專利名稱：提取金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物及菌體蛋白制成藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品類制成藥物的方法。
目前，利用生物反應(yīng)調(diào)解劑即用金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物提取藥物的方法有多種，國家知識產(chǎn)局于1991年9月4日公開的“從金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物中提取治療惡性腫瘤用藥的方法”，1991年5月1日公開的“接骨素生產(chǎn)方法”，1990年8月8日公開的“細胞生長刺激素及其制造方法”及1995年7月12日公開的“復(fù)方多價葡萄球菌素注射液”等多項發(fā)明專利。然而，上述文獻中是利用金黃色葡萄球菌的代謝混合物(未加以分離出單一有效成份)直接制成藥物，其制劑中成份復(fù)雜，易引起過敏等副作用。
本發(fā)明的目的在于將金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物中多種物質(zhì)加以分離而提取出其中一種單一活性成份，再輔以菌體中蛋白抗原物質(zhì)制成一種復(fù)合制劑。
為了達到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種提取金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物及菌體蛋白制成藥物的方法，包括如下步驟篩選菌種→制備菌種→制備培養(yǎng)基→接種培養(yǎng)→提取活性物質(zhì)→配制成品。
1、菌種以Staph aureus 155株作為生產(chǎn)菌株2、產(chǎn)毒培養(yǎng)基的制備2·1牛肉浸液的制備將新鮮的牛肉剔除筋膜后攪碎，稱取500克，加入蒸餾水1000-1500毫升，混勻，至冰箱冷藏(4-8℃)，放置過夜，次日煮沸45-60分鐘，按0.5-3.0％的量加1-2N的HCl，攪勻，用二層粗布過濾，用蒸餾水補足至原液量，115-121℃滅菌20-30分鐘，備用。
2·2牛肉消化液的制備將制取浸液后剩下的牛肉渣1000克，放入1500-2000毫升的蒸餾水中，裝進帶塞的玻璃瓶中，加入無水Na2CO30.5-2.0克，干燥胰酶4.5-7.5克，氯仿15-40ml混勻，蓋好塞于30-40℃消化，開始消化時每2-3小時搖動一次，并以40％的氫氧化鈉溶液調(diào)PH6.0-8.5，消化24-48小時后，用2N的HCl調(diào)PH3.0-5.0，再加熱至80-90℃，過濾，濾液加1-5％的氯仿，冰箱中冷藏備用。
2·3種子液及產(chǎn)毒培養(yǎng)基的配方牛 肉 汁 65-75％消 化 液 25-35％葡 萄 糖 0.15-0.35％氯 化 鉀 0.015-0.035％磷酸氫二鉀 0.2-0.4％氯 化 鈉 0.3-0.6％硫 酸 鎂 0.02-0.06％活 性 炭 0.1-0.3％PH值 6.0-8.03、類毒素的制備3·1種子管的制備將真空冷凍干燥保存的菌種接種于普通肉湯管中，放37-40℃溫箱中培養(yǎng)18-24小時，再分離于血液瓊脂平皿上，培養(yǎng)18-24小時，挑選典型、光滑、溶血圈大的菌落，接種于普通營養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)18-24小時，即為生產(chǎn)用菌種。
3·2種子液的培養(yǎng)取一白金耳斜面的培養(yǎng)物，接種于上述產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，37-40℃振蕩培養(yǎng)18-20小時即為種子液。
3·3毒素的制備按0.5-5％的比例將種子液接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，控制條件PH6.0-7.5，溫度為37-40℃，轉(zhuǎn)速200-400轉(zhuǎn)/分鐘，通氣是20L3/h(其中含20％的CO2)，培養(yǎng)18-24小時，取發(fā)酵液離心，測定上清液體溶血效價，達1∶1024為合格。
3·4制備類毒素3·4·1取上述毒素以0.5-2N NaOH溶液調(diào)PH7.0-8.0，加甲醛使最終濃度達0.2-0.5％，置37-40℃溫箱中解毒，至原液不溶血為解毒完全，一般需3-7天，此即為類毒素。
3·4·2類毒素的精制于類毒素中加入NaCl使最終濃度為10-20％攪拌使全溶，以2N的HCl將PH調(diào)至2.7-3.4,4℃靜止可見白色絮狀沉淀，以5000r/min離心10-30min，收集沉淀，以少量的蒸餾水洗一次，再離心，將所得沉淀溶于PH7.0-8.5的磷酸鹽緩沖溶液中，并離心除去不溶雜質(zhì)，此即為精制類毒素，測定類毒素效價，4℃保存。
4、菌體蛋白的制備取培養(yǎng)所得菌體，以蒸餾水洗滌3次，以冷生理鹽水洗滌3次，以細胞破碎儀4000次/分鐘振蕩2-5分鐘(以CO2氣制冷)，細胞破碎率達95％以上，以0.5-1N的鹽酸調(diào)PH4.0-4.5時，收集蛋白沉淀物，以蒸餾水溶解，透析，制得菌體蛋白。
5、配制成品5·1金黃色葡萄球菌素注射液的制備類毒素5000單位菌體蛋白125000微克加注射用水至500ml制成1000支配制后經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過濾，分裝成0.5ml/支，即為金黃色葡萄球菌素注射液。
5·2金黃色葡萄球菌素凍干粉針的制備類毒素5000單位菌體蛋白125000微克低分子右旋糖酐24克加注射用水至500ml制成1000支配制后經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過濾，分裝成0.5ml/支，經(jīng)真空冷凍干燥制成金黃色葡萄球菌素凍干粉針。
所述金黃色葡萄球菌素注射液及凍干粉針的作用是①、對腫瘤細胞的顯著的殺傷和抑制生長的作用典型的病例用藥1-2個療程后，實體瘤(原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶)部分甚至完全得到緩解，多數(shù)病人的生存期明顯的延長，生存質(zhì)量顯著的改善。
②、能顯著增強機體的免疫功能尤其對惡性腫瘤起免疫監(jiān)視作用的“細胞免疫”功能。病人用藥一個療程后，淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率增加151-198％,NK細胞活性增加162-312％。能誘導(dǎo)和增強機體免疫活性以對抗病毒感染引起的疾病(病毒性肝炎、腎炎等)具有明顯的降酶、降黃的作用，改善肝、腎功能。
③、對各種癌性及炎性胸腹水的治療具有特殊療效可防止病變快速復(fù)發(fā)，并達到緩解胸腹水積液引起的原發(fā)癌的浸潤轉(zhuǎn)移，壓迫疼痛等。
④、具有迅速升高白細胞的作用適用于各種原因引起的顆粒性白細胞減少癥，對不明原因引起的白細胞減少也有很好的療效，且有雙向調(diào)節(jié)作用，配合各種癌癥病人的放、化療具有明顯的增效減毒的作用。
本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明將金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物中多種物質(zhì)加以分離，提取其中一種單一活性成份，再加以精制，再輔以菌體中蛋白類抗原物質(zhì)制成的復(fù)合制劑，其特點在于制劑中成份明確，活性物純度高，對腫瘤細胞有殺傷和抑制作用，能增強人體免疫功能，對各種癌性及炎性胸腹水有特殊療效，及具有迅速升高白細胞的作用，副作用小，臨床效果明顯。
下面對本發(fā)明的實施例作進一步詳細描述。
本發(fā)明包括如下步驟篩選菌種→制備菌種→制備培養(yǎng)基→接種培養(yǎng)→提取活性物質(zhì)→配制成品。
1、菌種以Staph aureus 155株作為生產(chǎn)菌株2、產(chǎn)毒培養(yǎng)基的制備2·1牛肉浸液的制備將新鮮的牛肉剔除筋膜后攪碎，稱取500克，加入蒸餾水1000-1500毫升，混勻，至冰箱冷藏(4-8℃)，放置過夜，次日煮沸45-60分鐘，按0.5-3.0％的量加1-2N的HCl，攪勻，用二層粗布過濾，用蒸餾水補足至原液量，115-121℃滅菌20-30分鐘，備用。
2·2牛肉消化液的制備將制取浸液后剩下的牛肉渣1000克，放入1500-2000毫升的蒸餾水中，裝進帶塞的玻璃瓶中，加入無水Na2CO30.5-2.0克，干燥胰酶4.5-7.5克，氯仿15-40ml混勻，蓋好塞于30-40℃消化，開始消化時每2-3小時搖動一次，并以40％的氫氧化鈉溶液調(diào)PH6.0-8.5，消化24-48小時后，用2N的HCl調(diào)PH3.0-5.0，再加熱至80-90℃，過濾，濾液加1-5％的氯仿，冰箱中冷藏備用。
2·3種子液及產(chǎn)毒培養(yǎng)基的配方牛 肉 汁 65-75％消 化 液 25-35％葡 萄 糖 0.15-0.35％氯 化 鉀 0.015-0.035％磷酸氫二鉀 0.2-0.4％
氯 化 鈉 0.3-0.6％硫 酸 鎂 0.02-0.06％活 性 炭 0.1-0.3％PH值 6.0-8.03、類毒素的制備3·1種子管的制備將真空冷凍干燥保存的菌種接種于普通肉湯管中，放37-40℃溫箱中培養(yǎng)18-24小時，再分離于血液瓊脂平皿上，培養(yǎng)18-24小時，挑選典型、光滑、溶血圈大的菌落，接種于普通營養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)18-24小時，即為生產(chǎn)用菌種。
3·2種子液的培養(yǎng)取一白金耳斜面的培養(yǎng)物，接種于上述產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，37-40℃振蕩培養(yǎng)18-20小時即為種子液。
3·3毒素的制備按0.5-5％的比例將種子液接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，控制條件PH6.0-7.5，溫度為37-40℃，轉(zhuǎn)速200-400轉(zhuǎn)/分鐘，通氣是20L3/h(其中合20％的CO2)，培養(yǎng)18-24小時，取發(fā)酵波離心，測定上清液體溶血效價，達1∶1024為合格。
3·4制備類毒素3·4·1取上述毒素以0.5-2N NaOH溶液調(diào)PH7.0-8.0，加甲醛使最終濃度達0.2-0.5％，置37-40℃溫箱中解毒，至原液不溶血為解毒完全，一般需3-7天，此即為類毒素。
3·4·2類毒素的精制于類毒素中加入NaCl使最終濃度為10-20％攪拌使全溶，以2N的HCl將PH調(diào)至2.7-3.4,4℃靜止可見白色絮狀沉淀，以5000r/min離心10-30min，收集沉淀，以少量的蒸餾水洗一次，再離心，將所得沉淀溶于PH7.0-8.5的磷酸鹽緩沖溶液中，并離心除去不溶雜質(zhì)，此即為精制類毒素，測定類毒素效價，4℃保存。
4、菌體蛋白的制備取培養(yǎng)所得菌體，以蒸餾水洗滌3次，以冷生理鹽水洗滌3次，以細胞破碎儀4000次/分鐘振蕩2-5分鐘(以CO2氣制冷)，細胞破碎率達95％以上，以0.5-1N的鹽酸調(diào)PH4.0-4.5時，收集蛋白沉淀物，以蒸餾水溶解，透析，制得菌體蛋白。
5、配制成品5·1金黃色葡萄球菌素注射液的制備類毒素5000單位菌體蛋白125000微克加注射用水至500ml制成1000支配制后經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過濾，分裝成0.5ml/支，即為金黃色葡萄球菌素注射液。
5·2金黃色葡萄球菌素凍干粉針的制備類毒素5000單位菌體蛋白125000微克低分子右旋糖酐24克加注射用水至500ml制成1000支配制后經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過濾，分裝成0.5ml/支，經(jīng)真空冷凍干燥制成金黃色葡萄球菌素凍干粉針。
所述金黃色葡萄球菌素注射液及凍干粉針的作用是①、對腫瘤細胞的顯著的殺傷和抑制生長的作用典型的病例用藥1-2個療程后，實體瘤(原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶)部分甚至完全得到緩解，多數(shù)病人的生存期明顯的延長，生存質(zhì)量顯著的改善。
②、能顯著增強機體的免疫功能尤其對惡性腫瘤起免疫監(jiān)視作用的“細胞免疫”功能。病人用藥一個療程后，淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率增加151-198％，NK細胞活性增加162-312％。能誘導(dǎo)和增強機體免疫活性以對抗病毒感染引起的疾病(病毒性肝炎、腎炎等)具有明顯的降酶、降黃的作用，改善肝、腎功能。
③、對各種癌性及炎性胸腹水的治療具有特殊療效可防止病變快速復(fù)發(fā)，并達到緩解胸腹水積液引起的原發(fā)癌的浸潤轉(zhuǎn)移，壓迫疼痛等。
④、具有迅速升高白細胞的作用適用于各種原因引起的顆粒性白細胞減少癥，對不明原因引起的白細胞減少也有很好的療效，且有雙向調(diào)節(jié)作用，配合各種癌癥病人的放、化療具有明顯的增效減毒的作用。
所述本發(fā)明的類毒素的提純精制工藝為1、取葡萄球菌毒素除菌濾液200ml，調(diào)PH7.0，加入濃度30％ZnCl2溶液40ml，置室溫過濾，次日離心3000/min,20分鐘，棄去上清，沉淀以蒸餾水洗兩次，加入10％檸檬酸銨溶液50ml，待沉淀溶解后再加2.5％硫酸銨溶液20毫升過濾，待濾液裝入透析膜中流水透析，以奈氏試劑檢查銨根，銨根＜0.2％為合格。
2、硫酸銨分級沉淀法第一次沉淀向毒素除菌液中加入固體硫酸銨至70％飽和度，將全部蛋白質(zhì)沉淀。0-4℃靜止過夜，離心3500r/min,25分鐘，將沉淀溶于原毒素量的1/8蒸餾水中。
第二次沉淀向以上處理液中加入固體硫酸銨至15％飽和，靜止一小時過濾，棄去沉淀。
第三次沉淀向第二次濾液中再加固體硫酸銨，使之成35％飽和，靜止1小時離心3500r/min,25分鐘，倒去上清，將沉淀加入PH8.0的磷酸緩沖液達原體積的1/8，透析后即得精制類毒素。
3、先精制再解毒法將發(fā)酵所得毒素除菌后，加NaCl便成10-20％的濃度，攪拌使全部溶解，以2N的HCl將PH調(diào)至2.7-3.4,4℃靜后，以5000r/min離心，10-30min，收集沉淀，以少量的蒸餾水洗一次，再離心，將所得沉淀溶于PH7.0-8.5的磷酸鹽緩沖液中，離心除不溶解的雜質(zhì)，以0.5-2N的NaOH調(diào)PH7.0-8.0，加籟氨酸成0.05mol/L，加甲醛后最終濃度達0.2-0.5％，置37-40℃溫箱中解毒，至原液不溶血為解毒完全，即得精制類毒素。
權(quán)利要求
1.一種提取金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物及菌體蛋白制成藥物的方法，包括如下步驟篩選菌種→制備菌種→制備培養(yǎng)基→接種培養(yǎng)→提取活性物質(zhì)→配制成品。(1)菌種以Staph aureus 155株作為生產(chǎn)菌株(2)產(chǎn)毒培養(yǎng)基的制備a、牛肉浸液的制備將新鮮的牛肉剔除筋膜后攪碎，稱取500克，加入蒸餾水1000-1500毫升，混勻，至冰箱冷藏(4-8℃)，放置過夜，次日煮沸45-60分鐘，按0.5-3.0％的量加1-2N的HCl，攪勻，用二層粗布過濾，用蒸餾水補足至原液量，115-121℃滅菌20-30分鐘，備用。b、牛肉消化液的制備將制取浸液后剩下的牛肉渣1000克，放入1500-2000毫升的蒸餾水中，裝進帶塞的玻璃瓶中，加入無水Na2CO30.5-2.0克，干燥胰酶4.5-7.5克，氯仿15-40ml混勻，蓋好塞于30-40℃消化，開始消化時每2-3小時搖動一次，并以40％的氫氧化鈉溶液調(diào)PH6.0-8.5，消化24-48小時后，用2N的HCl調(diào)PH3.0-5.0，再加熱至80-90℃，過濾，濾液加1-5％的氯仿，冰箱中冷藏備用。c、種子液及產(chǎn)毒培養(yǎng)基的配方牛 肉 汁 65-75％消 化 液 25-35％葡 萄 糖 0.15-0.35％氯 化 鉀 0.015-0.035％磷酸氫二鉀 0.2-0.4％氯 化 鈉 0.3-0.6％硫 酸 鎂 0.02-0.06％活 性 炭 0.1-0.3％PH值 6.0-8.0(3)類毒素的制備a、種子管的制備將真空冷凍干燥保存的菌種接種于普通肉湯管中，放37-40℃溫箱中培養(yǎng)18-24小時，再分離于血液瓊脂平皿上，培養(yǎng)18-24小時，挑選典型、光滑、溶血圈大的菌落，接種于普通營養(yǎng)瓊脂斜面上培養(yǎng)18-24小時，即為生產(chǎn)用菌種。b、種子液的培養(yǎng)取一白金耳斜面的培養(yǎng)物，接種于上述產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，37-40℃振蕩培養(yǎng)18-20小時即為種子液。c、毒素的制備按0.5-5％的比例將種子液接種于產(chǎn)毒培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中進行培養(yǎng)，控制條件PH6.0-7.5，溫度為37-40℃，轉(zhuǎn)速200-400轉(zhuǎn)/分鐘，通氣是20L3/h(其中含20％的CO2)，培養(yǎng)18-24小時，取發(fā)酵液離心，測定上清液體溶血效價，達1∶1024為合格。d、制備類毒素取上述毒素以0.5-2N NaOH溶液調(diào)PH7.0-8.0，加甲醛使最終濃度達0.2-0.5％，置37-40℃溫箱中解毒，至原液不溶血為解毒完全，一般需3-7天，此即為類毒素。類毒素的精制于類毒素中加入NaCl使最終濃度為10-20％攪拌使全溶，以2N的HCl將PH調(diào)至2.7-3.4,4℃靜止可見白色絮狀沉淀，以5000r/min離心10-30min，收集沉淀，以少量的蒸餾水洗一次，再離心，將所得沉淀溶于PH7.0-8.5的磷酸鹽緩沖溶液中，并離心除去不溶雜質(zhì)，此即為精制類毒素，測定類毒素效價，4℃保存。(4)菌體蛋白的制備取培養(yǎng)所得菌體，以蒸餾水洗滌3次，以冷生理鹽水洗滌3次，以細胞破碎儀4000次/分鐘振蕩2-5分鐘(以CO2氣制冷)，細胞破碎率達95％以上，以0.5-1N的鹽酸調(diào)PH4.0-4.5時，收集蛋白沉淀物，以蒸餾水溶解，透析，制得菌體蛋白。(5)配制成品a、金黃色葡萄球菌素注射液的制備類毒素5000單位菌體蛋白125000微克加注射用水至500ml制成1000支配制后經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過濾，分裝成0.5ml/支，即為金黃色葡萄球菌素注射液。b、金黃色葡萄球菌素凍干粉針的制備類毒素5000單位菌體蛋白125000微克低分子右旋糖酐24克加注射用水至500ml制成1000支配制后經(jīng)0.22μm微孔濾膜除菌過濾，分裝成0.5ml/支，經(jīng)真空冷凍干燥制成金黃色葡萄球菌素凍干粉針。
2.按照權(quán)利要求1所述提取金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物及菌體蛋白制成藥物的方法，其特征在于所述金黃色葡萄球菌素注射液及凍干粉針的作用是①、對腫瘤細胞的顯著的殺傷和抑制生長的作用典型的病例用藥1-2個療程后，實體瘤(原發(fā)或轉(zhuǎn)移灶)部分甚至完全得到緩解，多數(shù)病人的生存期明顯的延長，生存質(zhì)量顯著的改善。②、能顯著增強機體的免疫功能尤其對惡性腫瘤起免疫監(jiān)視作用的“細胞免疫”功能。病人用藥一個療程后，淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率增加151-198％,NK細胞活性增加162-312％。能誘導(dǎo)和增強機體免疫活性以對抗病毒感染引起的疾病(病毒性肝炎、腎炎等)具有明顯的降酶、降黃的作用，改善肝、腎功能。③、對各種癌性及炎性胸腹水的治療具有特殊療效可防止病變快速復(fù)發(fā)，并達到緩解胸腹水積液引起的原發(fā)癌的浸潤轉(zhuǎn)移，壓迫疼痛等。④、具有迅速升高白細胞的作用適用于各種原因引起的顆粒性白細胞減少癥，對不明原因引起的白細胞減少也有很好的療效，且有雙向調(diào)節(jié)作用，配合各種癌癥病人的放、化療具有明顯的增效減毒的作用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種提取金黃色葡萄球菌代謝產(chǎn)物及菌體蛋白制成藥物的方法,該藥物中含有金黃色葡萄球菌素及菌體蛋白兩種抗原物質(zhì),其制備步驟包括:篩選菌種→制備菌種→制備培養(yǎng)→接種培養(yǎng)→提取活性物質(zhì)→配制成品,該藥物可對腫瘤細胞有殺傷和抑制作用,能增強人體免疫功能,對各種瘤性及炎性胸腹水有特殊療效及具有迅速升高白細胞的作用。
文檔編號A61K35/74GK1310022SQ0011014
公開日2001年8月29日 申請日期2000年2月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月22日
發(fā)明者俞嘉林, 張瑞斌, 辛濱 申請人:哈爾濱高科技集團天健藥業(yè)有限責(zé)任公司, 俞嘉林, 張瑞斌, 辛濱