專利名稱：復方鱉甲軟肝片用于治療慢性乙型肝炎肝纖維化的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥組合物，特別是一種復方鱉甲軟肝片用于治療慢性乙型肝炎肝纖維化的用途。
慢性乙型肝炎肝纖維化是近年來肝病專業(yè)研究的熱門課題，根據(jù)其臨床表現(xiàn)當屬中醫(yī)的積聚病癥范疇。積聚之為病，緣于肝病之初起，濕熱邪毒傷及肝脾，失治誤治，肝脾功能失調(diào)，正氣漸傷，日久及腎，余邪留戀不凈，氣結(jié)血瘀阻于肝絡(luò)。肝者主藏血，喜疏泄條達，故為體陰用陽之臟。肝傷即氣失條達，肝氣郁結(jié)；氣為血帥，氣行則血行，氣滯則血瘀，瘀血聚于肋下，則生痞塊。肝郁日久化熱，耗傷陰血，不能柔養(yǎng)肝絡(luò)，故脅肋隱痛。肝熱羈留故口干且苦。乙癸同源，肝陰虧虛，子盜母氣，暗耗腎陰，足少陰經(jīng)也經(jīng)過脅肋，故更加重脅肋隱痛之勢，并可見面色晦暗，甚則黧黑。脾者與胃同居中州，互為表里，為后天之本。脾主升清，胃主降濁，胃主受納腐熟，脾主運化轉(zhuǎn)輸，為氣血化生之源。脾傷則納化失司，氣機升降不利，故可脘腹脹滿，納差便溏，神疲乏力。脾病延久，后天不能補養(yǎng)先天，腎氣也虛，故更加重神疲乏力，精力漸衰。赤縷紅痣，蛛砂掌，舌質(zhì)黯或有瘀斑，皆為瘀血之象，舌苔薄黃膩為濕熱邪毒未凈之征；脈弦細為肝病遷延，本虛標實之象。
綜上所述，慢性乙型肝炎肝纖維化的中醫(yī)病理特點，為濕熱邪毒不清，肝脾已傷。故既有熱毒、瘀血之邪實一面，又有脾腎氣虛及肝腎陰虛在同，因此，是一種本虛標實之證。
本發(fā)明的目的是提供一種具有軟堅散結(jié)、化瘀解毒、益氣養(yǎng)陰之功效的復方鱉甲軟肝片用于治療慢性乙型肝炎肝纖維化的用途。
本發(fā)明所述復方鱉甲軟肝片中藥制劑是由下述重量份數(shù)的原料組成的鱉甲110-130份赤芍 80-90份當歸40-60份三七40-60份 黨參 80-90份黃芪80-90份紫河車 40-50份 冬蟲夏草 20-30份板藍根 130-150份連翹130-150份莪術(shù) 20-30份本發(fā)明所述復方鱉甲軟肝片中藥制劑考慮到瘀血阻于肝絡(luò)，宜化瘀通絡(luò)為要，同時兼顧熱毒余邪未清，適應(yīng)正視肝脾腎三臟之虛，故宜清熱解毒、養(yǎng)血柔肝、健脾益氣、補腎填精，從而達到攻補兼施，標本兼顧的目的。本中藥制劑主治脅肋隱痛或肋下痞塊，面色晦黯，脘腹脹滿，納差便溏，神疲乏力，口干且苦，赤縷紅痣，蛛砂掌，舌質(zhì)黯或有瘀斑，舌苔薄黃膩，脈弦細。慢性乙型肝炎肝纖維化患者見上述瘀血阻絡(luò)，氣陰虧虛，熱毒未盡證候者均可使用。
其中，所述鱉甲在本方中為君。它味成性平，人肝，腎經(jīng)，其既可軟堅散結(jié)，又可滋陰潛陽，故于本病的瘀血凝結(jié)、肝腎陰血已傷的證尤為貼切?！侗窘?jīng)》謂“主心腹堅積、寒熱、去痞、息肉、陰蝕、痔、惡肉”。《本草從新》謂“治厥陰血分之病”。
本方以當歸、赤芍、三七三味為臣，以增強養(yǎng)血活血，化瘀散結(jié)之力。當歸味甘辛性溫，功專補血活血，從而養(yǎng)血柔肝，活血祛瘀。赤芍味苦微寒，具有清熱涼血，化瘀通絡(luò)之功，專入肝經(jīng)，《本經(jīng)》謂“主邪氣腹痛，除血痹破堅積、寒熱，止痛，利小便”。三七味甘微苦味溫，為散瘀消腫，止血定痛之藥。以上三藥菜助鱉甲消瘕、去積聚、化痞塊的作用，祛邪而不傷正。
本方中所述黨參、黃芪健脾益氣；所述冬蟲夏草、紫河車益腎填精；所述板藍根、連翹清熱解毒，從三個不同方面協(xié)助治療次要證候，是為佐藥。黨參甘平，補中益氣《本草從新》謂“主補中益氣和脾胃，除煩渴...中氣微弱，用以調(diào)補，甚為平妥。”黃芪甘微溫，被氣升陽，固表托毒；《別錄》謂“被丈夫虛損，五勞贏瘦，止渴、腹痛、瀉痢、益氣、利陰氣”。參芪同用，溫補脾胃，升提中氣，化生氣血，即所謂“見肝之病，知肝傳脾，當先實脾”之要義。冬蟲夏草味甘性平，為補益肺腎之品；《綱目拾遺》謂“性溫暖，被精益髓。”紫河車味甘成性溫，有補氣、養(yǎng)血、益精功效，為血肉有情之品，故凡氣血不足、腎精虧損之癥皆可服用。此二味對于肝脾俱傷、日久及腎、氣血陰精虧虛之體，均可起到益腎柔肝，被腎扶脾的作用。板藍根味苦性寒，有瀉火解毒、消腫散結(jié)之功，故為瘡家藥?！侗窘?jīng)》謂“治寒熱，鼠瘺，瘰癘，癰腫，惡瘡，結(jié)熱，毒。”二味清熱解毒之品，針對熱毒末清之象而設(shè)。
本方中所述莪術(shù)，其性苦辛性溫，本品辛散苦泄溫通，專入肝經(jīng)血分，雖能行氣祛瘀，散結(jié)消瘀之功，然方中本藥用量較小，也起到引經(jīng)報使之能，故為使藥。
總之，本發(fā)明所述復方鱉甲軟肝片中藥制劑攻補兼施、標本兼顧，使熱毒余邪得以清除，肝脾腎三臟功能得以恢復，現(xiàn)于肝絡(luò)之瘀血得以消散，達到扶正消癥的目的，具有軟堅散結(jié)、化瘀解毒、益氣養(yǎng)陰的功效，有效率為81.67％，治愈率達55.23％。
本復方鱉甲軟肝片中藥制劑的制備方法包括將鱉甲、三七、赤芍、冬蟲夏草、紫河車粉碎成細粉；將當歸、莪術(shù)、連翹蒸餾提取揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液待用，將藥渣加水煎煮1-2小時，濾過，濾液與上述水溶液合并；將黨參、黃芪及板藍根三味加水煎煮三次，每次1-2小時，合并三次煎液，過濾得濾液；將所有濾液和水溶液合并，離心去雜后，在50℃下減壓濃縮至相對密度為1.25-1.30的稠膏狀，真空干燥成干浸膏，粉碎成細粉，并與上述鱉甲、三七、赤芍、冬蟲夏草、紫河車五味的細粉及輔料適量混勻，制成顆粒并干燥，再加入上述當歸、莪術(shù)、連翹三味的揮發(fā)油，混勻，壓制成片即可。
其中，所述鱉甲為制鱉甲，其化學成分含動物膠、角蛋白、碘質(zhì)和VD等，均不宜長時間加熱煎煮，而應(yīng)粉末入藥，其蜂窩狀不規(guī)則性孔隙的骨組織特有顯微結(jié)構(gòu)，可作為與其它藥材區(qū)別的主要特征，制備時應(yīng)先對購進的制鱉甲應(yīng)逐個檢查，棄去在運輸、貯藏期間所發(fā)生霉變、腐臭者，凈品置烘箱中于100-110℃烘干備用；所述赤芍為含測藥材，主含單萜類有效成分芍藥甙的4種衍生物，對肝細胞DNA合成有明顯增強作用，對心、肝微粒體有顯著誘導作用而利于解毒，還含沒食子酸鞣質(zhì)等成分，但有效成分提得率偏低，粉末入藥即可保持有效成分，又利于含量測定，制備時對購進的赤芍飲片，在含量測定符合要求后，先過篩，除去灰屑，再用清水迅速漂洗一次，除去泥沙，凈品干燥備用；所述三七為名貴藥材，含三七皂甙R1、人參甙Rh1、R2、Rc、Rg1，活血成分特殊氨基酸三七素，16種氨基酸，多種無機元素和生物堿等，一兩種溶劑很難將有效成分提盡，故均以粉末入藥為宜，制備時對購進的三七先過篩，除去灰屑，再用清水漂洗一次，除去泥沙，凈品烘干備用；所述冬蟲夏草為名貴藥材，主含粗蛋白25.32％，碳水化合物28.9％，脂肪8.4％，粗纖維18.53％，另含Vit B120.29μg/100g等，一兩種溶劑很難將其有效成分提盡，故均以粉末入藥為宜，制備時先挑出似纖維狀的附著物及雜質(zhì)，然后置烘箱于75-85℃烘干備用；所述紫河車為制紫河車，其成分復雜，含多種抗體、干擾素、β-抑制因子、激素和酶等，不宜用醇或水加熱煎煮提取，亦用粉末入藥，制備時對購進的制紫河車應(yīng)逐個檢查，棄去腐臭者，凈品置高壓鍋于121℃蒸0.5h，取出烘干備用。經(jīng)上述前處理后的五味藥材按處方量準確稱量，混合均勻，粉碎成細粉，粉碎方法為機械粉碎方法，所用的粉碎機為煙臺市芝罘制藥機械廠生產(chǎn)，它由ZKF-3型自控粉碎機組控制臺、WZS3-470型臥式轉(zhuǎn)篩及hF3-200型粉碎機等三個主要部分組成，其工作效率為每小時粉碎20-200kg藥材，過篩粒度可在20-400目之間任意調(diào)整，實際選用100目篩進行粉碎，由于它屬于自動循環(huán)式粉碎方式，其出粉率可達95％以上。然后再將細粉用鈷-60γ射線輻照滅菌方法，輻照劑量為5kGy，可保證本品衛(wèi)生學合格。
所述蒸餾提取揮發(fā)油的方法為藥典甲法(中國藥典1990年版一部附錄48頁)，即按處方量取當歸、莪術(shù)、連翹混合于燒瓶中，加7-9倍量的水蒸餾1-5小時，所述臣藥當歸，含揮發(fā)油、蒿本內(nèi)酯、亞丁苯酚、膽堿、阿魏酸和多種氨基酸；使藥莪術(shù)，含揮發(fā)油莪術(shù)醇、莪術(shù)雙酮、酚性成分、有機酸、樹脂、淀粉等；佐藥連翹，含揮發(fā)油、連翹甙4.89％、白樺脂酸、熊果酸、齊墩果酸、連翹酸、連翹脂素、牛蒡子甙等，三味合并加熱水(＞80℃，因有皂甙)用水蒸汽蒸餾，收集揮發(fā)油的平均得量為0.97ml。制劑中揮發(fā)油的加入量即揮發(fā)油的提得量；其加入方法為用7-9倍量的76％乙醇溶解揮發(fā)油，搖勻后噴灑到干燥顆粒上，密閉35-45分鐘。
所述佐藥黨參，含多糖、皂甙、葡萄糖、蔗糖、9種甾醇成分、17種氨基酸、12種有機酸、14種無機元素等，對神經(jīng)、免疫、消化系統(tǒng)多種作用；所述佐藥黃芪，含黃芪甲甙、21種氨基酸、葡萄糖醛酸、葉酸、14種微量元素、多糖、膽堿等。黃芪甲甙是抗病毒、抗肝毒性損害的有效成分，其多糖和水溶性煎劑有明顯的保肝護肝作用；所述佐藥板藍根，含靛甙、蔗糖、精氨酸等7種氨基酸、靛藍、靛玉紅等；三味藥加熱水煎煮提膏入藥較宜。
所述所有濾液和水溶液混合后的濃縮過程是在E1-1型真空濃縮罐(由常熟制藥機械廠生產(chǎn))中進行的，真空度?？刂圃?.06-0.07MPa，以使液溫在50-70℃下蒸發(fā)，每小時可蒸發(fā)水份60-80升。
所述濃縮稠膏的干燥過程的壓力在620-670mmHg，溫度為70-80℃，成干浸膏后粉碎成細粉，平均出膏量為10.8kg，平均出膏率為20.6％。
本復方鱉甲軟肝片中藥制劑的制備方法還可以包括將生藥原粉及浸膏粉混勻后，加入蔗糖粉及淀粉，混合據(jù)均勻，用乙醇作為潤濕劑制成軟材，過篩制粒，置烘箱干燥得干燥顆粒。此顆粒的質(zhì)控參數(shù)為1、水分含量3-5％通常為3.5％2、粒度大小14-22目。
3、芍藥甙含量每0.5g顆粒含芍藥甙不得少于2.1mg。
其中，所述蔗糖粉的加入量為5.5-9.5/藥材總重量；淀粉的加入量為1.2/藥粉總重量；所述乙醇的濃度為67-71％；所述過篩粒度為16目；所述烘箱溫度為75-85℃，干燥時間為1.5-2.5小時。
本復方鱉甲軟肝片中藥制劑的制備方法還可以包括加入硬脂酸鎂，此硬脂酸鎂屬疏水性潤滑輔料，其在工藝中的作用是增加藥物在壓片過程中的流動性以減少藥物顆粒與顆粒之間、顆粒與機械部分之間的摩擦力與粘著力，可在制粒后、壓片前加入，加入量為0.25-1％。
所述當歸、莪術(shù)、連翹三味藥揮發(fā)油提取方法為取約65g當歸、莪術(shù)、連翹于1000ml圓底燒瓶中，按中國藥典1990年版一部附錄48頁揮發(fā)油測定甲法，加8倍量水中熱回流5h進行提取，結(jié)果如表1。
表1當歸、莪術(shù)、連翹揮發(fā)油提取結(jié)果投料量 揮發(fā)油量(ml) 揮發(fā)油提取率加水量(g) 1h2h3h4h5h(v/w)64.9228倍0.19 0.26 0.30 0.31 0.32 0.49％64.9958倍0.20 0.27 0.31 0.32 0.32 0.49％64.5708倍0.18 0.25 0.30 0.31 0.31 0.48％
從上述表可以看出，提取時間達3h，其揮發(fā)油基本提盡，因此，提取揮發(fā)油時間定為3h。
在揮發(fā)油提取3h后，分離出水溶液，將藥渣經(jīng)第二煎煮(加7倍量水，煎煮時間1h)，其浸出率銳減，再經(jīng)第三次煎煮(加7倍量水，煎煮時間為1h)， 其浸出率更低(水溶液相對密度1.0037)，其水溶物具體提取結(jié)果見表2。
表2 當歸、莪術(shù)、連翹水溶物提取結(jié)果煎煮次數(shù) 加水量 煎煮時間(h) 浸出率(％) 浸出率占合計百分率(％)一 8倍3 11.9 73.5二 7倍1 3.7 22.8三 7倍1 0.6 3.7從表2可以看出，前二次煎煮即已基本提盡當歸等三味的水溶物，因此，水溶物提取方法為加水煎煮二次，第一次煎煮時間為3h(加8倍量水)，第二次煎煮時間為1h(加7倍量水)。
為進一步驗證復方鱉甲軟肝片的抗肝纖維化作用，可以通過動物實驗，在以下七個方面觀察該藥對肝臟病理改變的影響，具體內(nèi)容及過程如下一、復方鱉甲軟肝片抗肝纖維化對阻斷肝纖維化形成、溶解或吸收已形成的肝纖維化的作用。
實驗動物體重180-200g，因本動物實驗周期長達6-8個月；雌性大鼠在發(fā)情期及孕哺期機體內(nèi)分泌系統(tǒng)改變，影響藥物療效的觀察，則選用雄性S.D大鼠(中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)。二級Wistar大鼠質(zhì)量合格證，證號京動管質(zhì)字(1994)第032號。
驗證藥物為華星藥廠研制的復方鱉甲軟肝片，每片含生藥量0.46克。
動物模型制備以35mg/100ml的苯巴比妥鈉溶液代替常水，喂飼動物10天；以鼠體重(0.15ul/g體重)增減確定給予四氯化碳量，每周一次，每次最大量不超過250ul；隨機分6個組，每組16只大鼠。
(1)、復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，相當成人4倍(鼠0.25g/kg體重，人0.061g/kg體重)，飲常水。
(2)、復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，相當成人8倍，飲常水。
(3)、復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組給CCL4三個月，形成肝纖維化后，每日飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，飲常水。
(4)、肝安干糖漿14.4g/kg組給CCI4，每日在飼料內(nèi)加肝安干糖漿14.4g/kg，相當成人15倍(鼠14.4g/kg體重，人0.96g/kg體重)。飲常水。肝安干糖漿為支鏈氨基酸配制而成的干糖漿制劑，含有三種氨基酸，其成份是L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-纈氨酸，其藥理作用(1)可增加血中支鏈氨基酸，改善氨基酸失衡，對肝昏迷有蘇醒和預防作用；(2)可促進蛋白質(zhì)合成，降低蛋白質(zhì)分解，有利于肝細胞的再生和修復。適用于肝性腦病，肝硬化及慢性活動性肝炎、慢性遷延性肝炎等的治療和預防，用法每次1袋，每日3次，規(guī)格每袋14.5g(24.48％)(每袋含三種氨基酸總量為3.55g)。因該藥成分中不含有復方鱉甲軟肝片的成分，并獲遼寧衛(wèi)藥(88)2263-61號，故選為陽性對照藥物。
(5)、四氯化碳模型組給CCL4，喂固體飼料，飲常水。
(6)、正常對照組不給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg(按生藥量計算)，飲常水。
驗證藥物的配制將由鱉甲(制)、莪術(shù)、三七、黃芪、冬蟲夏草等中藥經(jīng)優(yōu)選工藝提取制成的復方鱉甲軟肝片藥粉70g(1g藥粉相當含生藥1.40g)加面粉3000g混勻，加蜂蜜，用壓丸機，壓出2000丸涼干，每丸含復方鱉甲軟肝片生藥50mg；晨起喂飼大鼠(喂飼空腹大鼠，因空腹大鼠急于進食，故很快先把藥丸吞食，待觀察大鼠吃盡丸藥后，再給固體飼料，以保證受試藥物不受損失)。
驗證方法(1)、HE染色(2)、將標本置于10％的中性福爾馬林固定液中，固定24小時，石臘包埋，切片厚度為5um，行苦味酸天狼星紅一偏振光法將0.5g的天狼星紅(Sirius Red F3BA-N，Mobory chemical CO.Vnion N、I)溶于飽和100ml苦味溶液中。切片脫蠟入水，在0.1％苦味酸、天狼星紅溶液染1小時，自來水沖洗，經(jīng)Harris蘇木精染核，常規(guī)脫水，透明，樹膠封片。應(yīng)用Zeiss偏振光法顯微鏡觀察。
(3)、可溶性膠原的提取及測定；將部分肝切除組織經(jīng)丙酮脫酯后，用0.5M乙酸浸泡打碎成勻漿，4℃過夜，6000g4℃離心1h，取上清，測A260及A280值，以1.45A280-0.74A260換算成每毫克肝組織的蛋白量，采用Rennard等的ELISA方法，計算出膠原含量。
研證肝纖維化病理分級判定標準按0-6級分級O級肝組織正常，無膠原纖維增生；I級膠原纖維從匯管區(qū)或中央靜脈周圍輕度向外延伸；II級膠原纖維延伸明顯，但尚未連接包繞整個肝小葉；III級膠原纖維延伸連接包繞整個肝小葉；IV級膠原纖維包繞分割肝小葉，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，以大方形假小葉為主；V級肝小葉結(jié)構(gòu)完全破壞，假小葉形成，大方形與小圓形假小葉各占50％；VI級肝內(nèi)布滿小圓形假小葉，其間有粗大增生的膠原纖維。
研證結(jié)果1、復方鱉甲軟肝片對大鼠實驗性肝纖維化療效見表1。
表1，復方鱉甲軟肝片對實驗性肝纖維化作用肝纖維化程度O級 I級 II級 III級 IV級 V級 VI級總計正常對照組16- - - - - - 16CCL4模型組 - - - - 2 8 3 13肝安干糖漿組 - - 1 3 3 2 1 10復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組 - 4 2 2 1 2 - 11復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組 - 3 2 2 1 1 1 10復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組 - 1 3 2 2 2 1 11表1示各組與CCL4模型組相比P＜0.05；均有抗肝纖維化作用，復方鱉甲軟肝片各組與肝安組比亦有差異P＜0.05。
2、苦味酸天狼星紅一偏振光法觀察結(jié)果。
正常肝組織切片經(jīng)苦味酸天狼星紅染色，在偏振光顯微鏡下中見匯管區(qū)及狄氏間隙周圍由淺紅色I型膠原纖維和綠色III型膠原纖維參半構(gòu)成。CCL4模型組則粗大紅色重迭的I型膠原成束排列，分割、包繞肝小葉。I型膠原明顯多于III型膠原；肝安組60％類同CCL4模型組，40％為粗大紅色I型膠原纖維束，重疊少，延伸明顯，有延伸連接。復方鱉甲軟肝片阻斷組則為較細的紅色I型膠原纖維束，多延伸，少重疊及連接；0.5g/kg治療組由治療前粗大紅色重疊I型膠原纖維束包繞、分割肝小葉，變成少重疊，分割、多延伸連接的纖維束。
3、苦味酸天狼星紅染色電子計算機圖象分析表2。
表2，復方鱉甲軟肝片對肝臟原纖維的影響I型膠原(紅) III型膠原(綠)正常對照組 1.5632±0.04181.8371±0.0524CCL4模型組 41.2371±2.6314 27.0289±1.8217肝安干糖漿組28.4156±2.4726 16.0123±1.2635復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組6.3261±1.4587 7.0461±1.1352復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組 8.1365±1.2741 7.8612±1.5036復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組 18.2248±2.7311 13.4666±2.1223復方鱉甲軟肝片治療前 36.4167±3.6771 23.6223±4.36714、復方鱉甲軟肝片對肝組膠原含量的影響見表3。
表3，復方鱉甲軟肝片對肝組膠含量的影響用藥前膠原量(ug/mg肝臟蛋白) 用藥后膠原量(ug/mg肝臟蛋白)I型 III型 I型 III型正常對照組2.783±0.361 2.934±0.214 2.914±0.132 2.973±0.232CCL4模型組 2.573±0.324 2.893±0.502 13.298±2.814 8.112±2.136肝安干糖漿組 2.627±0.296 2.741±0.223 8.734±1.431 5.542±2.103復方鱉甲軟肝片0.25g/Kg阻斷組 2.714±0.326 2.684±0.367 5.326±1.418 6.924±1.857復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組 2.688±0.217 2.789±0.418 6.134±1.211 6.642±2.114復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組 12.378±3.251 8.892±2.146 8.394±1.922 7.301±2.462表3示CCL4模型組與各組相比，I、III型膠原量均顯著增高(P＜0.01)，各組相比復方鱉甲軟肝片優(yōu)于肝安(P＜0.05)；復方鱉甲軟肝片阻斷組優(yōu)于治療組(P＜0.05)。
以上研究結(jié)果進一步證實復方鱉甲軟肝片對CCL4，損傷性肝纖維化有明確的抗肝纖維化作用。阻斷組在肝纖維化尚未完全形成即給藥，6個月后發(fā)現(xiàn)復方鱉甲軟肝片0.25g/kg、0.5g/kg阻斷組中I-III級纖維化程度分別占72.72％和70％，表明肝纖維化程度明顯減輕，這種阻斷肝纖維化發(fā)展的作用明顯強于肝安組(P＜0.05)。治療組在肝纖維化完全形成后，再投藥治療3個月后，發(fā)現(xiàn)I-III級纖維化程度占54.54％，較模型組纖維化程度明顯輕。提示復方鱉甲軟肝片既有抗肝纖維作用，又有溶解或吸收已形成的肝纖維作用。
苦味酸天狼星紅一偏振光法觀察結(jié)果表明，CCL4模型組因粗大I型膠原纖維束張力強，重疊、延伸、連接，封閉內(nèi)皮細胞間的“窗”，導致血竇的“毛細管化”，而破壞肝臟的正常組織結(jié)構(gòu)，使Disse腔中膠原過多沉積，造成肝組織中膠原量異常增多，改變膠原I/III值見(表2，3)，形成肝纖維化或肝硬變。復方鱉甲軟肝片增強肝臟的膠原酶活力，促進膠原纖維束的溶解，阻斷了血竇的“毛細管化”，使Disse腔中不能沉積大量膠原，維持肝臟結(jié)構(gòu)完整，I型膠原含量增高不顯，使I/III膠原值處于相對正常，從而阻斷肝纖維化的形成，溶解或吸收已形成的肝纖維化。
總之，復方鱉甲軟肝片抗肝纖維化的療效是肯定的，具有阻斷肝纖維化形成，溶解或吸收已形成的肝纖維化的作用。
二、復方鱉甲軟肝片對儲脂細胞I、III型膠原mRNA表達的影響肝纖維化特點是Disse腔中大量膠原蛋白沉積，使血竇“毛細管化”。目前認為貯脂細胞(Fat-Storicg Cells；FSCs)是Disse腔中膠原蛋白的主要來源。為弄清復方鱉甲軟肝片抗纖維化的作用及其機理，本實驗在CCL4損傷性纖維化中，研究復方鱉甲軟肝片對FSCs I、III型膠原mRNA表達的影響。
實驗動物體重180-200g，因本動物實驗周期長達6-8個月；雌性大鼠在發(fā)情期及孕哺期機體內(nèi)分泌系統(tǒng)改變，影響藥物療效的觀察，則選用雄性S.D大鼠(中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)。二級Wistar大鼠質(zhì)量合格證，證號京動管質(zhì)字(1994)第032號。
研證藥材為華星藥廠研制的復方鱉甲軟肝片，每片含生藥量0.46克。
動物模型制備(1)、以35mg/100ml的苯巴比妥鈉溶液代替常水，喂飼動物10天。(2)、以鼠體重(0.15ul/g體重)增減確定給予四氯化碳量，每周一次，每次最大量不超過250ul。
隨機分6個組，每組16只大鼠。
(1)、復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.25g/kg，相當成人4倍(鼠0.25g/kg體重，人0.061g/kg體重)，飲常水。
(2)、復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，相當成人8倍，飲常水。
(3)、復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組給CCL4三個月，形成肝纖維化后，每日飼料同加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，飲常水。
(4)、肝安干糖漿14.4g/kg組給CCI4，每日在飼料內(nèi)加肝安干糖漿14.4g/kg，相當成人15倍(鼠14.4g/kg體重，人0.96g/kg體重)。飲常水。肝安干糖漿為支鏈氨基酸配制而成的干糖漿制劑，含有三種氨基酸，其成份是L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-纈氨酸，其藥理作用1、可增加血中支鏈氨基酸，改善氨基酸失衡，對肝錯迷有蘇醒和預防作用。2、可促進蛋白質(zhì)合成，降低蛋白質(zhì)分解，有利于肝細胞的再生和修復。適用于肝性腦病，肝硬化及慢性活動性肝炎，慢性遷延性肝炎等的治療和預防，用法每次1袋，每日3次，規(guī)格每袋14.5g(24.48％)(每袋含三種氨基酸總量為3.55g)。因該藥成分中不含有復方鱉甲軟肝片的成分，并獲遼寧衛(wèi)藥(88)2263-61號，故選為陽性對照藥物。
(5)、四氯化碳模型組給CCL4，喂固本飼料，飲常水。
(6)、正常對照組不給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg(按生藥量計算)，飲常水。
驗證藥物的配制將復方鱉甲軟肝片藥粉70g(1g藥粉相當含生藥1.40g)加面粉3000g混勻，加蜂蜜，用壓丸機，壓出2000丸涼干，每丸含復方鱉甲軟肝片生藥50mg；晨起喂飼大鼠(喂飼空腹大鼠，因空腹大鼠急于進食，故很快先把藥丸吞食，待觀察大鼠吃盡丸藥后，再給固體飼料，以保證受試藥物不受損失)。
驗證方法1、FSCs純化分離阻斷組治療6個月，治療組投藥3個月。動物在0.3％戊巴比妥鈉麻醉下，剖腹，門靜脈插管，按Friedman等分離FSCs的方法，分離，純化FSCs，將獲得純度95％以上的FSCs。
2、核酸探針及地高標記α2(I)cDNA、α1(III)cDNA及GAP cDNA由中國預防醫(yī)學中心勞動衛(wèi)生與職業(yè)病研究所惠贈。按Dig-DNA Labeling and Detecteon kit(Boehringer Mannheim)說明書標記探針。標記的探針濃度為52ng/ul。
3、DNA-RNA斑點雜交用異硫酸胍法提取FSCs中總RNA。RNA純度OD260/OD280為1.8。將變性處理的RNA以10xSSC PH7.0，等濃度稀釋后，點樣于NC膜上，按Sambrook等方法雜交，洗膜，最后按Dig-DNA Labeing and Detection kit方法，免疫顯色。
4、核酸原位雜交①、組織切片制備新鮮肝組織經(jīng)液氮速凍，恒冷冰凍連續(xù)切片，分別貼附于-氨丙基三乙氧硅烷(3-Amino Proyl-Triethoxysilane，APES)處理的載玻片上，4％多聚甲醛固定20min，PBS浸洗后逐級乙醇脫水。
②、雜交前預處理0.03％H2O2(甲醇)浸20min，PBS浸洗后乙醇脫水，5mM MgCL210m in，0.2NHCL20min，2xSSC-5mM EDTA50℃30min，蛋白酶水解(1ug/ml)-PBSPH7.4，37℃15min；0.5％甘氨酸(PBS PH7.4)10min；4％多聚甲醛固定30min，5mMMgCL2浸洗15min。
③、預雜交滴加預雜交液(5xDenbardt’s液2ml，葡聚糖硫酸0.5；血清DNA 5mg，tRNA2.5mg，甲酰胺5ml，4xssc 3ml)200ul，4℃孵育20min。
④、雜交用預雜交液稀釋α1(III)及GAP Dig-CDNA為35pg/ul，65℃熱變性，退火，42℃過夜。
⑤、雜交后處理6xssc-45％甲酰胺浸洗30min。2xssc浸洗30min，按Dig-DNALabeling and Detection kit說明，行免疫顯色，蘇木素10秒，漂洗、脫色、透明、封膠固定。
驗證結(jié)果1、斑點雜交結(jié)果各組動物FSCs提取的總RNA經(jīng)甲醛變性后，以5ug點樣于NC模上與Dig-α1(III)cDNA，Dig-α2(I)cDNA及Dig-GAP cDNA作，斑點密度掃描統(tǒng)計見表1。表1，復方鱉甲軟肝片對FSCsα2(I)、α1(III)mRNA水平的影響mRNA水平 (X±S)n6 α2(I) α1(III)GAP正常對照組 6 1.3382±0.24931.6531±0.4062.1236±0.6247CCL4模型組 6 23.4988±3.2864 17.0025±4.8634 3.2114±0.912240.25g/kg阻斷組 6 4.3101±1.12574.8642±0.8796 2.6831±0.42210.5g/kg阻斷組6 4.6432±0.91365.2831±1.2333 2.8937±0.89220.5g/kg治療組6 11.2431±2.6753 7.4323±2.11896 2.1432± 0.9128肝安干糖漿組 6 16.1823±3.5896 8.4932±3.0241 3.3812±1.1241表1示CCL4模型組與各組相比，無論α2(I)或α1(III)mRNA水平顯著差異(p＜0.05)；復方鱉甲軟肝片與肝安組相比，均有顯著差異(p＜0.05)，各組GAPmRNA水平均有相比，差異不顯著(p＞0.05)。
2、原位雜交結(jié)果各組動物肝冰凍切片分別與Dig-α2(I)cDNA、Dig-α1(III)cDNA及Dig-GAPcDNA探針進行原位雜交，且CCL4模型匯管區(qū)α1(III)mRNA、α2(I)mRNA比正常對照明顯增高，以α2(I)mRNA顯著增高為特點，雜交顆粒主要集中于Disse腔周壁的間質(zhì)細胞漿內(nèi)或核周圍。不同動物組間雜交顆粒密度有一定差異。
FSCs是近年來日益受到重視的一種肝臟非實質(zhì)細胞，在肝纖維化形成和發(fā)展中起重要作用。多數(shù)學者利用該細胞進行抗肝纖維化機理的研究。
本文目的是觀察復方鱉甲軟肝片對CCL4損傷性肝纖維化中、FSCs α2(I)及α1(III)mRNA表達的影響。在CCL4模型中，斑點雜交表明α2(I)mRNA的表達水平比正常對照顯著增高，尤其是α2(I)mRNA表達水平增高17.56倍(P＜0.01)，說明肝纖維化時FSCs中I型膠原mRNA過量表達，這結(jié)果與已有報道一致。
原位雜交表明CCL4模型組α2(I)mRNA水平及α1(III)mRNA過量表達，以α2(I)mRNA為突出，且不同組間雜交顆粒密度有一定差異。提示轉(zhuǎn)錄水平的差異性。我們過去的研究已證明復方鱉甲軟肝片確有抗肝纖維化作用，促進膠原酶活力增強，溶解或吸收已形成的肝纖維化；抑制FSCs增殖和膠原蛋白的合成，阻斷肝纖維化的形成。本研究進一步表明復方鱉甲軟肝片對FSCs α2(I)mRNA的表達有較強的抑制作用，與CCL4模型組比較，復方鱉甲軟肝片阻斷組α2(I)mRNA水平分別降低了81.7％和80.3％(P＜0.01)；而復方鱉甲軟肝片治療組則降低了52.2％(P＜0.05)。提示在肝纖維化形成階段，復方鱉甲軟肝片可能有效地抑制FSCsα2(I)mRNA的高水平表達，對已形成肝纖維化的α2(I)mRNA高水平表達有一定程度的抑制作用。
總之，復方鱉甲軟肝片具有抵制FSC α2(I)mRNA高水平表達，減少I型膠原的過量合成，阻斷纖維化的發(fā)展的功效。
三、中藥復方鱉甲軟肝片對貯脂細胞增殖及合成膠原蛋白的影響肝纖維化是以Disse腔中大量膠原蛋白沉積為特點的，目前認為貯脂細胞(Fat-St oring Cells；FSCs)是Disse腔中膠原蛋白的主要來源，故應(yīng)觀察復方鱉甲軟肝片對FSCs增殖及合成膠原蛋白的影響。
實驗動物體重180-200g，因本動物實驗周期長達6-8個月；雌性大鼠在發(fā)情期及孕哺期機體內(nèi)分泌系統(tǒng)改變，影響藥物療效的觀察，則選用雄性S.D大鼠(中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)。二級Wistar大鼠質(zhì)量合格證，證號京動管質(zhì)字(1994)第032號。
驗證藥材為華星藥廠研制的復方鱉甲軟肝片，每片含生藥量0.46克。
動物模型制備以35mg/100ml的苯巴比妥鈉溶液代替常水，喂飼動物10天；以鼠體重(0.15μl/g體重)增減確定給予四氯化碳量，每周一次，每次最大量不超過250μl。
隨機分6個組，每組16只大鼠。
(1)、復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，相當成人4倍(鼠0.25g/kg體重，人0.061g/kg體重)，飲常水。
(2)、復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，相當成人8倍，飲常水。
(3)、復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組給CCL4三個月，形成肝纖維化后，每日飼料同加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，飲常水。
(4)、肝安干糖漿14.4g/kg組給CCI4，每日在飼料內(nèi)加肝安干糖漿14.4g/kg，相當成人15倍(鼠14.4g/kg體重，人0.96g/kg體重)。飲常水。肝安干糖漿為支鏈氨基酸配制而成的干糖漿制劑，含有三種氨基酸，其成份是L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-纈氨酸，其藥理作用1可增加血中支鏈氨基酸，改善氨基酸失衡，對肝錯迷有蘇醒和預防作用。2可促進蛋白質(zhì)合成，降低蛋白質(zhì)分解，有利于肝細胞的再生和修復。適用于肝性腦病，肝硬化及慢性活動性肝炎，慢性遷延性肝炎等的治療和預防，用法每次1袋，每日3次，規(guī)格每袋14.5g(24.48％)(每袋含三種氨基酸總量為3.55g)。因該藥成分中不含有復方鱉甲軟肝片的成分，并獲遼寧衛(wèi)藥(88)2263-61號，故選為陽性對照藥物。
(5)、四氯化碳模型組給CCL4，喂固本飼料，飲常水。
(6)、正常對照組不給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg(按生藥量計算)，飲常水。
驗證藥物的配制將復方鱉甲軟肝片藥粉70g(1g藥粉相當含生藥1.40g)加面粉3000g混勻，加蜂蜜，用壓丸機，壓出2000丸涼干，每丸含復方鱉甲軟肝片生藥50mg；晨起喂飼大鼠(喂飼空腹大鼠，因空腹大鼠急于進食，故很快先把藥丸吞食，待觀察大鼠吃盡丸藥后，再給固體飼料，以保證受試藥物不受損失)。
驗證方法阻斷組治療6個月，治療組投藥3個月后，部分動物在0.3％戊巴比妥鈉麻醉下，剖腹，門靜脈插管，按Friedman等分離FSC的方法，分離，純化FSC，將獲得純度95％以上的FSCs，懸浮于199完全培養(yǎng)基中，以1×106cells/ml，接種在35mm培養(yǎng)板中，每孔1.5ml，置36.5℃，濕度96％，5％CO2的培養(yǎng)箱中行原代培養(yǎng)，按時換液。FSCs特點是在光鏡下胞漿有大量脂滴，紫外光328nm照射下，細胞呈蘭綠色自發(fā)光，Desmin染色陽性。
1、貯脂細胞增殖的測定利用3H-胸腺嘧啶脫氧核苷(3H-TdR，原子能研究院產(chǎn)品)摻入量，測定FSCs增殖程度。FSCs原代培養(yǎng)48小時后，脈沖加入3H-TdR(1.0μci/ml)培養(yǎng)18小時，終止摻入，將FSCs轉(zhuǎn)移到醋酸纖維膜上，用β-液爍測cpm，以cpm/well表示DNA復制。
2、脯氨酸及羥脯氨酸的測定利用3H-脯氨酸(3H-Pro，原子能研究院產(chǎn)品)3H羥脯氨酸(3H-HPro)分別摻入膠原和非膠原蛋白的合成過程，觀察膠原與非膠原合成情況，將FSCs原代培養(yǎng)48小時后，脈沖加入3H-Hpro(10.0μci/ml)培養(yǎng)18小時，終止摻入。收集培養(yǎng)液和細胞。用10％TCA沉淀蛋白質(zhì)。采用Rojkind以等方法分離3H-Rro及3H-HPro，經(jīng)β-液閃測cpm；用Cesoar方法測每孔細胞中DNA量。以cpm/μgDNA和cpm/well表示3H-HPro不同水平的摻入量。
數(shù)據(jù)處理采用t檢驗，--上述所有數(shù)據(jù)均為三復數(shù)平均數(shù)。
1、復方鱉甲軟肝片對FSCs增殖的影響CCL4模型組與各組相比，F(xiàn)SCs增殖明顯增高(P＜0.01)；各組間相比，復方鱉甲軟肝片0.25g/kg及0.5g/kg阻斷組對FSCs抑制程度明顯，分別降低了87.5％和88.4％(P＜0.01)；而復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組僅降低了52.2％(P＜0.05)。
2、復方鱉甲軟肝片對FSCs合成膠原的影響見表1。
表1 復方鱉甲軟肝片對FSCs合成膠原的影響膠原量X+S(X104cpm/μgDNA) X±S(X103cpm/well)CCL4模型組(N＝4) 8.2556±1.94312.1365±1.2637復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組(n＝4) 4.2824±1.36104 6.2688±0.96746肝安干糖漿組(n＝4) 4.2632±1.5109 4.8921±0.6125正常對照組(n＝4)2.007±1.00432.9215±0.1123復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組(n＝4) 3.5501±0.9639 2.634±0.2213復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組(n＝4) 3.7706±1.2367 2.2468±0.2825表1示CCL4模型組與各組相比，F(xiàn)SCs合成膠原能力明顯增強(P＜0.05)；各組相比復方鱉甲軟肝片0.25g/kg和0.5g/kg阻斷組FSCs合成膠原能力降低2.235和2.189倍(P＜0.01)，而復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組及肝安組分別高于阻斷組1.206和1.316倍(P＜0.05)。
3、復方鱉甲軟肝片對FSCs合成非膠原蛋白影響見表2。
表2 復方鱉甲軟肝片對FSCs合成非膠原蛋白的影響非膠原量X+S(X104cpm/μgDNA) X±S(X103cpm/well)CCL4模型組(N＝4) 8.9429±0.51745.2905±0.6814復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組(n＝4) 3.61413±0.9628 5.2905±0.6814肝安干糖漿組(n＝4) 4.6732±1.02454.8921±0.8632正常對照組(n＝4)3.1632±1.12874.6042±1.2175復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組(n＝4) 3.7591±1.33032.2907±0.4728復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組(n＝4) 3.61413±1.36104 2.15356±0.2216
表2示CCL4模型組與各組相比，F(xiàn)SCs合成非膠原蛋白能力明顯增強(P＜0.05)；各組間相比復方鱉甲軟肝片阻斷組FSCs合成非膠原蛋白能力明顯降低(P＜0.05)。
本實驗結(jié)果表明各不同組對FSCs增殖的影響各不同，以復方鱉甲軟肝片阻斷組的抑制作用最強，而肝安組及復方鱉甲軟肝片治療組較弱；對正常對照組沒有表現(xiàn)出抑制或促進作用。這種對FSCs的增殖影響的不同，提示復方鱉甲軟肝片對暫時性活化的FSCs增殖抑制較強，即對肝纖維化形成初期的抑制作用較強，對持久性活化的FSCs增殖抑制較弱，則對已形成的肝纖維化的抑制作用較弱。
我們在cpm/μgDNA及cpm/well二個不同水平來反映各組對FSCs合成膠原蛋白的不同影響作用，即對單個FSCs合成膠原蛋白的影響及對FSCs總體合成膠原蛋白總量的影響證實，復方鱉甲軟肝片阻斷組對FSCs合成膠原及非膠原蛋白有較強的抑制作用；肝安組及復方鱉甲軟肝片治療組的抑制作用較弱，且復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組在cpm/μgDNA及cpm/well二個水平上表現(xiàn)不一致的作用見(表1)。因該中藥對已形成肝纖維化的FSCs增殖抑制較弱，盡管可減少cpm/μgDNA水平FSCs合成膠原量，但是FSCs總數(shù)沒有明顯減少，使cpm/well水平膠原合成總量增高。
總之，本實驗證實了復方鱉甲軟肝片確有抗肝纖維化作用，主要對肝纖維化形成早期階段、抑制FSCs增殖、減少膠原蛋白的合成、降低膠原蛋白在Disse腔過量沉積、對已形成的肝纖維化亦有一定的改善作用，是值得推廣，進一步加以驗證。
四、復方鱉甲軟肝片對膠原代謝的影響實驗實驗動物體重180-200g，因本動物實驗周期長達6-8個月；雌性大鼠在發(fā)情期及孕哺期機體內(nèi)分泌系統(tǒng)改變，影響藥物療效的觀察，則選用雄性S.D大鼠(中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)。二級Wistar大鼠質(zhì)量合格證，證號京動管質(zhì)字(1994)第032號。
驗證藥材為華星藥廠研制的復方鱉甲軟肝片，每片含生藥量0.46克。
動物模型制備以35mg/100ml的苯巴比妥鈉溶液代替常水，喂飼動物10天；以鼠體重(0.15μl/g體重)增減確定給予四氯化碳量，每周一次，每次最大量不超過250μl。
隨機分6個組，每組16只大鼠。
(1)、復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.25g/kg，相當成人4倍(鼠0.25g/kg體重，人0.061g/kg體重)，飲常水。
(2)、復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，相當成人8倍，飲常水。
(3)、復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組給CCL4三個月，形成肝纖維化后，每日飼料同加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg，飲常水。
(4)、肝安干糖漿14.4g/kg組給CCI4，每日在飼料內(nèi)加肝安干糖漿14.4g/kg，相當成人15倍(鼠14.4g/kg體重，人0.96g/kg體重)。飲常水。肝安干糖漿為支鏈氨基酸配制而成的干糖漿制劑，含有三種氨基酸，其成份是L-異亮氨酸，L-亮氨酸，L-纈氨酸，其藥理作用1、可增加血中支鏈氨基酸，改善氨基酸失衡，對肝錯迷有蘇醒和預防作用。2、可促進蛋白質(zhì)合成，降低蛋白質(zhì)分解，有利于肝細胞的再生和修復。適用于肝性腦病，肝硬化及慢性活動性肝炎，慢性遷延性肝炎等的治療和預防，用法每次1袋，每日3次，規(guī)格每袋14.5g(24.48％)(每袋含三種氨基酸總量為3.55g)。因該藥成分中不含有復方鱉甲軟肝片的成分，并獲遼寧衛(wèi)藥(88)2263-61號，故選為陽性對照藥物。
(5)、四氯化碳模型組給CCL4，喂固本飼料，飲常水。
(6)、正常對照組不給CCL4，每日在飼料內(nèi)加復方鱉甲軟肝片0.5g/kg(按生藥量計算)，飲常水。
驗證藥物的配制將復方鱉甲軟肝片藥粉70g(1g藥粉相當含生藥1.40g)加面粉3000g混勻，加蜂蜜，用壓丸機，壓出2000丸。
檢測指標中藥治療前后均分別采血，同時剖腹行部分肝切除。分離血清，-20℃保存，做如下指標的測定血清中I、III型膠原水平，膠原酶活力及計算I/III型膠原值；肝組織中I、III型膠原含量，膠原酶活力及計算I/III型膠原值。
實驗方法(1)、血清膠原測定采用Rennard等的ELISA方法。I、III型多克隆抗體(中國預防醫(yī)學科學院勞動衛(wèi)生與職業(yè)研究所提供)。
(2)、肝組織膠原測定將肝組織37℃烤干，稱取等量肝組織，0.5m醋酸抽提，6000g，4℃離心一小時，取上清，測A260及A280值，以1.45A260-0.74A260，得出蛋白量，據(jù)ELISA法測出I、III型膠原量，即可得出每毫克肝組織蛋白中膠原的含量。
(3)、膠原酶活力測定采用胡柴玲等方法，略做改進。
a、純化膠原酶(Sigma)用SepharexG-200(Sigma)層析，在278nm消光系數(shù)為1.76，分子量為80-90KD。
b、制備膠原酶底物用NaB3H4(Boston)標記鼠尾膠，制成3H-鼠尾膠，用0.05MTris-0.05MCaCL2緩沖液稀釋底物至0.2％。
c、膠原酶測定取肝懸液(1mg濕肝/ml)及血清各100μl，加0.1％胰蛋白酶10μl，37℃孵育100min，加5mM馬來亞基酰胺100μl加3H-鼠尾膠1ml，37℃孵育20小時，用0.5％BSA及2％TcA沉淀鼠尾膠，4℃放置30min，15600g，4℃離心30min，上清液移入5ml閃爍瓶中，行β-液閃爍計數(shù)。全部實驗數(shù)據(jù)采用3復數(shù)均數(shù)。
驗證結(jié)果
1、復方鱉甲軟肝片對血清I、III型膠原改變的影響見表1。
表1，復方鱉甲軟肝片對血清I、III型膠原的影響I型膠原量(ng/ml) III型膠原量(ng/ml)用藥前用藥后 用藥前 用藥后CCL4模型組(N＝11) 92.7±21.6 314.6±53.4△△ 118.26±33.6 168.5±42.6正常對照組(N＝11) 112.6±26.3 108.4±14.8**136.43±26.5 142.5±28.4肝安干糖漿組(N＝11) 101.3±32.4 246.4±46.1△△ 132.22±41.7 148.2±36.2復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組(N＝11) 232.4±28.6 189.7±26.2△* 153.30±18.7 160.3±45.3復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組(N＝11) 108.7±29.3 139.6±23.7**128.45±28.4 136.6±24.1復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療阻(N＝11) 116.8±13.4 141.3±32.6 133.68±31.7 128.7±24.8△用藥前后相比P＜0.05，△△P＜0.01，*與CCL4模型組相比P＜0.05，**P＜0.01表1示復方鱉甲軟肝片0.25g/kg、0.5g/kg阻斷組與CCL4模型組相比I型膠原分別減少55.6％和55.1％(P＜0.01)；肝安組及模型組I型膠原分別高于治療前2.4和3.4倍(P＜0.01)；0.5g/kg治療組反減少40％(P＜0.05)。對III型膠原無顯著改變。
2、復方鱉甲軟肝片對肝組織I、III型膠原的影響見表2。
表2，復方鱉甲軟肝片對肝組織I、III型膠原影響I型膠原量(μg/mg肝臟蛋白) III型膠原量(μg/mg肝臟蛋白)用藥前 用藥后 用藥前用藥后CCL4模型組(N＝11) 2.573±0.324 13.298±2.814 2.893±0.502 8.112±2.136正常對照組(N＝11) 2.783±0.361 2.914±0.1322.934±0.214 2.973±0.232肝安干糖漿組(N＝11) 2.627±0.296 8.734±1.4312.741±0.223 5.542±2.103復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組(N＝11) 2.714±0.326 5. 326±1.418 2.684±0.367 6.924±1.857復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組(N＝11) 2.688±0.217 6.134±1.2112.789± 0.418 6.642±2.114復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療阻(N＝11) 12.378±3.251 8.394±1.9228.892±2.146 7.301±2.462表2示肝安組，CCL4模型I型膠原量顯著增高，分別為用藥前3.39和5.17倍(P＜0.01)，復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療組減少32.2％；與CCL4模型組相比0.5g/kg治療組，0.25g/kg及0.5g/kg阻斷組分別減少36.9％、59.95％和53.9(P＜0.05)。III型膠原略增高，與模型組相比無差異。
3、復方鱉甲軟肝片對血清及肝組織中I/III型膠原值的影響見表3。
表3，復方鱉甲軟肝片對血清及肝組織中I/III型膠原值的影響血清中膠原I/III值肝組織中膠原I/III值動物數(shù)治療前治療后 動物數(shù) 用藥前用藥后CCL4模型組11 0.784±0.156 1.879±0.3256 0.899±0.635 1.728±0.324正常對照組 11 0.825±0.211 0.806±0.1726 0.969±0.207 0.951±0.316肝安干糖漿組 11 0.776±0.189 1.682±0.3486 1.045±0.421 1.623±0.214復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組 11 1.523±0.231 1.217±0.1856 1.392±0.146 1.309±0.317復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組11 0.846±0.178 1.022±0.2566 0.886±0.312 1.047±0.236復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療阻11 0.874±0.216 1.089±0.2466 0.924±0.218 1.134±0.223表3示肝安組及CCL4模型組明顯高于治療前，大于1.5(P＜0.05)；0.5g/kg治療組與CCL4模型組相比可降低膠原I/III值；余者均小于1.5(P＜0.05)。
4、復方鱉甲軟肝片對肝組織膠原酶活力的影響見表4。
表4、復方鱉甲軟肝片對肝組織膠原酶活力的影響膠原酶活力(IU/mg濕肝)動物數(shù) 用藥前 用藥后CCL4模型組 924.5±1.22 13.9±0.31正常對照組 11 23.7±0.41 25.4±0.23肝安干糖漿組11 26.0±1.91 20.7±0.4復方鱉甲軟肝片0.25g/kg阻斷組12 16.3±0.72 24.7±0.34復方鱉甲軟肝片0.5g/kg阻斷組 12 24.7±0.51 49.3±1.23復方鱉甲軟肝片0.5g/kg治療阻 922.4±0.32 43.5±1.71表4示治療后復方鱉甲軟肝片0.25g/kg及0.5g/kg阻斷組膠原酶活力增高101.2％和94.2％(P＜0.01)；10.5g/kg治療組增高51.5％(P＜0.05)，而CCL4模型組及肝安組分別降低43.3％(P＜0.01)和20.4％(P＜0.05)。
關(guān)于復方鱉甲軟肝片的藥效學研究已證明，該藥可減輕肝組織內(nèi)炎癥反應(yīng)和肝細胞壞死，抑制纖維增生，本實驗結(jié)果進一步表明，復方鱉甲軟肝片對CCL4損傷性肝纖維化有明確的抗肝纖維作用。其中，阻斷組系肝纖維化尚未完全形成，即給中藥治療6個月，發(fā)現(xiàn)肝組織、血清中膠原含量沒有明顯增高，尤以I型膠原沒有增高為特點，使血清、肝組織中膠原I/III值在1上下；而治療組是在肝纖維化完全形成后給藥治療3上月發(fā)現(xiàn)肝組織及血清中膠原量較治療前或模型組有不同程度的降低，且主要是促進I型膠原的降低，使膠原I/III值由治療前1.392和1.523降為1.309和1.217；使I/III值沒有大于1.5，說明復方鱉甲軟肝片不僅可使纖維化形成減少，也可使形成肝纖維化溶解吸收，從而起到抗纖維化作用。
復方鱉甲軟肝片抗肝纖維作用機理，一方面是保護肝細胞，減輕炎癥反應(yīng)，而抑制膠原增生；另一方面影響膠原代謝，主要在肝纖維化形成階段，增強膠原酶活力，促使新增生膠原降解，尤其是粗膠原纖維，即I型膠原的降解；同時可抑制貯脂細胞增殖及膠原蛋白合成，減少I型膠原mRNA量，從而抑制膠原增生，使肝組織和血清中I/III值處于正常范圍內(nèi)，阻斷、延緩肝纖維化形成。
本實驗表明血清和肝組織原水平有較好的一致性，提示血清膠原水平及I/III值變化可間接反映肝組織中的改變。
總之，復方鱉甲軟肝片對肝纖維化形成階段的膠原代謝有顯著的影響作用，對已形成的纖維化有溶解、吸收作用。阻斷、延緩肝纖維化的發(fā)展，因而有較好的抗纖維化作用。
五、復方鱉甲軟肝片對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響實驗采用生化免疫方法，觀察該藥對小鼠腹腔巨噬細胞特異吞噬功能作用的影響。巨噬細胞是體內(nèi)具有吞噬、殺菌、抗腫瘤、抗原提呈及輔佐免疫功能的細胞，測定巨噬細胞特異吞噬功能是研究藥物對機體免疫系統(tǒng)影響的重要指標之一。
實驗材料1、昆明種小鼠，雌雄各半，體重18-20g，由中國醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，三級KM小鼠質(zhì)量合格證，證號京動管質(zhì)字(1994)第029號。
2、5％雞紅細胞(CRBC)用肝素抗凝法采集一份一年齡以內(nèi)公雞血，置四份(V/V)的阿氏液中、4℃冰箱存放備用，最好用新鮮懸液。
3、復方鱉甲軟肝片由華星制藥廠提供，每片含生藥0.46g。
4、Hank′s液NaCI 8.000gNa2HPO4.12H200.134gKCI 0.400gKH2PO40.060gCaCI20.140gNaHCO20.350gMgSO4.7H20 0.200gGIucose 1.000g溶于1000ml雙蒸水中。
5、阿氏液
無水葡萄糖 2.05gNacl0.42g檸檬酸鈉(Na3C6H5O7) 0.80g溶于100ml雙蒸水中。
6、1/15M磷酸緩沖液7、肝素液濃度為500μ/ml驗證方法(1)、實驗小白鼠分為兩組，正常對照組和復方鱉甲軟肝片治療組。
(2)、將復方鱉甲軟肝片碾成細粉，用注射水配成混懸液，濃度為0.2g/ml，對治療組小鼠灌胃，給藥劑量為5g/kg/d，每天1次，連續(xù)給藥7天。
(3)、實驗前吸取CRBC儲存液1ml，加Hank′s至5ml，離心(1000轉(zhuǎn)/分，5′)去除紅細胞外的有形成份。通常洗兩次。第二次離心2000轉(zhuǎn)5′，以細胞壓積方法計算，(用Hank，s稀釋成5％V/V即為CRBC懸液)。
(4)、將配好的CRBC懸液0.3ml注入小鼠腹腔，2.5-3小時后脫頸處死，消毒后剪開腹部皮膚，經(jīng)腹膜注入Hank′s液2-3ml，輕揉動物腹部，使之充分洗涮腹腔內(nèi)的巨噬細胞，然后自腹部中央剪一小孔，用滴管吸取腹腔細胞液約2ml(盡量多吸)，于刻度離心管中，離心1000轉(zhuǎn)，5′，棄去上清液，然后再加Hank′s(或生理鹽水)2ml混勻滴片。
(5)、每鼠滴片兩張，每片滴懸液不少于0.5ml(以免巨噬細胞數(shù)量不足)，在37℃培養(yǎng)箱溫育30-50，蒸餾水沖洗玻片細胞滴液，保留玻片貼壁細胞。
(6)、待玻片風干，以甲醇固定5′，選用姬姆薩稀釋液(磷酸緩沖液與染液10∶1)，邊染邊在鏡下觀察，一般20′左右。
(7)、在蒸餾水沖洗下分化數(shù)秒種，濾紙吸干多余染液，鏡下觀察染色程度，蘭色表示分化不夠，再用蒸餾水沖洗，待細胞核鏡下呈紫色為宜。
(8)、標本完全涼干后，用二甲苯透明十幾秒鐘，立刻用加拿大樹膠封片。
(9)、鏡下看染色標本。
(10)、計算巨噬細胞吞噬率和吞噬指數(shù)。
實驗結(jié)果觀察復方鱉甲軟肝片對小鼠腹腔巨噬細胞特異吞噬功能的影響，比較給藥組與正常組小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞吞噬力的差別，判斷標準采用吞噬率和吞噬指數(shù)的高低，結(jié)果見表1-2。
表1、復方鱉甲軟肝片對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能的影響組別 鼠號 吞噬率(％)X±SD(％)12.027.0正常對照組32.0 5.0±3.5411.053.0128.0212.0藥物治療組311.014.0±7.0417.059.067.0表1結(jié)果說明，正常小鼠腹腔巨噬細胞對雞紅細胞吞噬率為5.0％；而復方鱉甲軟肝片治療組吞噬率為14.0％，比正常對照組平均提高9.0％，說明復方鱉甲軟肝片確有促使小鼠腹腔巨噬細胞特異吞噬功能，增強機體免疫力的作用。
表2 給藥組與正常組吞噬指數(shù)的比較組別 鼠數(shù)(只)吞噬指數(shù)提高(％)正常對照組5 1.08藥物治療組6 1.156.5表2結(jié)果說明，正常對照組巨噬細胞巨噬指數(shù)為1.08，而藥物組為1.15，提高吞噬指數(shù)6.5％，表明給藥后的小鼠腹腔巨噬細胞吞噬力加強。
驗證結(jié)果1、通過小鼠腹腔巨噬細胞特異吞噬功能的測定，治療組小鼠平均腹腔巨噬細胞對雞紅細胞吞噬率為14.0％，而正常組小鼠吞噬率為5.0％，復方鱉甲軟肝片組吞噬率提高9.0％。說明復方鱉甲軟肝片有促巨噬細胞特異吞噬作用。
2、從巨噬細胞吞噬指數(shù)來看，給藥組為1.15，而正常組為1.08，平均提高指數(shù)6.5％，進一步證明復方鱉甲軟肝片確實具有促進巨噬細吞噬功能，增強機體免疫機能的作用。
3、結(jié)果證明，復方鱉甲軟肝片“增強機體免疫機能”的臨床功效與本實驗結(jié)論相吻合。
六、復方鱉甲軟肝片對大鼠急性肝損傷保護作用的實驗本實驗以CCL4制造大鼠肝損傷實驗動物模型，而后設(shè)置復方鱉甲軟肝片不同劑量組給予灌胃治療，測血清轉(zhuǎn)氨酶，根據(jù)降酶情況評價本藥抗急性肝損傷的治療效果。
實驗動物純種大鼠，大鼠體重180-200g，雌雄各半，由中國科學院實驗動物中心供給，二級Wistar大鼠質(zhì)量合格證證號京動管質(zhì)字(1994)第032號。符合國際動物標準。
驗證藥材為華星藥廠研制的復方鱉甲軟肝片，每片含生藥量0.46克；四氯化碳(CCL4)分析純，北京化工廠生產(chǎn)；液體石蠟醫(yī)用，撫順市制藥廠；注射用水由本院動物實驗中心提供；Photometer 4010型生化分析儀。
動物模型制備8％CCL41.8ml/kg體重(用液體石蠟配制)，給大鼠皮下注射致大鼠急性肝損傷，6小時后可作為急性肝損傷動物模型，供實驗用。
隨機分5組(一)正常對照組16只大鼠，不給CCL4，給注射用水2ml灌胃一日二次(其余給常規(guī)飼料)，共48小時。
(二)模型對照組20只大鼠，給CCL4，6小時造成模型后，給注射用水2ml灌胃一日二次(其余給常規(guī)飼料)，共48小時。
(三)治療組設(shè)三個劑量組(0.5g/kg/d，1.5g/kg/d，5.0g/kg/d)，每組9只大鼠，給CCL46小時后將已用研缽研成細粉的復方鱉甲軟肝片，按每克藥粉相當含生藥1.40克計算，根據(jù)每公斤體重每天三個不同劑量組的50％，以2ml注射用水溶解，一日二次，分別給三個劑量治療組大鼠灌胃(其余給常規(guī)飼料)，共48小時。
檢測方法48小時終止治療后，五組皆股動脈取血，由本實驗室用photometer4010型生化分析儀，檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，以光密度值(OD)表示。
實驗結(jié)果為了觀察和比較復方鱉甲軟肝片對實驗性大鼠急性肝損傷治療效果，測定48小時治療組和對照組血清轉(zhuǎn)氨酶含量變化，對復方鱉甲軟肝片降酶效果進行觀察。見下表。
表一復方鱉甲軟肝片對實驗性大鼠急性肝損傷保護(降酶)作用結(jié)果組別鼠數(shù)(只) 光密度(OD) 為模型的(％)正常對照組 16 0.152±0.029 ----
模型對照組 200.385±0.135 100小劑量組0.5g/kg/d 9 0.282±0.94 73.25中劑量組1.5g/kg/d 9 0.335±0.112 87.12大劑量組5.0g/kg/d 9 0.315±0.112 81.82結(jié)果說明1、以模型對照組轉(zhuǎn)氨酶光密度值(OD)為100％，復方鱉甲軟肝片小、中、大劑量組轉(zhuǎn)氨酶水平分別降低了26.75％，12.88％和18.18％。
2、為了評價復方鱉甲軟肝片劑量與降酶效果的關(guān)系，將三個劑量組分別與模型對照組實驗數(shù)據(jù)以及各劑量組之間做顯著性計算，結(jié)果小劑量組、大劑量組與模型組相比，p＜0.01和0.05。小劑量組降酶水平非常顯著，大劑量組顯著，中劑量組與大劑量組無統(tǒng)計學差別處于同等水平，所以三個劑量組均有降酶作用。
3、復方鱉甲軟肝片對CCL造成的大鼠急性肝損傷有保護作用，轉(zhuǎn)氨酶的下降率約13-27％。
4、本動物實驗結(jié)果與我們臨床應(yīng)用有極好療效相一致，初步證實復方鱉甲軟肝片不僅有抗肝纖維化作用，還具有抗肝損傷，保護肝功能作用，因此，是治療慢性乙型肝炎肝纖維化及早期肝硬變的有效藥物。
七、復方鱉甲軟肝片抗鴨乙型肝炎病毒的效果觀察實驗采用一日齡北京鴨，靜脈感染鴨乙型肝炎病毒，7天后給復方鱉甲軟肝片，觀察藥物對鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)的影響。實驗共設(shè)計四個劑量組0.0536g/kg/d；0.268g/kg/d；1.0g/kg//d；4.0g/kg/d組，共10天。
材料和方法(一)藥物復方鱉甲軟肝片粉劑(1g含生藥1.40g)，本院華星藥廠提供。批號930206，陽性藥物無環(huán)鳥苷(ACV)，湖北科益公司購入。
(二)病毒鴨乙型肝炎病毒，鴨乙型肝炎病毒DNA(DHBV-DNA)血清，-70℃保存，由中國醫(yī)學科學院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所提供。
(三)動物1日齡北京鴨，體重80-100g，購自北京蓮花池鴨場。
(四)試劑32P-dcTP購自北京福瑞生物工程公司，缺口翻譯藥合購自普洛麥格公司(Promega Co.)；Sephadex G-50；FicoII PVP購自瑞典Pharmacia公司；SDS為西德Merok公司產(chǎn)品；魚精蛋白DNA；牛血清白蛋白為中國科院生物物理所產(chǎn)品；硝酸纖維素膜(0.45μm)為Amersham公司產(chǎn)品。
(五)實驗方法
1.鴨乙型肝炎病毒感染1日齡北京鴨，經(jīng)靜脈感染DHBV-DNA陽性血清，0.2ml/只，感染7天后，分離血清，-70℃保存待檢。
2.藥物治療DHBV感染北京鴨7天后，按體重隨機分組，每組6-7只，設(shè)病毒對照組(DHBV)，以生理鹽水代替藥物，陽性藥物組用無環(huán)鳥苷，灌胃給藥200mg/kg/d，2次/天，10天，治療組分4個劑量(按含生藥量)，0.0536g/kg/d；0.268g/kg/d；1.0g/kg//d；4.0g/kg/d，灌胃，2次/天，1ml/次(將藥用生理鹽水稀釋為1ml，內(nèi)含不同濃度)，共10天。分別于感染后7天即用藥前(T0)，用藥后5天(T5)和停藥后3天(T10)和停藥后3天(P3)，自鴨腿靜脈取血，分離血清，-70℃保存待檢。
3.檢測方法按缺口翻譯試劑盒說明，采用32P標記DHBV-DNA探針，做鴨血清斑點雜交。放射自顯影膠片斑點，用酶標檢測儀測定OD值(濾光片為490nm)，計算血清DHBV-DNA密度，以雜交斑點OD值作為標本DHBV-DNA水平值。
(六)藥效計算計算每組鴨不同時間血清DNA OD值(X±SD)，并將給藥后不同時間(T5，T10)和停藥后(P3)血清DHBV-DNA水平與同組給藥前(T0)OD值比較，用配對t檢驗，計算p值，分析差異的顯著性，觀察藥物對病毒感染的抑制率(％)。
將給藥后治療組不同時間DHBF-DNA抑制率，分別與病毒對照組相同時間DHBV-DNA抑制率比較，采用成組t檢驗計算P值，分析差異的顯著性，判斷藥效。
實驗結(jié)果1.1日齡北京鴨感染DHBV后7天，治療組及病毒對照組感染鴨血清DHBV-DNA全部呈陽性。病毒對照組13只鴨感染后20天內(nèi)，除第一批第10天和第二批停藥后3天血清DHBV-DNA有明顯的波動外，其余不同時間均未見明顯的變化，為自然波動。
2.實驗選用4個劑量組，0.0536g/kg/d；0.268g/kg/d；1.0g/kg//d；4.0g/kg/d組。首先將給藥第5天、第10天和停藥后3天的OD值與給藥前OD值進行自身比較。除0.0536g/kg/d組未見明顯的抑制作用外(P＞0.05)，其余各劑量組均有明顯的抑制作用。0.268g/kg/d組在給藥后第10天及停藥后3天，鴨血清DHBV-DNA OD值與給藥前比較有明顯的抑制作用，并均有非常顯著性意義(P＜0.01)；1.0g/kg/d組停藥后3天與給藥前比較，抑制作用仍非常顯著(P＜0.01)；4.0g/kg/d組在給藥后5天、10天及停藥后3天與自身給藥前比較，均表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P＜0.05)，見表1。
表1.復方鱉甲軟肝片在鴨體內(nèi)不同時間血清DHBV-DNA OD值鴨數(shù)鴨血清DHBV-DNA 0D值(X±SD)組別(只)T0T5T10P3N.S6 1.09±0.23 1.23±0.17 1.40±0.11* 1.22±0.290.0536g/kg/d 6 1.03±0.37 0.85±0.35 1.00±0.331.19±0.470.268g/kg/d6 1.82±0.29 1.38±0.52 1.15±0.24** 1.10±0.40**N.S7 0.67±0.15 0.67±0.15 0.76±0.211.02±0.07**1.0g/kg/d 6 1.21±0.30 0.98±0.34 0.98±0.420.63±0.30**4.0g/kg/d 6 1.42±0.26 1.10 40.21* 1.05±0.24* 0.99±0.30**N.S6 0.26±0.05 0.22±0.07 0.29±0.060.30±0.10ACV200mg/kg/d 6 0.23±0.03 0.15±0.06* 0.15±0.07* 0.13±0.05**注給藥組各時相DHBV-DNA OD值與病毒對照組各時相DHBR-DNA OD值比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
再將4個劑量組的抑制率與病毒對照組抑制率作成組分析，除0.0536g/kg/d組外，其余3個劑量組仍有顯著性意義，見表2。
表2、復方鱉甲軟肝片治療組與病毒對照組在鴨體內(nèi)對DHBV-DNA的抑制率組別 鴨數(shù) 抑制率(％)(只)T5T10P3病毒對照組 6 -12.80 -28.40-11.900.0536g/kg/d6 17.502.90 15.500.268g/kg/d 6 24.2036.80 39.60*病毒對照組 7 0-13.40-52.20
1.0g/kg/d 6 19.0019.0047.90**4.0g/kg/d 6 22.5026.1030.30**病毒對照組 6 0.20 -0.12-0.15ACV 200mg/kg/d 6 0.35 0.35** 0.43*注給藥組各時相DHBV-DNA抑制率分別與病毒對照組各時相DHBV-DNA抑制率比較，*P＜0.05.**P＜0.01從表2中看出，0.268g/kg/d組在給藥后第10天，停藥后3天對DHBV-DNA都有非常顯著的抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)；1.0g/kg/d組及4.0g/kg/d組在停藥后第3天仍可以看出很強的抑制作用(p＜0.01)。無環(huán)鳥苷200g/kg/d組給藥后第10天和停藥后第3天也有明顯的抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)，未見反跳現(xiàn)象。
在復方鱉甲軟肝片在鴨乙型肝炎病毒感染鴨血清DHBV-DNA治療作用的實驗中，4個劑量組，除最小劑量0.0536g/kg/d組效果不明顯，無統(tǒng)計學意義外，其余劑量組分別在給藥后第5天、10天和停藥后3天表現(xiàn)出明顯的抑制作用，統(tǒng)計學處理結(jié)果為顯著(p＜0.05)或非常顯著(p＜0.01)。值得注意的是，0.268g/kg/d組、1.0g/kg/d組和4.0g/kg/d組在停藥后，對DHBV-DNA沒有出現(xiàn)反跳作用，反而表現(xiàn)出很強的抑制作用，統(tǒng)計學處理非常顯著(p＜0.01)。以上實驗結(jié)果表明，中藥制劑復方鱉甲軟肝片在治療鴨乙型肝炎病毒感染有較好的抑制效果，并表現(xiàn)出持久的抑制病毒作用。
權(quán)利要求
1.復方鱉甲軟肝片的用途，其特征是用于治療慢性乙型肝炎肝纖維化。
2.復方鱉甲軟肝片的用途，其特征是用于治療早期肝硬變。
全文摘要
本發(fā)明為一種復方鱉甲軟肝片的用途,即復方鱉甲軟肝片可用于治療慢性乙型肝炎肝纖維化及早期肝硬變。本發(fā)明在七個方面證明了本復方鱉甲軟肝片具有阻斷肝纖維化的形成、溶解和吸收已形成的肝纖維的作用,有效率為81.67%,治愈率達55.23%。
文檔編號A61P1/16GK1273105SQ0010569
公開日2000年11月15日 申請日期2000年4月18日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月18日
發(fā)明者陳德永, 宋喜秀, 楊永平 申請人:內(nèi)蒙古福瑞制藥有限責任公司