基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物制藥領(lǐng)域，具體提供了一種基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)及其制備方法，用于調(diào)控破骨細(xì)胞功能。本發(fā)明的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、破骨細(xì)胞靶向分子和具有調(diào)控破骨細(xì)胞功能的小核酸藥物。本發(fā)明的遞送系統(tǒng)針對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行靶向，具有較強(qiáng)的專屬性；該遞送系統(tǒng)不僅可防止小核酸藥物被體內(nèi)物質(zhì)降解，還可將小核酸藥物特異性傳遞到靶細(xì)胞中，有利于小核酸藥物調(diào)控破骨細(xì)胞的功能。
【專利說(shuō)明】
基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)及其制備方法，尤其涉及一種基于小核酸 藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨組織吸收是骨組織發(fā)生的基本過(guò)程，破骨細(xì)胞負(fù)責(zé)該功能。在破骨細(xì)胞中，異常 表達(dá)的小核酸會(huì)引起破骨細(xì)胞功能異常，同時(shí)引發(fā)各種骨與關(guān)節(jié)疾病，如：骨質(zhì)疏松癥、骨 壞死和骨硬化疾病等。
[0003] 小核酸可以調(diào)芐基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞功能。近年來(lái)，一系列可調(diào)控破骨細(xì)胞 功能的小核酸被發(fā)現(xiàn)，包括影響破骨細(xì)胞生成、遷移和成熟的miR-29家族、miR-148a和 miR-503等。調(diào)控破骨細(xì)胞小核酸藥物的發(fā)現(xiàn)，使得通過(guò)核糖核酸的阻斷劑和模擬物等技術(shù) 手段，實(shí)現(xiàn)小核酸藥物調(diào)控破骨細(xì)胞功能，進(jìn)行骨治療成為可能。
[0004] 然而，破骨樣細(xì)胞主要分布在骨吸收表面，而且在使用小核酸藥物進(jìn)行治療時(shí)，破 骨樣細(xì)胞是主要的作用靶點(diǎn)，所以特異性靶向骨破壞表面以及破骨樣細(xì)胞尤為重要。
[0005] 據(jù)報(bào)道，骨靶向藥物遞送系統(tǒng)通常由骨靶向分子、脂質(zhì)體材料和小分子藥物/高 分子化合物組成。現(xiàn)有技術(shù)中，中國(guó)2012年12月19日公開的專利CN102824647A報(bào)道了 基于小核酸藥物成骨治療的骨靶向遞送系統(tǒng)，該遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、骨靶向分子和具有 促進(jìn)骨形成功能的小核酸藥物。但是，能夠特異性靶向破骨細(xì)胞的藥物遞送系統(tǒng)目前還未 見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于小核酸藥物的破 骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，所述遞送系統(tǒng)針破骨樣細(xì)胞進(jìn)行靶向，可利用小核酸藥物調(diào)控破骨 細(xì)胞功能，具有較強(qiáng)的專屬性和特異性，
[0007] 與此相應(yīng)，本發(fā)明的另一目的在于提供一種基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向系統(tǒng) 的制備方法。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)包括脂 質(zhì)體、破骨細(xì)胞靶向分子和具有調(diào)控破骨細(xì)胞功能的小核酸藥物。
[0009] 本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)中，破骨細(xì)胞靶向分子連接于脂質(zhì)體表面，小核酸藥物包 封于脂質(zhì)體內(nèi)。小核酸藥物包封在遞送系統(tǒng)中，不僅可防止小核酸藥物被體內(nèi)物質(zhì)降解，還 可作用于靶向目標(biāo)，調(diào)控破骨細(xì)胞生成、遷移和成熟。
[0010] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的優(yōu)選實(shí)施方式，
[0011] 所述破骨細(xì)胞靶向分子為天門冬氨酸多肽重復(fù)序列。
[0012] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述 破骨細(xì)胞靶向分子為8個(gè)天門冬氨酸多肽重復(fù)序列。8個(gè)天門冬氨酸多肽重復(fù)序列如SEQ ID NO: 1所示，具體為：Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp。8個(gè)天門冬氨酸多肽重復(fù)序列 對(duì)骨吸收表面有較高的親和性，因此可通過(guò)它來(lái)靶向破骨樣細(xì)胞，將藥物遞送到破骨細(xì)胞 并調(diào)控其功能。
[0013] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的優(yōu)選實(shí)施方式，所述 小核酸藥物為具有調(diào)控破骨細(xì)胞功能的微小核糖核酸的模擬物和微小核糖核酸的阻斷 劑中的一種或幾種。作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的更優(yōu)選 實(shí)施方式，所述微小核糖核酸的模擬物為miR-21mimic或miR-126-5p mimic ;所述微小 核糖核酸的阻斷劑選自 miR-29 家族、miR_148a antagomir、miR-503、antagomir-214 或 antagomir_2861〇
[0014] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的優(yōu)選實(shí)施方式，所述脂 質(zhì)體含有非陽(yáng)離子脂質(zhì)或者含有陽(yáng)離子脂質(zhì)與非陽(yáng)離子脂質(zhì)的混合物。
[0015] 本發(fā)明模擬細(xì)胞膜的成分，脂質(zhì)體為多種脂質(zhì)的混合物，這樣脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的 親和性更高，本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)更容易將藥物遞送到細(xì)胞內(nèi)。
[0016] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的更優(yōu)選實(shí)施方式，所 述脂質(zhì)體中，陽(yáng)離子脂質(zhì)的質(zhì)量百分比為20~50%，非陽(yáng)離子脂質(zhì)的質(zhì)量百分比為50~ 80% 〇
[0017] 陽(yáng)離子脂質(zhì)為一類帶正電荷的磷脂，非陽(yáng)離子脂質(zhì)包括不帶電荷和帶負(fù)電荷的脂 質(zhì)。此外，脂質(zhì)體中也可含有中性脂質(zhì)膽固醇等輔助脂質(zhì)和/或聚乙二醇（PEG)等修飾劑。
[0018] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的優(yōu)選實(shí)施方式，所 述陽(yáng)離子脂質(zhì)類選自二油酰二甲基銨丙烷（D0DAP)、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)、二 硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC)、二油酰磷脂酰膽堿（DOPC)、 DLin-KC2_DMA (英文表不為 2, 2_di lino ley l-4-dimethy Iaminoethy 1_[1,3] -dioxo lane, 中文表示為：2-二亞油基-4-二甲基氨基乙基-(I，3)-二氧戊環(huán)）、I，2-二油烯氧基-3-三 甲氨基丙烷（DOTAP)、N-[1-(2, 3-二油基氧）丙基]-N，N，N，_氯化三甲銨（DOTMA)中的至 少一種；非陽(yáng)離子脂質(zhì)類選自DC-膽固醇（DC-Chol)、磷脂酰膽堿（PC)、磷脂酰乙醇胺（PE) 中的至少一種。
[0019] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的優(yōu)選實(shí)施方式，所述脂 質(zhì)為帶有甲氧基末端的PEG修飾脂質(zhì)，例如，脂質(zhì)體中的脂質(zhì)為二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的 PEG 化衍生物（DSPE-mPEG)。
[0020] PEG修飾脂質(zhì)體具有水溶性好、毒性低、無(wú)免疫原性等優(yōu)勢(shì)；PEG末端可以進(jìn)行羧 酸、胺或馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)等活性基團(tuán)修飾，便于進(jìn)一步與破骨細(xì)胞靶向分子連接，故PEG修 飾脂質(zhì)適合用作于連接反應(yīng)的起始劑。
[0021] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的優(yōu)選實(shí)施方式，所述脂 質(zhì)體含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-MAL)，末端的活 性馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)有利于在脂質(zhì)體表面進(jìn)行修飾。
[0022] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的優(yōu)選實(shí)施方式，所述破 骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)中，脂質(zhì)體中的脂質(zhì)包括二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬 來(lái)酰亞胺，破骨細(xì)胞靶向分子末端進(jìn)行巰基修飾。破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)中，通過(guò)巰基與馬 來(lái)酰亞胺鍵結(jié)合，靶向分子連接于脂質(zhì)體表面上。破骨細(xì)胞靶向分子末端進(jìn)行巰基修飾，巰 基（-SH)可與脂質(zhì)體中的馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)直接反應(yīng)，這樣破骨細(xì)胞靶向分子不僅可靶向破 骨細(xì)胞，還能直接連接于脂質(zhì)體表面。
[0023] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的優(yōu)選實(shí)施方式，所述 破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)中，破骨細(xì)胞靶向分子與脂質(zhì)體的摩爾比為2 : 100~10 : 100， 小核酸藥物與脂質(zhì)體的脂質(zhì)質(zhì)量比為2%~20%。本發(fā)明的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng) 中，破骨細(xì)胞靶向分子與脂質(zhì)體的摩爾比是通過(guò)HPLC(高效液相色譜）測(cè)試破骨細(xì)胞 靶向分子與脂質(zhì)體連接前、后，游離靶向分子的減少量，從而確定的。小核酸藥物與脂 質(zhì)體脂質(zhì)的質(zhì)量比是經(jīng)Quant-iTTM RiboGreen?:RNA試劑盒檢測(cè)，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè) (D-Asp8)-liposome_miR-148a antagomir 中加入 0· 5%Triton X-100 前后數(shù)值的區(qū)別，進(jìn) 行鑒定的；加入〇· 5% Triton X-100前（Cb)，加入0· 5% Triton X-100后（Ca)，包封率為 (Ca-Cb)/Ca X100 %〇
[0024] 本發(fā)明提供的上述小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的制備方法包括以下步 驟：
[0025] (1)制備空白脂質(zhì)體：將脂質(zhì)溶解于有機(jī)溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑后，加入 綬沖液進(jìn)行水化，采用擠出儀對(duì)多層脂質(zhì)體進(jìn)行擠出，制得空白脂質(zhì)體；
[0026] (2)連接破骨細(xì)胞靶向分子和空白脂質(zhì)體：取破骨細(xì)胞靶向分子與空白脂質(zhì)體混 合，攪拌過(guò)夜進(jìn)行連接反應(yīng)；
[0027] (3)純化以及凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體；
[0028] (4)包封小核酸藥物：將具有調(diào)控破骨細(xì)胞功能的小核酸藥物溶于經(jīng)DEPC處理的 蒸餾水中，加入步驟（3)所得的凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體進(jìn)行水化處理，孵育破骨細(xì) 胞靶向空白脂質(zhì)體與小核酸藥物，制得破骨細(xì)胞靶向小核酸藥物脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。
[0029] 本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的制備方法中，步驟（1)的脂 質(zhì)溶解于有機(jī)溶劑中時(shí)完全溶解即可（每一毫克脂質(zhì)約需要IOml體積的氯仿溶解）。步驟 (3)中，純化步驟（2)所得的含破骨細(xì)胞靶向分子的空白脂質(zhì)體，分離出游離的破骨細(xì)胞靶 向分子后，使用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥純化所得的破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體樣品。
[0030] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的制備方法的優(yōu)選實(shí)施 方式，所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的制備方法包括以下步驟：
[0031] (1)制備空白脂質(zhì)體：將脂質(zhì)溶解于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿后，加入pH為 7. 0~9. 0、濃度為10~50mM的磷酸鹽綬沖液進(jìn)行水化，采用擠出儀對(duì)多層脂質(zhì)體進(jìn)行擠 出，制得空白脂質(zhì)體；
[0032] (2)連接破骨細(xì)胞靶向分子和空白脂質(zhì)體：取破骨細(xì)胞靶向分子與空白脂質(zhì)體混 合，攪拌過(guò)夜進(jìn)行連接反應(yīng)；其中，破骨細(xì)胞靶向分子與空白脂質(zhì)體的摩爾比為：2 : 1~ 10 ： 1 ；
[0033] (3)采用S印harose CL-4B凝膠柱純化以及凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體；
[0034] (4)包封小核酸藥物：將具有調(diào)控破骨細(xì)胞功能的小核酸藥物溶于經(jīng)DEPC處理的 蒸餾水中，加入步驟（3)所得的凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體進(jìn)行水化處理；其中，小核酸 藥物與破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體的比例為：每加入50g小核酸藥物，加入1~I. 2mol凍干 破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體；孵育破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體與小核酸藥物20~40分鐘，制得 破骨細(xì)胞靶向小核酸藥物脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。
[0035] 作為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系的制備方法的更優(yōu)選實(shí) 施方式，所述步驟（1)中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)于40°C水浴中進(jìn)行；步驟（1)中每稱取Img脂質(zhì)時(shí)，加 入IOmL緩沖溶液；所述步驟⑵中，破骨細(xì)胞靶向分子與空白脂質(zhì)體的摩爾比為3 : 1;步 驟（2)中破骨細(xì)胞靶向分子與空白脂質(zhì)體混合、進(jìn)行連接反應(yīng)的溫度為4°C，攪拌的速度為 60~120轉(zhuǎn)/分鐘；所述步驟（3)中，純化過(guò)程中采用的流動(dòng)相選用PH為7. 0~9. 0、濃度 為10~50mM磷酸鹽綬沖液，所述步驟（4)中，加入的小核酸藥物與破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì) 體的優(yōu)選比例為：每加入50g小核酸藥物，加入Imol凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體；小核 酸藥物的包封率為80%以上；步驟（4)中孵育破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體與小核酸藥物的優(yōu) 選方式為：于100轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行混勻，常溫下反應(yīng)40分鐘。
[0036] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明脂質(zhì)體中含有多種脂質(zhì)的混合物，脂質(zhì)體與細(xì)胞膜 的親和性更高，本發(fā)明的靶向遞送系統(tǒng)更容易被人吸收。本發(fā)明的破骨細(xì)胞靶向分子不僅 可靶向破骨細(xì)胞，靶向分子上用基團(tuán)進(jìn)行修飾，還可有利于其連接于脂質(zhì)體上。
[0037] 本發(fā)明通過(guò)將破骨細(xì)胞的靶向分子、調(diào)控破骨細(xì)胞功能的小核酸藥物和脂質(zhì)體連 接，提供了一種基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)及其制備方法。本發(fā)明主要針對(duì) 破骨樣細(xì)胞進(jìn)行靶向，具有較強(qiáng)的專屬性；本發(fā)明提供的基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向 遞送系統(tǒng)不僅可防止小核酸藥物被體內(nèi)物質(zhì)降解，還可將小核酸藥物特異性傳遞到靶細(xì)胞 中，有利于小核酸藥物調(diào)控破骨細(xì)胞的功能。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1 :為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的制備過(guò)程示意 圖；
[0039] 圖2a_2b :為本發(fā)明驗(yàn)證破骨細(xì)胞靶向分子連接到脂質(zhì)體表面的高效液相色譜 圖；
[0040] 圖3a_3c :為本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的粒徑分布以 及在體外血漿中穩(wěn)定性測(cè)試的結(jié)果圖；
[0041] 圖4 :為在體內(nèi)各器官骨靶向性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，攜帶FAM熒光標(biāo)記的基于小核酸藥物 的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)以及對(duì)照組的熒光強(qiáng)度活體成像圖；
[0042] 圖5a_5f :為FAM熒光標(biāo)記的小核酸藥物和相應(yīng)抗體（OSCAR)標(biāo)記破骨細(xì)胞的免 疫組分析結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0043] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但不以任何的方式限制本發(fā)明的有效范圍。
[0044] 實(shí)施例中，破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的制備過(guò)程如圖1所示。下述實(shí)施例制得的破 骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)中，破骨細(xì)胞靶向分子（D-AspS)-SH與脂質(zhì)體中的所含有二硬脂酰磷 脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺，通過(guò)巰基與馬來(lái)酰亞胺鍵的結(jié)合，靶向分子連接 于脂質(zhì)體表面；小核酸藥物均包封于脂質(zhì)體內(nèi)。
[0045] 實(shí)施例的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)中，破骨細(xì)胞靶向分子與脂質(zhì)體的摩爾比是通 過(guò)HPLC(高效液相色譜）測(cè)試破骨細(xì)胞靶向分子與脂質(zhì)體連接前、后，游離靶向分子的減 少量，從而確定的。小核酸藥物與脂質(zhì)體脂質(zhì)的質(zhì)量比是經(jīng)Quant-iTTM RiboGreen?. RNA試劑盒檢測(cè)，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)（D-Asp8)-liposome_miR-148a antagomir中加入0· 5% Triton X-IOO前后數(shù)值的區(qū)別，進(jìn)行鑒定的；加入(λ 5% Triton X-IOO前（Cb)，加入(λ 5% Triton Χ-100 后（Ca),包封率為（Ca-Cb)/Ca X 100 %。
[0046] 實(shí)施例中，制備空白脂質(zhì)體時(shí)，每稱取Img脂質(zhì)（指脂質(zhì)總量）時(shí)，加入IOmL緩沖 溶液進(jìn)行水化。
[0047] 實(shí)施例中，脂質(zhì)體-(miR_148a antagomir)指的是由脂質(zhì)體與微小核糖核酸阻斷 劑miR-148a antagomir按照本發(fā)明方法組成的系統(tǒng)，即先按照本發(fā)明方法制備空白脂質(zhì) 體，再按照本發(fā)明方法孵育空白脂質(zhì)體與miR-148a antagomir,將miR-148a antagomir包 封于脂質(zhì)體內(nèi)。
[0048] 實(shí)施例1
[0049] 本發(fā)明基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述 基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、末端進(jìn)行巰基修飾的8個(gè)天門冬 氨酸多肽重復(fù)序列（(D-Asp8)-SH)和微小核糖核酸的阻斷劑miR-148a antagomir;其中， 脂質(zhì)體由以下質(zhì)量百分比的脂質(zhì)組成：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰 亞胺（DSPE-PEG-MAL)5%、l，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷（D0TAP)15%、DC-膽固醇 (DC-Chol) 50%、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE) 15%和二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇 2000 (DSPE-PEG2000) 15 %。本實(shí)施例的靶向遞送系統(tǒng)中，（D-Asp8) -SH與脂質(zhì)體的摩爾比為 2 : 100,微小核糖核酸阻斷劑miR-148a antagomir與脂質(zhì)體的質(zhì)量比為10%, miR-148a antagomir在含脂質(zhì)體中的包封率達(dá)到80%。
[0050] 本實(shí)施例所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)采用以下方法制備而成， 制備過(guò)程示意圖如圖1所示：
[0051] (1)制備空白脂質(zhì)體：將由以下質(zhì)量百分比組成的脂質(zhì)：二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-MAL) 5 %、1，2-二油烯氧基-3-三甲氨基丙烷 (DOTAP) 15%、DC-膽固醇（DC-Chol)50%、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE) 15%和二硬脂酰基 磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000) 15%，完全溶解于氯仿中，于40°C水浴中旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿后，加入PH為7.0、濃度為30mM的磷酸鹽綬沖液進(jìn)行水化，采用擠出儀對(duì)多 層脂質(zhì)體進(jìn)行擠出，制得空白脂質(zhì)體；
[0052] (2)連接破骨細(xì)胞靶向分子和空白脂質(zhì)體：于4°C溫度下，將濃度為lmg/ml的末端 進(jìn)行巰基修飾的8個(gè)天門冬氨酸多肽重復(fù)序列（(D-AspS)-SH)與步驟（1)所得空白脂質(zhì)體 以3 : 1摩爾比混合，以60轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌過(guò)夜，連接（D-Asp8) -SH與空白脂質(zhì)體，得 到（D-Asp8)-SH革巴向空白脂質(zhì)體（表示為（D-Asp8)-脂質(zhì)體）；
[0053] (3)純化以及凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體：以pH為7. 0、濃度為30mM的磷酸鹽 綬沖液作流動(dòng)相，用Sepharose CL-4B凝膠柱純化上述步驟（2)所得（D-Asp8)-SH革巴向空 白脂質(zhì)體，分離出游離的（D_Asp8) -SH，用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥純化所得的（D-Asp8) -SH靶 向空白脂質(zhì)體；
[0054] (4)包封小核酸藥物：稱取微小核糖核酸阻斷劑miR_148a antagomir,將 miR-148a antagomir溶于經(jīng)DEPC處理的蒸饋水中，加入凍干的（D-Asp8)-脂質(zhì)體進(jìn)行水 化（miR_148a antagomir與（D_Asp8)_脂質(zhì)體的比例為：每加入50g miR_148a antagomir， 加入I. lm〇l(D-Asp8)-脂質(zhì)體），以100轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌混勻，孵育35min，制得破骨 細(xì)胞靶向小核酸藥物脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)（該遞送系統(tǒng)表示為：(D-AspS)-脂質(zhì)體-miR-148a antagomir)ο
[0055] 實(shí)施例2
[0056] 本發(fā)明基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞祀向遞送系統(tǒng)的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述基 于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、末端進(jìn)行巰基修飾的8個(gè)天門冬氨酸 多肽重復(fù)序列（(D-AspS)-SH)和微小核糖核酸的阻斷劑。其中，脂質(zhì)體由以下質(zhì)量百分比 的脂質(zhì)組成：二油酰二甲基銨丙烷（DODAP) 10%、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE) 10%、二硬脂 酰磷脂酰膽堿（DSPC) 15%、DC-膽固醇（DC-Chol)60%和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二 醇2000-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-MAL)5% ;微小核糖核酸的阻斷劑由miR-29a、miR-29b和 miR-29c組成，miR-29a、miR-29b和miR-29c質(zhì)量百分比分別為30%、30%、40%。本實(shí)施 例的靶向遞送系統(tǒng)中，（D-AspS)-SH與脂質(zhì)體的摩爾比為10 : 100,微小核糖核酸阻斷劑與 脂質(zhì)體的質(zhì)量比為2%，微小核糖核酸阻斷劑在脂質(zhì)體中的包封率為80%。
[0057] 本實(shí)施例所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)采用以下方法制備而成， 制備過(guò)程示意圖如圖1所示：
[0058] (1)制備空白脂質(zhì)體：將由以下質(zhì)量百分比組成的脂質(zhì)：二油酰二甲基銨丙 烷（DODAP)IO%、二油酰磷脂酰乙醇胺（D0PE)10%、二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC)15%、 DC-膽固醇（DC-Chol) 60 %、和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺 (DSPE-PEG-MAL) 5 %，完全溶解于氯仿中，于40°C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿后，加入PH為 8. 0、濃度為IOmM的磷酸鹽綬沖液進(jìn)行水化，采用擠出儀對(duì)多層脂質(zhì)體進(jìn)行擠出，制得空白 脂質(zhì)體；
[0059] (2)連接破骨細(xì)胞靶向分子和空白脂質(zhì)體：于4°C溫度下，將末端進(jìn)行巰基修飾的 8個(gè)天門冬氨酸多肽重復(fù)序列（(D-AspS)-SH)與步驟（1)所得空白脂質(zhì)體以10 : 1摩爾比 混合，以120轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌過(guò)夜，連接（D-Asp8)-SH與空白脂質(zhì)體，得到（D-Asp8)-SH 靶向空白脂質(zhì)體（表示為（D-AspS)-脂質(zhì)體）；
[0060] (3)純化以及凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體：以pH為8. 0、濃度為IOmM的磷酸鹽 綬沖液作流動(dòng)相，用Sepharose CL-4B凝膠柱純化上述步驟（2)所得（D-Asp8)-SH革巴向空 白脂質(zhì)體，分離出游離的（D_Asp8) -SH，用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥純化所得的（D-Asp8) -SH靶 向空白脂質(zhì)體；
[0061] (4)包封小核酸藥物：稱取微小核糖核酸的阻斷劑，微小核糖核酸的阻斷劑由質(zhì) 量百分比分別為30 %、30 %、40 %的miR-29a、miR-29b和miR-29c組成；將微小核糖核酸 的阻斷劑溶于經(jīng)DEPC處理的蒸餾水中，加入凍干的（D-AspS)-脂質(zhì)體進(jìn)行水化（微小核 糖核酸的阻斷劑與（D-AspS)-脂質(zhì)體的比例為：每加入50g微小核糖核酸的阻斷劑，加入 I. 2mol (D-Asp8)-脂質(zhì)體），以100轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌混勻，孵育20min，制得破骨細(xì)胞靶 向小核酸藥物脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。
[0062] 實(shí)施例3
[0063] 本發(fā)明基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述基 于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、末端進(jìn)行巰基修飾的8個(gè)天門冬氨酸 多肽重復(fù)序列（(D-AspS)-SH)和微小核糖核酸的阻斷劑。其中，脂質(zhì)體由以下質(zhì)量百分比 的脂質(zhì)組成：1，2-二油烯氧基_3_二甲氨基丙烷（DOTAP) 5 %、N-[l_(2, 3-二油基氧）丙 基]-^-氯化三甲銨（0(^嫩）10%、磷脂酰膽堿（?〇50%、0(：-膽固醇（0(：-〇1〇1)30% 和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-MAL)5% ;微小核糖核 酸的阻斷劑由質(zhì)量百分比分別為50%、50%的antagomir-214和antagomir-2861組成。本 實(shí)施例的靶向遞送系統(tǒng)中，（D-AspS)-SH與脂質(zhì)體的摩爾比為5 : 100,微小核糖核酸阻斷 劑與脂質(zhì)體的質(zhì)量比為20%，微小核糖核酸阻斷劑在脂質(zhì)體中的包封率為80%。
[0064] 本實(shí)施例所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)采用以下方法制備而成， 制備過(guò)程示意圖如圖1所示：
[0065] (1)制備空白脂質(zhì)體：將由以下質(zhì)量百分比組成的脂質(zhì)：1，2_二油烯氧基-3-三 甲氨基丙烷（DOTAP) 5%、N-[1-(2, 3-二油基氧）丙基]-N，N，N，_氯化三甲銨（DOTMA) 10%、 磷脂酰膽堿（PC) 50%、DC-膽固醇（DC-Chol)30%和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-MAL)5%，完全溶解于氯仿中，于40°C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯 仿后，加入PH為9. 0、濃度為50mM的磷酸鹽綬沖液進(jìn)行水化，采用擠出儀對(duì)多層脂質(zhì)體進(jìn)行 擠出，制得空白脂質(zhì)體；
[0066] (2)連接破骨細(xì)胞靶向分子和空白脂質(zhì)體：于4°C溫度下，將末端進(jìn)行巰基修飾的 8個(gè)天門冬氨酸多肽重復(fù)序列（(D-AspS)-SH)與步驟（1)所得空白脂質(zhì)體以6 : 1摩爾比 混合，以90轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌過(guò)夜，連接（D-Asp8) -SH與空白脂質(zhì)體，得到（D-Asp8) -SH 靶向空白脂質(zhì)體（表示為（D-AspS)-脂質(zhì)體）；
[0067] (3)純化以及凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體：以pH為9. 0、濃度為50mM的磷酸鹽 綬沖液作流動(dòng)相，用Sepharose CL-4B凝膠柱純化上述步驟（2)所得（D-Asp8)-SH革巴向空 白脂質(zhì)體，分離出游離的（D_Asp8) -SH，用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥純化所得的（D-Asp8) -SH靶 向空白脂質(zhì)體；
[0068] (4)包封小核酸藥物：稱取微小核糖核酸的阻斷劑，微小核糖核酸的阻斷劑由質(zhì) 量百分比分別為50%、50%的311丨38〇111；[1-214和311丨380111；[1-2861組成 ；將微小核糖核酸 的阻斷劑溶于經(jīng)DEPC處理的蒸餾水中，加入凍干的（D-AspS)-脂質(zhì)體進(jìn)行水化（微小核 糖核酸的阻斷劑與（D-AspS)-脂質(zhì)體的比例為：每加入50g微小核糖核酸的阻斷劑，加入 Imol (D-Asp8)-脂質(zhì)體），以100轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌混勻，孵育40min，制得破骨細(xì)胞靶向 小核酸藥物脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。
[0069] 實(shí)施例4
[0070] 本發(fā)明基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的一種實(shí)施例，本實(shí)施例所述基 于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、末端進(jìn)行巰基修飾的8個(gè)天門冬氨酸 多肽重復(fù)序列（(D-Asp8)-SH)和微小核糖核酸的模擬物miR-21mimic。其中，脂質(zhì)體由以 下質(zhì)量百分比的脂質(zhì)組成：DC-膽固醇（DC-Chol)50%、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE) 15%、 二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC) 15%、二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC) 15%和二硬脂酰磷脂酰乙 醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-MAL)5%。本實(shí)施例的靶向遞送系統(tǒng)中， (D-Asp8)-SH與脂質(zhì)體的摩爾比為3 : 100，miR-21mimic與脂質(zhì)體的質(zhì)量比為8%，其在脂 質(zhì)體中的包封率為80%。
[0071] 本實(shí)施例所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)采用以下方法制備而成， 制備過(guò)程示意圖如圖1所示：
[0072] (1)制備空白脂質(zhì)體：將由以下質(zhì)量百分比組成的脂質(zhì)：DC-膽固醇 (DC-Chol) 50 %、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE) 15 %、二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC) 15 %、二 棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC) 15 %和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺 (DSPE-PEG-MAL) 5 %，完全溶解于氯仿中，于40°C水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿后，加入PH為 7. 0、濃度為30mM的磷酸鹽綬沖液進(jìn)行水化，采用擠出儀對(duì)多層脂質(zhì)體進(jìn)行擠出，制得空白 脂質(zhì)體；
[0073] (2)連接破骨細(xì)胞靶向分子和空白脂質(zhì)體：于4°C溫度下，將末端進(jìn)行巰基修飾的 8個(gè)天門冬氨酸多肽重復(fù)序列（(D-AspS)-SH)與步驟（1)所得空白脂質(zhì)體以2 : 1摩爾比 混合，以60轉(zhuǎn)/分鐘的速度攪拌過(guò)夜，連接（D-Asp8) -SH與空白脂質(zhì)體，得到（D-Asp8) -SH 靶向空白脂質(zhì)體（表示為（D-AspS)-脂質(zhì)體）；
[0074] (3)純化以及凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體：以pH為7. 0、濃度為30mM的磷酸鹽 綬沖液作流動(dòng)相，用Sepharose CL-4B凝膠柱純化上述步驟（2)所得（D-Asp8)-SH革巴向空 白脂質(zhì)體，分離出游離的（D_Asp8) -SH，用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥純化所得的（D-Asp8) -SH靶 向空白脂質(zhì)體；
[0075] (4)包封小核酸藥物：稱取微小核糖核酸的模擬物miR-21mimic，將其溶于經(jīng)DEPC 處理的蒸饋水中，加入凍干的（D-Asp8)-脂質(zhì)體進(jìn)行水化（miR-21mimic與（D-Asp8)-脂質(zhì) 體的比例為：每加入50g miR-21mimic，加入Imol (D-Asp8)-脂質(zhì)體），以100轉(zhuǎn)/分鐘的速 度攪拌混勻，孵育30min，制得破骨細(xì)胞靶向小核酸藥物脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。
[0076] 實(shí)施例5
[0077] 本實(shí)施例采用高效液相色譜法（HPLC)驗(yàn)證破骨細(xì)胞靶向分子連接到脂質(zhì)體表 面。
[0078] 本實(shí)施例中，基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)按照本發(fā)明的方法制備， 制備方法包括以下步驟（為方便定量檢測(cè)，在反應(yīng)前將D-Asp8-SH配制成lmg/ml) :
[0079] (1)制備空白脂質(zhì)體：將脂質(zhì)（所述脂質(zhì)中陽(yáng)離子脂質(zhì)的質(zhì)量百分比為20~ 50%，非陽(yáng)離子脂質(zhì)的質(zhì)量百分比為50~80% ;并且脂質(zhì)中包含二硬脂酰磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇2000-馬來(lái)酰亞胺（DSPE-PEG-MAL))完全溶解于有機(jī)溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去 有機(jī)溶劑后，加入綬沖液進(jìn)行水化，采用擠出儀對(duì)多層脂質(zhì)體進(jìn)行擠出，制得空白脂質(zhì)體；
[0080] (2)連接破骨細(xì)胞革巴向分子和空白脂質(zhì)體：將濃度為lmg/ml的末端進(jìn)行巰基修飾 的8個(gè)天門冬氨酸多肽重復(fù)序列（(D-AspS)-SH)與步驟（1)所得空白脂質(zhì)體混合，攪拌過(guò) 夜，連接（D-Asp8)-SH與空白脂質(zhì)體；
[0081] (3)純化以及凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體：純化上述步驟（2)所得（D-AspS)-SH 靶向空白脂質(zhì)體，分離出游離的（D-Asp8) -SH，用冷凍干燥機(jī)冷凍干燥純化所得的 (D-Asp8)-SH革巴向空白脂質(zhì)體（該脂質(zhì)體表示為（D-Asp8)-脂質(zhì)體）；
[0082] (4)包封小核酸藥物：稱取微小核糖核酸阻斷劑miR_148a antagomir，將 miR-148a antagomir溶于經(jīng)DEPC處理的蒸饋水中，加入凍干的（D-Asp8)-脂質(zhì)體進(jìn)行水 化，攪拌混勻，孵育，制得破骨細(xì)胞靶向小核酸藥物脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)（該遞送系統(tǒng)表示為： (D_Asp8)-脂質(zhì)體-miR_148a antagomir)。
[0083] 分別測(cè)試lmg/ml (D_Asp8) -SH與本發(fā)明的空白脂質(zhì)體連接前、后的高效液 相色譜色譜圖。高效液相色譜的條件為：色譜柱=Kromasil 100-5C18色譜柱，規(guī)格： 4.6_^15〇111111，顆粒尺寸54 111;柱溫：351：;流動(dòng)相為0.1%三氟乙酸水溶液與0.1%三氟乙 酸乙腈溶液，0. 1 %三氟乙酸水溶液與0. 1 %三氟乙酸乙腈溶液的初始體積比為90 : 10,十 分鐘后，0.1 %三氟乙酸水溶液與0.1 %三氟乙酸乙腈溶液的體積比為70 : 30 ;洗脫方式： 梯度洗脫；流速：流速I. 〇ml/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm。
[0084] 高效液相色譜法驗(yàn)證破骨細(xì)胞祀向分子鏈接到脂質(zhì)體表面的結(jié)果如圖2所示。圖 2中，圖2a表示濃度為lmg/ml的（D-Asp8)-SH與脂質(zhì)體連接前的色譜圖；圖2b表示濃度 為lmg/ml的（D-Asp8)-SH與脂質(zhì)體連接后的色譜圖。結(jié)果表明，（D-Asp8)-SH的出峰時(shí)間 為t = 8. 8min ;連接反應(yīng)后，（D-Asp8)-SH的峰面積減小，可見（D-Asp8)-SH濃度降低。-SH 會(huì)與DSPE-PEG-MAL表面的馬來(lái)酰亞胺鍵結(jié)合，故（D-Asp8) -SH連接在DSPE-PEG-MAL上，導(dǎo) 致（D-Asp8)-SH濃度降低。
[0085] 實(shí)施例6
[0086] 測(cè)試本發(fā)明所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的的粒徑分布以及其 在體外血楽中的穩(wěn)定性；其中，測(cè)試的遞送系統(tǒng)中的小核酸藥物為miR-148a antagomir，穩(wěn) 定性的測(cè)試方式為：采用瓊脂糖膠進(jìn)行檢測(cè)是否存在miR-148a antagomir。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3所示。圖3中，圖3a為所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的的粒徑分布圖；圖 3b為所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)在體外血漿中的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果圖； 圖3c為游離的微小核糖核酸阻斷劑miR-148a antagomir在體外血楽中的穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果 圖。
[0087] 結(jié)果表明，所述靶向遞送系統(tǒng)粒徑均值為150nm ;所述靶向遞送系統(tǒng)在血漿中24h 后仍能測(cè)得miR-148a antagomir，但游離的miR-148a antagomir在血楽中Ih后不能檢測(cè) 至LU由此可見，遞送系統(tǒng)能對(duì)miR-148a antagomir起到保護(hù)作用，免受血楽中降解酶的降 解作用。
[0088] 實(shí)施例7
[0089] 測(cè)試在體內(nèi)各器官骨靶向性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，攜帶FAM熒光標(biāo)記的基于小核酸 藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)和對(duì)照組的熒光強(qiáng)度活體成像圖；其中，（D-AspS)-脂 質(zhì)體-(miR-148a antagomir)為本發(fā)明的革El向遞送系統(tǒng)，對(duì)照組為游離的miR-148a antagomir、In vivo jetPEI-(miR_148a antagomir)、月旨質(zhì)體-(miR_148a antagomir)系 統(tǒng)。In vivo jetPEI 購(gòu)買于 Polyplus-transfection 公司，In vivo jetPEI-(miR_148a antagomir)按照 Polyplus-transfection 公司提供的 DNA&siRNA Delivery ProtocolQn vivo-jetPEI DNA&RNA遞送系統(tǒng)制備方法）制得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。
[0090] 結(jié)果表明，在心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織中，對(duì)于FAM標(biāo)記的基于小核酸藥 物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，其小核酸藥物的熒光強(qiáng)度較FAM標(biāo)記的對(duì)照組弱，而在骨組 織中的熒光強(qiáng)度較其他組強(qiáng)。由此，可以表明（D-AspS)-SH靶頭的存在可幫助miR-148a antagomir遞送到骨組織上，而規(guī)避其他組織，達(dá)到靶向骨組織的效果。
[0091] 實(shí)施例8
[0092] 測(cè)試分析FAM熒光標(biāo)記的小核酸藥物和相應(yīng)抗體（OSCAR)標(biāo)記破骨細(xì)胞的免疫 組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5a_5f所示。圖5a、5b、5c表示脂質(zhì)-miR_148a antagomir組，圖5d、5e、 5f表示本發(fā)明的革巴向遞送系統(tǒng)：（D-Asp8)-脂質(zhì)體-(miR_148a antagomir)。圖5a、5d為 OSCAR標(biāo)記破骨細(xì)胞，圖5b、5e為FAM熒光標(biāo)記的小核酸藥物；圖5c、5f為OSCAR和FAM與 DAPI (4'，6_二脒基-2-苯基吲哚）結(jié)合。
[0093] 結(jié)果表明，（D-Asp8)_脂質(zhì)體攜帶的miR_148a antagomir的綠色突光與破 骨樣細(xì)胞的紅色熒光有很好的重合，重合機(jī)率大于不含靶頭的脂質(zhì)體攜帶的miR-148a antagomir，因不含祀頭的脂質(zhì)體攜帶的miR-148a antagomir綠色突光與破骨樣細(xì)胞與破 骨樣細(xì)胞的紅色熒光沒(méi)有重合；由此可見，（D-AspS)-脂質(zhì)體具有細(xì)胞選擇性，有利于小核 酸革G向遞送到破骨樣細(xì)胞。DAPI突光染色進(jìn)一步證明miR-148a antagomir的綠色突光與 破骨樣細(xì)胞的紅色熒光出現(xiàn)的地方確實(shí)存在細(xì)胞，而非背景影響，證實(shí)含（D_Asp8) -SH靶 頭的脂質(zhì)體具有細(xì)胞選擇性，有利于小核酸靶向遞送到破骨細(xì)胞。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，其特征在于：所述基于小核酸藥物的破 骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)包括脂質(zhì)體、破骨細(xì)胞靶向分子和具有調(diào)控破骨細(xì)胞功能的小核酸藥 物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，其特征在于：所 述脂質(zhì)體中，陽(yáng)離子脂質(zhì)的質(zhì)量百分比為20~50%，非陽(yáng)離子脂質(zhì)的質(zhì)量百分比為50~ 80% 〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，其特征在于：所 述破骨細(xì)胞靶向分子為天門冬氨酸多肽重復(fù)序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，其特征在于：所 述破骨細(xì)胞靶向分子為8個(gè)天門冬氨酸多肽重復(fù)序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，其特征在于：所 述小核酸藥物為具有調(diào)控破骨細(xì)胞功能的微小核糖核酸的模擬物和微小核糖核酸的阻斷 劑中的一種或幾種。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，其特征在于：所 述微小核糖核酸的模擬物為miR-21mimic或miR-126-5p mimic ;所述微小核糖核酸的阻斷 劑選自 miR-29 家方矣、miR_148a antagomir、miR-503、antagomir-214 或 antagomir-2861 〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，其特征 在于：所述破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)中，脂質(zhì)體中含有二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇 2000-馬來(lái)酰亞胺，破骨細(xì)胞靶向分子末端進(jìn)行巰基修飾。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)，其特征在于：所 述破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)中，破骨細(xì)胞靶向分子與脂質(zhì)體的摩爾比為2 : 100~10 : 100， 小核酸藥物與脂質(zhì)體的脂質(zhì)質(zhì)量比為2%~20%。9. 一種如權(quán)利要求1所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的制備方法，其特 征在于：所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的制備方法包括以下步驟： (1) 制備空白脂質(zhì)體：將脂質(zhì)溶解于有機(jī)溶劑中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑后，加入緩沖 液進(jìn)行水化，采用擠出儀對(duì)多層脂質(zhì)體進(jìn)行擠出，制得空白脂質(zhì)體； (2) 連接破骨細(xì)胞靶向分子和空白脂質(zhì)體：取破骨細(xì)胞靶向分子與空白脂質(zhì)體混合， 攪拌過(guò)夜進(jìn)行連接反應(yīng)； (3) 純化以及凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體； (4) 包封小核酸藥物：將具有調(diào)控破骨細(xì)胞功能的小核酸藥物溶于經(jīng)DEPC處理的蒸餾 水中，加入步驟（3)所得的凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體進(jìn)行水化處理，孵育破骨細(xì)胞靶 向空白脂質(zhì)體與小核酸藥物，制得破骨細(xì)胞靶向小核酸藥物脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。10. 如權(quán)利要求9所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的制備方法，其特征 在于：所述基于小核酸藥物的破骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)的制備方法包括以下步驟： (1) 制備空白脂質(zhì)體：將脂質(zhì)溶解于氯仿中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿后，加入pH為7. 0~ 9. 0、濃度為10~50mM的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行水化，采用擠出儀對(duì)多層脂質(zhì)體進(jìn)行擠出，制得 空白脂質(zhì)體； (2) 連接破骨細(xì)胞靶向分子和空白脂質(zhì)體：取破骨細(xì)胞靶向分子與空白脂質(zhì)體混合， 攪拌過(guò)夜進(jìn)行連接反應(yīng)；其中，破骨細(xì)胞靶向分子與空白脂質(zhì)體的摩爾比為：2 : 1~ 10 ： 1 ； (3) 采用Sepharose CL-4B凝膠柱純化以及凍干破骨細(xì)胞革巴向空白脂質(zhì)體； (4) 包封小核酸藥物：將具有調(diào)控破骨細(xì)胞功能的小核酸藥物溶于經(jīng)DEPC處理的蒸餾 水中，加入步驟（3)所得的凍干破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體進(jìn)行水化處理；其中，小核酸藥物 與破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體的比例為：每加入50g小核酸藥物，加入1~1. 2mol凍干破骨 細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體；孵育破骨細(xì)胞靶向空白脂質(zhì)體與小核酸藥物20~40分鐘，制得破骨 細(xì)胞靶向小核酸藥物脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。
【文檔編號(hào)】A61P19/08GK105983102SQ201510063417
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月9日
【發(fā)明人】張保亭, 劉振麗, 黨蕾, 劉進(jìn), 郭保生
【申請(qǐng)人】北京和理咨詢有限公司