專利名稱：九州蟲草菌的人工培養(yǎng)方法及其子實體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物真菌的人工培養(yǎng)方法，特別是在我國首次發(fā)現(xiàn)的中國新紀(jì)錄種——九州蟲草菌(Cordyceps KyushuensisY.Kobayasi)的人工培養(yǎng)方法及其子實體的應(yīng)用。
蟲草菌為常用與常見真菌，野生蟲草具有多種藥用作用，滋補作用，已成為傳統(tǒng)的珍貴中藥材，倍受消費者的青睞。但由于其野生資源極為短缺，且生長環(huán)境特殊，野生量有限，再加上過度采挖，已遠不能滿足需求。為此，許多科學(xué)工作者都在致力于蟲草的人工培養(yǎng)，試圖解決現(xiàn)有野生蟲草資源短缺的問題。據(jù)有關(guān)文獻報道的一些蟲草屬真菌的人工培養(yǎng)方法主要有《冬蟲夏草菌絲的工業(yè)生產(chǎn)方法》(專利號85107991)與《蟲草菌種814選育及其發(fā)酵工藝》(專利號85102231)，都是用其分離的純菌種進行深層培養(yǎng)，以發(fā)酵工藝而獲得菌絲體，到目前為止，它只完成了無性世代，尚不能人工培養(yǎng)?！缎Q蛹蟲草的人工培育方法》(專利號87106987)是利用蛹蟲草的輪枝菌接種到固體培養(yǎng)基上，待菌絲長到一定程度再放入蠶蛹，讓其自然感染而長出子實體。其培養(yǎng)時間長，且入藥時將子實體與蛹體一起用，因蛹體大，子實體僅占其五分之一左右，蛹體內(nèi)的有效成分大部分已轉(zhuǎn)化到子實體上，故實際應(yīng)用效果受到影響。《人工培養(yǎng)巴西蟲草的方法》(90109380.7)是利用巴西蟲草菌接種于家蠶上，而獲得蟲、菌結(jié)合體。其應(yīng)用仍不是純子實體。據(jù)《天津藥學(xué)》98年第10卷第1期報道“蟲草明顯增加小鼠的脾臟重量，發(fā)現(xiàn)引起脾重增加的成分在子座，蟲體無效。”可見蟲草入藥起藥效作用的主要在子實體，不是蟲體?！吨腥A被毛孢及其完成有性階段冬蟲夏草的技術(shù)》(88103453)中的中華被毛孢為冬蟲夏草的無性型，其菌種要經(jīng)過幾個月的培養(yǎng)才能產(chǎn)生孢子，再用無性孢子浸染寄主斜脈蝠蛾幼蟲，經(jīng)10度左右低溫處理后，在18℃左右保溫培養(yǎng)，經(jīng)兩個月長出子座，整個培養(yǎng)周期較長。由于其孢子中的敗育現(xiàn)象存在，因而萌發(fā)率低，接種后寄生率也低，子實體難以形成，因此影響其推廣應(yīng)用。
本發(fā)明人曾在《北冬蟲夏草菌人工栽培子實體的方法》(93105056.1)、《蛹蟲草優(yōu)良菌種的選育及高產(chǎn)栽培方法》(94110061.8)、《蛹蟲草高產(chǎn)栽培方法》(97105853.0)等專利文獻中公開了蛹蟲草(又名北蟲草)人工栽培的方法。該方法利用以大米為主要成份的固體培養(yǎng)基，成功地培養(yǎng)蛹蟲草，但其基質(zhì)單一，脫離了原生物體的營養(yǎng)狀況，不能完全滿足子實體生長的需要，菌種退化，會出現(xiàn)藥理活性減退的問題，有效營養(yǎng)成分含量低。因此，上述人工培養(yǎng)方法有時不能保證菌種穩(wěn)定，給進行連續(xù)培養(yǎng)蟲草菌子實體的工作增加了難度。另外在《菌物系統(tǒng)》2000年第19卷第2期296頁公開了“中國新紀(jì)錄種-九州蟲草”，它是在沈陽東部山區(qū)采集的寄生于豆天蛾(Clanis Bilineata Walker)幼蟲體上一種蟲草菌，鑒定為九州蟲草(Cordyceps Kyushuensis Y.Kobayasi)。其外觀和形態(tài)特征簡述如下子實體生于從豆天蛾幼蟲上形成的菌索(菌絲束)上，菌索白色。子座橙紅色，高1.7-8.6cm，直徑0.2-0.6cm，子囊殼半內(nèi)生，卵形，367-495×260-316μm。子囊圓柱形，直徑3.5-4.8μm。次生子囊孢子短柱形，3.9-5.4×1.0-1.2μm。但目前國內(nèi)外公開文獻上尚無九州蟲草人工培養(yǎng)方法的報道。
本發(fā)明的目的就在于提供一種中國新紀(jì)錄種-九州蟲草菌的人工培養(yǎng)方法及其子實體的應(yīng)用，該方法有效克服了現(xiàn)有培養(yǎng)蟲草技術(shù)中存在的不能進行全人工培養(yǎng)、培養(yǎng)時間長、菌種退化現(xiàn)象嚴(yán)重等問題，具有菌種穩(wěn)定，生產(chǎn)周期短，可以連續(xù)、批量生產(chǎn)、有效營養(yǎng)成分含量高的優(yōu)點，采用純子實體入藥，其用量少，制劑藥用效果顯著。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的該方法是先將九州蟲草(CordycepsKyushuensis Y.Kobayasi)野生菌進行單孢子或單菌落純化，純化后的菌株制成液體菌種回接到以表面消毒的飼養(yǎng)的活體豆天蛾幼蟲為主要成分的培養(yǎng)基上，在適宜培養(yǎng)條件下自然感染，繼續(xù)培養(yǎng)直至長出九州蟲草子實體。
由于本發(fā)明的人工培養(yǎng)方法所采用的培養(yǎng)基是以無菌條件下人工飼養(yǎng)的活體豆天蛾幼蟲為主要成分，該幼蟲體大，營養(yǎng)豐富，且體內(nèi)不存在野生活體幼蟲體內(nèi)的雜菌，所以在對野生菌進行純化育種時，不僅可以確保選出與野生九州蟲草相同的純菌種，而且在接種繼續(xù)培養(yǎng)過程中能長出與天然九州蟲草子實體相同的人工培養(yǎng)九州蟲草子實體。該方法與其它蟲草人工培養(yǎng)方法相比，生產(chǎn)周期短、菌種穩(wěn)定，顯著提高九州蟲草菌的感染率，其培養(yǎng)成活率及長出子實體率均達到100％以上，轉(zhuǎn)化率最高達168.3％，也為連續(xù)批量生產(chǎn)、高產(chǎn)打下良好基礎(chǔ)。還可有效防止藥理活性減退，經(jīng)中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所和遼寧省中藥新藥研制開發(fā)中心測試，其結(jié)果表明人工培養(yǎng)長出的子座經(jīng)切片和顯微鏡觀察，其外部形態(tài)和內(nèi)部特征均與天然九州蟲草的特征相近，詳見表1表 1<
人工培養(yǎng)長出的蛹蟲草子實體與人工培養(yǎng)長出的九州蟲草子實體的營養(yǎng)成分差別較大詳見下表表 2
由此可見，人工培養(yǎng)九州蟲草子實體的有效營養(yǎng)成分含量高。采用純子實體入藥和用于保健品，不僅增強天然九州蟲草的補肺、益腎、止血化痰藥用和保健作用，有效治療肺、腎兩虛引起的疾病，而且還具有對荷瘤動物的扶正(促進調(diào)節(jié)免疫功能)、祛邪(抑制腫瘤生長提高生命延長率)、減毒(減輕化療副損傷促進造血機能等藥理作用。能明顯抑制癌細(xì)胞生長，恢復(fù)疲勞，進一步提高人體免疫功能。因人工培養(yǎng)的九州蟲草子實體的有效營養(yǎng)成分含量高，故用量少，可在確保療效的情況下，降低制藥成本。正因為如此，該人工培養(yǎng)九州蟲草已被列入科技部的重點科技攻關(guān)項目和進行國家一類新藥的研究，其子實體可制成九州蟲草膠囊劑和九州蟲草片劑，也可以作為藥膳和保健品、口服液、飲料和補酒等原料。
以上結(jié)合附圖和實施方法詳細(xì)說明本發(fā)明。


圖1是野生的九州蟲草形態(tài)特征圖。
圖2是用豆天蛾幼蟲培養(yǎng)基人工培養(yǎng)的九州蟲草形態(tài)特征圖。
圖3是用混配培養(yǎng)基人工培養(yǎng)的九州蟲草形態(tài)特征圖。
根據(jù)圖1-2所示，人工培養(yǎng)九州蟲草與野生九州蟲草的形態(tài)特征相近，詳見圖1-2。本發(fā)明的培養(yǎng)方法與其它蟲草菌人工培養(yǎng)方法不同，其主要特點是先將采集到的野生九州蟲草菌進行組織或孢子分離，再進行單菌落成單孢子純化，培養(yǎng)菌絲后在顯微鏡下觀察，將符合九州蟲草菌特征的純化菌株制成液體菌種，回接到以表面消毒的無菌條件下飼養(yǎng)的活體豆天蛾幼蟲的培養(yǎng)基上或以上述豆天蛾幼蟲凍干粉再混配谷米制成的混配培養(yǎng)基上，自然感染待菌絲充滿培養(yǎng)基，在適宜培養(yǎng)條件下即可長出與野生九州蟲草相同的子實體。
上述方法中，在無菌條件下飼養(yǎng)的豆天蛾幼蟲宜選用3令-5令(生長期七天左右為一令)活體幼蟲接入液體菌種。在1百重量份混配培養(yǎng)基中，各組分的重量比分別是無菌條件下飼養(yǎng)的活體豆天蛾幼蟲凍干粉3-5份，含有薏米、碎玉米、大米等谷米97-95份，營養(yǎng)水為上述原料總重量的1.4倍。所用的營養(yǎng)水是按以下方法配制的在1千重量份的營養(yǎng)水中含有九州蟲草子實體純粉1-1.5份，KH2PO42-2.5份，K2HPO41-1.5份MgSO41-1.5份，余量為水。所用的液體菌種是將純化后的菌株接種到液體培養(yǎng)基中得到的，其液體培養(yǎng)基中每百重量份含有豆天蛾幼蟲凍干粉3-5份，馬鈴薯10-15份，糖1-2份，維生素B10.001-0.002份，余量為水。
通過對人工九州蟲草子實體進行的系統(tǒng)研究結(jié)果如下藥效研究表明人工九州蟲草子實體以300mg/kg、600mg/kg的劑量灌胃給藥10天，可使S180實體瘤荷瘤小鼠的脾指數(shù)、碳素廓清指數(shù)與吞噬指數(shù)、血清溶血素與脾細(xì)胞介導(dǎo)的SRBC溶血素、M吞噬指數(shù)等免疫指標(biāo)明顯增高，與荷瘤對照比較P＜0.05或0.01。
人工九州蟲草子實體以300mg/kg、600mg/kg的劑量灌胃給藥10天，可使S180實體瘤荷瘤小鼠的TNF-β和IL-2有明顯的促進作用，并明顯優(yōu)于以香菇多糖為復(fù)方的中藥對照藥強力康(P＜0.01)。
人工九州蟲草子實體以300mg/kg、600mg/kg的劑量灌胃給藥10天，可使S180實體瘤荷瘤小鼠腫瘤生長抑制率分別為20.83％和30.72％；對S180腹水型BALB/C小鼠的生命延長率分別為193％和185％；與環(huán)磷酰胺作用相似180％。
人工九州蟲草子實體以300mg/kg、600mg/kg的劑量灌胃給藥10天，對環(huán)磷酰胺所致小鼠周圍血白細(xì)胞的降低有一定的保護作用，與對照組相比較P＜0.05。
此外，人工九州蟲草子實體可使正常小鼠免疫器官的胸腺及脾臟重量明顯增加；并可使氫考所致免疫功能低下小鼠的胸腺重量、T淋巴細(xì)胞酯酶染色率、雞紅細(xì)胞吞噬指數(shù)明顯增加；還可使正常小鼠耐缺氧時間及低溫水浴游泳時間明顯延長。
初步臨床研究結(jié)果以每日1.2g的口服劑量連續(xù)給藥28天，并于第二周開始化療一個療程。結(jié)果顯示30例中晚期癌腫患者的消化道副反應(yīng)數(shù)、白細(xì)胞下降數(shù)、NK細(xì)胞活性升高例數(shù)均明顯優(yōu)于對照高聚金葡萄菌素。
表 3 30例患者腫瘤分布情況(見表3)
藥理研究表明人工九州蟲草子實體不但可以抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，延長荷瘤動物存活期，還對荷瘤動物具有明確的免疫調(diào)節(jié)作用，特別是對荷瘤動物的TNF-β與IL-2的調(diào)節(jié)作用上明顯優(yōu)于目前臨床廣泛使用的植物多糖類免疫調(diào)節(jié)劑，證明該藥具有抑制腫瘤生長和促進免疫調(diào)節(jié)機能的雙重藥理作用。
化學(xué)研究表明人工九州蟲草子實體含有較多的核苷類化合物、其含量明顯高于同類蟲草屬真菌及人工制品，其主要活性成分蟲草素具有明顯的抑制腫瘤生長并與環(huán)磷酰胺有明顯的協(xié)同作用，其含量為蛹蟲草菌粉的10倍以上。人工九州蟲草子實體與臨床常用的扶正祛邪類復(fù)方制劑及其它人工蟲草屬制品相比具有劑量小(1.35g/日)、藥材及制劑的可控性強，易為國際市場所接受等特點。
初步毒理研究表明人工九州蟲草子實體毒性小，用藥安全。
急性毒性試驗表明人工九州蟲草子實體對小鼠灌胃給藥的最大耐受量為10g/Kg，相當(dāng)于成人一日用量的444倍。
長期毒性試驗表明連續(xù)16周給大鼠灌胃給予人工九州蟲草子實體1.2g/Kg.d及0.6g/Kg.d(相當(dāng)于臨床用量的53.3倍和26.7倍)，對大鼠一般體征、行動行為、生長發(fā)育、血象檢查、肝、腎功能等生化檢查及病理檢查均未發(fā)現(xiàn)異常改變，提示本品長期用藥安全。
綜上所述，人工九州蟲草子實體及其制劑具有資源豐富，藥理作用明確，主要活性物質(zhì)基本清楚，毒性符合我國現(xiàn)行新藥審批要求，藥材與制劑可控性強等特點，是一個非常有前途的扶正祛邪腫瘤輔助治療藥。它的開發(fā)成功不但可使我國在蟲草屬真菌開發(fā)領(lǐng)域中繼續(xù)占據(jù)領(lǐng)先地位，還可創(chuàng)造相當(dāng)?shù)纳鐣б媾c經(jīng)濟效益。
本發(fā)明的具體實施方法及應(yīng)用如下實施方法1將采集的野生九州蟲草子實體進行表面消毒，剝?nèi)ネ鈱?，露出髓部，用消毒刀片?.2-0.3cm組織塊放在滅菌的培養(yǎng)基平皿上，經(jīng)過7天適溫培養(yǎng)，挑取健壯菌絲放于試管斜面上，再適溫培養(yǎng)7-10天，根據(jù)菌絲生長情況進行粗選，再接于平皿上，在接種點周圍插片，讓其生長，5天左右，取出蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)，符合該菌株的菌絲特征的留下制成液體菌種，再回接到豆天蛾幼蟲體上，能夠長出與野生九州蟲草子實體相同的即為入選的純菌種。該液體菌種是將純化后的菌株10毫克接入100毫升液體培養(yǎng)基中，每百分份液體培養(yǎng)基中含有豆天蛾幼蟲凍干粉3-5份，馬鈴薯10-15份，糖1-2份，維生素B10.001-0.002，余量為水。
實施方法2將入選的純菌種1毫升接種到經(jīng)表面消毒的3令豆天蛾幼蟲體上，讓其自然感染30天左右，待菌絲充滿其體內(nèi)，覆蓋經(jīng)滅菌的生境土壤2厘米，20天左右，便從幼蟲體上長出橙紅至橙黃色九州蟲草子實體。
實施方法3將入選的純菌種1.5毫升接種到經(jīng)表面消毒的4令豆天蛾幼蟲體上，讓其自然感染35天左右，待菌絲充滿其體內(nèi)，覆蓋經(jīng)滅菌的生境土壤2.5厘米，20天左右，便從幼蟲體上長出橙紅至橙黃色九州蟲草子實體。
實施方法4將入選菌種2毫升接種到經(jīng)表面消毒的5令豆天蛾幼蟲體上，讓其自然感染40天左右，待菌絲充滿其體內(nèi)，覆蓋經(jīng)滅菌的生境土壤3厘米，20天左右，便于幼蟲體上長出其子實體。
實施方法5用豆天蛾幼蟲凍干粉3公斤，薏米10公斤，碎玉米12公斤，大米75公斤，混合均勻，裝入罐頭瓶(或塑料瓶、袋中)每瓶裝30克，加入營養(yǎng)水42毫升，制成混配培養(yǎng)基，滅菌后接入液體菌種2毫升，適溫培養(yǎng)20天左右，待菌絲基本布滿培養(yǎng)基表面并向下延伸，給予散射光照(2500LUX左右)，進行通風(fēng)(瓶口薄膜扎眼通氣)，門、窗錯開每天3-4次，每次20-30分鐘，室內(nèi)濕度為85-90％，25-30天即可采收子實體。
實施方法6用豆天蛾幼蟲凍干粉4公斤，薏米9公斤，碎玉米11公斤，大米76公斤，混合均勻裝入瓶(或袋)中，每瓶裝量40克，加營養(yǎng)水56毫升，滅菌后接入菌種3毫升，適溫避光培養(yǎng)23天左右，待菌絲布滿培養(yǎng)基表面并向下延伸給予散射光照，以下同實施方法5。
實施方法7用豆天蛾幼蟲粉5公斤，薏米8公斤，碎玉米10公斤，大米77公斤，混合均勻，裝入瓶(或袋)中，每瓶裝量50克，加營養(yǎng)水70毫升，滅菌后接入菌種4毫升，適溫培養(yǎng)25天左右，待菌絲布滿料面并向下延伸，給予散射光照，以下同實施方法5。
實施方法8將九州蟲草子實體在60℃以下干燥粉碎，過六號篩制成純粉，加80％左右的乙醇制粒，60℃干燥，整粒，裝膠囊，用鈷60照射殺菌后包裝即得九州蟲草膠囊，其主要成分見表4。
實施方法9將九州蟲草子實體純粉300克。甘露醇粉256.85克，硬脂酸鎂2克，在混合機中混合均勻，并將薄荷醇0.15克溶于乙醇中作粘合劑與混合藥粉制成適宜的軟材，并在制粒機中制成適宜的顆粒，在50℃下干燥，6小時后，整粒，用壓片機壓制成標(biāo)示量為560mg的枕形片，檢驗合格后，用鋁型包裝機進行氣泡眼包裝，再進行鈷60照射殺菌，包裝即得九州蟲草片。
其主要成分見表5九州蟲草膠囊經(jīng)30例中晚期癌癥患者使用，設(shè)治療組，用九州蟲草膠囊每日1.2克，分三次服用，對照組給予高聚金萄素注射液4毫克隔日一次肌注，時間為一個月治療白細(xì)胞下降數(shù)為40％，明顯低于對照組84％，P＜0.005；NK細(xì)胞活性升高，治療組為83％，明顯高于對照組53％，P＜0.025。對消化道副反應(yīng)，治療組明顯低于對照組分別為33.3％和78.9％，P＜0.005。
九州蟲草片經(jīng)中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所檢驗，認(rèn)為具有調(diào)節(jié)免疫，抗疲勞和調(diào)節(jié)血脂的作用，臨床用于免疫功能低下，血脂增高，從事腦力體力勞動及運動后需恢復(fù)體力的人群。含服或吞服，每天4-6片。
表 4 九州蟲草片的主要有效成分
表 5 九州蟲膠囊的主要有效成分
權(quán)利要求
1.一種九州蟲草菌的人工培養(yǎng)方法，其特征在于先將九州蟲草菌(Cordyceps Kyushuensis Y.Kobayasi)野生菌進行單孢子或單菌落純化，純化后的菌株制成液體菌種回接到以表面消毒的無菌條件下飼養(yǎng)的活體豆天蛾幼蟲為主要成分的培養(yǎng)基上，在適宜培養(yǎng)條件下自然感染，繼續(xù)培養(yǎng)直至長出九州蟲草子實體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所使用的培養(yǎng)基活體豆天蛾幼蟲為無菌條件下飼養(yǎng)的3令-5令幼蟲，將其表面消毒接入液體菌種，在20-24℃的條件下自然感染30-40天，待菌絲充滿其體內(nèi)，覆蓋2-3厘米經(jīng)滅菌的生境土壤，繼續(xù)培養(yǎng)直至長出九州蟲草子實體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所使用的培養(yǎng)基為混配培養(yǎng)基，每百份混配培養(yǎng)基中各組分的重量比分別是無菌條件下飼養(yǎng)的活體豆天蛾幼蟲凍干粉3-5份，谷米97-95份，營養(yǎng)水為上述原料總重的1.4倍，混配培養(yǎng)基滅菌后接入液體菌種，適溫培養(yǎng)條件下自然感染，待菌絲基本布滿培養(yǎng)基表面并向下延伸，給予散時光照射、通風(fēng)，直至長出九州蟲草子實體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述液體菌種是將純化后的菌株接種到液體培養(yǎng)基中得到的，其每百重量份液體培養(yǎng)基中含有豆天蛾幼蟲凍干粉3-5份，馬鈴薯10-15份，糖1-2份，維生素B0.001-0.002份，余量為水。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述營養(yǎng)水每1千重量份中含有九州蟲草子實體純粉1-1.5份，碧全2-2.5份，糖10-15份，KH2PO42-2.5份，K2HPO41-1.5份MgSO41-1.5份，余量為水。
6.據(jù)權(quán)利要求1所述培養(yǎng)方法制得的九州蟲草的應(yīng)用，其特征在于將九州蟲草子實體干燥、粉碎成100目細(xì)粉，用乙醇造粒，60℃以下干燥、整粒、裝入膠囊，以鈷60滅菌后，制得九州蟲草膠囊劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)方法制得的九州蟲草的應(yīng)用，其特征在于以九州蟲草子實體為主料，再輔以甘露醇、硬脂酸鎂、糖精鈉、薄荷醇，制取九州蟲草片劑，所用原料各組分重量比為九州蟲草子實體純粉300份，甘露醇256.85份，糖精鈉1份，薄荷醇0.15份，硬脂酸鎂2份，利用乙醇造粒、干燥、壓片即為成品。
全文摘要
一種中國新紀(jì)錄種九州蟲草菌的人工培養(yǎng)方法及其子實體的應(yīng)用,它是將九州蟲草野生菌進行單孢子或單菌落純化,再將純化后的菌株回接到以無菌條件下飼養(yǎng)的活體豆天蛾幼蟲為主要成分的培養(yǎng)基上,在適宜培養(yǎng)條件下,自然感染,即培養(yǎng)出與天然九州蟲草相同的子實體。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中存在的菌種敗育現(xiàn)象嚴(yán)重的問題,具有菌種穩(wěn)定、生產(chǎn)周期短、可以連續(xù)、批量生產(chǎn)、有效營養(yǎng)成分含量高的優(yōu)點,采用純子實體入藥,可制成膠囊劑、片劑、也可作為藥膳和保健食品、口服液、飲料和補酒等的原料。其用量少,制劑的藥用效果顯著。
文檔編號A61K47/22GK1274751SQ0011049
公開日2000年11月29日 申請日期2000年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月6日
發(fā)明者李春艷, 吳謝軍 申請人:李春艷, 吳謝軍