑的形式)。人用的藥物組合物一般通過非腸道途徑施用(最典型的是靜脈內(nèi)施用、皮下施用、肌肉內(nèi)施用)。雖然不是必須的，但是所提供的藥物組合物最好是適合于精確量施用的單位劑量形式。本發(fā)明還預(yù)計(jì)包括慢釋或緩釋劑型，由此可長期提供相對(duì)恒定水平的活性物質(zhì)。
(b)液體制劑例如，可通過將本文所列舉的多肽或多核苷酸溶解或分散到液體賦形劑(例如水、鹽水、含水葡萄糖、乙二醇或乙醇)中，來制備藥學(xué)上可接受的液體組合物。組合物還可任選地含有其它藥用制劑、藥物制劑、載體和輔助物質(zhì)(例如潤濕劑或乳化劑以及pH緩沖劑)。用于注射的組合物可提供為液體溶液或懸浮液、乳液或者在注射之前適于溶解或懸浮于液體中的固體形式。用于口服、鼻內(nèi)或局部施用的藥物組合物可以固體、半固體或液體形式來提供，包括片劑、膠囊、粉劑、液體和懸浮液。對(duì)于通過呼吸道施用的方式，優(yōu)選的組合物是當(dāng)與合適的氣霧劑化裝置一起使用時(shí)可提供固體、粉末或液體氣霧劑的組合物。
本發(fā)明還包括含有具膜結(jié)合肽的脂質(zhì)體的組合物，從而可將脂質(zhì)體特異性遞送到腫瘤或致瘤性細(xì)胞區(qū)域或遞送至免疫系統(tǒng)。這些脂質(zhì)體可制備為除了含有肽之外，還含有免疫治療劑(諸如接下來可在識(shí)別位點(diǎn)釋放的上述那些免疫治療劑)(Wolff等人(1984)生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochem.Biophys.Acta)802259)。另一個(gè)這樣的遞送系統(tǒng)采用嵌合細(xì)小病毒B19衣殼來呈遞抗原結(jié)合片段(Brown等人(1994)病毒學(xué)198477-488；以及Miyamura等人(1994)美國國家科學(xué)院院報(bào)918507-8511)。這些嵌合系統(tǒng)包括在本文中以便使用。
可以許多方式來評(píng)估本發(fā)明中所列舉的組合物的功效。因此，試驗(yàn)化合物可制備為合適的藥物組合物并且施與測試對(duì)象。最初的研究最好用小動(dòng)物(例如小鼠或兔)進(jìn)行，其次任選地用非人靈長類動(dòng)物進(jìn)行，然后最終用人進(jìn)行。優(yōu)選的是，測試以前沒有抗體應(yīng)答的個(gè)體的免疫原性。按照適當(dāng)?shù)闹委煏r(shí)間表來施用適當(dāng)測試劑量的試驗(yàn)組合物。在預(yù)定的范圍內(nèi)比較不同劑量和時(shí)間安排是合適的?？乖Y(jié)合片段的施用劑量范圍應(yīng)大得足以產(chǎn)生所需的療效，該療效是，疾病的癥狀被改善了，并且不會(huì)產(chǎn)生不適當(dāng)?shù)母弊饔?例如不想要的交叉反應(yīng)和過敏反應(yīng))。通常，劑量隨著患者的年齡、健康狀況、性別和病情程度來變化，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定劑量。當(dāng)存在任一并發(fā)癥時(shí)，各個(gè)醫(yī)師可調(diào)節(jié)劑量。通常，當(dāng)結(jié)合治療劑服用這些組合物時(shí)，可使用相當(dāng)于用于體內(nèi)免疫診斷成像的較低劑量的組合物。
2.抗原結(jié)合片段本發(fā)明包括含有本文所述的抗原結(jié)合片段的藥物組合物。這些藥物組合物可單獨(dú)或結(jié)合其它治療形式(化療、放療或免疫治療(如WO98/23735；WO98/34642；WO97/10000；WO97/10001；以及WO97/06821所述))，用于誘導(dǎo)或協(xié)助免疫應(yīng)答以及治療腫瘤疾病，或者包括耐受性，以及治療自身免疫疾病(GvHD、同種移植排斥、過敏原等等)。其它的治療方法在本文中有所描述并且或在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。適宜的疾病包括(但不限于)病毒、寄生蟲、細(xì)菌、真菌引起的疾病、腫瘤以及自身免疫疾病。
在鼠乳腺癌模型中，F(xiàn)lt3-配體(Flt3-L)為用于各種造血譜系(包括DCs和B細(xì)胞)的刺激細(xì)胞因子，已經(jīng)鼠乳腺癌細(xì)胞一起作為疫苗使用(Chen等人(1997)癌研究573511-6)。DCs還可載有腫癌抗原或被轉(zhuǎn)導(dǎo)，以表達(dá)腫瘤抗原；然后將這些細(xì)胞用作腫瘤接種的佐劑。在適當(dāng)?shù)腗HC限制下，DCs將腫瘤相關(guān)抗原內(nèi)源性呈遞到傳入淋巴系統(tǒng)中(Wan等人(1997)人類基因治療(Hum.Gene Ther.)81355-63；Peiper等人(1997)外科學(xué)(Surgery)122235-41；以及Smith等人(1997)國際免疫學(xué)(Int.Immunol.)91085-93)。目前的黑素瘤疫苗操縱抗原呈遞網(wǎng)絡(luò)，并且在介導(dǎo)腫瘤保護(hù)性免疫時(shí)有效地結(jié)合了最佳細(xì)胞和抗體抗-腫瘤免疫應(yīng)答。這些治療方法已經(jīng)導(dǎo)致疾病的消退、延緩疾病的惡化或者在一些情形中對(duì)生存有所改善，并且極少有副作用(Kuhn等人(1997)皮膚外科學(xué)(Dermatol.Surg.)23649-54)。Conforti等人(1997)外科腫瘤雜志(J.Surg.Oncol.)6655-64還對(duì)黑素瘤疫苗進(jìn)行了綜述。
疫苗可包裝在藥學(xué)上可接受的載體內(nèi)，并摻合有本領(lǐng)域內(nèi)所公知的佐劑或其它成分(例如細(xì)胞因子)。除了允許制劑中存在含有細(xì)菌和細(xì)菌成分的佐劑(例如弗氏完全或不完全佐劑)，獸用的疫苗基本上與人用的相似。
F、治療方法本發(fā)明還包括用來治療本文所述和/或本領(lǐng)域內(nèi)公知的各種紊亂的方法。這些方法包括施用一定量的含有有效量的本發(fā)明組合物的藥物組合物，以獲得所需的效果、改善現(xiàn)存狀況或者防止復(fù)發(fā)。對(duì)于癌癥的治療，所施用的藥物組合物的量是產(chǎn)生所需效果的有效量。有效量可以一次或一系列的施用來提供。有效量可以彈丸劑或連續(xù)灌注的方式來提供。適當(dāng)?shù)幕钚詣┌?腫瘤藥物、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑和效應(yīng)子細(xì)胞(諸如Douillard等人(1986)雜文瘤(Hybridomas)(Supp.15139)中所述的那些)。
藥物組合物和治療方式適用于通過直接或間接引發(fā)對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答來治療病人?！皞€(gè)體”、“病人”或“受試者”是脊椎動(dòng)物，優(yōu)選的是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選的是人。哺乳動(dòng)物包括(但不限于)人、野生動(dòng)物、未馴服的動(dòng)物、農(nóng)場動(dòng)物、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物?！鞍┌Y受試對(duì)象”是哺乳動(dòng)物，最好是被診斷為癌癥、腫瘤或者有得這些病危險(xiǎn)的人。
正如本文所用的，“治療”是指，試圖改變接受治療的個(gè)體或細(xì)胞的病程而進(jìn)行的臨床介入方案，并且為了預(yù)防或者在臨床病理的過程中實(shí)施該“治療”。治療效果包括(但不限于)阻止疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、消除疾病的任何直接或間接病理結(jié)果、阻止腫瘤轉(zhuǎn)移、減小疾病惡化的速度、減輕或緩和疾病狀況以及緩解或改善預(yù)后。
與病情相關(guān)的“病理”是包括健康的正常的生理狀況，或者被影響個(gè)體的生活質(zhì)量的任一狀況。這可包括(但不限于)被影響的組織對(duì)以前未影響區(qū)域的破壞性侵入、以消耗正常組織功能為代價(jià)的生長、不規(guī)律或被抑制的生物活性、炎性或免疫性應(yīng)答的加重或抑制、對(duì)其它病原生物或介質(zhì)的易感性增大以及不利的臨床癥狀例如可由護(hù)理醫(yī)師確定的疼痛、發(fā)燒、惡心、疲勞、心情變化以及諸如其它與疾病相關(guān)的特征。
“有效量”是在治療時(shí)足以產(chǎn)生有益或預(yù)期臨床結(jié)果的量。有效量可以一個(gè)或多個(gè)劑量施與病人。就治療而言，有效量是足以緩和、改善、穩(wěn)定、逆轉(zhuǎn)或減緩病情發(fā)展或者還減輕了疾病的病理結(jié)果的量。有效量一般可由醫(yī)師在一個(gè)接一個(gè)病例的基礎(chǔ)上確定，并且在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。在確定合適劑量以便獲得有效量時(shí)一般要考慮幾個(gè)因素。這些因素包括病人的年齡、性別和體重、接受治療的身體狀況、病情的嚴(yán)重程度以及所施用的抗原結(jié)合片段的劑型和有效濃度。
本文所用的術(shù)語“免疫調(diào)節(jié)”或“調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答”包括免疫刺激以及免疫抑制作用。免疫刺激作用包括(但不限于)直接或間接增強(qiáng)細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的作用。免疫刺激作用的例子包括(但不限于)增加了抗原特異的抗體的產(chǎn)生；淋巴細(xì)胞群(例如NK細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)的活化或增殖；增加了細(xì)胞因子或趨化因子的合成，這些因子包括(但不限于)IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、干擾素、TNF-α、IL-10、TGF-β等。免疫抑制作用包括直接或間接降低細(xì)胞或體液免疫應(yīng)答的作用。免疫抑制作用的例子包括(但不限于)降低了抗原特異性抗體的產(chǎn)生例如IgE產(chǎn)生降低；具有免疫抑制活性的淋巴細(xì)胞或其它細(xì)胞群(諸如可導(dǎo)致免疫耐受性的那些細(xì)胞群)的激活；以及增加了對(duì)某些細(xì)胞功能具有抑制作用的細(xì)胞因子的合成，這些因子包括(但不限于)IL-10和TGF-β。此類因子的一個(gè)例子是IFN-γ，它似乎阻斷了IL-4誘導(dǎo)的向IgE和IgG1的類轉(zhuǎn)換，借此降低了這些抗體亞類的水平。
接受癌癥治療的合適的人類受試者還包括兩個(gè)治療組，這可根據(jù)臨床標(biāo)準(zhǔn)來區(qū)分。具有“晚期疾病”或“嚴(yán)重的腫瘤負(fù)載”的病人是那些具有臨床上可測到的腫瘤的病人。臨床上可測到的腫瘤是指可基于腫塊而檢測的腫瘤(例如通過觸摸、CAT掃描、聲波圖、乳房造影圖或X射線；用其上的陽性生化或組織病理標(biāo)志來鑒定此類群體是不夠的)。將本發(fā)明中列舉的藥物組合物施與這些病人，以便誘出抗腫瘤應(yīng)答，目的在于減輕病情。理想的治療結(jié)果是腫塊減小了，但是任何臨床癥狀的改善都是有益的。臨床改善包括腫瘤惡化的危險(xiǎn)或速度減小了或者腫瘤的病理結(jié)果減輕了。
第二組適宜受試者是本領(lǐng)域內(nèi)公知的“佐劑組”。這些個(gè)體具有癌癥歷史并且已經(jīng)對(duì)另一治療方式有響應(yīng)。以前的治療方法包括(但不限于)外科切除術(shù)、放療和傳統(tǒng)的化療。結(jié)果，這些個(gè)體無臨床上可測到的腫瘤。然而，獨(dú)想他們?cè)谠瓉淼哪[瘤部位附近或者由于轉(zhuǎn)移而有疾病惡化的危險(xiǎn)。
本文所用的“佐劑”有幾重意思，所有這些意思依據(jù)該術(shù)語所在的上下文中而明了。在藥物制備的上下文中，佐劑是化學(xué)或生物劑，其與抗原結(jié)合施用(同時(shí)或不同時(shí)施用)或?qū)⑵渲亟M融合至抗原，從而可增強(qiáng)抗原的免疫原性(參見Singh等人(1999)自然生物技術(shù)(Nature Biotech.)171075-1081)。也已提議將所分離的DCs可用作佐劑。此處所用的組合物包括在本發(fā)明中。在癌癥診斷或治療的上下文中，佐劑是指，無臨床上可測到的腫塊但被懷疑有復(fù)發(fā)危險(xiǎn)的一類癌癥病人。
這一組還可亞分成高危和低危個(gè)體。亞分是基于初始治療之前或之后所觀察的特征而作出的。這些特征在臨床領(lǐng)域是公知的并且適于為每種不同的癌癥下定義。高危亞組的典型特征是，腫瘤已經(jīng)侵襲了鄰近組織或者顯示出牽涉到淋巴結(jié)。
另一適宜組是具有癌癥的遺傳素質(zhì)但還沒有明顯的癌癥臨床跡象的病人。例如，對(duì)與乳腺癌有關(guān)的基因突變測試顯陽性的女性，由于其還處于分娩年齡，因此希望在治療中預(yù)防性服用一種或多種本文所述的抗原結(jié)合片段，以便在適合實(shí)施預(yù)防手術(shù)之前阻止癌癥的發(fā)生。
特別合適的受試者是具有(但不限于)以下癌癥的病人惡性膠質(zhì)瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、軟組織肉瘤以及多種癌癥(包括小細(xì)胞肺癌)。合適的癌癥還包括腫瘤學(xué)領(lǐng)域內(nèi)公知的任何癌癥，包括(但不限于)星形細(xì)胞瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、間膠質(zhì)瘤、室管膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、原始神經(jīng)外胚層瘤(PNET)、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、胰管腺癌、小和大的細(xì)胞肺腺癌、脊索癌、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、支氣管肺泡癌、上皮腺癌、及其肝轉(zhuǎn)移瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、基底細(xì)胞癌、汗腺癌、乳頭狀癌、皮脂腺癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、膽管癌、絨膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、睪丸瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聲神經(jīng)瘤、間膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、以及重鏈病、乳腺癌(例如管和小葉腺癌)、子宮頸的鱗狀腺癌、子宮和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱的過渡鱗狀細(xì)胞癌、B和T細(xì)胞淋巴瘤(結(jié)的和擴(kuò)散的)漿細(xì)胞瘤、急性和慢性白血病、惡性黑瘤、軟組織肉瘤和平滑肌肉瘤。
病人可具有疾病進(jìn)化形式，其中治療目的包括疾病發(fā)展的緩和及逆轉(zhuǎn)以及/或者副作用的改善。病人具有病史，他們?yōu)榇艘呀?jīng)接受了治療，其中治療目的一般包括復(fù)發(fā)危險(xiǎn)的減小或延遲。
自身免疫紊亂是由導(dǎo)致多種細(xì)胞、組織和器官的自身破壞的錯(cuò)導(dǎo)免疫應(yīng)答引起的。這些紊亂的起因是未知的。已知通過MHC的自身識(shí)別在免疫應(yīng)答中是重要的。然而，對(duì)自身免疫應(yīng)答和負(fù)責(zé)自身免疫的細(xì)胞的抑制還不十分清楚。
自身免疫是由幾個(gè)因素(包括遺傳、激素和環(huán)境影響)綜合引起的。許多自身免疫紊亂的特征在于B細(xì)胞的超活性，是以白細(xì)胞和自身抗體的增殖和高丙種球蛋白血癥為標(biāo)志。B細(xì)胞的超活性可能與T細(xì)胞的異常有關(guān)。激素和遺傳因素強(qiáng)烈影響自身免疫紊亂的發(fā)生；例如，紅斑狼瘡顯著影響分娩年齡的女性，并且某些HLA單倍型與特定自身免疫紊亂漸增的危險(xiǎn)性有關(guān)。
一般的自身免疫紊亂包括(但不限于)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、強(qiáng)直性脊柱炎、眼干燥綜合征、肺出血腎炎綜合征、瑞特綜合征、硬皮病、脈管炎、多肌炎和皮膚肌炎。這些疾病中的許多種都包括與免疫紊亂有關(guān)的異常的炎癥反應(yīng)。本文所述的DCs在這些紊亂的治療中是適用的，尤其是當(dāng)用來滅活或誘導(dǎo)紊亂中所涉及的T細(xì)胞的耐受原性時(shí)。治療方法在本領(lǐng)域內(nèi)是公知的。正如本文所討論的，由本文所述的方法獲得的一種或多種DCs亞類在自身免疫的治療中是適用的。
抗原結(jié)合片段的“免疫活性”是指，特異性結(jié)合完整抗體識(shí)別的抗原。這些結(jié)合能夠或者不能夠激發(fā)免疫應(yīng)答。特異性免疫應(yīng)答可激發(fā)抗體、B細(xì)胞應(yīng)答、T細(xì)胞應(yīng)答、這些形式的任何組合以及由此生成的效應(yīng)子功能。這些功能包括(但不限于)抗體介導(dǎo)的功能ADCC和補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解(CDC)。T細(xì)胞應(yīng)答包括(但不限于)T輔助細(xì)胞功能、細(xì)胞毒T細(xì)胞功能、炎癥/誘導(dǎo)性T細(xì)胞功能以及T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制。能夠按照任一上述這些標(biāo)準(zhǔn)直接或間接激發(fā)特異性免疫應(yīng)答的化合物(單獨(dú)或與載體或佐劑結(jié)合)被稱作“免疫原”?？乖Y(jié)合片段的“活性”或“功能”是指任一種的抗體免疫活性，包括癌癥的檢測、改善或緩和。
“免疫應(yīng)答”是指對(duì)惡性或疾病組織、致病因子和身體暴露在其中的其它外源因子的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)或增強(qiáng)。免疫應(yīng)答可以是體液應(yīng)答(這一點(diǎn)通過抗體的產(chǎn)生而證實(shí))；和/或細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答，(這一點(diǎn)通過此類細(xì)胞諸如天然殺傷細(xì)胞或細(xì)胞毒T細(xì)胞(CTLs)和由此產(chǎn)生的細(xì)胞因子所顯示的溶細(xì)胞應(yīng)答所證實(shí))。可通過感染或惡性部位的單核細(xì)胞浸潤，來監(jiān)測免疫應(yīng)答。典型的是，這些監(jiān)測是通過組織病理來實(shí)施的。“癌癥特異的免疫應(yīng)答”是針對(duì)惡性腫瘤而不是針對(duì)非癌細(xì)胞發(fā)生的應(yīng)答。本文所述的治療一般可誘導(dǎo)或促進(jìn)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，但也能誘導(dǎo)或促進(jìn)抗體介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這些治療還可影響對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的類型。
按照本發(fā)明的組合物還適用于誘導(dǎo)抗原特異的Th1免疫應(yīng)答?？梢栽诟鶕?jù)本發(fā)明處理的宿主中測到刺激了Th1型免疫應(yīng)答，并且可利用本領(lǐng)域內(nèi)公知的任何方法來測定，這些方法包括(但不限于)在抗原攻擊之前和之后測得的IL-4水平降低了；或者，與抗原致敏的、或者致敏且攻擊的無本發(fā)明組合物處理的對(duì)照宿主相比，檢測到被處理的宿主內(nèi)IL-4的水平較低(或者甚至檢測不到)；與抗原致敏的或者致敏且攻擊的對(duì)照宿主相比，被處理的宿主內(nèi)IL-12、IL-18和/或IFN(α、β或γ，優(yōu)選的是IFN-γ)的水平上升；與未處理的對(duì)照相比，被處理的宿主內(nèi)產(chǎn)生IgG2a抗體；在抗原攻擊之前和之后可測到，抗原特異性IgE水平降低，或者，與抗原致敏的、或者致敏且攻擊的未處理宿主相比，檢測到被處理的宿主內(nèi)抗原特異性IgE水平較低(或者甚至檢測不到)。通過利用本文所述以及本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法體外或離體測定由APCs和/或淋巴細(xì)胞(優(yōu)選地DCs和/或T細(xì)胞)釋放的細(xì)胞因子，可以實(shí)施諸如此類的各種測定。
偏向于Th1的細(xì)胞因子誘導(dǎo)可增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答，諸如由NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性殺傷細(xì)胞、Th1輔助和記憶細(xì)胞實(shí)施的那些應(yīng)答。這些應(yīng)答用于抗病毒、真菌、原生動(dòng)物寄生蟲、細(xì)菌、變態(tài)反應(yīng)性疾病和哮喘以及腫瘤的預(yù)防性或治療性接種中尤其有益。
本發(fā)明還包括通過連接BDCA-2而下調(diào)I型干擾素的產(chǎn)生、通過連接BDCA-2而下調(diào)Th1的免疫應(yīng)答，以及通過連接BDCA-2而使免疫應(yīng)答偏向于Th2的免疫應(yīng)答。通過妨礙BDCA-2的連接可逆轉(zhuǎn)這些指征。本發(fā)明還包括篩選用于干擾BDCA-2的連接的合適組分以及這些組分的組合物。
當(dāng)抗原結(jié)合片段與多種治療劑結(jié)合使用時(shí)，通常將這兩種物質(zhì)基本上同時(shí)施用。術(shù)語“基本上同時(shí)”的意思是，相對(duì)于時(shí)間而言，它們可以合理地一起施用?？梢悦咳栈蛘呷魏纹渌m當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔來施用治療劑，這取決于諸如疾病的性質(zhì)、病人的身體狀況和治療劑的半衰期這些因素。
可通過注射或者通過在一段時(shí)間逐漸灌注的方式來施用治療組合物。抗原結(jié)合片段可以單獨(dú)或與其它治療劑一起靜脈內(nèi)施用、腹膜內(nèi)施用、肌內(nèi)施用、皮下施用、腔內(nèi)施用、結(jié)內(nèi)施用、鞘內(nèi)施用或經(jīng)皮膚施用。
施用的另一種方法是損傷內(nèi)施用例如直接注射到腫瘤內(nèi)。對(duì)癌癥病人所實(shí)施的多種免疫治療形狀的損傷內(nèi)施用不會(huì)產(chǎn)生全身施用免疫劑所見的毒性(Fletcher等人(1987)淋巴因子研究(Lymphokine Res.)645；Rabinowich等人(1987)癌研究(Cancer Res.)47173；Rosenberg等人(1989)科學(xué)2331318；以及Pizz等人(1984)國際癌雜志(J.Int.Cancer)34359)。
另外，希望將組合物局部施用在需要治療的病灶區(qū)；這可例如通過在手術(shù)過程中注射、借助于導(dǎo)管或借助于埋入物通過局部輸注來實(shí)現(xiàn)，其中所述埋入物是多孔、無孔或膠質(zhì)材料，包括膜(例如硅橡膠膜)或纖維。一種合適的此類膜是由Guilford sciences提供的Gliadel。
BDCA-2與抗-BDCA-2單克隆抗體(AC144)的連接誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+動(dòng)員這一事實(shí)表明，通過觸發(fā)BDCA-2信號(hào)或者抑制BDCA-2信號(hào)的觸發(fā)，可在功能上調(diào)節(jié)漿細(xì)胞樣DC(以及表達(dá)BDCA-2的所有其它細(xì)胞)?？紤]到DC的功能性調(diào)節(jié)，以下方面包括在權(quán)利要求書中A)D4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)和下調(diào)。
B)使免疫應(yīng)答向耐受性或免疫性分化。
C)使CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞的發(fā)育、Th2細(xì)胞的發(fā)育或Th3/T-調(diào)節(jié)性-1 CD4+T細(xì)胞的發(fā)育分化。后者也許通過分泌TGF-β和/或IL-10來下調(diào)免疫應(yīng)答。
D)DC通常被認(rèn)為是T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞。然而，最近來自幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究業(yè)已表明，它們?cè)贐細(xì)胞的活化和抗體合成的調(diào)節(jié)中起著重要的作用。因此通過DCs上的BDCA-2可調(diào)節(jié)B細(xì)胞應(yīng)答。同樣，對(duì)于NK細(xì)胞應(yīng)答也是如此。
由于I型干擾素可誘導(dǎo)人類的Th1型免疫應(yīng)答(Parronchi等人(1996)歐洲免疫學(xué)雜志(Eu r.J.Immunol.) 26697-703)，因此BDCA-2的觸發(fā)使CD4+T細(xì)胞應(yīng)答向Th2細(xì)胞發(fā)育分化，其中對(duì)BDCA-2信號(hào)的抑制使CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞發(fā)育分化。本發(fā)明還包括通過分別觸發(fā)BDCA-2信號(hào)或抑制BDCA-2信號(hào)的觸發(fā)，而使CD4+T細(xì)胞應(yīng)答向Th2或Th1細(xì)胞發(fā)育分化。
本文提到的所有出版物借此全部作為本文的參考文獻(xiàn)。所提供的以下實(shí)施例是為了闡述本發(fā)明，而并非是為了限定本發(fā)明。
實(shí)施例1DC特異的mAb的產(chǎn)生五只6-8周齡的雌性Balb/c小鼠(Simonsen Laboratories，Gilroy，CA)在麻醉下于第0、4、7、11和14天右足墊接種5x105至1x106個(gè)純化的HLA-DR+lin-血液DC，并且在第-3、0、4、7、11和14天于左足墊接種大約1x106HLA-A2+Bristol-8 B淋巴母細(xì)胞瘤細(xì)胞。在注射前，將這兩種細(xì)胞都在室溫下與1100PHA(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)一起溫育10分鐘，然后用PBS洗滌。該處理提供了非特異性佐劑效果并且無需使用佐劑(例如弗氏佐劑)。
在第15天，即第五次注射HLA-DR+lin-DC之后的那天，取出小鼠右足腘淋巴結(jié)。制備淋巴細(xì)胞懸液，并用改良Kohler和Milstein(1975)自然256495所述方法將細(xì)胞與SP2/0 Ag14骨髓瘤細(xì)胞融合。將融合細(xì)胞置于96孔板，其中融合細(xì)胞在補(bǔ)充了以下成分的DMEM中20％ FCS(HyClone，Logan，UT)、2mmol/L的L-谷氨酰胺、15mmol/L的Hepes、10-4mmol/L的次黃嘌呤(Gibco/BRL)，然后放在37℃、含有9％CO2的培養(yǎng)箱中。
當(dāng)出現(xiàn)可視的雜交瘤克隆時(shí)，用流式細(xì)胞術(shù)篩分這些孔的上清液以了解抗體分泌和對(duì)PBMC無非反應(yīng)性(＜1％的陽性細(xì)胞)。簡言之，將大鼠抗-小鼠κmAb結(jié)合的聚苯乙烯珠(2.5μm的直徑，Interfacial DynamicsCorp.，Portland，OR)和PBMC的混合物與50μl雜交瘤上清液在室溫下一起溫育20分鐘。然后用含有5mmol/L EDTA和0.5％ BSA的PBS(pH7.4)(PBS/EDTA/BSA)將微球/細(xì)胞混合物洗滌兩次，通過用PE結(jié)合的大鼠抗-小鼠IgM mAb(克隆X54，BD Biosciences，San jose，CA)、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb(克隆X56，BD Biosciences)和大鼠抗-小鼠IgG2 mAb(克隆X57，BD Biosciences)進(jìn)行染色，來檢測珠和測試細(xì)胞與上清液中的小鼠IgM、IgG1、IgG2a與IgG2b的結(jié)合。利用散射信號(hào)在流式細(xì)胞術(shù)分析時(shí)可容易地辨別PBMC和聚苯乙烯珠。
然后為了測定對(duì)相當(dāng)比例的血液DC的反應(yīng)性，而利用流式血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析來篩分滿足第一輪篩分標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)上清液。簡言之，在室溫下，將大鼠抗-小鼠mAb結(jié)合的聚苯乙烯殊和富集的血液DC(PBMC耗竭了B細(xì)胞、T細(xì)胞和單核細(xì)胞的PBMC)的混合物與50μl的雜交瘤上清液一起溫育20分鐘。然后用PBS/EDTA/BSA將混合物洗滌兩次，通過用PE結(jié)合的大鼠抗-小鼠IgM mAb、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和大鼠抗-小鼠IgG2mAb進(jìn)行染色，來檢測珠和富集的血液DC與上清液中的小鼠IgM、IgG1、IgG2a與IgG2b的結(jié)合。為了辨別流式細(xì)胞術(shù)分析中的HLA-DR+DC與HLA-DR-細(xì)胞，洗滌珠/細(xì)胞混合物一次，然后通過與100μg/ml的小鼠IgG2a在室溫下一起溫育5分鐘，以飽和PE結(jié)合的大鼠抗-小鼠IgG2 mAb和珠結(jié)合的大鼠抗-小鼠κmAb的游離結(jié)合位點(diǎn)，并用抗-HLA-DR-FITC(克隆AC122，IgG2a)復(fù)染該混合物。
所選擇的雜交瘤細(xì)胞在培養(yǎng)物中擴(kuò)增，然后在液氮中冷凍貯藏，通過極限稀釋建立亞克隆，并將陽性亞克隆系列也冷凍于液氮中。利用ISOTYPE Ab-STAT試劑盒(SangStat Medical Corp.，Palo Alto，CA)來測定mAb的同種型。
為了制備mAb，雜交瘤細(xì)胞既可以腹水瘤于Balb/c小鼠中生長，收集富含mAb的腹水液，也可在細(xì)胞培養(yǎng)物(滾瓶培養(yǎng)或中空纖維培養(yǎng))中收集富含mAb的培養(yǎng)上清液。如下從腹水液或細(xì)胞培養(yǎng)上清液中制備純的IgG mAb首先用蛋白A親和層析，隨后在一些情形中，通過疏水相互作用層析，于在4℃下貯藏在含5mmol/L EDTA和0.05％疊氮鈉的PBS中。所純化的mAb與FITC(Sigma，St.Louis，MO)、PE(Cyanotech Corp.，Kailua Kona，HI)、Cy5(Amersham Life Science Inc.，Arlington Heights，IL)、APC(Europa Bioproducts Ltd.，劍橋，基因)、生物素(Pierce，Rockford，IL)和膠體超順磁珠(大約50nm的直徑，Miltenyi Biotec GmbH，Bergisch Gladbach，德國)按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)結(jié)合。Hermanson(1996)生物結(jié)合技術(shù)(Bioconjugate Techniques，)Academic Press Inc.，San Diego，785頁；Aslam等人(1998)生物結(jié)合用于生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)(Bioconjugationprotein coupling techniques for the biomedicalsciences.)Macmillan Reference Ltd.，倫敦，833頁；以及Kantor等人(1997)用膠體超順磁顆粒進(jìn)行的磁性細(xì)胞分類(Magnetic cell sorting withcolloidal superparamagnetic particles.)此文在細(xì)胞制備方法及應(yīng)用(CellSeparation Methods and Applications)一書中，Recktenwald等人編輯，Marcel Dekker Inc.紐約，153-173頁。
細(xì)胞的制備來自正常的健康志愿者的血沉棕黃層是從Institute forTransfusionmedicine，Hospital Merheim，Cologne，德國獲得的。用標(biāo)準(zhǔn)的Ficoll-Paque(Pharmacia，Uppsala，瑞典)密度梯度離心技術(shù)從血沉棕黃層中制備PBMC。
用等離子氯化銨緩沖液(155mmol/L的NH4C、l0mmol/L的KHCO3以及0.1mM的EDTA)裂解紅細(xì)胞，而從血沉棕黃層中制備外周血白細(xì)胞(Hansel等人(1991)J.Immunol.Met.145105-110)。利用在別處所詳細(xì)描述的二步免疫磁性細(xì)胞分類(MACS)技術(shù)，將CD4+lin-血液DC從PBMC中分離出來(Robert等人(1999)；以及Miltenyi等人(1999)在流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分類(Flow cytometry and cell sorting.)Radbruch編輯.Springer-Verlag，Berlin.一書中的高梯度磁性細(xì)胞分類(High gradientmagnetic cell sorting.)218-247頁)。簡言之，利用抗CD3 mAb(克隆BW264/56)、抗CD11b mAb(克隆MI/70.15.11.5)、抗CD16 mAb(克隆VEP-13)，來耗竭單核細(xì)胞、T細(xì)胞和NK細(xì)胞，并且在一些試驗(yàn)中B細(xì)胞和單核細(xì)胞上表達(dá)有一種未充分說明的抗原(克隆L179)。然后從被耗竭的細(xì)胞部分中，用抗CD4(M-T321)抗體富集血液DC至高度純化。為了篩分雜交瘤培養(yǎng)上清液(見上文)，基于CD3和L179抗原的表達(dá)通過免疫磁性耗竭T細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，而僅僅部分富集了血液DC。
可如下將表達(dá)CD1c-、BDCA-2-和BDCA-3的細(xì)胞從PBMC或扁桃體中分離出來用PE-或FITC結(jié)合的mAb(分別為AD5-8E7，AC144和AD6-5E8)作為初級(jí)試劑而用抗-PE或抗-FITC mAb結(jié)合的微珠(MiltenyiBiotec GmbH)作為二級(jí)試劑來進(jìn)行間接的磁性標(biāo)記，然后用MACS富集所標(biāo)記的細(xì)胞。在一些試驗(yàn)中，基于用抗-BDCA-3 mAb(AD5-5E8)結(jié)合的微珠進(jìn)行的直接磁性標(biāo)記來分離BDCA-3+細(xì)胞。如下獲得沒有污染CD1c+B細(xì)胞的高度純化的CD1c+血液DC利用CD19 mAb結(jié)合的微珠(Miltenyi Biotec GmbH)免疫磁性耗竭CD18+B細(xì)胞，隨后免疫磁性富集CD1c+細(xì)胞。通過基于用磁性標(biāo)記試劑偪盒(Miltenyi Biotec)對(duì)表達(dá)CD3-、CD7-、CD14-、CD15-、CD36-、CD45RA-和HLA-DR的細(xì)胞進(jìn)行的間接磁性標(biāo)記而免疫磁性耗竭非嗜堿性粒細(xì)胞，可從PBMC中純化出嗜堿性粒細(xì)胞?；诜謩e用CD14、CD34和CD3 mAb結(jié)合的微珠(Miltenyi BiotecGmbH)進(jìn)行的直接磁性標(biāo)記可免疫磁性純化CD14+單核細(xì)胞、CD34+造血祖細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞。
細(xì)胞培養(yǎng)為了產(chǎn)生“未成熟”單核細(xì)胞衍生的DC(Mo-DC)，在500-1000U/mlrIL-4(PeproTech，Rocky Hill，NJ)和100ng/ml rGM-CSF(ReproTech)的存在下，于37℃，濕潤的含有5％CO2的環(huán)境下，于培養(yǎng)基(補(bǔ)充有2mmol/L的L-谷氨酰胺、10％FCS(Sigma)、100mmol/L)的丙酮酸鈉(Gibco/BRL)、100U/ml的青霉素(Gibco/BRL)和100μg/ml的鏈霉素(Gibco/BRL的RPMI1640(Gibco BRL))中以5x105至1x106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度將所純化的CD14+單核細(xì)胞培養(yǎng)7天。為了產(chǎn)生“成熟”Mo-DC，將“未成熟”Mo-DC洗滌一次，并在20ng/ml的TNF-α(PeproTech)的存在下于培養(yǎng)基中再培養(yǎng)3天。為了產(chǎn)生CD34+造血祖細(xì)胞衍生的DC(CD34-DC)，在100ng/ml rFlt3-配體(PeproTech)、0.5ng/ml的rTGF-β1(PeproTech)、10ng/ml的rTNF-α、20ng/ml的rSCF(PeproTech)和100ng/ml的rGM-CSF的存在下，在培養(yǎng)基中以5x104個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度將所純化的CD34+細(xì)胞培養(yǎng)11天。在10ng/ml rIL-3(PeproTech)的存在下，在培養(yǎng)基中以5x105至1x106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度將新鮮分離的CD4+lin-血液DC培養(yǎng)多達(dá)48小時(shí)。在沒有任何細(xì)胞因子存在下或在10ng/ml rIL-3、20ng/ml IL-4(PeproTech)和100ng/mlGM-CSF的存在下，在培養(yǎng)基中以5x105至1x106個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度將所分離的表達(dá)CD1c-、BDCA-2和BDCA-3的細(xì)胞培養(yǎng)多達(dá)48小時(shí)。
實(shí)施例2血液DCs的流式細(xì)胞術(shù)分析FACScalibur(BD Biosciences)可用于單色、雙色、三色或四色流式細(xì)胞術(shù)。數(shù)據(jù)(5x103至2x105個(gè)細(xì)胞/樣品)是以列表的方式獲得的并且用CellQuest軟件(BD Biosciences)進(jìn)行分析。
以下mAb(克隆名)用于本次的流式細(xì)胞術(shù)的研究中CD1a(HI149)、CD10(HI10a)、CD11a(G43-25B)、CD11c(B-ly6)、CD25(M-A261)、CD27(M-T271)、CD32(FL18.26)、CD38(HIT2)、CD40(5C3)、CD43(IG10)、CD54(HA58)、CD62L(Dreg56)、CD64(10.1)、CD69(FN50)、CD98(UM7F8)、抗-HLA-DQ(TU169)以及抗-TCRαβT1OB9.1A-31(來自PharMingen，San Diego，CA)；CD2(S5.2)、CD8(SK1)、CD13(L138)、CD14(MFP9)、CD19(SJ25-CI)、CD33(P67.6)、CD34(8G12)、CD45RO(UCHL-1)、CD56(NCAM16.2)、CD71(L01.1)、CD123(9F5)、抗-IgD(TA4.1)、抗-小鼠IgG1(X56)、抗-小鼠IgG2(X57)和抗-小鼠IgM(X54)(來自BD Biosciences)；CD5(CLB-T11/11，6G4)、CD7(CLB-T-3A1/1，7F3)、CD16(CLB-FcRgran/l，5D2)、CD45RA(F8-11-13)、CD80(CLB-DALI)(來自CLB，Amsterdam，Netherlands)；CD18(7E4)、CD23(9P25)；CD58(AICD58)、CD77(38.13)、CD83(HB15A)、CD86(HA5.2B7)、CD116(SC06)(來自Coulter Immunotech，Marseilles，法國)；CD4(M-T321)、CD11b(MI/70.15.11.5)、CD14(TUK4)、CD15(VIMC6)、抗-HLA-DR(910/D7)、抗-AC133(AC133/1)和抗-TCRαβ(BW242/412)(來自Milenyi BiotecGmbH)、CD36(AC106)、CD123(AC145)、抗-HLA-DR(AC122和AC123)和抗-GPA(AC107)(來自Amcell，Sunnyvale，CA)；CD1c(M241)(來自Ancell，Bayport，MN)；多克隆抗-IgG、抗-IgM(SA-DA4)、多克隆抗-κ以及多克隆抗-λ(來自Southern BiotechnologyAssociates，Birminghsm.Alabama)；CD61(VIPL2)(來自W.Knapp，Institute of Immunology，University of Vienna，維也納，奧地利)；CD44(IM7)(來自J.Moll，F(xiàn)orschungszentrum Karlsruhe，Karlsruhe，德國)；CD20(H147)(來自Caltag Laboratories，Burlingame，CA)；抗-CLA(HECA-452)(來自E.Butcher，Department of Pathology，StanfordUniversity，Stanford，CA)；抗-FcεRI(15-1)(來自J.P.Kinet，MolecularAllergy and Immunology Section，National Institute of Allergy andInfectious Diseases，National Institutes of Health，Rockville，Maryland)；CD11c(Ki-M1)(來自M.R.Parwaresch，Department of Pathology，Christian Albrechts University，Kiel，德國)；CMRF-44和CMRF-56(來自D.N.Hart，Mater Medical Research Institute，Mater MisericordiaeHospitals，South Brisbane，昆士蘭，澳大利亞)；以及抗-HLA-A、-B、-C(W6/32)(來自Sigma)。
所有抗體都用作FITC-、PE-、生物素-或Cy5結(jié)合的mAb。對(duì)于用生物素化mAb進(jìn)行的間接免疫熒光染色，使用鏈親合素-APC(BDBiosciences)。為了排除流式細(xì)胞術(shù)分析中的死細(xì)胞，用碘化丙碇給細(xì)胞染色。為了使Fc受體介導(dǎo)的mAb結(jié)合最小化，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)在含有人IgG的FcR封閉試劑(Miltenyi Biotec GmbH)存在下給細(xì)胞染色。
顯微鏡分析用細(xì)胞離心機(jī)(Cytospin3，Shandon，Pittsburgh，PA)將細(xì)胞下旋至載玻片上。對(duì)于熒光顯微術(shù)，載玻片在細(xì)胞離心之后于空氣中干燥過夜并安裝有熒光鏡架(Fluoromount G)(Southern Biotechnology Associates)。對(duì)于May Grunwald/Giemsa染色，載玻片在細(xì)胞離心之后于空氣中干燥至少2小時(shí)，并在室溫下于May Grunwald/Giemsa溶液(Merck，Darmstadt，德國)中染色2分鐘，然后在蒸餾水中進(jìn)行徹底漂洗，再在室溫下于Giemsa溶液(Merck)中染色15分鐘，并在蒸餾水中反復(fù)洗滌，空氣中干燥至少2小時(shí)。利用Zeiss Axioscop，顯微鏡(Zeiss，Oberkochen，德國)進(jìn)行分析。用Xillix Microlmager Ml1400-12X(Xillix，Vancouver，加拿大)制作數(shù)字圖片。
實(shí)施例3交叉抑制、共帽化和其內(nèi)化分析為了分析兩個(gè)不同的mAb克隆是否識(shí)別相同(或者緊密相關(guān)的)的抗原表位，可進(jìn)行交叉抑制結(jié)合測定。在4℃下將1x106至2x106個(gè)細(xì)胞與濃度大約100μg/ml的兩種mAb克隆之一預(yù)溫育10分鐘，然后在4℃下用另一種mAb克隆以最佳滴度與PE的結(jié)合物染色5分鐘。用PBMC來分析BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4特異性mAb克隆的交叉抑制，并用MOLT-4細(xì)胞來分析CD1c特異性mAb克隆的交叉抑制。用流式細(xì)胞術(shù)來分析細(xì)胞染色。
為了確定AD5-5E8和AD5-14H12是否識(shí)別相同抗原(或者相同的抗原復(fù)合物)，進(jìn)行了共帽化測定。簡言之，通過用PE結(jié)合的AD5-14H12 mAb和抗-PE mAb結(jié)合的微珠進(jìn)行間接磁標(biāo)記，從而將表達(dá)BDCA-3的細(xì)胞從PBMC中分離出來，所分離的細(xì)胞于37℃下溫育30分鐘，以便誘導(dǎo)mAb-抗原復(fù)合物的帽化。之后，用補(bǔ)充有0.1％疊氮鈉的冰冷PBS/EDTA/BSA(PBS/EDTA/BSA/疊氮化物)洗滌細(xì)胞，并在4℃下用在PBS/EDTA/BSA/疊氮化物中的FITC結(jié)合的AD5-5E8mAb染色10分鐘。利用熒光顯微鏡分析細(xì)胞染色。
利用共內(nèi)化分析來考證AC144和AD5-17F6是否識(shí)別相同的抗原(或者相同的抗原復(fù)合物)。簡言之，在室溫下于PBS/BSA中將1x106的PBMC與50μg/ml的AC144mAb一起溫育15分鐘，并在PBS/BSA中洗滌兩次，然后于37℃下在細(xì)胞培養(yǎng)基中溫育30分鐘。為了分析AC144 mAb在培養(yǎng)之后是否被內(nèi)化，在培養(yǎng)期之前或之后用大鼠抗-小鼠IgG1-PE給若干等份的細(xì)胞染色。為了確定所有的AC144 mAb結(jié)合位點(diǎn)在培養(yǎng)之前是否已被未結(jié)合的AC144 mAb飽和，以及培養(yǎng)之后是否重新出現(xiàn)任何游離的結(jié)合位點(diǎn)，在培養(yǎng)期之前和之后用AC144-PE給若干等份的細(xì)胞染色。為了分析AD5-17F6抗原是否被共內(nèi)化，在培養(yǎng)期之前和之后用AD5-17F6-PE給若干等份染色。用CD123-FITC和HLA-DR-Cy5給所有細(xì)胞進(jìn)行復(fù)染，以便能夠在流式細(xì)胞術(shù)分析中選通CD123亮HLA-DR+漿細(xì)胞樣DC。
實(shí)施例4胞吞分析為了評(píng)估血液DC亞類的胞吞作用，在37℃下將純化的CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+血液DC，以及(作為對(duì)照的)純化CD3+T細(xì)胞于含有1mg/ml螢光黃(LY)的培養(yǎng)基中溫育0、15、45和75分鐘。之后，細(xì)胞在冰冷的PBS/EDTA/BSA中洗滌三次并用流式細(xì)胞術(shù)分析。
實(shí)施例5所分離的血液DCs與未培養(yǎng)的血細(xì)胞的反應(yīng)性按照表1所列的mAb與血細(xì)胞的反應(yīng)性，可將其分成四組(1)AC144、AD5-13A11和ADB-4B8；(2)AD5-17F6；(3)AD5-5E8和AD5-14H12；以及(4)AD5-8E7。
第一組的mAb即AC144、AD5-13A11和ADB-4B8，可對(duì)所有PBMC的大約0.41±0.17％(n＝10)染色(圖1A)。在前面和側(cè)面散射信號(hào)的點(diǎn)陣圖中，這些稀有細(xì)胞構(gòu)成了位于小的靜止期淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞之間的均相細(xì)胞群(圖1B)。因此，這些稀有細(xì)胞不表達(dá)分別在T細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞上表達(dá)的αβT細(xì)胞受體(TCRαβ)、CD14、CD19和CD56(圖1A)，即譜系標(biāo)志物。高度純化的血液DC(＞95％的HLA-DR+、TCRαβ-、CD14-、CD19-和CD56-)的染色揭示出第一組的mAb可與CD11c-CD123亮血液DC反應(yīng)(圖2)，但不與CD11c+血液DC反應(yīng)。為了分析它們是否全部都與單一抗原反應(yīng)，我們進(jìn)行雙色染色和交叉抑制研究。結(jié)果表明，這一組的所有mAb都識(shí)別相同抗原的同一個(gè)表位。該抗原被命名為BDCA-2。
如圖3所示，第二組的mAb即AD5-17F6，它識(shí)別的PBMC中的細(xì)胞與AC144識(shí)別的PBMC中的細(xì)胞相同，其中所述AC144為第一組中BDCA-2特異的mAb之一。然而，被AD5-17F6染色的抗原不同于BDCA-2。這可由共內(nèi)化實(shí)驗(yàn)明確證實(shí)，其中AD5-17F6在抗-BDCA-2 mAb介導(dǎo)的BDCA-2的內(nèi)化之前和之后所顯示的表面染色強(qiáng)度相同；這還可由培養(yǎng)后對(duì)DC的染色明確證實(shí)，其中AC144 mAb和AD5-17F6 mAb顯示出完全不同的染色模式(圖4)。被AD5-17F6識(shí)別的抗原命名為BDCA-4并且等同于神經(jīng)纖毛旦白-1(He等人(1997))。
第三組的mAb即AD5-5E8和AD5-14H12，可對(duì)所有PBMC的大約0.04±0.01％(n＝10)染色(圖1A)。根據(jù)散射信號(hào)(圖1B)和用抗TCRαβ、CD14、CD19和CD56的mAb進(jìn)行的復(fù)染(圖1A)，這些細(xì)胞可與淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞區(qū)分開，并比第一組抗體識(shí)別的細(xì)胞稍大些。因此，對(duì)血液DC的染色表明AD5-5E8和AD5-14H12識(shí)別的是不同的亞類，這個(gè)亞類被命名為CD11c暗CD123-血液DC(圖2)。根據(jù)雙色染色、交叉封閉研究和共帽化實(shí)驗(yàn)，這兩種mAb似乎識(shí)別同一抗原的兩個(gè)在空間上不相關(guān)的表位。我們將該抗原命名為BDCA-3。
第四組mAb即AD5-8E7，可與高達(dá)2.39±0.96％(n＝10)的未分級(jí)PBMC反應(yīng)(圖1A)。對(duì)譜系標(biāo)志物TCRαβ、CD14和CD19的光散射分析(圖1B)和復(fù)染色揭示出該mAb不與T細(xì)胞及單核細(xì)胞反應(yīng)，但小的靜止期CD19+B細(xì)胞的主要亞類反應(yīng)。對(duì)純化DC的染色表明，除了B細(xì)胞之外，AD5-8E7也可染色血液DC的第三亞類，該亞類不同于第一和第二組的mAb所識(shí)別的那些亞類，并命名為CD11c亮CD123暗血液DC。相當(dāng)比例的CD11c亮CD123暗血液DC表達(dá)CD56(參見以下部分)。由于這個(gè)原因，一些可與AD5-8E7反應(yīng)的PBMC為CD56染色(圖1A)。AD5-8E7不與純化的NK細(xì)胞反應(yīng)。由AD5-8E7識(shí)別的抗原最初被命名為BDCA-1，因?yàn)樗坪跏且粋€(gè)新抗原。然而，隨后又發(fā)現(xiàn)AD5-8E7完全封閉CD1c mAb M241與MOLT-4細(xì)胞的結(jié)合(圖6)。于是，被AD5-8E7識(shí)別的抗原是CD1c。
表1所列的mAb沒有一個(gè)可與粒細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞、純化嗜堿性粒細(xì)胞和純化CD34+造血祖細(xì)胞反應(yīng)。
實(shí)施例6BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4在所培養(yǎng)的血液DC、Mo-DC和CD34-DC上的表達(dá)新鮮分離的漿細(xì)胞樣CD11c-血液DC的生存和成熟依賴于IL-3，而CD11c+血液DC的生存和成熟遠(yuǎn)非細(xì)胞因子依賴的。在rIL-3的存在下，對(duì)全血DC培養(yǎng)0、1、3、6、9、12、18、24、36和48小時(shí)之后，分析BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4在CD11c-和CD11c+血液DC上的表達(dá)。結(jié)果如圖4所示。在48小時(shí)之內(nèi)BDCA-2在CD11c-血液DC上的表達(dá)完全下調(diào)。相反，BDCA-4在CD11c-血液DC上的表達(dá)甚至進(jìn)一步被上調(diào)，并且不像BDCA-2，BDCA-4還在大部分CD11c+DC上(如果不是所有的話)以高水平表達(dá)。在CD11c-血液DC上BDCA-3的表達(dá)被迅速誘導(dǎo)，并在24小時(shí)之后達(dá)到最高的表達(dá)水平。此后，BDCA-3的表達(dá)似乎又被下調(diào)。分析BDCA-3在CD11c+血液DC上的表達(dá)被以下事實(shí)復(fù)雜化即BDCA-3-CD11c亮和BDCA-3+CD11c暗亞類在培養(yǎng)開始時(shí)均存在。至少在培養(yǎng)的6小時(shí)之內(nèi)在BDCA-3+CD11暗血液DC群上BDCA-3的表達(dá)保持不變，并且在3小時(shí)之內(nèi)在BDCA-3-CD11c亮血液DC亞類的至少一些細(xì)胞上BDCA-3的表達(dá)被誘導(dǎo)。
BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4在Mo-DC和CD34-DC上的表達(dá)單核細(xì)胞和CD34+造血祖細(xì)胞離體產(chǎn)生功能CD1a+DC(Bender等人(1996)；Pickl等人(1996)；Romani等人(1994)；Sallusto等人(1994)；Caux等人(1992)；Mackensen等人(1995)；Szabolcs等人(1995)；Herbst等人(1996)；de Wynter等人(1998)；以及Strunk等人(1996))。圖7表明，Mo-DC和CD34-DC表達(dá)CD1a、CD1c和BDCA-4，但不表達(dá)BDCA-2和BDCA-3，其中Mo-DC通過在rGM-CSF和IL-4存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞7天而產(chǎn)生，且其中CD34-DC通過在rFlt3-配體、rTGF-β1、rTNF-α、rSCF和rGM-CSF存在下培養(yǎng)CD34+造血祖細(xì)胞11天而產(chǎn)生。
實(shí)施例7在抗-BDCA-2介導(dǎo)的交聯(lián)之后BDCA-2被內(nèi)化通過用FITC結(jié)合的AC144 mAb(IgG1)給PBMC染色，提出了抗-BDCA-2 mAb標(biāo)記的BDCA-2+細(xì)胞在37℃溫育導(dǎo)致mAb內(nèi)化的可能性。其次，在37℃溫育后，通過用PE結(jié)合的大鼠抗-小鼠IgG1 mAb進(jìn)行染色來檢測殘留的細(xì)胞表面相關(guān)mAb。如圖8所示，當(dāng)細(xì)胞在37℃下進(jìn)行溫育時(shí)，大鼠抗-小鼠IgG1-PE的的染色強(qiáng)度非常迅速地降到背景水平。相反，AC144-FITC染色強(qiáng)度僅僅暫時(shí)降到大約50％的水平，但其后又返回到接近預(yù)溫育水平。這證實(shí)，BDCA-2在抗-BDCA-2 mAb交聯(lián)之后被內(nèi)化，并具有類似于受體介導(dǎo)的胞吞作用的動(dòng)力學(xué)特性。AC144-FITC染色強(qiáng)度的瞬時(shí)下降可能是由于胞吞作用之前BDCA-2/抗-BDCA-2 mAb復(fù)合物的斑化作用和帽化作用。
實(shí)施例8所分離的CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+血液DC的形態(tài)學(xué)通過用PE結(jié)合的一級(jí)mAb和抗-PE Ab結(jié)合的微珠進(jìn)行間接磁性標(biāo)記并通過MACS富集被標(biāo)記的細(xì)胞，可將CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+細(xì)胞從PBMC中分離出來(圖9)。在細(xì)胞離心的載玻片進(jìn)行MayGrunwald/Giemsa染色時(shí)(圖9)，新鮮分離的表達(dá)BDCA-2的細(xì)胞展示出來自血液和扁桃體的CD11c-CD4+lin-DC的典型淋巴漿細(xì)胞樣形態(tài)學(xué)即，具有卵形或鋸齒形細(xì)胞核的中等尺寸的圓形細(xì)胞。相反，新鮮分離的CD1c+血液DC以及新鮮分離的BDCA-3+血液DC均顯示出來自血液或扁桃體的CD11c+CD4+lin-DC的典型形態(tài)學(xué)特征即，具有短細(xì)胞突起和更多超小葉形細(xì)胞核的非圓形細(xì)胞。除了CD1c+BDC之外，在所分離的CD1c+PBMC的細(xì)胞離心載玻片上還可看到具有典型的小的靜止期淋巴細(xì)胞形態(tài)的CD1c+B細(xì)胞。如果在富集CD1c+細(xì)胞之前將CD19+B細(xì)胞從PBMC中磁性分離出來，可獲得高度純化的CD1c+BDC。
實(shí)施例9
CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+血液DC的表面表型通過用PE-和FITC結(jié)合的mAb進(jìn)行雙色免疫熒光來分析BDCA-2+和BDCA-3+血液DC的表型。對(duì)于CD1c+血液DC的分析，用CD19-Cy5進(jìn)行三色染色，以便排除B細(xì)胞。表位分析結(jié)果如表2所示并可總結(jié)如下血液DC亞類都不表達(dá)CD1a、CD8、CD15、CD16、CD19、CD20、CD23、CD25、CD27、CD34、CD61、CD69、CD7.1、CD77、CD80、CD83、血型糖蛋白A(GPA)、TCRαβ、AC133、IgD、IgM和CMRF-56抗原。所有的血液DC亞類都表達(dá)相似水平的CD43、CD44、CD54和MHCI類分子。BDCA-2+血液DC與其它兩個(gè)亞類不同，因?yàn)槠洳槐磉_(dá)CD13、CD40、CD45RO、CD56，但表達(dá)CD45RA和少量的CD10，且其表達(dá)較低水平的CD18、CD38、CD58、CD98、CD116和CLA，以及表達(dá)較高水平的CD4。CD1c血液DC與其它兩個(gè)亞類不同，因?yàn)槠浔磉_(dá)CD2，且表達(dá)較高水平的MHC II類分子，但表達(dá)較低水平的CD62L，并且還表達(dá)Fc受體CD32、CD64和FcεR1。可能是由于對(duì)Fc受體的表達(dá)，CD1c+血液DC也為IgG、κ和λ陽性；另外，一些CD1c+DC為CD14和CD11b陽性，而它們的表達(dá)水平與CD1c和CD2表達(dá)水平成反比。BDCA-3+血液DC不同于其它兩個(gè)亞類，因?yàn)槠湟苑浅５偷乃絹肀磉_(dá)CD36并且似乎還表達(dá)低水平的CD5。最后，除了CD11c和CD123外，至少一種其它抗原即CD33，可用于區(qū)分所有三個(gè)亞類CD33以低水平表達(dá)在BDCA-2+DC上，以中等水平表達(dá)在BDCA-3+DC上，而以高水平表達(dá)在CD1c+DC上。
表2



實(shí)施例10培養(yǎng)之后MHC II類、CD83和共刺激分子在CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+血液DC上的表達(dá)在沒有任何補(bǔ)充細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中將新鮮分離的CD1c+血液DC和BDCA-3+血液DC培養(yǎng)1天，并且在轉(zhuǎn)染CD32的成纖維細(xì)胞上于補(bǔ)充有IL-3和CD40 mAb的培養(yǎng)基中，將新鮮分離的BDCA-2+血液DC培養(yǎng)2天。培養(yǎng)期之后，分析細(xì)胞CD1a、CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表達(dá)。為了對(duì)比，還包括通過在GM-CSF和IL-4的存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞7天而產(chǎn)生的所謂“未成熟”Mo-DC，以及通過在TNF-α的存在下培養(yǎng)“未成熟”Mo-DC 3天而產(chǎn)生的所謂“成熟”Mo-DC(Sallusto等人(1995)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志182389-400；以及Sallusto等人(1998)免疫學(xué)雜志282760-2769)。如圖10所示，與“未成熟”Mo-DC和“成熟”Mo-DC相反，培養(yǎng)期之后血液DC亞類都不表達(dá)CD1a。然而，共刺激分子CD80和CD86、DC活化抗原CD83(Zhou等人(1995)；Zhou等人(1992)免疫學(xué)雜志149735-742；以及Zhou等人(1996)美國國家科學(xué)院院報(bào)USA932588-2592)以及HLA-DR分子在培養(yǎng)之后于所有三種血液DC亞類上均上調(diào)到與成熟Mo-DC相當(dāng)?shù)念愃扑缴?。該結(jié)果與另一實(shí)驗(yàn)沒有明顯的不同，其中在另一實(shí)驗(yàn)中，所有三種血液DC亞類在補(bǔ)充有IL-3、IL-4和GM-CSF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。正如以前對(duì)來自血液和扁桃體的CD11c-CD4+lin-DC所顯示的，BDCA-2+血液DC當(dāng)在沒有IL-3的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)會(huì)迅速死亡。
實(shí)施例11新鮮分離的CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+血液DC的胞吞能力通過在LY的存在下于37℃培養(yǎng)純化的CD1c+、BDCA-2+和BDCA-3+血液DC以及作為對(duì)照的純化CD3+T細(xì)胞，并在不同時(shí)間段之后用流式細(xì)胞術(shù)來分析LY的攝取，可測定上述細(xì)胞的胞吞能力。如圖11所示，不像純化的CD3+T細(xì)胞，純化的CD1c+血液DC、BDCA-3+血液DC以及在某種程度上BDCA-2+血液DC具有胞吞LY的能力。用FITC-葡聚糖可獲得類似的結(jié)果。所有的血液DC群的胞吞能力與Mo-DC相比都要低得多。
通過用AD5-17F6 mAb(AD5-17F6親和柱)純化抗原并用MALDITOF質(zhì)譜法分析所純化的抗原，可獲得BDCA-4的氨基酸序列。BDCA-4與神經(jīng)纖毛旦白-1等同(He等人(1997))。
實(shí)施例12BDCA-2與抗-BDCA-2單克隆抗體(AC144)的連接誘導(dǎo)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)員，而BDCA-4(神經(jīng)纖毛旦白-1)與抗-BDCA-4的連接不誘導(dǎo)Ca2+動(dòng)員。
材料和方法測定BDCA-2+BDCA-4+BDC和BDCA-2轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞中的胞質(zhì)鈣。BDCA-2+BDCA-4+血液DC和BDCA-2轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞載有Indo-1 AM(Sigma，St.Louis，MO)(正如Valitutti等人所述，(1993)歐洲免疫學(xué)雜志.23790-795)。分別將抗-BDCA-2(AC144，IgG1)或抗-BDCA-4(AD5-17F6，IgG1)mAb加入到新鮮分離的BDCA-2+BDCA-4+BDC和BDCA-2轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞中，隨后加入或不加入作為交聯(lián)劑的大鼠抗-小鼠IgG1mAb(X56)。在流式細(xì)胞熒光測定儀分析細(xì)胞，以便檢測Ca2+流出。該分析中只包括活的(基于散射標(biāo)準(zhǔn))和Indo-1標(biāo)記的細(xì)胞(基于405nm/525nm的發(fā)射光譜)。
圖13表示，抗-BDCA-2 mAb單獨(dú)(A)和/或抗-BDCA-2加上交聯(lián)的二級(jí)mAb(B、D、E)可對(duì)免疫磁性純化的BDCA-2+BDCA-4+BDC(A、B)和BDCA-2轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞(D)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)動(dòng)員，而對(duì)未轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞(E)卻不誘導(dǎo)。
將免疫磁性純化的BDCA-2+BDCA-4+BDC上的BDCA-4與抗-BDCA-4mAb連接并與二級(jí)mAb交聯(lián)不會(huì)誘導(dǎo)胞質(zhì)Ca2+動(dòng)員。所示出的是，Ca2+依賴的Indo-1-熒光405nm/525mm之比(Y軸)對(duì)時(shí)間(X軸，1024值對(duì)應(yīng)于204，80秒)的作圖。
如圖13所示，將漿細(xì)胞樣BDC(圖13A和B)和BDCA-2轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞(圖13D)上的表面BDCA-2與特異性mAb(AC144，IgG1)，(隨后進(jìn)行(圖13B和D)或不進(jìn)行(圖13A)二級(jí)交聯(lián)mAb(大鼠抗-小鼠IgG1，X56)，可引發(fā)胞質(zhì)鈣濃度迅速快速且暫時(shí)的升高。相反，漿細(xì)胞樣DC與抗-BDCA-4 mAb(AD5-17F6)、然后與二級(jí)交聯(lián)mAb(大鼠抗-小鼠IgG1，X56)溫育(圖14C)，以及未轉(zhuǎn)染的U937細(xì)胞與抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)、然后與二級(jí)交聯(lián)mAb(大鼠抗-小鼠IgG1，X56)溫育(圖13E)都不會(huì)誘導(dǎo)胞質(zhì)鈣濃度快速且暫時(shí)的升高。
實(shí)施例13通過用抗-BDCA-2 mAb觸發(fā)BDCA-2，可抑制純化的BDCA-2+BDCA-4+BDC對(duì)病毒刺激(流感病毒株P(guān)R8)的應(yīng)答而導(dǎo)致的I型干擾素的產(chǎn)生在應(yīng)答包膜病毒、細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞時(shí)，CD4+CD123亮CD11c-漿細(xì)胞樣DC表現(xiàn)為主要的I型干擾素產(chǎn)生細(xì)胞(Fitgerald-Bocarsly等人(1993)藥物治療(Pharmacol.Ther.)6039-62；Siegal等人(1999)科學(xué)2841835-1837；Cella等人(1999)自然醫(yī)學(xué)(Nature Med.)5919-923)。由于這個(gè)原因，它們已經(jīng)被稱為天然I型干擾素生成細(xì)胞(NIPC)。漿細(xì)胞樣DC表達(dá)BDCA-2和BDCA-4。如圖14所示，將漿細(xì)胞樣DC上的表面BDCA-2與特異的mAb、然后與二級(jí)交聯(lián)mAb(大鼠抗-小鼠IgG1，X56)連接，可抑制由來自血液或扁桃體的免疫磁性純化的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC對(duì)流感病毒株P(guān)R8(5HAU/ml)的應(yīng)答而導(dǎo)致的I型干擾素的分泌。在含有抗-BDCA-2、流感病毒和交聯(lián)mAb的培養(yǎng)物(圖14，AC144+RamG1+FLU)中I型干擾素的產(chǎn)生水平遠(yuǎn)低于僅含有流感病毒的培養(yǎng)物(圖14，F(xiàn)LU)或者含有同種型對(duì)照mAb(抗-細(xì)胞角蛋白mAb CK3-11D5，IgG1)、流感病毒和交聯(lián)mAb的培養(yǎng)物(圖14，CK3+RamG1+FLU)中I型干擾素的產(chǎn)生水平。
相反，漿細(xì)胞樣DC上的表面BDCA-4與特異的mAb、然后與二級(jí)交聯(lián)mAb(大鼠抗-小鼠IgG1，X56)連接，不會(huì)抑制由來自血液或扁桃體的免疫磁性純化的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC對(duì)流感病毒株P(guān)R8(5HAU/ml)的應(yīng)答而導(dǎo)致的I型干擾素的分泌。I型干擾素在含有抗-BDCA-4、流感病毒交聯(lián)的mAb的培養(yǎng)物(圖14，17F6+RamG1+FLU)中的生成水平與在含有同種型對(duì)照mAb(抗-細(xì)胞角蛋白mAb CK3-11D5，IgG1)、流感病毒和交聯(lián)mAb的培養(yǎng)物(圖14，CK3+RamG1+FLU)中的生成水平相同。
材料和方法通過用抗-BDCA-4(AD5-17F6)結(jié)合的微珠進(jìn)行直接磁性標(biāo)記并用MACS富集所標(biāo)記的細(xì)胞，可將表達(dá)BDCA-2和BDCA-4的漿細(xì)胞樣DC從PBMC(圖14A)或扁桃體細(xì)胞(圖14B)中分離出來。在存在以下物質(zhì)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所分離的表達(dá)BDCA-2和BDCA-4的漿細(xì)胞樣DC 24小時(shí)a)只存在IL-3(圖14，對(duì)照)；b)IL-3、抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)和大鼠抗-小鼠IgG1 mAb(圖14，AC144+RamG1)；c)IL-3、抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株P(guān)R8(圖14，AC144+RamG1+FLU)；d)IL-3和流感病毒株P(guān)R8(圖14，F(xiàn)LU)；e)IL-3、抗-細(xì)胞角蛋白mAb(CK3-11D5，IgG1)、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株P(guān)R8(圖14，CK3+RamG1+FLU)；以及f)IL-3、抗-BDCA-4 mAb(AD5-17F6)、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株P(guān)R8(圖14，17F6+RamG1+FLU)。
參照標(biāo)準(zhǔn)的INF-α曲線通過評(píng)估對(duì)Daudi細(xì)胞增殖的抑制可測定培養(yǎng)物上清液中所分泌的I型干擾素(Nederman等人(1990)生物制劑(Biologicals)1829-34)。
關(guān)于對(duì)BDCA-2+BDCA-4+漿細(xì)胞樣DC產(chǎn)生的I型干擾素的抑制，在SLE病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)循環(huán)的I型干擾素與型I干擾素誘導(dǎo)因子的水平升高(類似于抗-DNA抗體和DNA復(fù)合物)，并且它們還與疾病的活動(dòng)性有關(guān)。另外，用I型干擾素治療的非自身免疫紊亂病人頻繁地產(chǎn)生自身抗體并且偶爾導(dǎo)致SLE。來自Ronnblom等人(1999)臨床和實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(Clin.Exp.Immunol.)115196-202；(1999)免疫學(xué)雜志1636306-6313；以及(2000)免疫學(xué)雜志1653519-3526的幾篇論文表明，來自病人的I型干擾素誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)來自健康供體的PBMC分泌I型干擾素，并且它們還選擇性激活天然I型干擾素生成細(xì)胞(NIPC＝漿細(xì)胞樣DC)。
此處提出的BDCA-2的連接抑制了病毒刺激而誘導(dǎo)的I型干擾素的產(chǎn)生，這一發(fā)現(xiàn)表明可利用BDCA-2的結(jié)合來治療疾病，它不僅通過BDCA-2的連接而且通過耗竭NIPC(＝BDCA-2+BDCA-4+漿細(xì)胞樣DC)而發(fā)揮作用。因此本發(fā)明還包括體內(nèi)、體外及離體耗竭NIPC。這種耗竭適用于自身免疫疾病的治療或預(yù)防。
圖14表示是BDCA-2(而不是BDCA-4)與特異性mAb、然后與二級(jí)交聯(lián)mAb的連接可抑制由來自血液或扁桃體的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC對(duì)流感病毒株P(guān)R8刺激的應(yīng)答而導(dǎo)致的I型干擾素的分泌。在以下物質(zhì)的存在下，將來自血液(A)或扁桃體(B)的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC培養(yǎng)24小時(shí)只有IL-3(對(duì)照)；IL-3、抗-BDCA-2 mAb和大鼠抗-小鼠IgG1 mAb(AC144+RamG1)；IL-3、抗-BDCA-2 mAb、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株P(guān)R8(AC144+RamG1+FLU)；IL-3和流感病毒株P(guān)R8(FLU)；IL-3、抗-細(xì)胞角蛋白mAb、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株P(guān)R8(CK3+RamG1+FLU)；IL-3、抗-BDCA-4 mAb、大鼠抗-小鼠IgG1 mAb和流感病毒株P(guān)R8(17F6+RamG1+FLU)。參照標(biāo)準(zhǔn)的I型干擾素曲線通過生物分析方法可測定在培養(yǎng)物上清液中所分泌的I型干擾素(U/ml)。
實(shí)施例14BDCA-2不僅能夠胞吞配體，而且能夠?qū)⑵溥f送到加工和裝載抗原的區(qū)室中，并將其呈遞給CD4+II類限制性T細(xì)胞。
材料和方法通過用抗-BDCA-4(AD5-17F6)結(jié)合的微珠進(jìn)行直接磁性標(biāo)記并用MACS富集所標(biāo)記的細(xì)胞，可將表達(dá)BDCA-2和BDCA-4的漿細(xì)胞樣DC從PBMC中分離出來。在IgG1 mAb(0.2μg/ml)的存在下，將分離的表達(dá)BDCA-2和BDCA-4的漿細(xì)胞樣DC于96孔平底微板上與4x104個(gè)細(xì)胞/孔的B13 T細(xì)胞克隆(Lanzavecchia等人(1988)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志167345-352)共培養(yǎng)。以下是分析中所用的mAbAC144(抗-BDCA-2，IgG1)、ZM3.8(抗-ILT3，IgG1)和CK3-11D5(抗-細(xì)胞角蛋白，IgG1)。48小時(shí)之后，用(3H)胸苷(1μCi/孔)脈沖標(biāo)記培養(yǎng)物，并且在繼續(xù)培養(yǎng)16小時(shí)之后測定所摻入的放射活性。將(3H)胸苷的攝入(cpm)對(duì)培養(yǎng)物中所分離的表達(dá)BDCA-2和BDCA-4的漿細(xì)胞樣DC數(shù)作圖(圖15)。
圖15表示所分離的表達(dá)BDCA-2和BDCA-4的漿細(xì)胞樣DC可將抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)呈遞給小鼠IgG1特異的T細(xì)胞克隆。與抗-ILT-3 mAb(ZM3.8，IgG1，▲)和抗-細(xì)胞角蛋白mAb(CK3-11D5，IgG1，●)相比，BDCA-2+BDCA-4+漿細(xì)胞樣DC可將抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1，■)更有效地呈遞給T細(xì)胞。
于37℃溫育抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)標(biāo)記的BDCA-2+BDCA-4+漿細(xì)胞樣DC，可導(dǎo)致抗-BDCA-2 mAb/BDCA-2復(fù)合物在細(xì)胞表面極迅速地內(nèi)化(圖8)。此處表明，抗-BDCA-2 mAb(AC144，IgG1)進(jìn)入了加工和裝載抗原的區(qū)室并且由該抗體衍生的肽被有效地呈遞給特異于小鼠IgG1肽表位的CD4+II類限制性T細(xì)胞克隆(B13)。將抗-BDCA-2 mAb的呈遞與結(jié)合到受體(ILT3)上的IgG1 mAb的呈遞進(jìn)行比較，其中所述受體已知能夠?qū)⑵渑潴w靶向到加工和裝載肽的區(qū)室內(nèi)，還將抗-BDCA-2 mAb的呈遞與不結(jié)合BDCA-2+BDCA-4+漿細(xì)胞樣DC上的細(xì)胞表面分子但是能夠攝入流體相中的IgG1 mAb(抗-細(xì)胞角蛋白mAbCK3-11D5，IgG1)的呈遞進(jìn)行比較。如圖15所示，與抗-ILT-3 mAb和抗-細(xì)胞角蛋白mAb相比，BDCA-2+BDCA-4+漿細(xì)胞樣DC可將抗-BDCA-2 mAb(AC144)更有效地呈遞給T細(xì)胞。
實(shí)施例15在扁桃體細(xì)胞中，BDCA-2的表達(dá)被限制在CD123+T細(xì)胞區(qū)相關(guān)的漿細(xì)胞樣DC上，而BDCA-4也可低水平地表達(dá)在一些其它細(xì)胞上。
圖16表示BDCA-2和BDCA-4在扁桃體漿細(xì)胞樣CD123+DC上表達(dá)。所示出的是，分別用FITC結(jié)合的抗BDCA-2 mAb(AC144)和PE結(jié)合的抗CD123和BDCA-4的mAb(AD5-17F6)對(duì)扁桃體細(xì)胞進(jìn)行雙色染色。注意，BDCA-2的表達(dá)被限制在CD123亮的漿細(xì)胞樣DC上，而BDCA-4也可低水平地表達(dá)在一些其它細(xì)胞上。
實(shí)施例16BDCA-4 mAb(AD5-17F6)識(shí)別神經(jīng)纖毛旦白-1神經(jīng)纖毛旦白-1是腦衰蛋白/semaphorin家族的受體，其介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞導(dǎo)向。內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞也表達(dá)神經(jīng)纖毛旦白-1，而后者作為血管內(nèi)皮生長因子的同種型特異性受體。但以前不知道神經(jīng)纖毛旦白-1在血液和扁桃體中的漿細(xì)胞樣DC上表達(dá)并且它可作為至少是在新鮮未培養(yǎng)血液中漿細(xì)胞樣DC的極好標(biāo)記物。
材料和方法用抗-BDCA-4 mAb AD5-17F6(抗-NRP-1(ML))將神經(jīng)纖毛旦白-1從未轉(zhuǎn)染的PAE細(xì)胞(P)和神經(jīng)纖毛旦白-1轉(zhuǎn)染的PEA細(xì)胞(NP)的細(xì)胞裂解物中免疫沉淀出來(Soker等人(1998)細(xì)胞92735-745)。用BDCA-4特異的mAb AD5-17F6(ML)或神經(jīng)纖毛旦白-1特異的mAb(來自Shay Soker，波士頓兒童醫(yī)院(Children’s Hospital，Boston)，MA(S))通過SDS-PAGE和Western印跡法來分析所沉淀的蛋白質(zhì)。
圖17表示，用抗-BDCA-4 mAb AD5-17F6(抗-NRP-1(ML))將神經(jīng)纖毛旦白-1從神經(jīng)纖毛旦白-1轉(zhuǎn)染的PEA細(xì)胞(NP)(而不是未轉(zhuǎn)染的PAE細(xì)胞(P))的細(xì)胞裂解物中免疫沉淀出來。利用BDCA-4特異的mAb AD5-17F6(ML)或神經(jīng)纖毛旦白-1特異的mAb(來自Shay Soker，波士頓兒童醫(yī)院MA(S))通過SDS-PAGE和Western印跡法來分析所沉淀的蛋白質(zhì)。
注意，BDCA-4特異的mAb AD5-17F6從神經(jīng)纖毛旦白-1轉(zhuǎn)染的PEA細(xì)胞(NP)(而不是未轉(zhuǎn)染的PAE細(xì)胞(P))中免疫沉淀出大約130-140kDa的特定條帶?？捎脕碜許hay Soker(S)的神經(jīng)纖毛旦白-1特異的mAb(而不是抗-BDCA-4 mAb AD5-17F6(ML))來檢測該條帶。于是，在標(biāo)準(zhǔn)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中我們的抗-BDCA-4 mAb AD5-17F6識(shí)別天然形式的神經(jīng)纖毛旦白-1，但是當(dāng)用于SDS-PAGE/Western印跡實(shí)驗(yàn)中時(shí)卻不能檢測到神經(jīng)纖毛旦白-1的變性形式。
令人感興趣的是，神經(jīng)纖毛旦白-1還可由內(nèi)皮和腫瘤細(xì)胞來表達(dá)，而后者作為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的同種型特異性受體。更感興趣的是，有幾篇論文(Gabrilovich等人(1996)自然醫(yī)學(xué)21267；自然醫(yī)學(xué)21096-103；Gabrilovich等人(1999)臨床癌研究(Clin.Cancer Res.)52963-70；Ohm等人(1999).免疫學(xué)雜志1633260-8；Oyama等人(1998)免疫學(xué)雜志1601224-32；Gabrilovich等人(1998).血液924150-66；Ishida等人(1998)免疫學(xué)雜志1614842-51)業(yè)已表明，由大多數(shù)腫瘤所產(chǎn)生的VEGF減小了體內(nèi)DC的生成和功能。還不清楚對(duì)DCs的這些作用是否由神經(jīng)纖毛旦白-1(BDCA-4)介導(dǎo)，但是本發(fā)明包括神經(jīng)纖毛旦白-1介導(dǎo)的對(duì)DCs的功能調(diào)節(jié)。
實(shí)施例17通過用抗-BDCA-2 mAb觸發(fā)BDCA-2，可抑制純化的BDCA-2+BDCA-4+BDC對(duì)poly IC刺激的應(yīng)答而導(dǎo)致的I型干擾素(IFN-α)的產(chǎn)生在對(duì)包膜病毒、細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞的應(yīng)答中，CD4+CD123亮CD11c-漿細(xì)胞樣DC表現(xiàn)為主要的I型干擾素產(chǎn)生細(xì)胞(Fizgerald-Bocarsly等人(1993)藥物治療(Pharmacol.Ther.)6039-62；Siegal等人(1999)科學(xué)2841835-1837；Cella等人(1999)自然醫(yī)學(xué)5919-923)。由于這個(gè)原因，它們也已被稱作天然I型干擾素生成細(xì)胞(NIPC)。漿細(xì)胞樣DC表達(dá)BDCA-2和BDCA-4。如圖19所示，將漿細(xì)胞樣DC上的表面BDCA-2與特異的mAb、然后與二級(jí)交聯(lián)mAb(山羊抗-小鼠IgG)的連接，可抑制由來自血液或扁桃體的免疫磁性純化的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC對(duì)poly IC刺激的應(yīng)答而導(dǎo)致的IFN-α的分泌。IFN-α在具有抗-BDCA-2、poly IC和交聯(lián)mAb(圖18，AC144+山羊抗-小鼠IgG+poly IC)的培養(yǎng)物中的生成水平與在具有小鼠IgG、poly IC和交聯(lián)mAb(圖18，小鼠IgG1+山羊抗-小鼠IgG+poly IC)的培養(yǎng)物中的生成水平一樣低。
材料和方法用BDCA-4微珠，將CD11c-CD123亮漿細(xì)胞樣DC從人外周血單核細(xì)胞中分離。在37℃下于RPMI、10％FCS、10mMHEPES、50μM2-ME、20μg/ml慶大霉素中使CD11c-CD123亮漿細(xì)胞樣DC(1x106細(xì)胞/ml)與10μg/ml的AC144mAb或小鼠IgG1mAb(CF6B，抗-TPO)一起溫育30分鐘。加入20μg/ml的山羊抗-小鼠IgG(Chcmicon International)，并將細(xì)胞于37℃再溫育30分鐘。在37℃下這些細(xì)胞與或不與20μg的poly IC(Sigma)一起溫育24小時(shí)。收獲培養(yǎng)上清液并用ELISA(Endogen)測定IFN-α的濃度。測定靈敏度是3pg/ml。
圖18表示，是BDCA-2(而不是BDCA-4)與特異的mAb、然后與二級(jí)交聯(lián)mAb的連接抑制由來自血液或扁桃體的漿細(xì)胞樣BDCA-2+BDCA-4+DC對(duì)poly IC刺激的應(yīng)答而導(dǎo)致的IFN-α的分泌。在37℃下使來自血液的BDCA-2+BDCA-4+DC與10μg/ml的AC144 mAb(2和4)或小鼠IgG1mAb(CF6B，抗-TPO，1和3)一起溫育30分鐘。加入20μg/ml的山羊抗-小鼠IgG并將細(xì)胞于37℃下再溫育30分鐘。在37℃下這些細(xì)胞與(3和4)或不與(1和2)20μg的poly IC(Sigma)一起溫育24小時(shí)。收獲培養(yǎng)上清液并用ELISA測定INF-α的濃度。
實(shí)施例18在多種組織和純化血細(xì)胞群中用RT-PCR分析BDCA-2 mRNA的表達(dá)核酸與氨基酸序列通過COS細(xì)胞中的表達(dá)克隆而獲得編碼BDCA-2的cDNA。圖5示出了BDCA-2的氨基酸序列(全部六個(gè)外顯子均表達(dá)的同種型)。BDCA-2是新的C-型凝集素II型膜蛋白。這些凝集素例如在Bates等人(1999)免疫學(xué)雜志1631973-1983中有所描述。實(shí)施例20給出了BDCA-2與已知的C型凝集素的比較。
圖19表示用來自CLONTECH的人多組織cDNA系列的分析(泳道1心臟；泳道2腦；泳道3胎盤；泳道4肺；泳道5肝；泳道6骨骼肌；泳道7腎；泳道8胰腺；泳道9脾；泳道10胸腺；泳道11睪丸；泳道12卵巢；泳道13小腸；泳道14淋巴結(jié)；泳道15骨髓；泳道16胎兒肝臟；泳道17扁桃體)，以及從血液白細(xì)胞的不同群體所制備的cDNAs的分析(泳道18T細(xì)胞；泳道19B細(xì)胞；泳道20NK細(xì)胞；泳道21單核細(xì)胞；泳道22CD11c亮CD123低DC；泳道23CD11c-CD123亮漿細(xì)胞樣BDC)，用于了解BDCA-2 cDNA的存在。
所有的cDNAs被歸一化到若干不同管家基因(甘油醛-3-磷酸脫氫酶、磷脂酶A2、α-微管蛋白和β-肌動(dòng)蛋白)的mRNA的表達(dá)水平上。歸一化確保了對(duì)靶mRNAs組織特異性和相對(duì)豐度的精確評(píng)估。將相同量的cDNA(大約50pg)用于每個(gè)RT-PCR反應(yīng)。用BDCA-2特異性引物(正向引物5’-TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT(SEQ ID NO)和反向引物5’-TAGCTTTCTACAACGGTGGATGCC(SEQ ID NO))以及上述四個(gè)管家基因的引物(CLONTECH)，用AdvanTaq Plus DNAPolymerase(CLONTECH)來實(shí)施RT-PCR反應(yīng)。
循環(huán)條件如下94℃ 30秒以及68℃ 2分鐘。擴(kuò)增BDCA-2時(shí)進(jìn)行34次循環(huán)，擴(kuò)增甘油醛-3-磷酸脫氫酶(G3PDH)時(shí)進(jìn)行38次循環(huán)。注意，僅僅在CD11c-CD123亮漿細(xì)胞樣DC可檢測到BDCA-2 mRNA信號(hào)。如果再進(jìn)行4次PCR循環(huán)用于擴(kuò)增BDCA-2 cDNA(38次循環(huán)而不是34次循環(huán))，那么在胰腺、睪丸、卵巢、骨髓和扁桃體中也可檢測到弱信號(hào)。對(duì)來自睪丸的cDNA(38次PCR循環(huán))，與來自CD11c-CD123亮漿細(xì)胞樣DC的信號(hào)相比，較短的轉(zhuǎn)錄本(剪接變體)信號(hào)更突出，并且來自全長轉(zhuǎn)錄本的信號(hào)確實(shí)只在更多次的PCR循環(huán)下才可檢測到。
實(shí)施例19BDCA-2的外顯子/內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)以及BDCA-2的剪接變體可如下獲得BDCA-2剪接變體的信息來自漿細(xì)胞樣DC的mRNA用在起始密碼子之前的mRNA序列(正向引物5′-TTGAAAGAACCACACCCCGAAAGT(SEQ ID NO))和在終止密碼子之后的與mRNA序列互補(bǔ)的引物(反向引物5′-TAGCTTTCTACAACGGTGGATGCC(SEQ ID NO))來進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，然后將所得到的片段克隆入質(zhì)粒并對(duì)插入片段測序。結(jié)果如圖20所示。作為比較，圖21示出了小鼠樹突狀細(xì)胞相關(guān)的C型凝集素2(Dectin-2)的剪接變體。
圖22對(duì)已扣除了內(nèi)含子的BDCA-2和小鼠Dectin-2的mRNA序列同源比較，其中指出了扣除的內(nèi)含子所在位置。表3示出了外顯子的參數(shù)。
表3

內(nèi)含子的部位是基于人類雜色體12克隆RP11-277J24、工作草圖序列、21無序片段(GenBank登記號(hào)AC006517)和基于轉(zhuǎn)錄本剪接的規(guī)則。BDCA-2的內(nèi)含子/外顯子構(gòu)建類似于Dectin-2。
至少產(chǎn)生了四種BDCA-2的剪接變體。它們是編碼具有全部六個(gè)外顯子的蛋白質(zhì)的mRNA；編碼含有外顯子1、3、4、5和6的蛋白質(zhì)的mRNA；編碼含有外顯子1、2、4、5和6的蛋白質(zhì)的mRNA；以及編碼含有外顯子1、2、3、5、和6的蛋白質(zhì)的mRNA。
實(shí)施例20BDCA-2的同源性和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域圖23示出了人BDCA-2、人DCIR(樹突狀細(xì)胞免疫受體)和小鼠Dectin-2(樹突狀細(xì)胞相關(guān)的C型凝集素-2)的氨基酸序列的同源性比較。人DCIR(GenBank登記號(hào)AJ133532)是與人分子中的BDCA-2最高度同源的分子(參見Bates等人(1999)免疫學(xué)雜志1631973)，在一段191aa中約51％的aa相同。
小鼠Dectin-2(GenBank登記號(hào)AF240357)是與人BDCA-2最接近的鼠同源物(參見Ariizumi等人(2000)生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)1611957；WO98/28332；PCT/US97/23761；以及美國專利6,046,158)，在一段211aa中約51％的aa相同。
BDCA-2(213aa)、DCIR(237aa)和Dectin-2(209aa)均為鈣依賴的(C-型)凝集素家族的II型膜糖蛋白。這些分子中的每一種都含有推定的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(BDCA-2aa 1-21；DCIRaa 1-44；Dectin-2aa 1-17)、推定的跨膜結(jié)構(gòu)域(BDCA-2aa 22-41；DCIRaa 44-69；Dectin-2aa 18-40)和推定的胞外結(jié)構(gòu)域(BDCA-2aa 42-231；DCIRaa 70-237；Dectin-2aa40-209)。在推定的胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)，這些分子中的每一種都在COOH末端含有一個(gè)單一的糖識(shí)別結(jié)構(gòu)域(CRD)(BDCA-2aa 83-206；DCIRaa106-230；Dectin-2aa 79-202)。圖23示出了人BDCA-2、人DCIR和小鼠Dectin-2的對(duì)比排列。
表4示出了用PROSITE數(shù)據(jù)庫所找到的推定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域/基序。
表4


BDCA-2含有三個(gè)推定的N-糖基化位點(diǎn)(aa 110-113 NCSV；aa 137-140NSSY；aa 164-167 NVTF)，而Dectin-2(aa 131-134 NESL)和DCIR(aa185-188 NESS)只含有一個(gè)推定的N-糖基化位點(diǎn)。BDCA-2和Dectin-2的所有推定的磷酸化位點(diǎn)都位于推定的胞外結(jié)構(gòu)域內(nèi)。因此，它們通過胞內(nèi)激酶而磷酸化幾乎是不可能的。正如許多在天然殺傷基因復(fù)合物內(nèi)編碼的C型凝集素(例如CD94、Ly-49和NKG2)，DCIR在胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有共有的免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM基序；(I/V)XYXX(L/V)，為(aa 5-10 ITYAEV)。有趣的是，在BDCA-2和Dectin-2的相對(duì)短的胞質(zhì)尾部(BDCA-221 aa；Dectin-217 aa)沒有發(fā)現(xiàn)該ITIM基序。
實(shí)施例21BDCA-3蛋白的分析用10ng/ml的PMA(Sigma)和0.5mg/ml的離子霉素刺激表達(dá)BDCA-3的HD-MY-Z細(xì)胞達(dá)24小時(shí)，以便上調(diào)BDCA-3的表達(dá)。將3x107個(gè)PMA/離子霉素刺激的HD-MY-Z細(xì)胞在4℃下與1mg/ml的Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)溫育15分鐘使細(xì)胞被表面生物素化，然后洗滌兩次，將細(xì)胞重懸于補(bǔ)充有10％蔗糖和蛋白酶抑制劑(來自Serva的苯甲磺酰氟、胃蛋白酶抑制劑A、亮抑蛋白酶肽和抑蛋白酶肽)的50mMTris-HCl pH8.0中，并在0℃進(jìn)行超聲(5x4秒，70％輸出)。所超聲的細(xì)胞于4℃以900xg離心10分鐘，以便除去胞核及完整細(xì)胞。上清液于4℃以30,000xg的條件離心2小時(shí)，以便得到純化的細(xì)胞膜。通過在0℃于補(bǔ)充有蛋白酶抑制劑和1％NP-40的50mM Tris-HCl pH8.0，150mMNaCl中溫育1小時(shí)，以裂解胞膜。通過在4℃以30,000xg進(jìn)行離心，可除去未溶解的胞膜碎片。將MnCl2和CaCl2加入到上清液中，并使它們各自的終濃度為1mM。將裂解物于ConA Sepharose柱(1ml)上吸附，并且用10ml的洗脫緩沖劑(0.5MD(+)甘露糖，20mM Tris-HCl pH7.4，0.5M NaCl，1％NP-40)來洗脫所結(jié)合的蛋白質(zhì)，并用Cetriprep-10離心濃縮機(jī)(Amicon)將其濃縮到1ml的體積。
通過在4℃與150μl的抗-NIP mAb結(jié)合的微殊(Miltenyi Biotec)一起溫育30分鐘并進(jìn)行μMACS柱分離，可預(yù)清潔蛋白質(zhì)。為了特異性免疫沉淀BDCA-3，蛋白質(zhì)可與2μg NIP結(jié)合的BDCA-3特異性mAbAD5-14H12(IgG1)一起溫育，或者為了控制特異性，可在4℃與2μg作為一級(jí)試劑的NIP結(jié)合的CD19特異性mAb SJ25-C1(IgG1)一起溫育14小時(shí)，并且在4℃與作為二級(jí)試劑的抗-NIP mAb結(jié)合的微珠一起溫育3小時(shí)。利用μMACS柱分離技術(shù)來分離所沉淀的蛋白質(zhì)。用70μl含有DTT的的SDS-PAGE緩沖劑洗脫所保留的蛋白質(zhì)。用鏈親和素-過氧化物酶通過SDS-PAGE(4-12％)和Western印跡法來分析所沉淀的蛋白質(zhì)。
圖24的結(jié)果表明，BDCA-3特異性mAb AD5-14H12可從HD-MY-Z細(xì)胞上特異性免疫沉淀出大約100kD的細(xì)胞表面蛋白質(zhì)。因此，BDCA-3具有100kD的表觀分子量。
雖然為了清楚和理解起見，業(yè)已借助圖解和實(shí)施例對(duì)上述發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可對(duì)它們進(jìn)行某些改變和改進(jìn)。因此，這些描述和實(shí)施例不應(yīng)該構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限定，該范圍記載在后面所附的權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含分離的特異于樹突狀細(xì)胞(DCs)亞類的抗原結(jié)合片段，其中所述亞類被命名為AC144、AD5-13A11、AD5-17F6、AD5-4B8、AD5-5E8、AD5-14H12或AD5-8E7的抗體特異性識(shí)別。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段是AC144或者是由其衍生的。
3.據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段是AD5-1311或者是由其衍生的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段是AD5-4B8或者是由其衍生的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段是AD5-17F6或者是由其衍生的。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段是AD5-5E8或者是由其衍生的。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段是AD5-14H12或者是由其衍生的。
8.據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段是AD5-8E7或者是由其衍生的。
9.一種組合物，其包含特異于命名為BDCA-2(SEQ ID NO2)的抗原的一個(gè)表位的抗原結(jié)合片段。
10.一種組合物，其包含特異于命名為BDCA-3的抗原的一個(gè)表位的抗原結(jié)合片段。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，其中BDCA-3是100kD的蛋白質(zhì)。
12.基本上分離或濃縮的細(xì)胞群或亞群，其被根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的組合物特異性識(shí)別。
13.基本上被分離或濃縮的DC群或亞群，其是通過鑒定細(xì)胞表面上的神經(jīng)纖毛旦白-1而分離的。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的DC群或亞群，其中與特異于BDCA-4的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)的抗原結(jié)合片段識(shí)別所述的神經(jīng)纖毛旦白-1。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段選自全抗體、雙特異性抗體、嵌合抗體、Fab、F(ab’)2、單鏈V區(qū)片段(scFv)、融合多肽、aptomer、糖類以及凝集素。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段是人源的。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的組合物，其中噬菌體展示文庫編碼所述抗原結(jié)合片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中所述抗原結(jié)合片段基本上是由scFv構(gòu)成的。
19.根據(jù)權(quán)利要求15的組合物，其中融合多肽包括被融合到化學(xué)功能組分上的抗原結(jié)合片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的組合物，其中所述組分選自信號(hào)肽、增強(qiáng)免疫反應(yīng)性的試劑、抗原、促進(jìn)與固相載體偶聯(lián)的試劑、生物應(yīng)答修飾劑、免疫毒素、毒素、可檢測的標(biāo)記物、順磁標(biāo)記物以及藥物。
21.據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中促進(jìn)與固相載體偶聯(lián)的試劑選自生物素和親和素。
22.據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中生物應(yīng)答修飾劑是細(xì)胞因子或趨化因子。
23.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中細(xì)胞因子/趨化因子選自IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、干擾素、TNF-α、IL-10和TGF-β。
24.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中毒素選自蓖麻毒蛋白、放射性核素、商陸抗病毒蛋白、假單胞桿菌外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白A鏈、霉菌核糖體滅活蛋白和磷脂酶類。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的組合物，其中可檢測標(biāo)記物選自放射性同位素、熒光化合物、膠體金屬、化學(xué)發(fā)光化合物、生物發(fā)光化合物、酶、底物、輔因子和抑制劑。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-25中任意一項(xiàng)所述的組合物，其進(jìn)一步包含生理上可接受的賦形劑。
27.一種細(xì)胞群或亞群，其中基本上所有的細(xì)胞都表達(dá)BDCA-1、BDCA-2和BDCA-3的至少之一，或基本上所有的細(xì)胞都在基于BDCA-1、BDCA-2和BDCA-3中的至少之一的表達(dá)基礎(chǔ)上而被分離、濃縮或計(jì)數(shù)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中至少80％的細(xì)胞為BDCA-1+。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中至少90％的細(xì)胞是BDCA-1+。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中至少95％的細(xì)胞為BDCA-1+。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中至少80％的細(xì)胞為BDCA-2+。
32.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中至少90％的細(xì)胞為BDCA-2+。
33.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中至少95％的細(xì)胞為BDCA-2+。
34.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中至少80％的細(xì)胞為BDCA-3+。
35.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中至少90％的細(xì)胞為BDCA-3+。
36.根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其中至少95％的細(xì)胞為BDCA-3+。
37.一種樹突狀細(xì)胞群或亞群，其中基本上所有的細(xì)胞都表達(dá)BDCA-4，或基本上所有的細(xì)胞都在表達(dá)BDCA-4的基礎(chǔ)上被分離、濃縮或計(jì)數(shù)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中至少80％的細(xì)胞為BDCA-4+。
39.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中至少90％的細(xì)胞為BDCA-4+。
40.根據(jù)權(quán)利要求37的組合物，其中至少95％的細(xì)胞為BDCA-4+。
41.權(quán)利要求12-14和29-40中任意一項(xiàng)所述的樹突狀細(xì)胞，其中細(xì)胞基本上為活化的。
42.一種組合物，其包含權(quán)利要求12-14和28-41中任意一項(xiàng)所述的細(xì)胞和生理可接受的賦形劑。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種抗原或抗原肽(T細(xì)胞表位)。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的組合物，其中抗原被承載到細(xì)胞內(nèi)。
45.根據(jù)權(quán)利要求43的組合物，其中抗原在含有細(xì)胞的溶液中。
46.根據(jù)權(quán)利要求43的組合物，其中抗原被呈遞到細(xì)胞表面。
47.根據(jù)權(quán)利要求43的組合物，其中細(xì)胞已被處理，以調(diào)節(jié)胞質(zhì)鈣濃度(至少是瞬時(shí)的)。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的組合物，其中抗原由外源衍生的基因或mRNA表達(dá)。
49.根據(jù)權(quán)利要求48的細(xì)胞，其中用特異于BDCA-2的抗原結(jié)合片段對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中抗原選自腫瘤細(xì)胞抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲衍生的抗原、自身抗原和/或抗原肽(T細(xì)胞表位)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中在組合物施與受試對(duì)象之后，細(xì)胞和抗原的濃度可在受試對(duì)象體內(nèi)有效引發(fā)免疫應(yīng)答。
52.根據(jù)權(quán)利要求51的組合物，其中免疫應(yīng)答是導(dǎo)向抗腫瘤、病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌的。
53.根據(jù)權(quán)利要求52的組合物，其中抗原是人腫瘤抗原，并選自星形細(xì)胞瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、間膠質(zhì)瘤、室管膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、原始神經(jīng)外胚層瘤(PNET)、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、胰管腺癌、小和大的細(xì)胞肺腺癌、脊索癌、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、支氣管肺泡癌、上皮腺癌、及其肝轉(zhuǎn)移瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、基底細(xì)胞癌、汗腺癌、乳頭狀癌、皮脂腺癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、膽囊癌、絨膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、睪丸瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聲神經(jīng)瘤、間膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、以及重鏈病、乳腺癌(例如管和小葉腺癌)、子宮頸的鱗狀腺癌、子宮和卵巢上皮癌、前列腺腺癌、膀胱的過渡鱗狀細(xì)胞癌、B和T細(xì)胞淋巴癌(結(jié)的和擴(kuò)散的)漿細(xì)胞瘤、急性和慢性白血病、惡性黑瘤、軟組織肉瘤和平滑肌肉瘤。
54.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中抗原是耐受原。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的組合物，其中耐受原為自身免疫疾病特異的。
56.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中自身免疫疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、強(qiáng)直性脊柱炎、眼干燥綜合征、肺出血腎炎綜合征、瑞特綜合征、硬皮病、脈管炎、多肌炎和皮膚肌炎。
57.根據(jù)權(quán)利要求55的組合物，其中耐受原為器官移殖特異的。
58.根據(jù)權(quán)利要求56的組合物，其中器官移殖選自心臟、肺、肝、骨髓、干細(xì)胞、腎、皮膚。
59.一種用于獲得包含富集DCs的細(xì)胞的組合物的方法，該方法包括將人細(xì)胞混合物分離為一個(gè)組分，其中該組分中至少80％的細(xì)胞是BDCA-1+。
60.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中至少90％的細(xì)胞是BDCA-1+。
61.根據(jù)權(quán)利要求59的方法，其中至少95％的細(xì)胞是BDCA-1+。
62.一種用于獲得包含為富集DCs的細(xì)胞的組合物的方法，該方法包括將人細(xì)胞混合物分離為一個(gè)組分，其中該組分中至少80％的細(xì)胞是BDCA-2+。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中至少90％的細(xì)胞是BDCA-2+。
64.根據(jù)權(quán)利要求62的方法，其中至少95％的細(xì)胞是BDCA-2+。
65.一種用于獲得包含富集DCs的細(xì)胞的組合物的方法，該方法包括將人細(xì)胞混合物分離為一個(gè)組分，其中該組分中至少80％的細(xì)胞是BDCA-3+。
66.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中至少90％的細(xì)胞是BDCA-3+。
67.根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中至少95％的細(xì)胞是BDCA-3+。
68.一種用于獲得包含富集DCs的細(xì)胞的組合物的方法，該方法包括將人細(xì)胞混合物分離為一個(gè)組分，其中該組分中至少80％的細(xì)胞是BDCA-4+。
69.根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其中至少90％的細(xì)胞是BDCA-4+。
70.根據(jù)權(quán)利要求68的方法，其中至少95％的細(xì)胞是BDCA-4+。
71.一種用于分離基本上純的細(xì)胞群的方法，包括a)獲得人細(xì)胞混合物；b)從由特異于命名為BDCA-2的抗原的抗原結(jié)合片段所特異性識(shí)別的混合物中將細(xì)胞基本上分離出來。
72.根據(jù)權(quán)利要求71的方法，其中抗原結(jié)合片段是AC144、AD5-13A11或AD5-4B8或者是由其衍生的。
73.一種用于分離基本上純的細(xì)胞群的方法，包括以下步驟a)獲得人細(xì)胞混合物；以及b)從由特異于命名為BDCA-3的抗原的抗原結(jié)合片段所特異性識(shí)別的混合物中將細(xì)胞基本上分離出來。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中抗原結(jié)合片段是AD5-5E8或AD5-14H12或者是由其衍生的。
75.一種用于分離基本上純的DCs群的方法，包括以下步驟c)獲得人細(xì)胞混合物；以及d)從由特異于命名為BDCA-4的抗原的抗原結(jié)合片段所特異性識(shí)別的混合物中將細(xì)胞基本上分離出來。
76.根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中抗原結(jié)合片段是AD5-17F6或者是由其衍生的。
77.根據(jù)權(quán)利要求63-76中任意一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞源選自胎兒骨髓、新生兒骨髓、成人骨髓、胎兒肝臟、外周血和臍帶血、白細(xì)胞分離復(fù)置術(shù)、活化的新鮮血液、經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞、扁桃體、脾、淋巴結(jié)、皮膚、氣道上皮、肺、肝、腸、淋巴集結(jié)和鼻。
78.根據(jù)權(quán)利要求77的方法，其中外周血是被動(dòng)員的。
79.根據(jù)權(quán)利要求77的方法，其中動(dòng)員是通過用選自fLt3-配體和G-CSF的組合物進(jìn)行預(yù)處理而實(shí)施的。
80.根據(jù)權(quán)利要求77的方法，其中動(dòng)員是通過用選自誘導(dǎo)內(nèi)源性I型干擾素、IL-12和IL-4的方法的組合物進(jìn)行預(yù)處理而實(shí)施的。
81.一種用于計(jì)數(shù)細(xì)胞的方法，包括以下步驟a)獲得細(xì)胞混合物；以及b)用抗原結(jié)合片段標(biāo)記細(xì)胞，其中所述抗原結(jié)合片段特異于選自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任一種或多種抗原。
82.根據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中抗原是BDCA-1。
83.根據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中抗原是BDCA-2。
84.根據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中抗原是BDCA-3。
85.根據(jù)權(quán)利要求81的方法，其中抗原是BDCA-4。
86.一種調(diào)節(jié)DCs的免疫能力的方法，包括以下步驟分離基本上純的DCs群或亞群；以及調(diào)節(jié)DCs的胞質(zhì)鈣濃度(至少是瞬時(shí)的)。
87.根據(jù)權(quán)利要求86的方法，其中DCs的調(diào)節(jié)導(dǎo)致優(yōu)先誘導(dǎo)對(duì)抗原的Th1應(yīng)答的樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)生。
88.根據(jù)權(quán)利要求87的方法，其中抗原是變應(yīng)原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、腫瘤抗原、寄生蟲抗原和真菌抗原。
89.根據(jù)權(quán)利要求86的方法，其中DCs的調(diào)節(jié)導(dǎo)致優(yōu)先誘導(dǎo)對(duì)抗原的Th2應(yīng)答的樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)生。
90.根據(jù)權(quán)利要求89的方法，其中抗原選自寄生蟲、自身抗原、細(xì)菌和病毒。
91.根據(jù)權(quán)利要求86的方法，其中DCs的調(diào)節(jié)導(dǎo)致優(yōu)先誘導(dǎo)對(duì)抗原的Th3/Th-R應(yīng)答的樹突狀細(xì)胞的產(chǎn)生。
92.根據(jù)權(quán)利要求91的方法，其中抗原選自寄生蟲、自身抗原、細(xì)菌、變應(yīng)原和病毒。
93.一種用于篩選在測試劑中存在藥效劑的的方法，包括以下步驟用抗原結(jié)合片段分離或檢測或計(jì)數(shù)基本上純的細(xì)胞群或亞群，其中所述抗原結(jié)合片段特異于選自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任一種或多種抗原；用測試劑篩分細(xì)胞；監(jiān)測細(xì)胞對(duì)測試劑的應(yīng)答；將細(xì)胞對(duì)測試劑的應(yīng)答與細(xì)胞對(duì)所暴露的對(duì)照劑的應(yīng)答進(jìn)行比較；以及確定測試劑是否調(diào)節(jié)所分離、檢測、計(jì)數(shù)細(xì)胞的任何一種免疫學(xué)特性。
94.根據(jù)權(quán)利要求93的方法，其中細(xì)胞特性選自抗原呈遞、細(xì)胞因子的產(chǎn)生、對(duì)細(xì)胞因子的應(yīng)答、對(duì)Th1應(yīng)答的誘導(dǎo)和抑制、對(duì)Th2應(yīng)答的誘導(dǎo)和抑制、對(duì)誘導(dǎo)耐受的Th3/Th-R應(yīng)答能力的誘導(dǎo)和抑制、對(duì)抗原特異性應(yīng)答的誘導(dǎo)、T細(xì)胞無反應(yīng)性的誘導(dǎo)、至少瞬時(shí)動(dòng)員胞內(nèi)鈣的佐劑活性和能力。
95.一種調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的免疫學(xué)特性的方法，其包括改變胞質(zhì)鈣濃度(至少是瞬時(shí)的)或者改變動(dòng)員胞內(nèi)鈣的能力。
96.根據(jù)權(quán)利要求95的方法，其中調(diào)節(jié)選自體內(nèi)、體外和離體調(diào)節(jié)。
97.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，其中調(diào)節(jié)是通過I型干擾素進(jìn)行的。
98.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，其中調(diào)節(jié)是通過抗原結(jié)合片段與抗原的特異性結(jié)合而進(jìn)行的，或是通過抑制配體與一種BDCA的結(jié)合而進(jìn)行的，其中所述抗原選自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4。
99.根據(jù)權(quán)利要求96的方法，其中調(diào)節(jié)是通過觸發(fā)BDCAs或抑制其觸發(fā)進(jìn)行的。
100.一種治療生理疾病的方法，包括給需要該治療的受試者施用有效量的由權(quán)利要求1-88中任意一項(xiàng)所得到的DC。
101.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中生理疾病是病毒感染。
102.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中病毒感染選自肝炎、HIV、流感、鼻病毒、皰疹病毒、慢病毒屬、CMV和麻疹。
103.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中生理疾病是自身免疫疾病。
104.根據(jù)權(quán)利要求103的方法，其中自身免疫疾病選自SLE、多發(fā)性硬化、關(guān)節(jié)炎、硬皮病和牛皮癬。
105.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中生理疾病是變態(tài)反應(yīng)。
106.根據(jù)權(quán)利要求105的方法，其中變態(tài)反應(yīng)選自變態(tài)反應(yīng)、蕁麻疹和過敏性休克。
107.根據(jù)權(quán)利要求106的方法，其中變態(tài)反應(yīng)是哮喘。
108.根據(jù)權(quán)利要求100的方法，其中生理疾病是癌癥。
109.根據(jù)權(quán)利要求108的方法，其中癌癥選自星形細(xì)胞瘤、纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、間膠質(zhì)瘤、室管膜細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、原始神經(jīng)外胚層瘤(PNET)、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、胰管腺癌、小和大的細(xì)胞肺腺癌、脊索癌、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、支氣管肺泡癌、上皮腺角化癌、及其肝轉(zhuǎn)移瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、基底細(xì)胞癌、汗腺癌、乳頭狀癌、皮脂腺癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、膽管癌、絨膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤、睪丸瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聲神經(jīng)瘤、間膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、白血病、多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥、以及重鏈病、乳腺癌(例如管和小葉腺癌)、子宮頸的鱗狀腺癌、子宮和卵巢上皮癌、前列腺腺角化癌、膀胱的過渡鱗狀細(xì)胞癌、B和T細(xì)胞淋巴癌(結(jié)的和擴(kuò)散的)漿細(xì)胞瘤、急性和慢性白血病、惡性黑瘤、軟組織肉瘤和平滑肌肉瘤。
110.一種調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞細(xì)胞因子生成的方法，包括以下步驟用抗原結(jié)合片段分離基本上純的樹突狀細(xì)胞群或亞群，其中所述抗原結(jié)合片段特異于選自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4的任一種或多種抗原；以及用調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞細(xì)胞因子生成的試劑處理細(xì)胞。
111.一種調(diào)節(jié)體內(nèi)樹突狀細(xì)胞細(xì)胞因子生成的方法，其包括給所需該調(diào)節(jié)的受試者施用有效量的調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞細(xì)胞因子生成的試劑。
112.一種產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答和/或體液免疫應(yīng)答的方法，其包括給需要產(chǎn)生應(yīng)答的受試者施用有效量的基本上純的載有抗原并用抗原結(jié)合片段分離的樹突狀細(xì)胞群或亞群，其中所述抗原結(jié)合片段特異于選自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任一種或多種抗原，其中細(xì)胞被調(diào)節(jié)，從而誘導(dǎo)選自Th-1、Th-2和Th-3/Th-R的應(yīng)答。
113.根據(jù)權(quán)利要求112的方法，其中抗原是通過轉(zhuǎn)染、裝入mRNA和細(xì)胞融合而荷載的。
114.一種產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答或體液免疫應(yīng)答的方法，包括給需要產(chǎn)生應(yīng)答的受試者施用有效量的基本上純的載有抗原并用抗原結(jié)合片段分離的樹突狀細(xì)胞群或亞群，其中所述抗原結(jié)合片段特異于選自BDCA-1、BDCA-2、BDCA-3和BDCA-4中的任一種或多種抗原，其中細(xì)胞被調(diào)節(jié)，從而誘導(dǎo)選自Th-1、Th-2和Th-3/Th-R的應(yīng)答。
115.通過在重組宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)并從總的重組宿主細(xì)胞成分中純化出所表達(dá)的多肽而制備的多肽，其中所述多肽包含大約5個(gè)來自SEQ IDNO2的連續(xù)氨基酸殘基。
116.一種包括純化多肽的組合物，其中所述多肽包括大約5個(gè)來自SEQ ID NO2的連續(xù)氨基酸殘基。
117.根據(jù)權(quán)利要求116的組合物，其中所述多肽包含BDCA-2胞外結(jié)構(gòu)域。
118.一種包含5-50個(gè)來自SEQ ID NO2的連續(xù)氨基酸殘基的純化多肽。
119.一種包含與不是SEQ ID NO2的多肽氨基酸序列相連的多肽氨基酸序列的融合蛋白質(zhì)，其中所述氨基酸序列包括大約5個(gè)來自SEQ IDNO2的氨基酸殘基。
120.權(quán)利要求119的重組多肽，其包含大約15個(gè)來自SEQ ID NO2的連續(xù)氨基酸殘基。
121.權(quán)利要求120的重組多肽，其包含大約30個(gè)來自SEQ ID NO2的連續(xù)氨基酸殘基。
122.權(quán)利要求120的重組多肽，其包含大約50個(gè)來自SEQ ID NO2的連續(xù)氨基酸殘基。
123.權(quán)利要求122的組合物，其中多肽包含大約15個(gè)來自SEQ IDNO2的連續(xù)氨基酸殘基。
124.權(quán)利要求123的組合物，其中多肽包含大約30個(gè)來自SEQ IDNO2的連續(xù)氨基酸殘基。
125.包含BDCA-2的至少一種剪接變體的多肽。
126.根據(jù)權(quán)利要求125的多肽，其中剪接變體包含外顯子1-6。
127.根據(jù)權(quán)利要求126的多肽，其中剪接變體包含外顯子1、3、4、5和6。
128.根據(jù)權(quán)利要求126的多肽，其中剪接變體包含外顯子1、2、4、5和6。
129.根據(jù)權(quán)利要求126的多肽，其中剪接變體包含外顯子1、2、3、5和6。
130.編碼BDCA-2或其片段的多核苷酸或其互補(bǔ)序列。
131.根據(jù)權(quán)利要求130的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO2的至少5個(gè)氨基酸殘基。
132.根據(jù)權(quán)利要求131的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO2的至少15個(gè)氨基酸殘基。
133.根據(jù)權(quán)利要求131的多核苷酸，其編碼SEQ ID NO2的至少30個(gè)氨基酸殘基。
134.根據(jù)權(quán)利要求130的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1的序列。
135.根據(jù)權(quán)利要求130的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸。
136.根據(jù)權(quán)利要求130的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1的至少75個(gè)連續(xù)核苷酸。
137.根據(jù)權(quán)利要求130的多核苷酸，其具有SEQ ID NO1的至少150個(gè)連續(xù)核苷酸。
138.編碼BDCA-2的至少一種剪接變體的多核苷酸。
139.根據(jù)權(quán)利要求138的多核苷酸，其中剪接變體包含外顯子1-6。
140.根據(jù)權(quán)利要求138的多核苷酸，其中剪接變體包含外顯子1、3、4、5和6。
141.根據(jù)權(quán)利要求138的多核苷酸，其中剪接變體包含外顯子1、2、4、5和6。
142.根據(jù)權(quán)利要求138的組合物，其中剪接變體包含外顯子1、2、3、5和6。
143.權(quán)利要求130-142中任意一項(xiàng)的多核苷酸，其功能性連接到啟動(dòng)子上。
144.權(quán)利要求130-142中任意一項(xiàng)的多核苷酸，其中啟動(dòng)子是重組啟動(dòng)子。
145.權(quán)利要求130-142中任意一項(xiàng)的多核苷酸，其中多核苷酸被包含在重組載體中。
146.包含權(quán)利要求130-142中任意一項(xiàng)的多核苷酸的重組宿主細(xì)胞。
147.權(quán)利要求130-142中任意一項(xiàng)的多核苷酸或其互補(bǔ)序列，其中在嚴(yán)緊的雜交條件下，編碼SEQ ID NO2或其片段的區(qū)域可與SEQ IDNO1或其互補(bǔ)序列雜交。
148.一種抑制BDCA與其特異性配體相互作用的方法，其包括使包含BDCA及其配體的組合物與有效量的抑制BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4與配體相互作用的試劑接觸。
149.根據(jù)權(quán)利要求148的方法，其中通過使包含DC和T細(xì)胞的組合物與有效量的抑制BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4與T細(xì)胞相互作用的試劑接觸而抑制DC和T細(xì)胞間的相互作用。
150.根據(jù)權(quán)利要求149的方法，其中試劑是特異于BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4的抗原結(jié)合片段。
151.根據(jù)權(quán)利要求150的方法，其中試劑為體內(nèi)或體外施用。
152.一種治療炎癥的方法，其包括給所需治療的受試者施用減輕受試者炎癥的有效量的試劑，其中所述試劑可抑制BDCA-2、BDCA-3或BDCA-4與T細(xì)胞的相互作用。
153.一種抑制細(xì)胞表達(dá)BDCA-2的方法，其包含在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)反義BDCA-2。
154.包含權(quán)利要求130-142中任意一項(xiàng)的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了特異于樹突狀細(xì)胞、并能夠有效地治療和/或診斷各種疾病的抗原結(jié)合片段。本發(fā)明也提供了其應(yīng)用方法，用于篩選其它的這類抗原結(jié)合片段，以及由此獲得的產(chǎn)物。
文檔編號(hào)A61P33/14GK1454215SQ00819809
公開日2003年11月5日 申請(qǐng)日期2000年11月15日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月15日
發(fā)明者J·施米茨, A·齊奧諾克, D·W·巴克 申請(qǐng)人:米勒騰尼生物技術(shù)有限公司