專利名稱：干燥粉末組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及采用疏水衍生的糖類制備的穩(wěn)定治療劑的生產，和治療組合物。
背景技術：
目前臨床應用中可利用多數(shù)治療蛋白質和肽。存在多種遞送方法和途徑，其中腸道外途徑最為廣泛應用。通過肺途徑遞送是一種有吸引力的可選擇途徑，其主要原因在于患者的可接受性。而且有證據表明較大的分子如蛋白質可以通過肺表面被容易地吸收到血流中。用于肺遞送的技術仍處在研發(fā)的早期，其結果是存在可觀的新的治療蛋白和肽的肺制劑的范圍。
一種制備治療蛋白質的方法是采用用于在存儲期間穩(wěn)定蛋白質并輔助遞送的糖類。這種穩(wěn)定糖類的一個實例為海藻糖。
最近，對在制備蛋白質過程中采用疏水衍生的糖類(HDCs)引起了興趣。WO-Aα-96/03978公開了包括HDC和治療劑，并被制成用于直接遞送的固體劑型的組合物。該組合物可以是用于肺遞送的粉末、顯微操作針或用于射擊、透皮遞送的微粒，或者植入組合物。
擁有由HDC制備的治療劑的好處在于存在用于研制控釋遞送系統(tǒng)的可能性。此外，HDC本身可能具有期望的有助于遞送，尤其是遞送到深肺的性質。
但是，治療蛋白質一般親水性，而且由于HDC分子的疏水性，因而將蛋白質混入HDC是有問題的。
因此，需要一種有效的方法，通過它可以將親水性活性劑混入HDCs。
發(fā)明概述本發(fā)明基于采用親水性離子對(HIP)可以將親水性活性劑有效地混入HDCs的認識。
根據本發(fā)明的第一方面，制備治療組合物的方法包括在有機溶劑中形成疏水衍生的糖類和親水性治療劑與離子物質的離子對配合物(ion-pair complex)的溶液；并干燥該溶液。
在一個實施方案中，該方法包括步驟(i)在含水介質中混合該治療劑與離子物質形成沉淀；(ii)將該沉淀和HDC溶于有機溶劑；和(iii)干燥所得的有機溶液。
在進一步的實施方案中，該方法包括步驟(i)在水溶液中混合該治療劑與離子物質形成離子對配合物；(ii)加入與水不可混溶的有機活性劑形成有機相，并使該離子對配合物進入有機相；(iii)分離該有機相；(iv)將HDC加到該有機相；和(v)干燥該有機溶液。
根據第二方面，組合物包括，固體劑型，疏水衍生的糖類，治療劑和藥用離子洗滌劑。
根據第三方面，本發(fā)明的組合物可以用于制備通過肺途徑給予患者以治療疾病的藥物。
該產品期望用于治療用途，且該活性活性劑在遞送時是治療學有效的。
將親水性活性劑有效地混入HDC賦予了欲制備的有用治療劑期望的控釋性質。
發(fā)明詳述本發(fā)明的方法基于疏水離子對是一種可用于用疏水糖類配制親水性活性劑的有用的方法的認識。
總之，該方法包括在活性物質如蛋白質上的正電荷和所選擇的陰離子表面活性劑上的負電荷之間產生疏水離子對?；蛘?，將蛋白質和表面活性劑上的電荷的極性反轉。
本發(fā)明的方法可以在本領域技術人員已知的條件下進行。已知可以采用低濃度的陰離子洗滌劑從溶液中沉淀出親水性蛋白質。似乎沉淀是來自蛋白質離子對的相反離子被洗滌劑取代的結果。然后可以將沉淀通過例如離心分離，隨后將其溶于含有HDC的有機溶劑。然后該親水性活性劑與HDC處在溶液中，并可以將其干燥形成固體?；钚晕镔|的總回收率是很高的，因此本發(fā)明的方法提供了一種可發(fā)展的商業(yè)規(guī)模方法。
或者，采用相分離而不經沉淀而制備離子對。將含水相中的蛋白質與適宜的洗滌劑混合形成離子對。加入適宜的有機溶劑形成有機相，并將該離子對配合物引入到該有機相中。然后分離該有機相并與任選地被包括在進一步的有機溶劑中的HDC混合。
親水性活性劑(agent)可以用于本發(fā)明的親水性活性劑包括任何治療學活性蛋白質、肽、多核苷酸或離子藥物。特別地這種活性劑可以是酶或激素。實例包括但不限于胰島素、干擾素、生長因子、α-胰凝乳蛋白酶白介素、降鈣素、生長激素、亮丙瑞林(leuprolide)、集落刺激因子和DNase。胰島素是優(yōu)選的實施方案，并且是用于肺遞送的理想治療劑。
離子物質任何適宜的離子物質可以用于本發(fā)明。優(yōu)選的物質為洗滌劑。在將蛋白或肽引入HDCs中時，該物質優(yōu)選為陰離子的。當多核苷酸或帶負電的蛋白質為活性劑時，該物質應優(yōu)選為陽離子的。適宜的離子物質包括鹽如硫酸鹽、磺酸鹽、磷酸鹽或羧酸鹽。
適宜的陰離子洗滌劑的實例包括十二烷基硫酸鈉(SDS)、多庫脂鈉(AOT)、磷脂酰肌醇(PPI)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷脂酸鈉鹽(DPPA.Na)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸甘油鈉鹽(DPPG.Na)和油酸鈉。適宜的陰離子洗滌劑的實例包括苯甲烴銨氯化物(BAC)、六癸基三甲基銨溴化物(CTAB)和十二烷基三甲基銨溴化物(DoTAB)。
優(yōu)選該洗滌劑應該是藥學上可接受的。特別地，該洗滌劑應該適于肺遞送。
有機溶劑任何適宜的有機溶劑可用于本發(fā)明?？梢愿鶕钚詣┦褂脴O性或非極性溶劑。一般而言，該溶劑是藥學上可接受的溶劑。適宜的溶劑包括但不限于乙醇、丙醇、異丙醇、1-辛醇、丙酮、醚、乙酸乙酯、甲酸乙酯、二氯甲烷(DCM)、己烷和甲醇。
疏水衍生的糖類(HDCs)該HDC可以是任何現(xiàn)有技術中已知的HDC。優(yōu)選該HDC在干燥時形成高Tg的無定形玻璃態(tài)。
優(yōu)選該HDC能形成Tg大于20℃，選大于30℃，最優(yōu)選大于40℃的玻璃。
本文所用的″HDC″指各種的疏水衍生的糖類，其中至少一種羥基被包括但不限于酯和醚的疏水部分取代。
在WO-A-96/03978 and WO-A-99/01463中描述了多種適宜的HDCs的實例。HDC的具體的實例包括但不限于山梨醇六乙酸酯(SHAC)、α-葡萄糖五乙酸酯(α-GPAC)、β-葡萄糖五乙酸酯(β-GPAC)、1-O-辛基-β-D-葡萄糖四乙酸酯(OGTA)、海藻糖八乙酸酯(TOAC)、海藻糖八丙酸酯(TOPR)、β-4’，6’-二異丁酰六乙酰乳糖、蔗糖八乙酸酯(SOAC)、纖維二糖八乙酸酯(COAC)、棉子糖十一乙酸酯(RUDA)、蔗糖八丙酸酯、纖維二糖八丙酸酯、棉子糖十一丙酸酯、四-O-甲基海藻糖、二-O-甲基-六-O-乙酰蔗糖和海藻糖6，6-二異丁酸六乙酸酯。
已發(fā)現(xiàn)純的單一HDC玻璃在室溫和多達至少60％的濕度下是穩(wěn)定的。但是，混有某種活性物質的HDC玻璃混合物意外地在室溫和多達至少95％的濕度下是穩(wěn)定的。不同的HDCs的混合物可能是期望的，以獲得不同的控釋曲線。
許多因素影響提取至有機溶液中的蛋白質，即緩沖劑PH和離子強度、蛋白質分子量、洗滌劑蛋白質比率、PI和電荷分布，以及表面活性劑性質和溶劑性質。可以要求這些參數(shù)變化至使該方法步驟的效率最大。這對于領域技術人員來說是顯而易見的。
還可以改變這些參數(shù)以獲得所得產品的不同控釋性質。例如HIP配合物HDC比率或溶劑混合變化可能影響釋放性質。這些參數(shù)的變化對本領域技術人員來說也是顯而易見的。
可以采用任何適宜的方法干燥這些制劑，這些方法包括但不限于冷凍干燥、烘干、超臨界流體處理，和優(yōu)選的噴霧干燥。優(yōu)選噴霧干燥，因為它使溶劑的蒸發(fā)迅速，留下具有低殘留溶劑水平的玻璃狀無定形產品。該玻璃狀無定形產品應該優(yōu)選在室溫或室溫以上是穩(wěn)定的，以容易地存儲這些組合物而不損失活性。
該干燥的產品優(yōu)選為在室溫或室溫以上存儲穩(wěn)定的固體形式。其穩(wěn)定性可能歸因于在干燥時形成玻璃狀無定形結構的糖類。在一個實施方案中，該產品的玻璃轉化溫度(Tg)大于20℃，優(yōu)選大于30℃。該產品可以是適于直接遞送給患者的固體形式。優(yōu)選地，該產品是直徑小于30μm，優(yōu)選小于10μm，最優(yōu)選小于5μm的干燥粉末或″微球體″。這些粉末適于肺遞送。該產品還可以是用于射擊或透皮遞送的顯微操作針。
以下的實施例例舉本發(fā)明。
實施例1α-胰凝乳蛋白酶(CMT)α-胰凝乳蛋白酶(CMT)是一種PI為8.5而凈正電荷在PH5和6之間的非膜結合蛋白。已在PH5的10mM乙酸鈉/CaCl2緩沖劑中混合CMT與40當量的多庫脂鈉時實現(xiàn)將CMT有效地分配至有機溶劑。還注意到離子強度在提取的效率中起到了非常重要的作用，它主要通過控制乳劑的形成。通過改變氯化鈣的濃度而控制離子強度，并且呈現(xiàn)出一般性的趨勢，這種趨勢表明離子強度降低導致溶劑中蛋白質的百分回收率降低。有機溶劑的選擇是重要的，如采用CD測定發(fā)現(xiàn)CMT在非極性溶劑如異辛烷、declain和四氯化碳中為天然狀的，但在更大極性的溶劑如二氯甲烷中具有少量或沒有有機結構。
將在10mM的乙酸鈉中的濃度為2mg/ml的CMT、pH7.0的5mM氯化鈣、與50摩爾當量的在己烷中的濃度為1.778mg/ml的AOT混合。離心后，分離有機層，真空干燥并用BCA試驗測定蛋白質濃度。計算表明80-90％的酶被提取到該溶劑中。
然后采用在有機溶劑中出現(xiàn)的TOAC重復該實驗。將TOAC(60mg/ml，在丙酮中)加到CMT(2mg/ml，在己烷中)的HIP試樣中，產生最終的在丙酮和己烷(1∶1)中的30mg/ml TOAC和1mg/ml CMT的組合物。TOAC的用量為酶用量的5-10倍。將所得溶液噴霧干燥形成干燥粉末組合物。
實施例2胰島素(i)將在pH為2的10mM乙酸鈉緩沖劑中的胰島素(5mg/ml)與在水中的4.5摩爾當量的AOT(10mg/ml)混合，導致該蛋白質的有效沉淀。離心分離該蛋白質并將所得的團丸再次溶于含有25mg/mlTOAC或TIBAC的丙酮和IPA(1∶2)的混合物中。BCA分析該干燥的混合物表明99％的蛋白質被回收到該溶劑中。噴霧干燥該溶液得到產率至多為43％，而采用DSC的噴霧干燥材料的早期分析表明玻璃的存在。
(ii)將胰島素與在PH為11的10mM碳酸鈉中的7.5摩爾當量苯甲烴銨氯化物進行疏水性離子配對，并將其再次溶于含有25mg/mlTOAC的丙酮和IPA(1∶2)。BCA分析該制劑表明92％的蛋白質被提取至溶劑。噴霧干燥該制劑得到18％的回收率。
(iii)還用2％FITC-標記的胰島素摻加胰島素，采用AOT將其提取至含有TOAC的IPA和丙酮(比率2∶1)，并噴霧干燥。在該溶劑中回收的蛋白質的百分率為96％，并噴霧，干燥得到35％回收率的物質。
實施例3α-L-磷脂酰肌醇(PPI)最初進行實驗以研究得到進入有機溶劑的高回收率胰島素所需的最佳PPI數(shù)量。對于2mg的胰島素試樣，PPI的數(shù)量從5變化于7.5摩爾當量。將胰島素溶于10mM乙酸鈉緩沖劑，pH2.5(2mg/ml)，并在水中制備5mg/ml PPI的溶液。在將PPI加到各胰島素試樣時產生沉淀，在2500rpm下離心2分鐘收集該沉淀。將該團丸再次懸浮在各種不的溶劑中，即丙酮、二氯甲烷、乙醇及其混合物。當采用二氯甲烷和乙醇(比率1∶1)時，在有機溶劑中得到90％的回收率。沉淀容易地溶解得到2mg/ml溶液。
實施例4有DPPA、DPPG的胰島素測試兩種卵磷脂衍生物作為胰島素HIP的可能表面活性劑。整個過程采用標準緩沖條件(10mM乙酸鈉緩沖劑，pH2.5)。最優(yōu)化采用DPPA.Na HIP胰島素所需的條件包括將表面活性劑的摩爾當量由5改變至20。將沉淀溶于乙醇∶DCM(1∶1)，并且當使用9摩爾當量時，得到的回收率為71％。
待測試的第二卵磷脂衍生物為DPPG.Na。再次通過改變加入的相對于胰島素的DPPG的數(shù)量而將反應條件最優(yōu)化。研究數(shù)量的范圍為5-12摩爾當量。在采用BCA試驗分析以后，當用量為8摩爾當量時，在有機溶劑中回收大約88％的蛋白質。
實施例5亮丙瑞林嘗試擴大HIP的應用，研究額外試驗分子。LHRH類似物亮丙瑞林乙酸酯具有兩個可能的HIP部位。最初的實驗比較在pH2.5的10mM乙酸鈉緩沖劑和pH5的100mM檸檬酸鈉緩沖劑中的反應。PPI用作表面活性劑，加入2摩爾當量產生澄清、粘性團丸，形成在乙酸鹽緩沖劑中進行的試樣。BCA分析懸浮在乙醇∶DCM(1∶1)中的團丸表明已在乙酸鹽回收到66％的肽而在PH為5時僅回收到3％。建立采用leuprolide的BCA試驗的標準曲線并重復反應。得到63-66％的回收率。
還嘗試采用DPPG.Na進行反應。將緩沖劑保持為10mM乙酸鈉，pH 2.5。由于DPPG.Na在水中相對于PPI的不溶性，測試一定范圍的摩爾當量。DPPG.Na的用量范圍為肽用量的1-5倍。結果表明DPPG.Na用量的增加導致肽的百分回收率增加。當用量為5摩爾當量時得到最高的回收率(65％)。
實施例6胰蛋白酶還研究了胰蛋白酶作為酶的一個實例。其目的在于證明在HIP之后可以保持活性。將在PH2.5的10mM乙酸鈉緩沖劑中的2mg/ml胰蛋白酶與變化的摩爾當量的DPPG(from 40x to 100x)混合并收集沉淀。再次懸浮在乙醇∶DCM(1∶1)中，然后用BCA試驗分析表明回收率范圍為72％-83％。與90和100當量的DPPG形成的沉淀不太溶于溶劑，這可能是由于存在的卵磷脂的數(shù)量。嘗試用60摩爾當量的DPPG進一步優(yōu)化。
將乙酸鹽緩沖劑的PH從2.5改變到7.3來進一步研究反應。在PH 2.5進獲得最好的回收率。吸收到有機溶劑的酶的數(shù)量為74％。最后，最初的酶的濃度從標準的2mg/ml增加到5和10mg/ml。BCA分析再次溶解的團丸表明當最初的酶濃度為5mg/ml時，大約86％已被回收。
權利要求
1.一種制備治療組合物的方法，包括在有機溶劑中形成疏水衍生的糖類(HDC)和親水性治療劑與離子物質的離子對配合物的溶液；并干燥該溶液。
2.根據權利要求1的方法，包括步驟(i)在水溶液中混合該治療劑與離子物質形成離子對配合物；(ii)加入與水不可混溶的有機活性劑形成有機相，并使該離子對配合物進入該有機相；(iii)分離該有機相；(iv)將該HDC加到該有機相；和(v)干燥該有機溶液。
3.根據權利要求1的方法，包括步驟(i)在含水介質中混合該治療劑與離子物質形成沉淀；(ii)將該沉淀和HDC溶于有機溶劑；和(iii)干燥該溶液。
4.根據權利要求1-3的方法，其中在步驟(ii)之前分離該沉淀。
5.根據前述權利要求的任一方法，其中該治療劑為蛋白質、肽或多核苷酸。
6.根據前述權利要求的任一方法，其中該活性劑為酶或激素。
7.根據前述權利要求的任一方法，其中該活性劑為胰島素。
8.根據前述權利要求的任一方法，其中該HDC具有糖類骨架和至少一個被它的較少親水性的衍生物取代的羥基。
9.根據前述權利要求的任一方法，其中該HDC選自山梨醇六乙酸酯、α-葡萄糖五乙酸酯、β-葡萄糖五乙酸酯，1-O-辛基-β-D-葡萄糖四乙酸酯、海藻糖八乙酸酯、海藻糖八丙酸酯、蔗糖八乙酸酯、β-4’，6’-二異丁酰六乙酰乳糖、蔗糖八丙酸酯、纖維二糖八乙酸酯、棉子糖十一乙酸酯、棉子糖十一丙酸酯和海藻糖6，6-二異丁酸六乙酸酯。
10.根據前述權利要求的任一方法，其中干燥是通過噴霧干燥進行的。
11.根據前述權利要求的任一方法，其中該離子物質為洗滌劑。
12.一種組合物，包括，在固體劑型中，疏水衍生的糖類、治療劑和藥學上可接受的離子洗滌劑。
13.可以通過權利要求1-11的任一方法獲得的權利要求12的組合物。
14.權利要求12或13的組合物，其中該組合物為Tg大于20℃的玻璃態(tài)、無定形形式。
15.根據權利要求12-14的組合物，其中該固體劑型為尺寸小于10μm，優(yōu)選為1-5μm的顆粒。
16.根據權利要求12-14之任一組合物，其中該固體劑型為適于射擊遞送的顯微操作針。
17.根據權利要求12-16之任一組合物，用于治療用途。
18.一種用于肺遞送治療劑的裝置，其中該裝置包括根據權利要求15的組合物。
全文摘要
一種以穩(wěn)定存儲形式制備的,適于給予患者的親水性治療劑。該活性劑用疏水衍生的糖類配制,利用離子對形成以形成該活性劑和糖類的溶液。
文檔編號A61P43/00GK1360496SQ0081024
公開日2002年7月24日 申請日期2000年7月11日 優(yōu)先權日1999年7月12日
發(fā)明者P·杰克遜 申請人:四分保健(Uk)有限公司