專利名稱：用甲基營養(yǎng)酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組莫內(nèi)林的制作方法
根據(jù)美國法典35§119(e)本申請要求以下申請的優(yōu)先權(quán)申請人Lingxun Duan，美國臨時(shí)申請序列號(hào)60/114,529，申請日1998年12月31日，名稱為用甲基營養(yǎng)酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組莫內(nèi)林。
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一個(gè)單鏈的莫內(nèi)林樣蛋白，該蛋白是穩(wěn)定的，且以重量為基礎(chǔ)至少比蔗糖甜100倍。本發(fā)明也涉及編碼所述莫內(nèi)林樣蛋白的核酸。優(yōu)選地，此核酸進(jìn)一步包括一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)信號(hào)序列，該序列在甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris中引導(dǎo)編碼的莫內(nèi)林樣蛋白的表達(dá)和分泌。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一個(gè)含編碼莫內(nèi)林樣蛋白的核酸的重組Pichiapastoris細(xì)胞，一種從重組Pichia pastoris中生產(chǎn)莫內(nèi)林樣蛋白的方法及該方法的產(chǎn)物。
2.背景技術(shù)2.1.莫內(nèi)林莫內(nèi)林屬于來自熱帶植物的高甜蛋白家族(Dansby，自然生物技術(shù)學(xué)，1997，15419-420)。莫內(nèi)林比蔗糖甜大約3,000倍。其它相似的蛋白包括竹芋蛋白、非洲奇果蛋白、馬檳榔甜蛋白、pentadin和阿斯巴甜(Id.)。莫內(nèi)林最先是從西非植物Dioscorephyllum comminisii中分離的(美國專利第3,878,184和3,998,798號(hào)；Morris和Cagan，Biochim.Biophys.Acta，1972，261114-122)。莫內(nèi)林的氨基酸序列、三維結(jié)構(gòu)及各種物理和化學(xué)特性已被確定(Ogata等，自然，1987.328739-742；Morris等，生物化學(xué)雜志，1973.248534-539；Cagan，科學(xué)，1973，18132-35；Bohak和Li，Biochim.Biophys.Acta，1976，427153-170；Hudson和Beeman，Biochem.Biophys.Res.Comm.，1976，71212-220；Van der Wel和Loeve，F(xiàn)EBS Lett.，1973，29181-183；和Frank和Zuber，HoppeSeyler’s Z Physiol.Chem.，1976，357585-592)。
美國專利第4,300,576號(hào)公開了含竹芋蛋白或莫內(nèi)林的煙熏顆粒。美國專利第4,562,076號(hào)公開了包被竹芋蛋白或莫內(nèi)林的口香糖。美國專利第4,412,984號(hào)公開了含竹芋蛋白或莫內(nèi)林的加味增效的口服組合物。然而，盡管其具有低卡路里甜味劑的優(yōu)勢，但由于它對熱和pH的不穩(wěn)定性、獲取供應(yīng)植物來源的缺乏以及作為食品添加劑時(shí)調(diào)配方式的不確定性，使得廣泛地商業(yè)應(yīng)用受到阻礙(Dansby，NatureBiotechnology，1997，15419-420)。
1989年，Sung-Hou Kim研究組報(bào)道通過基因工程在大腸桿菌內(nèi)生產(chǎn)單鏈莫內(nèi)林(Kim等，蛋白工程1989，2571-575)。發(fā)現(xiàn)純化的單鏈莫內(nèi)林對熱更穩(wěn)定并且能耐受較寬的pH范圍，而且保留了甜度。本發(fā)明的數(shù)個(gè)方面已經(jīng)成為某些美國專利的主題。例如，美國專利第5,234,834號(hào)公開了在植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)單鏈莫內(nèi)林的構(gòu)成。美國專利第5,487,923號(hào)公開了分子式為B-C-A的甜蛋白化合物，其中B代表一個(gè)肽部分，與天然莫內(nèi)林B鏈的1-46殘基至少有90％的同一性并僅由保守取代基修飾；C是一個(gè)共價(jià)鍵，或是一個(gè)親水的、生理學(xué)可接受的、能夠提供相當(dāng)于1-10個(gè)氨基酸肽空間長度的共價(jià)連接單元，所選的氨基酸駐留在分子的外部而不干擾天然的構(gòu)型；A代表一個(gè)與天然莫內(nèi)林A鏈的6-45殘基至少90％一致并僅由保守取代基修飾的肽。美國專利第5,487,983號(hào)公開了一個(gè)制造美國專利第5,487,923號(hào)所公開的單鏈莫內(nèi)林的表達(dá)系統(tǒng)。美國專利第5,670,339號(hào)公開了編碼美國專利第5,487,923號(hào)所公開的單鏈莫內(nèi)林的DNA。美國專利第5,672,372號(hào)公開了用美國專利第5,487,923號(hào)所公開的單鏈莫內(nèi)林增加食物復(fù)合物甜味的方法。美國專利第5,264,558號(hào)公開了一個(gè)單鏈莫內(nèi)林蛋白，在標(biāo)準(zhǔn)的味覺測試中，以重量為單位至少是蔗糖的50倍。
最近，Kondo等，自然生物技術(shù)學(xué)，1997，15453-457公開了在念珠屬酵母細(xì)胞內(nèi)單鏈莫內(nèi)林蛋白的異源表達(dá)。它報(bào)道莫內(nèi)林可高水平表達(dá)，穩(wěn)定蛋白占＞50％。
2.2.在PICHIA PASTORIS中異源蛋白的表達(dá)甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris已被用作蛋白表達(dá)系統(tǒng)。此表達(dá)系統(tǒng)的數(shù)個(gè)方面已經(jīng)成為某些美國專利的主題。如，美國專利第4,837,148號(hào)公開了Pichia pastoris的自主復(fù)制序列。美國專利第4,855,231號(hào)公開了在Pichia pastoris細(xì)胞內(nèi)異源基因表達(dá)的調(diào)控區(qū)。美國專利第4,882,279號(hào)公開了Pichia pastoris的位點(diǎn)選擇性基因組修飾。美國專利第4,929,555號(hào)公開了使Pichia pastoris全細(xì)胞處于感受態(tài)以便轉(zhuǎn)化的方法。美國專利第5,122,465號(hào)公開了在Pichia pastoris菌株中產(chǎn)生可選擇表型的步驟。美國專利第5,324,639號(hào)公開了在甲基營養(yǎng)細(xì)胞，包括Pichia pastoris細(xì)胞內(nèi)，胰島素樣生長因子-1的生產(chǎn)。
數(shù)個(gè)信號(hào)序列已被用于引導(dǎo)在Pichia pastoris細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的異源蛋白的分泌。這些信號(hào)序列的實(shí)例包括但不限于，Pichia pastoris酸性磷酸酶的信號(hào)序列、巨曲霉α-帚曲菌素的信號(hào)序列(Martinez-Ruiz等，Protein Expr.Purif.，1998，12(3)315-22；Abdulaev等，ProteinExpr.Purif.，1997，10(1)61-9；Kotake等，J.Lipid Res.，1996，37(3)599-605)、α-t-N-乙酰半乳糖胺酶的信號(hào)序列(alphaNAGAL，EC 3.2.1.49)(Zhu等，Arch.Biochem.Biophys.，1998，352(1)1-8)、OmpA蛋白的信號(hào)肽(Heim等，Biochim.Biophys.Acta.，1998，1396(3)306-19)、鼠α-因子信號(hào)(cCel1)的信號(hào)序列或胡椒內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶的天然信號(hào)序列(Ferrarese等，F(xiàn)EBS Lett.，1998，422(1)23-6)、從木質(zhì)溶解的霉菌Trametes中分離的蟲漆酶的信號(hào)肽(Jonsson等，Curr Genet.，1997，32(6)425-30)、鼠溶酶體酸性α-甘露糖苷酶的信號(hào)肽(Merkle等，Biochim.Biophys.Acta.，1997，1336(2)132-46)、豬碳酸酐酶抑制劑的信號(hào)肽(Wuebbens等，生物化學(xué)，1997，36(14)4327-36)、awamori曲霉菌葡糖淀粉酶的信號(hào)序列(Fierobe等，Protein Expr.Purif，1997，9(2)159-70)、鼠主要尿蛋白的信號(hào)序列(Ferrari等，F(xiàn)EBS Lett，1997，401(1)73-7)、pho 1的信號(hào)序列(Skory等，Curr.Genet.，1996，30(5)417-22)、兔血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)的信號(hào)序列(Sadhukhan等，生物化學(xué)雜志，1996，271(31)18310-3)、Pichia pastoris天冬氨酸蛋白酶的前肽序列(Tsujikawa等，酵母，1996，12(6)541-53)、Pichia pastorisPRCl的信號(hào)序列(Ohi等，酵母，1996，12(1)31-40)、細(xì)菌熱穩(wěn)定α-淀粉酶的信號(hào)序列和來自釀酒酵母的SUC2基因信號(hào)序列(Paifer等，酵母，1994，10(11)1415-9)和釀酒酵母雜交信息素α-因子的信號(hào)序列(Fidler等，J.Mol.Endocrinol.，1998，21(3)327-336)。
盡管甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris已被成功地用于產(chǎn)生各種異源蛋白，但美國專利第5,324,639號(hào)指出，以目前對甲基營養(yǎng)酵母表達(dá)系統(tǒng)的了解水平，很難預(yù)測給定基因是否能在這種酵母中表達(dá)至適當(dāng)?shù)乃交蛟摻湍杆拗魇欠窨赡褪芷浼?xì)胞內(nèi)存在重組基因產(chǎn)物。美國專利第5,324,639號(hào)進(jìn)一步指出，特別困難的是預(yù)見一個(gè)特定蛋白是否可被甲基營養(yǎng)酵母宿主分泌，以及假如可分泌，以何效率分泌。例如，Vollmer等，免疫學(xué)方法雜志，1996，199(1)47-54,報(bào)道當(dāng)人sIL-6R的323個(gè)氨基酸殘基插入適合于甲基營養(yǎng)酵母Pichiapastoris的表達(dá)/分泌載體時(shí)，未觀察到可測定的重組蛋白的表達(dá)和分泌。至今，莫內(nèi)林尚未用Pichiapastoris表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和分泌過。
基于商業(yè)應(yīng)用莫內(nèi)林的強(qiáng)烈興趣，迫切需要更有效的方法以生產(chǎn)穩(wěn)定的莫內(nèi)林，它仍保留其天然甜度且簡化下游的純化步驟。本發(fā)明著眼于本領(lǐng)域內(nèi)的這些和其他需求。此上引用的文獻(xiàn)不應(yīng)被解釋為承認(rèn)這些文獻(xiàn)內(nèi)容是本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及一個(gè)分離的核酸，該核酸包括一個(gè)編碼嵌合蛋白的核苷酸序列，所述的嵌合蛋白從N末端到C末端包括a)第一肽基片段，其由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成，其中百同一性分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)一個(gè)肽基鍵，或第二肽基片段，其由1-12個(gè)氨基酸組成；和c)第三肽基片段由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的，其中所述的嵌合體蛋白是穩(wěn)定的且一定量的所述嵌合體蛋白至少比等量蔗糖甜100倍，在所述的核酸內(nèi)，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。優(yōu)選地，分離的核酸進(jìn)一步編碼一個(gè)能夠在Pichia pastoris內(nèi)引導(dǎo)蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子，和/或能夠引導(dǎo)所編碼的嵌合體蛋白從Pichia pastoris中分泌的氨基酸序列。
本發(fā)明也涉及一個(gè)含上述核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)嵌合體蛋白的方法，包括培養(yǎng)含上述核酸的重組Pichiapastoris細(xì)胞以使編碼的嵌合體蛋白被細(xì)胞表達(dá)和分泌，及回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。最后，本發(fā)明涉及上述方法的產(chǎn)物。
4.附圖的簡要說明圖l顯示重組單鏈莫內(nèi)林蛋白的氨基酸序列和編碼重組單鏈莫內(nèi)林蛋白的DNA序列。氨基酸殘基1-50相當(dāng)于天然莫內(nèi)林B鏈的1-50氨基酸殘基；氨基酸殘基51是作為連接單元的甘氨酸；氨基酸殘基52-96相當(dāng)于天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基。
圖2顯示用于合成重組單鏈莫內(nèi)林蛋白的DNA寡聚體序列。
圖3顯示每個(gè)DNA寡聚體在合成的莫內(nèi)林DNA中的位置和其酶消化位點(diǎn)。
圖4顯示重組莫內(nèi)林蛋白表達(dá)載體pGWYS1的限制圖譜。
圖5顯示pGWYS1的構(gòu)建。
圖6顯示從培養(yǎng)基中分離的分泌的重組莫內(nèi)林蛋白的SDS-PAGE分析。
圖7顯示分泌的重組莫內(nèi)林蛋白的純化步驟。
5.本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明提供了一個(gè)編碼單鏈莫內(nèi)林樣蛋白的核酸，該蛋白是穩(wěn)定的且以重量為基礎(chǔ)至少比蔗糖甜100倍。優(yōu)選地，該核酸進(jìn)一步包括一個(gè)啟動(dòng)子和信號(hào)序列，以在甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris中引導(dǎo)編碼的莫內(nèi)林樣蛋白的表達(dá)和分泌。本發(fā)明也提供了一個(gè)含編碼莫內(nèi)林樣蛋白的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞，由重組Pichia pastoris生產(chǎn)莫內(nèi)林樣蛋白的方法和該方法的產(chǎn)物。
為闡明本公開，但并不作為限制，本發(fā)明的詳細(xì)描述分成下面的分部分。
5.1.編碼單鏈莫內(nèi)林蛋白的核酸本發(fā)明提供了一個(gè)包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，所述的嵌合體蛋白從N末端到C末端包括a)由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成的第一個(gè)肽基片段，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)一個(gè)肽基鍵，或由1-12個(gè)氨基酸組成的第二個(gè)肽基片段；和c)由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成的第三個(gè)肽基片段，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的，其中所述的嵌合體蛋白是穩(wěn)定的且一定量的所述嵌合體蛋白至少比等量蔗糖甜100倍，在所述的核酸中，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中第一個(gè)肽基片段由與天然莫內(nèi)林B鏈至少60％同一性的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，第一個(gè)肽基片段由與天然莫內(nèi)林B鏈至少90％同一性的氨基酸序列組成。更優(yōu)選地，第一個(gè)肽基片段由天然莫內(nèi)林B鏈的1-50氨基酸殘基組成。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中第二個(gè)肽基片段由氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO1)組成。優(yōu)選地，第二個(gè)肽基片段由氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)組成。更優(yōu)選地，第二個(gè)肽基片段由氨基酸殘基Gyl組成。
仍然在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中第三個(gè)肽基片段由與天然莫內(nèi)林A鏈至少60％同一性的氨基酸序列組成。優(yōu)選地，第三個(gè)肽基片段由與天然莫內(nèi)林A鏈至少90％同一性的氨基酸序列組成。更優(yōu)選地，第三個(gè)肽基片段由天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基組成。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中第一個(gè)肽基片段由天然莫內(nèi)林B鏈的l-50氨基酸殘基組成，第二個(gè)肽基片段由氨基酸殘基Gly組成，第三個(gè)肽基片段由天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基組成。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，該蛋白可被抗莫內(nèi)林或抗竹芋蛋白抗體免疫反應(yīng)地結(jié)合。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，其中嵌合體蛋白進(jìn)一步包括一個(gè)可引導(dǎo)所述嵌合體蛋白從Pichia pastoris中分泌的氨基酸序列。優(yōu)選地，分泌引導(dǎo)序列是Pichia pastoris的內(nèi)源性信號(hào)序列。更優(yōu)選地，內(nèi)源性信號(hào)序列選自Pichia pastoris酸性磷酸酶、Pichia pastoris天冬氨酸蛋白酶和由Pichia pastoris PRC1編碼的Pichia pastoris羧肽酶Y的信號(hào)序列。此外可選擇地，分泌引導(dǎo)序列是一個(gè)酵母信號(hào)序列，其中所述的酵母不是Pichia pastoris。優(yōu)選地，酵母信號(hào)序列是來自釀酒酵母的信號(hào)序列。更優(yōu)選地，釀酒酵母信號(hào)序列選自釀酒酵母SUC2和釀酒酵母雜交信息素α-因子的信號(hào)序列。最優(yōu)選地，釀酒酵母信號(hào)序列是釀酒酵母雜交信息素α-因子的信號(hào)序列。其它可用于本發(fā)明的分泌引導(dǎo)序列包括但不限于，巨曲霉α-帚曲菌素、α-N-乙酰半乳糖胺酶、OmpA蛋白、鼠α-因子(cCel1)、胡椒內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶、從溶木真菌Trametes中分離的蟲漆酶、鼠溶酶體酸性α-甘露糖苷酶、豬碳酸酐酶抑制劑、awamori曲霉菌葡糖淀粉酶、鼠主要尿蛋白、pho1、兔血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和細(xì)菌熱穩(wěn)定α-淀粉酶的信號(hào)序列。
在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離核酸，該核酸是DNA。在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)分離核酸，它可與編碼嵌合體蛋白的DNA序列雜交。仍然在另一個(gè)特定的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一個(gè)與包括編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離核酸。
在一個(gè)特定的實(shí)施例中，本發(fā)明提供了一個(gè)編碼嵌合體蛋白的DNA，該DNA進(jìn)一步包括一個(gè)可在Pichia pastoris中引導(dǎo)蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子。優(yōu)選地，該啟動(dòng)子是Pichia pastoris的內(nèi)源性啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，內(nèi)源性啟動(dòng)子是Pichia pastoris甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)的啟動(dòng)子。另外，雖然不是優(yōu)選，但也可應(yīng)用甲基營養(yǎng)酵母中甲醇應(yīng)答基因的啟動(dòng)子。這種甲醇應(yīng)答啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于，來自Pichiapastoris AOX1的一級(jí)乙醇氧化酶基因的啟動(dòng)子、來自Pichia pastorisAOX2的二級(jí)乙醇氧化酶基因的啟動(dòng)子、來自Pichia pastoris(DAS)的二羥丙酮合成酶基因的啟動(dòng)子、來自Pichia pastoris的P40基因的啟動(dòng)子、來自Pichia pastoris的過氧化氫酶基因的啟動(dòng)子，等(見美國專利第5,324,639號(hào))。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)編碼嵌合體蛋白的DNA，該DNA進(jìn)一步包括令其在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制和選擇的序列。以此方式，大量DNA片段可通過細(xì)菌內(nèi)復(fù)制而生產(chǎn)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)編碼嵌合體蛋白質(zhì)的DNA，其中在編碼的嵌合體蛋白內(nèi)，第一個(gè)肽基片段由天然莫內(nèi)林B鏈的1-50氨基酸殘基組成，第二個(gè)肽基片段由氨基酸殘基Gly組成，第三個(gè)肽基片段由天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基組成，并且所述的DNA進(jìn)一步包括Pichia pastoris GAP的啟動(dòng)子和釀酒酵母雜交信息素α-因子的信號(hào)序列。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)編碼嵌合體蛋白的DNA，其中使用被Pichia pastoris細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。
在一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)編碼嵌合體蛋白的DNA，其中DNA分子包括如

圖1中描述的核苷酸序列或如圖4中描述的DNA載體。
包括編碼這里公開的嵌合體蛋白的核苷酸序列的核酸，或其任何片段、類似物或其衍生物，可用本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法獲得。核酸可被整個(gè)地化學(xué)合成。另外可選擇地是，編碼嵌合體蛋白每個(gè)片段，即第一、第二或第三肽基片段的核酸可通過分子克隆獲得，或從所需細(xì)胞內(nèi)純化。然后，編碼嵌合體蛋白每個(gè)片段的核酸可被化學(xué)地或酶聯(lián)地連接在一起，以形成包括編碼這里公開的嵌合體蛋白的核苷酸序列的核酸，或其任何片段、類似物或其衍生物。
任何Dioscoreophyllum comminisii細(xì)胞潛在地可作為核酸的來源以分離編碼莫內(nèi)林的核酸。另外可選擇地是，編碼莫內(nèi)林的核酸可根據(jù)圖1中描述的天然莫內(nèi)林氨基酸序列設(shè)計(jì)和合成(也見美國專利第5,478,923號(hào))。
DNA可用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)的方法從克隆的DNA(如DNA“文庫”)中通過化學(xué)合成、cDNA克隆、或通過基因組DNA或其片段的克隆獲得，從所需要的細(xì)胞中純化(見，例如，Sambrook等，1989，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室指南，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；Glover，D.M.(編)，1985，DNA克隆研究實(shí)踐，MRL Press，Ltd.，Oxford，U.K.Vol.I，II.)來源于基因組DNA的克隆除密碼子區(qū)域外，可含有調(diào)控和內(nèi)含子DNA區(qū)域；來自cDNA的克隆應(yīng)僅含外顯子序列。無論其來源，基因應(yīng)分子地克隆進(jìn)一個(gè)適合的載體以傳播基因。
在從cDNA來源的基因分子克隆中，cDNA是用本領(lǐng)域熟知的方法從總細(xì)胞RNA或mRNA中產(chǎn)生的?；蛞部蓮幕蚪MDNA中獲得，在產(chǎn)生DNA片段時(shí)(如用限制性酶或通過機(jī)械剪切)，其中一些可編碼所需的基因。然后線性DNA片段可按照大小采用標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)進(jìn)行分離，包括但不限于瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱層析。
一旦包括編碼這里公開的嵌合體蛋白的核苷酸序列的核酸、或其任何片段、類似物或其衍生物被獲得，其同一性可通過核酸測序(用本領(lǐng)域熟知的任何方法)而確定并與已知的序列比較。DNA序列分析可用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于Maxam和Gilbert的方法(Maxam和Gilbert，1980，Meth.Enzymol.，65499-560)，Sanger雙脫氧方法(Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，745463)，應(yīng)用T7 DNA聚合酶(Tabor和Richardson，美國專利第4,795,699號(hào))，應(yīng)用一個(gè)自動(dòng)DNA測序儀(如Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，或PCT出版物WO97/15690中描述的方法。
與包括編碼這里公開的嵌合體蛋白的核苷酸序列的核酸、或其任何片段、類似物或其衍生物雜交的核酸，可在低、高或中度嚴(yán)格的條件下通過核酸雜交分離(也見Shilo和Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，786789-6792)。
如這里所用的，“穩(wěn)定”是指聲明的單鏈莫內(nèi)林嵌合體蛋白在置于約4℃至少6個(gè)月、或約60℃至少2.5小時(shí)、或約100℃至少5分鐘后保留其至少70％的甜度。此外，“穩(wěn)定”是指聲明的單鏈莫內(nèi)林嵌合體蛋白在置于pH范圍約2.0-約11.0至少6小時(shí)后保留其至少70％的甜度。
聲明的單鏈莫內(nèi)林嵌合體蛋白的甜度可用本領(lǐng)域已知的普通味覺試驗(yàn)測定。例如，在重量基礎(chǔ)上通過適度稀釋比較蔗糖的甜度(也見美國專利第5,478,923號(hào))。
優(yōu)選的被酵母細(xì)胞利用的密碼子可用本領(lǐng)域已知的方法測定，如在Sharp等，核酸研究，1986,14(13)5125-43和Li和Luo，J.Theor.Biol.，1996，181(2)111-24中公開的方法。根據(jù)Sharp的方法，酵母中優(yōu)選密碼子的重要特征包括與tRNA多度相關(guān)、第三堿基嘧啶較大程度的偏差和較小的A+T堿基對傾向。Li和Luo公開了分類和預(yù)測大腸桿菌和酵母細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)水平的方法，其稱為自身相容的信息聚類(SCIC)。采用改良的密碼子采納指數(shù)(CAI)值，Li和Luo完成了對大腸桿菌和酵母中堿基組成、堿基相關(guān)和基因表達(dá)水平間關(guān)系的線性回歸分析。Li和Luo還提出了表達(dá)增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)位點(diǎn)(EENS)的假設(shè)，該假設(shè)的存在可通過基因表達(dá)和一個(gè)密碼子內(nèi)、相鄰密碼子內(nèi)和非相鄰密碼子內(nèi)堿基相關(guān)之間的線性方程來顯示。此外，可應(yīng)用已成功地用于在Pichia pastoris細(xì)胞中表達(dá)異源蛋白的密碼子。這些密碼子的實(shí)例可見于美國專利第4,837,148號(hào)；美國專利第4,855,231號(hào)；美國專利第4,882,279號(hào)；美國專利第4,929,555號(hào)；美國專利第5,122,465號(hào)；美國專利第5,324,639號(hào)；Martinez-Ruiz等，Protein Expr.Purif.，1998，12(3)315-22；Abdulaev等，Protein Expr.確良Purif.，1997，10(1)61-9；Kotake等，J.Lipid Res.，1996，37(3)599-605；Zhu等，Arch.Biochem.Biophys.，1998.352(1)1-8；Heim等，Biochim.Biophys.Acta.，1998，1396(3)306-19；Ferrarese等，F(xiàn)EBS Lett.，1998，422(1)23-6；Jonsson等，Curr.Geneet，1997，32(6)425-30；Merkle等，Biochim.Biophys.Acta.，1997，1336(2)132-46；Wuebbens等，生物化學(xué)，1997，36(14)4327-36；Fierobe等，Protein Expr.Purif.，1997，9(2)159-70；Ferrari等，F(xiàn)EBS Lett.，1997，401(1)73-7；Skory等，Curr.Genet.，1996，30(5)417-22；Sadhukhan等，生成物化學(xué)雜志，1996，271(31)；18310-3；Tsujikawa等，酵母，1996，12(6)；541-53；Ohi等，酵母，1996，12(1)31-40；Paifer等，酵母，1994，10(11)1415-9；Fidler等，J.Mol.Endocrinol.，1998，21(3)327-336；和Brocca等，蛋白科學(xué)，1998，7(6)1415-22。
一個(gè)嵌合體蛋白是否能夠被抗莫內(nèi)林或抗竹芋蛋白抗體免疫反應(yīng)地結(jié)合可用本領(lǐng)域已知的方法確定?？捎糜诒景l(fā)明的抗莫內(nèi)林或抗竹芋蛋白抗體的實(shí)例包括但不限于下面公開的抗體，Slootstra等，Chem.Senses，1995.20(5)535-43；Antonenko和Zanetti，生命科學(xué)，1994，55(15)187-92；Bodani等，雜交瘤，1993，12(2):177-83；Mandal等，雜交瘤，1991，10(4)459-66和Haimovich，Isr.J.Med.Sci.，1975，11(11)1183。
5.2.來自重組PICHIA PASTORIS細(xì)胞的莫內(nèi)林蛋白的產(chǎn)生在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一個(gè)含編碼嵌合體蛋白的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞，所述的嵌合體蛋白從N末端到C末端包括a)由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成的第一個(gè)肽基片段，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)一個(gè)肽基鍵，或由1-12個(gè)氨基酸組成的第二個(gè)肽基片段；和c)由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少40％同一性的氨基酸序列組成的第三個(gè)肽基片段，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的，其中所述的嵌合體蛋白是穩(wěn)定的且一定量的所述嵌合體蛋白至少是等量蔗糖的100倍甜，在其中所述的核酸內(nèi)，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選地使用的密碼子。優(yōu)選地，重組Pichia pastoris細(xì)胞含一個(gè)包括圖1中描述的核苷酸序列或圖4中描述的DNA載體的DNA分子。也提供了包含4.1節(jié)中公開的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞。
轉(zhuǎn)化甲基營養(yǎng)酵母如Pichia pastoris的方法，及可應(yīng)用的培養(yǎng)甲基營養(yǎng)酵母細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域通常知道的，該酵母細(xì)胞的基因組中含有編碼異源蛋白的基因。優(yōu)選地，公開于美國專利第4,837,148號(hào)、美國專利第4,855,231號(hào)、美國專利第4,882,279號(hào)、美國專利第4,929,555號(hào)、美國專利第5,122,465號(hào)和美國專利第5,324,639號(hào)的轉(zhuǎn)化、陽性轉(zhuǎn)化物選擇和培養(yǎng)方法可用于本發(fā)明。
在另一個(gè)特定的的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生莫內(nèi)林嵌合體蛋白的方法，包括培養(yǎng)含有4.1節(jié)公開的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞，使該細(xì)胞表達(dá)和分泌編碼的嵌合體蛋白，以及回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。優(yōu)選地，應(yīng)用含有DNA分子的重組Pichia pastoris細(xì)胞，該DNA分子包括如在圖1中所述的核苷酸酸序列或如圖4中所述的DNA載體。
在本方法中可使用本領(lǐng)域中任何合適的發(fā)酵方法。為了在如Pichiapastoris的甲基營養(yǎng)酵母中，大規(guī)模生產(chǎn)被GAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的重組DNA為基礎(chǔ)的產(chǎn)物，優(yōu)選采用一個(gè)三期、高細(xì)胞密度的批量飼養(yǎng)發(fā)酵系統(tǒng)。在這個(gè)發(fā)酵系統(tǒng)的第一期或生長期中，表達(dá)宿主Pichia pastoris細(xì)胞在限定的極限培養(yǎng)基如BMGY(緩沖的極限甘油復(fù)合培養(yǎng)基)中進(jìn)行培養(yǎng)，其中非誘導(dǎo)性的碳源(如甘油)是過量的。當(dāng)表達(dá)宿主Pichiapastoris細(xì)胞在這樣的碳源中生長時(shí)，異源基因表達(dá)被抑制，使得在缺乏異源蛋白表達(dá)的情況下產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)。在此生長期中，也優(yōu)選培養(yǎng)基的pH維持在大約5。下一步，表達(dá)宿主Pichia pastoris細(xì)胞在限制性非誘導(dǎo)性碳源中短時(shí)間生長以進(jìn)一步增加細(xì)胞團(tuán)，并抑制葡萄糖應(yīng)答啟動(dòng)子。在此限制生長期，培養(yǎng)基的pH保持在4以下，優(yōu)選在大約2.0到大約3.5的范圍。最后一期是生產(chǎn)期，其中可以使用“過量葡萄糖批量飼養(yǎng)模式”或“混合培養(yǎng)批量飼養(yǎng)模式”。在“過量葡萄糖批量飼養(yǎng)模式”中，單獨(dú)加入2％葡萄糖。在“混合培養(yǎng)批量飼養(yǎng)模式”，在發(fā)酵罐中加入限量的非誘導(dǎo)性碳源和葡萄糖，以誘導(dǎo)由GAP啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的莫內(nèi)林基因的表達(dá)。
分泌的莫內(nèi)林嵌合體蛋白可以從Pichia pastoris培養(yǎng)基中通過任何本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，美國專利第3,878,184號(hào)和第3,998,798號(hào)；Morris和Cagan，Biochim.Biophys.Acta，1972，261114-122；Kim等，蛋白工程(Protein Eng.)，1989，2571-575；和最近Kondo等，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，1997，15453-457中公開的方法可用于回收和分離分泌的莫內(nèi)林嵌合體蛋白。優(yōu)選地，表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白采用包括離子交換層析的方法進(jìn)行回收。更優(yōu)選地，表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白采用包括CM-Sephadex柱層析或DEAE-Sephadex柱層析的方法進(jìn)行回收。
在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了上述方法的產(chǎn)物。
6.實(shí)施例6.1合成的重組莫內(nèi)林DNA的制備重組莫內(nèi)林蛋白的氨基酸序列和編碼重組莫內(nèi)林蛋白的DNA核苷酸序列在圖1中顯示。如在圖1中所示，核苷酸1-150編碼天然莫內(nèi)林蛋白B鏈的1-50殘基；核苷酸150-152編碼作為連接“L”部分的甘氨酸；核苷酸153-287編碼天然莫內(nèi)林蛋白A鏈的1-45殘基。重組莫內(nèi)林蛋白由下列氨基酸序列作為前導(dǎo)，該氨基酸序列對應(yīng)于一個(gè)蛋氨酸(Met)殘基和釀酒酵母雜交信息素α因子的信號(hào)序列Met-Leu-Leu-Phe-Ile-Asn-Thr-Thr-Ile-Ala-Ser-Ile-Ala-Ala-Lys-Glu-Glu-Gly-Val-Ser-Leu-Glu-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Phe(SEQ IDNO3)。
這種編碼釀酒酵母雜交信息素α因子信號(hào)序列的合成DNA和重組莫內(nèi)林蛋白是由寡聚M1-M4和N1-N4制備的，這些寡聚體是采用ACTG公司的Applied Biosystems 380B DNA合成儀合成的(見圖2-3和5)。寡聚體用尿素一聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并經(jīng)過一個(gè)Sep-pak C18柱(Whatman)純化，如圖3所示退火和連接，以獲得被EcoRI位點(diǎn)分段的合成DNA。
為合成編碼釀酒酵母雜交信息素α因子信號(hào)序列的合成DNA和重組莫內(nèi)林蛋白，在100μl PCR反應(yīng)體積中，寡聚體M2到N3各2pM與10pM的寡聚體M1和N4混合，在缺乏Tag DNA聚合酶的情況下加熱到94℃ 5分鐘。然后反應(yīng)混合物緩慢冷卻到37℃。在加入1單位Vent DNA聚合酶(New England Biolabs公司)后，PCR反應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行。100微升PCR反應(yīng)混合物含50mM Tris-HCl(pH8.0)、2.5mMMgCl2、10mM DTT、1mM dNTP和1單位Vent DNA聚合酶。PCR反應(yīng)按如下步驟進(jìn)行每次循環(huán)94℃ 1分鐘，53℃ 1.5分鐘，72℃ 2分鐘；總共30個(gè)循環(huán)。最后，反應(yīng)混合物在72℃孵育10分鐘。反應(yīng)混合物用苯酚/氯仿提取，用乙醇沉淀，用1.2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠純化。純化的DNA片斷被插入到pT7bleu(R)載體(Novagen公司)中產(chǎn)生pT7yM質(zhì)粒(見圖5)。在20μl DNA連接反應(yīng)體系中，加入2μl 10mMATP、40單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs公司)，與1μg純化的莫內(nèi)林DNA片斷和50ng pT7blue(R)載體混合。反應(yīng)混合物在16℃保溫16小時(shí)。在200μl大腸桿菌NovaBlue感受態(tài)細(xì)胞中添加5μl連接混合物而將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞(Messing，酶學(xué)方法，1983，10120-78)，所需的序列通過采用T7和U19啟動(dòng)子進(jìn)行雙脫氧序列分析而確定(Sanger等，Proc.Natl.Acad..Sci.，1985.745463-5467)。
6.2表達(dá)載體pGWYS-1的制備pGAPZa表達(dá)載體從Invitrogen公司購買。合成的莫內(nèi)林DNA片斷用EcoRI從pT7yMenallin中移出，并插入到pGAPZa載體的EcoRI位點(diǎn)中以得到pGWYS。簡言之，5μg純化的pT7yMenallin質(zhì)粒在20μl反應(yīng)體積中，用5單位EcoRI(Promega公司)在37℃消化2小時(shí)。反應(yīng)混合物用1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離后，合成的莫內(nèi)林DNA片斷用Wizard PCR Preps DNA純化試劑盒(Promega公司)進(jìn)行純化。100ng純化的莫內(nèi)林DNA片斷用于連接進(jìn)pGAPZa表達(dá)載體中。在10μl連接反應(yīng)體系中，50ng EcoRI消化的pGAPZa載體與100ng純化的莫內(nèi)林DNA片斷混合。連接反應(yīng)在存在10μl 20mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mMMgCl2、10mM DTT和200單位T4 DNA連接酶(New England Biolabs公司)的情況下，在16℃過夜進(jìn)行，以得到pGWYS。連接混合物被轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌TOP10F’細(xì)胞(Invitrogen公司)中。挑選出20個(gè)抗Zeocin的克隆，用α因子(5’CTATTGCCAGCATTGCTGC3’)(SEQ ID NO4)和N4寡聚體通過PCR反應(yīng)篩查插入起始端。每個(gè)挑選的克隆轉(zhuǎn)移到含200μg/ml Zeocin的3毫升LB培養(yǎng)基中，在37℃振蕩孵育過夜。重組質(zhì)粒pGWYS采用Qiagen Tip20試劑盒系統(tǒng)(Qiagen公司)從1.5ml培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞中制備。50ng純化的pGWYS質(zhì)粒被用作PCR模板以確定插入起始端。在25μl PCR反應(yīng)體系中，在存在1單位Taq DNA聚合酶(Promega公司)的情況下，50ng pGWYS質(zhì)粒與2.5pMα因子和N4寡聚體混合。PCR反應(yīng)在下列條件下進(jìn)行每個(gè)循環(huán)94℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃ 2分鐘；總共40個(gè)循環(huán)。最后，反應(yīng)混合物72℃孵育10分鐘。PCR反應(yīng)混合物在1.2％瓊脂糖凝膠上分離后，含所需起始端的插入物的克隆之一被命名為pGWYS-1。插入物的序列進(jìn)一步通過DNA測序確定。
6.3用pGWYS-1轉(zhuǎn)化Pichia pastoris細(xì)胞為在Pichia pastoris中得到莫內(nèi)林高水平和穩(wěn)定的表達(dá)，純化的pGWYS-1質(zhì)粒用II型電穿孔儀(Electroporation Apparatus II)(Invitrogen公司)，按照Pichia pastoris表達(dá)試劑盒說明書所述的電穿孔技術(shù)，轉(zhuǎn)化進(jìn)Pichia pastoris細(xì)胞中。簡言之，500ml Pichia pastorisGS115細(xì)胞在YPD培養(yǎng)基中在30℃生長，至OD600達(dá)1.3。細(xì)胞在4℃經(jīng)1,500g離心5分鐘沉淀。沉淀細(xì)胞用500ml冰冷無菌水沖洗。分別用250ml和20ml冰冷無菌水重復(fù)沖洗步驟。然后，細(xì)胞用20ml冰冷的1M山梨醇沖洗，并懸浮于1ml冰冷的山梨醇中。在1M山梨醇中的酵母GS115細(xì)胞40μl與10μg純化的pGWYS-1質(zhì)粒混合至總體積50μl，混合物被轉(zhuǎn)移進(jìn)冰冷的透明試管中。含有混合物的透明試管冰浴5分鐘。根據(jù)II型電穿孔儀(Invitrogen公司生產(chǎn))操作參數(shù)進(jìn)行電穿孔。電脈沖之后，試管中加入1ml冰冷的1M山梨醇，并將試管的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到微量離心管中。200μl轉(zhuǎn)化的細(xì)胞置于一個(gè)含400μg/ml Zeocin的5RDB培養(yǎng)板上。培養(yǎng)板在30℃孵育直至集落出現(xiàn)。陽性轉(zhuǎn)染體以在各種濃度Zeocin存在的情況下生長為特征，如400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml。
6.4陽性轉(zhuǎn)化體的穩(wěn)定性檢測選出三個(gè)陽性轉(zhuǎn)化體，根據(jù)其在存在800μg/ml Zeocin情況下的生長和在2％葡萄糖誘導(dǎo)下重組莫內(nèi)林的表達(dá)，進(jìn)一步確定特性。下面的實(shí)驗(yàn)用于檢測其遺傳穩(wěn)定性。用無菌牙簽挑出這3個(gè)陽性轉(zhuǎn)化體的每一個(gè)，不加任何選擇在YPD培養(yǎng)板上30℃孵育，直至集落出現(xiàn)。挑出這些集落，置于新的YPD培養(yǎng)板上直至新的集落出現(xiàn)。在這種非選擇性的生長重復(fù)50次后，每個(gè)傳代集落在含有800μg/ml Zeocin的選擇性培養(yǎng)板上孵育。在2％葡萄糖誘導(dǎo)下的蛋白表達(dá)用SDS-PAGE進(jìn)行分析。在YPD培養(yǎng)板上傳代50次后，所有三個(gè)陽性轉(zhuǎn)化體顯示與源集落同樣的表現(xiàn)型。
6.5重組莫內(nèi)林蛋白的生產(chǎn)每個(gè)在5.4中選擇的三個(gè)陽性轉(zhuǎn)化體在置于5升燒瓶中的1升YPD培養(yǎng)基中，在30℃生長，并進(jìn)行強(qiáng)烈振蕩(250rpm)。分別在24、48和72小時(shí)后，從培養(yǎng)瓶中獲取2ml上清液。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集的樣品5μl用15-20％梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分析。分泌的重組莫內(nèi)林被觀察到是12kD的蛋白帶。采用密度計(jì)(Densitometer)(Molecular Dynamic公司)進(jìn)行的SDS-PAGE定量分析顯示陽性菌株之一產(chǎn)生接近10克/升的分泌重組單鏈莫內(nèi)林。這個(gè)菌株被命名為GWyS1。
6.6分泌的重組莫內(nèi)林蛋白的純化采用蛋白質(zhì)方法純化從GwyS-1酵母菌株中分泌的重組莫內(nèi)林。根據(jù)第一個(gè)方法，培養(yǎng)72小時(shí)后，通過在12,000rpm(17,000g)離心收集上清液。收集后，上清液的pH采用0.1N NaOH溶液調(diào)節(jié)至6.8。1MNaH2PO4-Na2HPO4(pH6.8)以1∶100(v/v)加入到上清液中，并充分混合。然后將上清液裝于用0.01M NaH2PO4-Na2HPO4(pH6.8)溶液預(yù)平衡的CM-Sephadex柱(Phamacia公司)上。用5倍柱體積的0.01MNaH2PO4-Na2HPO4(pH6.8)溶液沖洗柱后，用0.3MNaCl-0.01MNaH2PO4-Na2HPO4(pH6.8)溶液洗脫重組莫內(nèi)林。在用水透析后，蛋白的純度通過凝膠電泳確定為大約98％。
根據(jù)第二個(gè)方法，培養(yǎng)72小時(shí)后，通過在12,000rpm(17,000g)離心收集上清液。收集后，上清液的pH采用0.1N NaOH溶液調(diào)節(jié)至大約7.2。1M NaCl-1M NaH2PO4-Na2HPO4(pH7.2)以1∶100(v/v)加入到上清液中，并充分混合。然后將上清液裝于用1MNaH2PO4-Na2HPO4(pH7.2)-1M NaCl溶液預(yù)平衡的DEAE-Sephadex柱(Phamacia公司)上。收集流動(dòng)相并用水透析。蛋白的純度通過凝膠電泳確定為大約98％。
按照任一方法純化的重組莫內(nèi)林蛋白進(jìn)一步凍干成干粉，以測定其甜度。
6.7甜度和穩(wěn)定性檢測純化的重組莫內(nèi)林的甜度采用普通的味覺實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測。通過以重量為基礎(chǔ)的適當(dāng)稀釋進(jìn)行與蔗糖甜度的對比。在經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)中，1、10、25和50mg/ml的蔗糖水溶液用作標(biāo)準(zhǔn)溶液。比較純化的重組莫內(nèi)林蛋白和蔗糖能夠產(chǎn)生甜味的最小重量。本發(fā)明的重組莫內(nèi)林需要添加的量大約比蔗糖少1000倍。例如，50ng/ml重組莫內(nèi)林蛋白溶液與50mg/ml蔗糖(Lucky超市的Lady Lee牌糖)一樣甜。
以100μg/ml濃度，在pH2.0、4.0、6.3和7.5下溶解天然莫內(nèi)林(Sigma公司)和純化的重組莫內(nèi)林，以檢測穩(wěn)定性。每個(gè)樣品加熱到37℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃ 15分鐘，并在品嘗前冷卻至室溫。最戲劇性的不同是，天然莫內(nèi)林在pH2.0加熱到50℃時(shí)丟失了其甜度，而純化的重組莫內(nèi)林即使在100℃加熱5分鐘仍然保持其甜度。本發(fā)明在范圍上并不受在此描述使用的微生物或特定的的實(shí)施方案所限制。實(shí)際上，從前面的描述和相關(guān)的圖表，本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員可很清楚地對本發(fā)明進(jìn)行除在此描述之外的各種改良。這些改良方案是屬于附加權(quán)利要求范圍之內(nèi)的。
許多文獻(xiàn)在此引用，其公開部分被全部引入作為參考。
權(quán)利要求
1.包含編碼嵌合體蛋白的核苷酸序列的分離的核酸，所述嵌合體蛋白質(zhì)從N末端到C末端包括a)由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少有40％同一性的氨基酸序列組成的第一個(gè)肽基片斷，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)肽基鍵，或由1-12個(gè)氨基酸組成的第二個(gè)肽基片斷；和c)由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少有40％同一性的氨基酸序列組成的第三個(gè)肽基片斷，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；其中所述嵌合體蛋白是穩(wěn)定的，且給定劑量的所述嵌合體蛋白質(zhì)至少比相同量的蔗糖甜100倍，并且在所述的核酸內(nèi)，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。
2.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第一個(gè)肽基片斷由與天然莫內(nèi)林B鏈至少有60％同一性的氨基酸序列組成。
3.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第一個(gè)肽基片斷由與天然莫內(nèi)林B鏈至少有90％同一性的氨基酸序列組成。
4.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第一個(gè)肽基片斷由如圖1所描述的氨基酸殘基1-50(SEQ ID NO5)的天然莫內(nèi)林B鏈的1-50氨基酸殘基組成。
5.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第二個(gè)肽基片斷由氨基酸殘基Gly組成。
6.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第二個(gè)肽基片斷由氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO2)組成。
7.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第二個(gè)肽基片斷由氨基酸序列Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ IDNO1)組成。
8.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第三個(gè)肽基片斷由與天然莫內(nèi)林A鏈至少有60％同一性的氨基酸序列組成。
9.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第三個(gè)肽基片斷由與天然莫內(nèi)林A鏈至少有90％同一性的氨基酸序列組成。
10.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述第三個(gè)肽基片斷由天然莫內(nèi)林A鏈的1-45氨基酸殘基，如在圖1中所描述的氨基酸殘基52-96(SEQ ID NO5)組成。
11.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，該核酸編碼圖1的氨基酸殘基1-96(SEQ ID NO5)。
12.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述嵌合體蛋白能被抗莫內(nèi)林抗體免疫反應(yīng)結(jié)合。
13.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述嵌合體蛋白能被抗竹芋蛋白抗體免疫反應(yīng)結(jié)合。
14.如權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述嵌合體蛋白進(jìn)一步包括能夠引導(dǎo)所述的嵌合體蛋白從Pichia pastoris中分泌的氨基酸序列。
15.如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其中所述分泌引導(dǎo)序列是Pichia pastoris的內(nèi)源性信號(hào)序列。
16.如權(quán)利要求15所述的分離的核酸，其中所述內(nèi)源性信號(hào)序列選自Pichia pastoris酸性磷酸酶、Pichia pastoris天冬氨酸蛋白酶和由Pichia pastoris PRC1編碼的Pichia pastoris羧肽酶Y的信號(hào)序列。
17.如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其中所述分泌引導(dǎo)序列是酵母信號(hào)序列，其中所述的酵母不是Pichia pastoris。
18.如權(quán)利要求17所述的分離的核酸，其中所述酵母信號(hào)序列來自釀酒酵母信號(hào)序列。
19.如權(quán)利要求18所述的分離的核酸，其中所述釀酒酵母信號(hào)序列選自釀酒酵母SUC2和釀酒酵母雜交信息素α因子的信號(hào)序列。
20.如權(quán)利要求19所述的分離的核酸，其中所述釀酒酵母信號(hào)序列是釀酒酵母雜交信息素α因子的信號(hào)序列。
21.如權(quán)利要求11所述的分離的核酸，進(jìn)一步包括能引導(dǎo)所述嵌合體蛋白從Pichia pastoris中分泌的氨基酸序列。
22.如權(quán)利要求21所述的分離的核酸，其中所述分泌引導(dǎo)序列是釀酒酵母雜交信息素α因子的信號(hào)序列。
23.如權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其中所述分泌引導(dǎo)序列選自巨曲霉菌α-帚曲菌素、α-N-乙酰半乳糖胺酶、OmpA蛋白、鼠α-因子(cCel1)、胡椒內(nèi)-β-1，4-葡聚糖酶、從溶木真菌Trametes中分離的蟲漆酶、鼠溶酶體酸α-甘露糖苷酶、豬碳酸酐酶抑制劑、awamori曲霉菌葡糖淀粉酶、鼠主要尿蛋白、Pho1、兔血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)和細(xì)菌熱穩(wěn)定α-淀粉酶的信號(hào)序列。
24.如權(quán)利要求1所述的核酸，其中所述的核酸是DNA。
25.包含與權(quán)利要求1所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列的分離的核酸。
26.與權(quán)利要求24所述的DNA序列雜交的分離的核酸。
27.如權(quán)利要求24所述的DNA，進(jìn)一步包括能在Pichia pastoris中引導(dǎo)蛋白表達(dá)的啟動(dòng)子。
28.如權(quán)利要求27所述的DNA，其中所述啟動(dòng)子是Pichia pastoris的內(nèi)源性啟動(dòng)子。
29.如權(quán)利要求28所述的DNA，其中所述內(nèi)源啟動(dòng)子是Pichiapastoris甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動(dòng)子。
30.如權(quán)利要求24所述的DNA，所述DNA編碼圖1的氨基酸殘基1-96(SEQ ID NO5)，所述DNA進(jìn)一步包括Pichia pastoris甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動(dòng)子和釀酒酵母雜交信息素α因子的信號(hào)序列。
31.如權(quán)利要求24所述的DNA，其中使用優(yōu)選地被Pichia pastoris細(xì)胞使用的密碼子。
32.包含圖1中所示核苷酸序列的DNA分子。
33.如圖4所示的pGWYS1 DNA載體。
34.含權(quán)利要求1所述核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞。
35.含權(quán)利要求32所述DNA的重組Pichia pastoris細(xì)胞。
36.含權(quán)利要求33所述DNA的重組Pichia pastoris細(xì)胞。
37.產(chǎn)生嵌合體蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)含權(quán)利要求1所述核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞，使得編碼的嵌合體蛋白被細(xì)胞表達(dá)和分泌，并回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。
38.產(chǎn)生嵌合體蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)含權(quán)利要求32所述DNA的重組Pichia pastoris細(xì)胞，使得編碼的嵌合體蛋白被細(xì)胞表達(dá)和分泌，并回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。
39.產(chǎn)生嵌合體蛋白的方法，該方法包括培養(yǎng)含權(quán)利要求33所述DNA的重組Pichia pastoris細(xì)胞，使得編碼的嵌合體蛋白被細(xì)胞表達(dá)和分泌，并回收表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白。
40.如權(quán)利要求37所述的方法，其中所述表達(dá)和分泌的嵌合體蛋白通過包括離子交換層析的方法回收。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所用的離子交換層析是CM-Sephadex柱層析。
42.如權(quán)利要求40所述的方法，其中所用的離子交換層析是DEAE-Sephadex柱層析。
43.權(quán)利要求37所述方法的產(chǎn)物。
44.權(quán)利要求38所述方法的產(chǎn)物。
45.權(quán)利要求39所述方法的產(chǎn)物。
46.權(quán)利要求40所述方法的產(chǎn)物。
47.權(quán)利要求41所述方法的產(chǎn)物。
48.權(quán)利要求42所述方法的產(chǎn)物。
49.一種嵌合體蛋白，所述的嵌合體蛋白從N-末端到C-末端包括a)由與天然莫內(nèi)林B鏈的1-50殘基至少有40％同一性的氨基酸序列組成的第一個(gè)肽基片斷，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林B鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；b)肽基鍵，或由1-12個(gè)氨基酸組成的第二個(gè)肽基片斷；和c)由與天然莫內(nèi)林A鏈的1-45殘基至少有40％同一性的氨基酸序列組成的第三個(gè)肽基片斷，其中同一性百分比是在與天然莫內(nèi)林A鏈相同大小的氨基酸序列上確定的；其中所述的嵌合體蛋白是穩(wěn)定的，且給定劑量的所述嵌合體蛋白質(zhì)至少比相同量的蔗糖甜100倍，并在所述的核酸內(nèi)，使用被酵母細(xì)胞優(yōu)選使用的密碼子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)單鏈的莫內(nèi)林樣蛋白,該蛋白是穩(wěn)定的,且以重量為基礎(chǔ)至少比蔗糖甜100倍。本發(fā)明還涉及編碼所述莫內(nèi)林樣蛋白的核酸。優(yōu)選地,此核酸進(jìn)一步包括一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)信號(hào)序列,該序列在甲基營養(yǎng)酵母Pichia pastoris中引導(dǎo)編碼的莫內(nèi)林樣蛋白的表達(dá)和分泌。本發(fā)明進(jìn)一步涉及含編碼莫內(nèi)林樣蛋白的核酸的重組Pichia pastoris細(xì)胞,一個(gè)從重組Pichia pastoris中生產(chǎn)莫內(nèi)林樣蛋白的方法及該方法的產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C12R1/84GK1332802SQ99815165
公開日2002年1月23日 申請日期1999年12月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月31日
發(fā)明者段陵潯 申請人:基因緯生物技術(shù)公司, 段陵潯