專利名稱：青光眼的診斷和治療的制作方法
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本發(fā)明在國家眼科研究院授權合同No.EY-11095和國家健康研究院授權合同No.MOI-RR-06192下由政府支持完成。政府對本發(fā)明有一定的權利。相關的專利申請本申請是1997年9月10日提交的，美國序列號No.08/926,492申請的部分繼續(xù)申請，美國序列號No.08/926,492申請是1997年2月3日提交的，美國序列號No.08/800,036申請的部分繼續(xù)申請，兩篇申請全部內容都通過在此引述而合并于本文。
本發(fā)明的背景青光眼是一組眼睛病變，其特點是視神經(jīng)的衰退。它是世界范圍內失明的重要原因之一。引發(fā)青光眼的一個主要風險因素是家族病史青光眼的幾種不同的遺傳形式已經(jīng)被描述了。
原發(fā)性先天青光眼或嬰兒期青光眼(基因符號GLC3)是一種遺傳病變，占整體失明的0.01-0.04％。其特點是眼睛的水排出系統(tǒng)的發(fā)育不當，導致眼內壓升高，眼球或角膜增大(如，水眼)，損傷視神經(jīng)，最終導致視覺損傷。盡管努力確認了具體組織上的缺陷，但GLC3基因的致病原因一直難以捉摸。與該疾病有關的至少兩個染色體位點已經(jīng)確定一個位點在2p21(GLC3A)[Sarfarazi，M.et al.，Genomics 30171-177(1995)]；第二個位點在1p36(GLC3B)[Akarsu，A.N.et al.，Hum.Mol.Gen.5(8)1199-1203(1996)]。其他特異位點，包括6p區(qū)域和染色體11，已被排除[Akarsu，A.N.et al.，Am.J.Med.Genet.61290-292(1996)]。
原發(fā)性開角型青光眼(基因符號GLC1)是一種常見的病變，其特點是視神經(jīng)萎縮導致視域損失，最終失明。根據(jù)發(fā)病年齡和臨床表現(xiàn)的不同，GLC1主要可分為兩組。
青少年發(fā)病的原發(fā)性開角型青光眼(GLC1A)，通常在孩童期晚期或成年期早期顯現(xiàn)。GLC1A的發(fā)展很快并嚴重伴隨眼內壓升高，對內科治療反應較差，通常需要眼睛外科手術。GLC1A已被制圖在染色體1的q21-q31區(qū)域，帶有遺傳異質性。[Sheffield，V.C.et al.，Hum.Mol.Genet.41837-1844(1995)]。
成年或成年晚期發(fā)病的原發(fā)性開角型青光眼(GLC1B)是最常見的青光眼類型。與青少年發(fā)病的原發(fā)性開角型青光眼相比，它比較柔和，且發(fā)展的較緩慢，發(fā)病期不同，通常在40歲以后。GLC1B的眼內壓升高輕微和緩，對定期調節(jié)內科治療反應令人滿意。然而，由于疾病的發(fā)展緩慢并且沒有痛苦，所以直到視神經(jīng)已經(jīng)發(fā)生了不可逆轉的損傷的晚期階段時，疾病才可能被發(fā)現(xiàn)?；蜻B鎖、單倍型、及臨床數(shù)據(jù)已為GLC1B在2cen-q13區(qū)域指定了一個位點[Stoilova，D.et al.，Genomics.36142-150(1996)]，和一個新位點3q21-q22[Sarfarazi，M.et al.，Submitted1996)]，及提供了其他幾個位點的進一步的證據(jù)。
由于青光眼的不知不覺中加居的特點，所以需要一種較好的早期方式來診斷或預測青光眼發(fā)展的可能性，這樣，在視神經(jīng)發(fā)生大的損傷之前，可采用預防或減輕的措施。
本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及診斷或治療青光眼的方法。個體青光眼的診斷方法包括，檢測與疾病有關的基因中突變的存在。突變可能是一個或多個核苷酸的插入或缺失，導致移碼突變；至少一個核苷酸的改變，導致編碼氨基酸中的改變；至少一個核苷酸的改變，導致提前出現(xiàn)終止密碼子；一個或幾個核苷酸的插入，如由于不等重組或基因轉換引起的插入，導致基因編碼序列的中斷；部分基因的重復；全部或部分基因的轉位；或全部或部分基因的重排。與青光眼有關的基因中可能存在一種以上的突變。與青光眼有關的突變可用多種方法確定，如對基因組DNA的Southern分析；基因組DNA的擴增，接著用限制酶消化進行的直接突變分析；對RNA的Northern分析；基因分離和直接測序；或對與青光眼有關的基因編碼蛋白質的分析。
例如，含有基因的DNA樣品是從懷疑患有青光眼，或是青光眼的攜帶者的個體中獲取的(測試個體)。在基因與突變核酸探針的特異雜交充分的條件下，將DNA與至少一種突變核酸探針接觸。突變核酸探針含有，具有至少一種上述突變的基因的DNA、cDNA、或RNA，或基因片段，或與這樣的cDNA片段對應的RNA片段。突變核酸片段與突變核酸探針特異性雜交的存在，表示基因中的突變與青光眼有關。在另一個實例中，在基因與PNA探針的特異性雜交充分的條件下，將DNA與PNA探針接觸；特異雜交存在，表示基因中的突變與青光眼有關。
另外，如果突變導致限制位點的產(chǎn)生或消除，那么，可以通過對從測試個體獲取的基因組DNA、RNA或cDNA樣品的限制性消化，進行直接突變分析。相關DNA、RNA或cDNA片段的消化模式，顯示與青光眼有關的突變存在或不存在。
與青光眼有關的突變存在也可以通過序列數(shù)據(jù)診斷。從測試個體獲取到基因組DNA、RNA或cDNA的樣品，確定基因序列、或基因片段。將從個體獲取的基因序列與已知基因序列(對照序列)相比較。在個體的基因中，如有以上所述的突變存在，則表示突變與青光眼有關。
本發(fā)明另外還涉及，通過檢測與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達的變化，來診斷個體青光眼的方法。表達的變化可以是蛋白質表達量的變化(量變化)，或蛋白質表達組成的變化(質變化)，或兩者都有。當測試樣品中的與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達，與對照樣品中的與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達相比較時，有變化的表示患有疾病。蛋白質表達中的變化可以采用標準技術來確定，如Western印跡法。
本發(fā)明另外還涉及與青光眼有關的突變基因編碼蛋白質的抗體(單克隆的或多克隆的)。這些抗體也可用在診斷方法中。如，將含有有關蛋白質的測試樣品與，對含有如上所述的與青光眼有關的突變的基因編碼蛋白質有特異性的抗體相接觸。有關的蛋白質與抗體的特異性結合，表示突變與青光眼有關。
本發(fā)明還涉及治療青光眼的方法，如服用代替、模仿或補充與青光眼有關的基因編碼蛋白質的活性的治療劑，及青光眼基因治療法。
本發(fā)明可容易地確定與青光眼有關的基因中的突變，因此也促使疾病得到即好又早的診斷和治療。對這種突變的確定，將一種形式的青光眼與其他形式區(qū)別開來，這樣可為患病個體，及家族中可能是患病個體或疾病攜帶者的其他成員，作出較好的治療計劃。
附圖簡要說明

圖1是對與原發(fā)性先天青光眼有關的基因的GLC3A主要候選區(qū)域的描述。
圖2是對CYP1B1基因的基因組結構的描述，其中帶有與青光眼有關的確定的三個突變。
圖3是一組示意圖，分別標為圖3A、圖3B、和圖3C，描述了五個GLC3A家族中基因組突變的分析。圖3A描述的是，通過丙烯酰胺凝膠電泳及測序測定的家族17和26的13個堿基對的缺失；圖3B描述的是，對家族10和11的單個胞嘧啶堿基插入的分析；圖3C描述的是，在家族15中觀察到的大型缺失的PCR特征。
本發(fā)明的詳細敘述本發(fā)明涉及診斷青光眼的方法。本文所用的“青光眼”，是指遺傳青光眼，如原發(fā)性先天和嬰兒期青光眼；原發(fā)性開角型青光眼(POAG)，包括青少年發(fā)病的和成年-或晚期發(fā)病的POAG；繼發(fā)性青光眼；色素青光眼；和低壓青光眼。
如本文所述，申請人已確定了與青光眼有關的基因，該基因中的突變與疾病存在是有關的。為了確定與青光眼有關的基因，申請人研究了存在于與原發(fā)性先天青光眼相關的位點GLC3A的基因。確定候補基因后，對從患有原發(fā)性先天青光眼的家族測試組個體中，取出的基因組DNA樣品的候補基因，申請人作了直接測序分析。申請人確定了人類細胞色素P4501B1(CYP1B1)基因中的17種不同突變與原發(fā)性先天青光眼有關。CYP1B1基因由Sutter所描述[Sutter，T.R.et al.，J.Biol.Chem.26913092(1994)]，其全部內容都通過在此引述而合并于本文；CYP1B1基因的核苷酸序列可從GenBank獲得，登記號為UO3688。
CYP1B1基因中的一種突變是13個堿基對的缺失，即核苷酸1410到核苷酸1422[GAGTGCAGGCAGA(SEQ ID NO.1)]被從CYP1B1基因編碼序列中移出，這種突變在不止一個家族中發(fā)現(xiàn)。這種突變導致移碼，通過在缺失位置下游203個堿基對處產(chǎn)生提前出現(xiàn)的終止密碼子，截斷開放讀框(最后原始氨基酸Thr-354(早移碼)后的68個氨基酸)。CYP1B1基因中與原發(fā)性先天青光眼有關的第二種突變是，在位于核苷酸1209到1214之間的六個胞嘧啶片段上，插入一個額外的胞嘧啶。這種插入也導致移碼突變，在插入位置下游106個堿基對處產(chǎn)生提前出現(xiàn)終止密碼子(最后一個原始氨基酸Pro-289下游的36個氨基酸)。CYP1B1基因中的第三種突變也是移出部分內含子II和外顯子III的大部分編碼序列的一種缺失。第四種突變是核苷酸1546-1555的十個堿基對的重復(TCATGCCACC，SEQ ID NO.20)；這種十個堿基對的重復導致移碼突變，在氨基酸403后產(chǎn)生提前出現(xiàn)中止，從全長蛋白質(沒有突變的)上移出140個氨基酸。第五種突變是核苷酸1737上的胞嘧啶的單個堿基缺失，導致移碼，產(chǎn)生提前出現(xiàn)終止密碼子TAG，導致移出80個氨基酸(氨基酸463后的全部氨基酸缺失)。第六種突變是核苷酸1187上的單個堿基的改變(G→T轉換)，這樣導致提前出現(xiàn)TAA終止密碼子。第七種突變是核苷酸1482上的單個堿基的改變(C→T轉換)，這樣導致從脯氨酸到亮氨酸編碼氨基酸的改變。第八種突變是核苷酸517上的單個堿基的改變(G→T轉換)，這樣導致從色氨酸到半胱氨酸編碼氨基酸的改變。第九種突變是核苷酸528上的單個堿基的改變(G→A轉換)，這樣導致從甘氨酸到谷氨酸編碼氨基酸的改變。第十種突變是在核苷酸846上插入胸腺嘧啶，造成移碼突，導致從蛋白質的羧基端377個氨基酸的缺失。第十一種突變是核苷酸1439上的單個堿基的改變(G→T轉換)，這樣導致從甘氨酸到色氨酸編碼氨基酸的改變。第十二種突變是核苷酸1505上的單個堿基的改變(G→A轉換)，這樣導致從谷氨酸到賴氨酸編碼氨基酸的改變。第十三種突變是核苷酸1515上的單個堿基的改變(G→A轉換)，這樣導致從精氨酸到組氨酸編碼氨基酸的改變。第十四種突變是核苷酸1656上的單個堿基的改變(C→T轉換)，這樣導致從脯氨酸到亮氨酸編碼氨基酸的改變。第十五種突變是核苷酸1691上缺失單個堿基(G)，造成移碼突變，導致從蛋白質的羧基端95個氨基酸的缺失。第十六種突變是核苷酸1751上的單個堿基的改變(C→T轉換)，這樣導致從精氨酸到色氨酸編碼氨基酸的改變。第十七種突變是開始于核苷酸1749的27個核苷酸的重復(即從1749-1775的核苷酸的重復)，造成移碼突變，導致從蛋白質的羧基端76個氨基酸的缺失。
由于在與青光眼有關的基因中發(fā)現(xiàn)了這些突變，所以就有了診斷青光眼的方法。現(xiàn)在，使用如本文所述的方法或其他適當?shù)姆椒?，就可以確定與青光眼有關的基因?！芭c青光眼有關的基因”是這樣一種基因，如果它發(fā)生了突變，那么突變與青光眼有關。“與青光眼有關的基因”包括編碼蛋白質的DNA，連同其他組成，如前導和尾部序列，啟動子單元，內含子和外顯子。本文所述的“與青光眼有關的突變”，包括基因中的突變，連同基因的cDNA或mRNA中的突變，其中基因(或基因的cDNA和mRNA)中的突變已確定與青光眼有關，如通過連鎖分析(或通過直接測序)而確定。
為了確定其他與青光眼有關的基因，可對與青光眼有關的已知位點進行分析采用如下述的方法，對在有關位點內、或與有關位點(已確定與青光眼有關的位點)緊密連鎖的基因進行突變分析。如，對成年發(fā)病的原發(fā)性開角型青光眼(POAG)，幾個位點已指定，包括2cen-q13區(qū)域[Stoilova，D.et al.，Genomics26142-150(1996)]；3q21-q22區(qū)域[Sarfarazi，M.et al.，submitted(1996)]；8q24(Tarfan，et al.，in preparation)；和10p(Sarfarazi，M.et al.，in preparation)?？蓪@些位點進行研究以確定與青光眼有關的基因?；蛘?，通過對患有青光眼的血緣族進行基因分析，可確定新位點；然后可以分析這些位點，確定與青光眼有關的基因。這些方法對有遺傳基礎的所有形式的青光眼適用。
確定與青光眼有關的基因后，診斷就成為可能。診斷青光眼是通過檢測與青光眼有關的基因中的一種或多種突變完成的。與青光眼有關的基因中的突變可以是單個、或一個以上的核苷酸的插入或缺失，導致在移碼突變；至少一個核苷酸的改變，導致編碼氨基酸的改變；至少一個核苷酸的改變，導致提前出現(xiàn)終止密碼子的產(chǎn)生；幾個核苷酸的缺失，導致核苷酸編碼的一種或多種氨基酸的缺失；一個或多個核苷酸的插入，如不等重組或基因轉換，導致基因編碼序列的中斷；全部或部分基因的重復；全部或部分基因的轉位；或全部或部分基因的重排。在單個基因中可能存在一種以上這樣的突變。這樣的序列改變導致與青光眼有關的基因所編碼的蛋白質的改變。例如，當突變是移碼突變時，移碼會導致編碼的氨基酸的改變，和/或導致提前出現(xiàn)終止密碼子的產(chǎn)生，造成截斷蛋白質的產(chǎn)生。另外，與青光眼有關的突變會是，在一個或多個核苷酸中的同義突變(如，突變不會導致與青光眼有關的基因編碼蛋白質的改變)。這樣的突變可能會改變基因的拼接位置，或要么影響基因的轉錄或翻譯。有上述的任何突變的與青光眼有關基因，本文稱之為“突變基因?！痹谠\斷青光眼的第一種方法中，使用的是雜交方法，如Southern分析(參閱Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F(xiàn).et al.，eds.，John Wiley & Son，包括至1997年的所有補充材料)。例如，基因組DNA，RNA，或cDNA的測試樣品，是從懷疑患有青光眼的(或攜帶缺陷基因的)個體中獲取的。個體可以是成年人，孩子，或胎兒。測試樣品可以從含有基因組DNA任何樣源獲取，如血液或組織樣品，如從皮膚或其他器官獲取。在一個較好的具體實施中，DNA的測試樣品是從成纖維細胞皮膚樣品、發(fā)根、或口腔取到的細胞(如，通過漱口)中獲取的。在另一個較好的具體實施中，DNA的測試樣品是用適當?shù)姆椒◤奶杭毎蚪M織中獲取的，如采用羊膜穿刺術或絨毛膜取樣。檢測DNA，RNA，或cDNA樣品，以確定是否有與青光眼有關的突變存在；突變的存在是由基因組DNA、RNA、或cDNA中的基因與核酸探針雜交而顯示。本文所用的“核酸探針”，可以是DNA探針或RNA探針。這些核酸探針與至少一種如上所述的與青光眼有關的突變基因雜交。只要一種核酸探針片段與含有突變的部分基因雜交，這樣的片段就可被使用。
為了用雜交法來診斷青光眼，將含有與青光眼有關的基因的測試樣品與至少一種核酸探針接觸制成雜交樣品。將雜交樣品保留在核酸探針和與青光眼有關的基因可進行特異雜交的充分條件下。本文所用的“特異雜交”，是指精確雜交(如，沒有誤配)。例如，特異雜交可在高度嚴緊條件下，或在中度嚴緊條件下實施。在本領域中，雜交的“嚴緊條件”是指使特定核酸與另一種核酸可進行雜交的緩沖液的濃度和溫度條件，其中第一種核酸可能是完全與第二種核酸互補，或第一種和第二種核酸可能是一定程度的互補。例如，某些高度精確條件可用于區(qū)分完全互補的核酸和部分互補的核酸。在Current Protocols in Molecular Biology(同上)中，2.10和6.3章，具體在2.10.1-2.10.16和6.1.1-6頁中，解釋了“高度嚴緊條件”和“中度嚴緊條件”，其中的內容通過在此引述而合并于本文。決定雜交嚴緊性的恰當條件，取決于多種因素，如核酸的長度，堿基組成，雜交序列之間誤配的百分率和分布，溫度，離子濃度，脫穩(wěn)定劑濃度，和其他因素。這樣，高度或中度嚴緊條件可經(jīng)驗地確定。在一個具體實施中，特異雜交的雜交條件是中度嚴緊條件。在一個尤其推薦的具體實施中，特異雜交的雜交條件是高度嚴緊條件。
如果發(fā)生了特異雜交，那么可用標準方法測得。如果特異雜交發(fā)生在核酸探針和測試樣品中與青光眼有關的基因之間，那么與青光眼有關的基因就有突變。在這種方法中，可同時使用一種以上的核酸探針。任何一種核酸探針的特異雜交表示，基因中的突變與青光眼有關，因此診斷了疾病。
例如，在診斷原發(fā)性先天青光眼中，可制備與帶有核苷酸1410到1422的13個堿基對缺失的部分CYP1B1基因雜交的核酸探針。如果這種核酸探針特異地與測試樣品中的與青光眼有關的基因雜交，原發(fā)性先天青光眼的診斷就完成了?；蛘?，可制備與帶有上述一種其他突變的CYP1B1基因雜交的核酸探針，如位于核苷酸1209和1214之間的六個胞嘧啶的片段上的一個額外的胞嘧啶(C)；核苷酸1546一1555的10個堿基對的重復；核苷酸1737上胞嘧啶(C)的缺失；核苷酸1187上G→T的轉換；核苷酸1482上C→T的轉換；核苷酸517上G→C的轉換；核苷酸528上G→A的轉換；核苷酸846上胸腺嘧啶(T)的插入；核苷酸1439上G→T的轉換；核苷酸1505上G→A的轉換；核苷酸1515上G→A的轉換；核苷酸1656SHANG C→T的轉換；核苷酸1691上鳥嘌呤(G)的缺失；核苷酸1751上C→T的轉換；開始于核苷酸1749的27個核苷酸的重復。這樣的核酸探針與測試樣品中與青光眼有關的基因的特異雜交，表示患有原發(fā)性先天青光眼。
在另一個雜交方法中，Northern分析(參閱Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel，F(xiàn).et al.，eds.，John Wiley & Son，同上)被用于確定與青光眼有關的突變的存在。對于Northern分析，RNA樣品是用適當?shù)姆绞綇臏y試個體獲取的。如上所述，核酸探針與從個體獲取的RNA的特異雜交，表示基因中的突變與青光眼有關，因此是對疾病的診斷。
使用核酸探針的典型實例參閱，如，美國專利No.5,288,611和4,851,330。
另外，在上述雜交法中，可使用肽核酸(PNA)探針代替核酸探針。PNA是一種DNA模擬，具有類肽、無機主鏈，如N-(2-氨基乙基)甘氨酸單元，有機堿基(A，G，C，T或U)通過亞甲基羰基接頭附著在甘氨酸的氮上[參閱如，Nielsen，P.E.et al.，Bioconjugate Chemistry，1994，5，American Chemical Society，P，1(1994)]。PNA可設計成，與含有與青光眼有關的突變的基因特異雜交的探針。PNA探針和與青光眼有關的突變基因雜交，是對疾病的診斷。
在本發(fā)明的另一個方法中，如果基因中的突變導致限制位點的產(chǎn)生或消除，那么通過限制性消化的突變分析，可以用來檢測突變基因。從測試個體獲取含有基因組DNA的測試樣品。聚合酶鏈反應(PCR)可用于擴增從測試個體獲取的基因組DNA測試樣品中的與青光眼有關的基因(如果必要，側翼序列)。如所述方式進行RFLP分析(參閱Current Protocols in MolecularBiology，同上)。相關DNA片段的消化模式顯示，存在或不存在與青光眼有關的突變。
序列分析也可用于檢測基因中的特異突變。從測試個體獲取DNA測試樣品。PCR可用于擴增基因，和/或其側翼序列。使用標準方法確定與青光眼有關的基因序列，或基因片段。將基因(或基因片段)序列與已知基因核酸序列比較。存在任何如上所述的與青光眼有關的突變，表示個體患有、或攜帶青光眼。在這種方法的一個具體實施中，這樣的序列分析可用于確定CYP1B1基因中的與青光眼有關的突變。
通過使用擴增基因產(chǎn)品與等位基因特異寡核苷酸(ASO)探針的斑點-印跡雜交，等位基因特異寡核苷酸也可用來檢測與青光眼有關的突變的存在[參閱如，Saiki，R.et al.，(1986)，Nature(London)324163-166]。“等位基因特異寡核苷酸”(本文也指“等位基因特異寡核苷酸探針”)是指約10-50個堿基對的寡核苷酸，較好的是約15-30個堿基對，其與含有與青光眼有關的突變的基因特異雜交。使用標準方法，可配制對與青光眼有關的基因中的特定突變有特異性的等位基因特異寡核苷酸探針。為確定與青光眼有關的基因中的突變，從測試個體獲取DNA測試樣品?？捎肞CR擴增所有與青光眼有關的基因或片段，及其側翼序列。使用標準方法，將含有被擴增的與青光眼有關的基因(或基因片段)的DNA進行斑點-印跡處理(參閱Current Protocols inMolecular Biology，同上)，將印跡與寡核苷酸探針接觸。這樣，即可測得被擴增的與青光眼有關的基因與探針存在的特異雜交。從個體獲取的DNA與寡核苷酸探針的特異雜交，表示與青光眼有關的基因中的突變與青光眼是有關的，因此是對疾病的診斷。
對青光眼的診斷，也可通過檢測與青光眼有關的基因所編碼的蛋白質的表達來完成。對從個體獲取的測試樣品進行存在與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達的變化的評價。與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達的變化，可能是蛋白質表達量的變化(如，產(chǎn)生蛋白質的量)；蛋白質表達質的變化(如，蛋白質的組成)，或兩者都有。本文所用的蛋白質表達的“變化”是指，對照樣品中的與青光眼有關的基因編碼蛋白質的表達，與測試樣品中的蛋白質的表達相比的變化。對照樣品是與測試樣品相對應的樣品(如，取自同類細胞)，是從沒有患青光眼的個體獲取的。與對照樣品比較，在測試樣品中的蛋白質表達的變化，表示患有青光眼。可使用多種方法檢測與青光眼有關的基因所編碼的蛋白質的表達，包括光譜法、比色法、電泳法、等電聚焦法和免疫印跡法(參閱Current Protocols in Molecular Biology，特指10章)。例如，Western印跡分析法，使用與突變基因編碼蛋白質特異結合的抗體，或與非突變基因編碼蛋白質特異結合的抗體，可用來確定，在測試樣品中，存在與青光眼有關的突變基因編碼的蛋白質，或在測試樣品中不存在非突變基因編碼的蛋白質。存在突變基因編碼的蛋白質，或不存在非突變基因編碼的蛋白質，是對青光眼的診斷。
在這種方法的一個具體實施中，將測試樣品中的與青光眼有關的基因編碼蛋白質的量或濃度，與對照樣品中的與青光眼有關的基因編碼蛋白質的量或濃度相比較。在測試樣品中的蛋白質的量或濃度比對照樣品中的蛋白質的量或濃度高或低，這樣，統(tǒng)計上顯著的差別，表示了與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達中的變化，這種變化是與疾病有關的。另外，將測試樣品中的與青光眼有關的基因編碼蛋白質的組成，與對照樣品中的與青光眼有關的基因編碼蛋白質的組成相比較。與對照樣品中的蛋白質組成相比較，在測試樣品中的蛋白質組成的差別，表示患有青光眼。在另一個具體實施中，在測試樣品中和對照樣品中，蛋白質的濃度或量以及組成可以測定。測試樣品中的蛋白質的濃度或量與對照樣品相比的差別；測試樣品中的蛋白質組成與對照樣品相比的差別；濃度或量和組成的兩種差別，表示患有疾病。
本發(fā)明還涉及，與青光眼有關的基因所編碼的突變蛋白質的抗體。本文所用的“突變蛋白質”，是指與青光眼有關的突變基因編碼的蛋白質或蛋白質片段。一旦與青光眼有關的基因中的突變被確定了，由突變基因編碼的蛋白質或蛋白質片段(本文也稱作有關蛋白質)也就可被確定，并且使用標準方法可以培養(yǎng)蛋白質或蛋白質片段的抗體(參閱Current Protocols in MolecularBiology，同上)。本文所用的“抗體”，包括多克隆和單克隆抗體，以及一種以上的與蛋白質或蛋白質片段反應的抗體的混合物(如不同類型的與突變蛋白質或蛋白質片段反應的單克隆抗體的合劑)。抗體進一步包括全部抗體和/或其生物功能片段、含有取自多種物種蛋白質的嵌合抗體、人源化抗體、類人類抗體、雙功能抗體。生物功能抗體片段是，足以與有關蛋白質結合的那部分片段。
和與青光眼有關的基因編碼突變蛋白質反應的單克隆抗體(mAb)，可使用體細胞雜交技術[Kohler and Milstein，Nature256495-497(1975)]或其他技術制備。在典型的雜交工藝中，與青光眼有關的基因編碼的、未提純或提純的突變蛋白質可用作免疫原。用免疫原使動物免疫，以獲取產(chǎn)生抗體的脾細胞。根據(jù)所需mAb的特異性，免疫動物的種類可以是不同的。產(chǎn)生抗體的細胞與不死細胞(如骨髓瘤細胞)相融合，產(chǎn)生一種雜交細胞，其能分泌本發(fā)明突變蛋白質的抗體。除去未融合的殘留產(chǎn)生抗體的細胞和不死細胞。產(chǎn)生所需抗體的雜交細胞，是使用傳統(tǒng)的技術選取的，選取的雜交細胞被克隆、培養(yǎng)。
多克隆抗體可用上述產(chǎn)生單克隆抗體相似的方式，通過免疫動物制備。將動物保留在所制備的抗體能同與青光眼有關的基因編碼突變蛋白質反應的條件下。當抗體達到所需的滴定度時，收集動物的血液。將含有多克隆抗體(抗血清)的血清與血液的其他組分分離。含有多克隆抗體的血清可進一步選擇地分成含有特種類型抗體的組分(如IgG，IgM)。
和與青光眼有關的突變基因編碼蛋白質或蛋白質片段特異結合的抗體(如和突變基因編碼蛋白質片段或蛋白質結合，但不和基因非突變復制編碼蛋白質結合)，也可用在診斷方法中。將含有與青光眼有關的基因編碼蛋白質的測試樣品與抗體接觸；抗體與蛋白質的結合，表示存在突變基因編碼的蛋白質，即診斷了疾病。
本發(fā)明還包括使用在發(fā)明方法中的試劑盒。試劑盒包括獲取測試樣品的裝置；核酸探針，PNA探針，或等位基因特異寡核苷酸探針；適當?shù)脑噭?；針對與青光眼有關的基因編碼的蛋白質的抗體；實施發(fā)明方法的說明；對照樣品；和/或其他組成。
本發(fā)明還涉及治療青光眼的方法。青光眼可通過服用藥劑治療，服用后，改善、緩解、減輕青光眼癥狀的嚴重性，或消除癥狀。如，可以服用和與青光眼有關的基因編碼突變蛋白質特異結合的抗體，以減輕或消除突變蛋白質的活性。另外，與青光眼有關的基因編碼的非突變蛋白質，也可作為治療青光眼的治療劑服用。在另一個具體實施中，也可服用模仿與青光眼有關的基因編碼蛋白質(突變蛋白質)的活性的藥劑，以補充或替代與青光眼有關的基因編碼蛋白質的活性。如，可以使用和與青光眼有關的基因編碼突變蛋白質具有相同生物活性的肽。可根據(jù)與青光眼有關的基因編碼蛋白質的結構設計制備Peptidomimetics(不是多肽分子，但模仿多肽的結構)。也可制備與蛋白質含有相同官能團，并與蛋白質具有相同功能的多糖。另外，藥劑文庫，如，可用組合化學已知的方法制成的藥劑文庫，可被用于測定另外的試劑。這樣的藥劑可用標準方法分離，如通過試劑與，也和與青光眼有關的基因編碼蛋白質特異結合的抗體的相互作用來分離。
在另一個具體實施中，使用了誘發(fā)或加強有關基因表達的藥劑，這樣，有關基因編碼蛋白質的表達補充或替代了突變蛋白質的活性。替代或補充突變蛋白質的活性，會減輕或消除青光眼的生理病因，因此治療了疾病。這樣的藥劑包括蛋白質，肽，peptidomimetics，抗體，或其他誘發(fā)或加強有關基因表達的小分子。如，誘發(fā)或加強家族細胞色素p450中另一種蛋白質的表達的試劑，通過補充或替代突變CYP1B1基因的活性，可用來治療先天青光眼。另外，如采用WO95/31560中所述的方法，也可制備誘發(fā)或加強有關基因表達的DNA結構物。
此外，為了靶中突變蛋白質并減輕或消除其活性，和與青光眼有關的基因編碼突變蛋白質特異結合的抗體，可與上述任何藥劑同時服用，或之前，之后服用。
青光眼也可通過服用基因，基因轉運載體，或其他核酸結構物治療?？商峁┙o個體，與青光眼有關的基因(或基因的cDNA)的非突變復制，或與青光眼有關的基因(或cDNA)的非突變復制mRNA。如，可服用含有與青光眼有關的非突變基因的基因轉運載體，在患青光眼個體中表達非突變基因?；蜣D運載體也可包含組織特異啟動子，以及其他單元(如加強單元，拼接信號，終止及聚腺苷酸化信號，病毒復制，細菌質粒序列，或其他載體核酸序列)。載體的運送可以靶向專門的區(qū)域或細胞類型(如使用修飾脂質體，或在身體的特定區(qū)域引入載體)。另外，提純的DNA或mRNA也可用作治療劑，如在WO 93/19183或WO90/11092中所述。這些方法也可來引入有關基因，這樣，有關基因編碼蛋白質的表達補充了或替代了突變蛋白質的活性。
在另一個具體實施中，使用了靶向與青光眼有關的突變基因、并通過整合或同源重組“修正”突變的核酸結構物。如，在WO90/09222中描述了結構物使用同源重組，提供DNA編碼治病的蛋白質或肽。如上所述的基因療法，通過直接給個體服用治療劑，可靶向活體細胞。另外，基因療法也可以靶向體外細胞，如從個體中移出的細胞；然后，將治療后的細胞重植入個體。上面段落中引用的出版物的全部內容參考收入本篇。
治療劑，包括上面描述的藥劑，連同上面描述的與基因治療有關的基因轉運載體、DNA、和/或mRNA，可采用眼科用藥，皮下注射用藥，靜脈注射用藥，肌肉注射用藥，局部用藥，口服用藥，直腸用藥，陰道用藥，鼻用藥，口腔用藥，通過吸入噴霧，或通過植入貯器方式用藥。在一個較好的具體實施中，治療劑對眼睛用藥，如采用局部用藥(如眼睛滴液或乳劑)。它們也能以包含傳統(tǒng)無毒藥用可接受的載體，輔劑和/或賦形劑的配方劑用藥。服用藥劑的形式(如膠囊，片劑，溶液，乳劑)，至少部分取決于藥劑服用的途徑。藥劑治療有效量是指顯著減輕或消除與青光眼有關癥狀的必要量。治療有效量依據(jù)個體而定，并且至少部分取決于，對藥劑、個體體重和性別、需治療癥狀的嚴重性、所需效果的考慮。這樣，通過考慮這些因素和實施常規(guī)試驗，治療有效量可由此領域中普通技術人員確定。
治療有效量可以由適當?shù)拈g隔，如小時、天、周分成的系列劑量服用。另外，治療有效量也可單劑服用。本文所用的“單劑”，可是單個劑量，也可是持續(xù)釋放劑量，如采用持續(xù)浸劑的控釋用藥配方。其他藥物可隨藥劑一起服用。
本發(fā)明由下列實例進一步說明。實例 與青光眼篩查組有關的基因的確定，及位點的確定使用17個患有原發(fā)性先天青光眼家族的篩查測試組[Sarfarazi，M.et al.，Genomics 30171(1995)；Turacli，M.E.et al.，Ophthamol.16359(1995)]。排除一些基因和候選染色體區(qū)域后[Akarsu，A.N.et al.，Am.J.Med Genet.62102(1996)]，對于原發(fā)性先天青光眼，基因組的隨機篩查定位在兩個位點，GLC3A[2p21 Sarfarazi，M.et al.，Genomics 30171(1995)]和GLC3B[1p36 Akarsu，A.N.et al.，Hum.Mol.Genetics.51199(1996)]，有證據(jù)顯示對于這種情況至少有一個其他未制圖的位點。在2p21上的GLC3A位點，最近在沙特阿拉伯的25個家族的另一個測試組中已經(jīng)證實[Bejjani，B.A.et al.，Am.J.Human Genet.59 suppl.，A212-1216(1996)]。在另外兩個家族中也得到確定。因此，對于這種情況，GLC3A位點是以主要位點出現(xiàn)的，近85％的測試家族與這個位點連鎖。
近親家族患病成員中純合子的最小保留片段的重要重組事件和檢定，將GLC3A主要候選區(qū)域減小到約2.5cM，由標記D2S2186和D2S1346各在一側。這個候選區(qū)域如圖1所示。著絲粒方向和端粒方向分別標出。錨定在染色體2放射雜交圖上的位點[Hudson，T.et al.，Science 2701945(1995)]被框出。從染色體2頂端的距離用cR或cM標出。灰色陰影區(qū)域表示GLC3A的候選區(qū)域，用標記D2S2186[Bejjani，B.A.et al.，Am.J.Hum.Genet.59 suppl.，A212/1216(1996)]和D2S1346標記[Sarfarazi，M.et al.，Genomics 30171(1995)]由重組事件確定。黑邊框表示在近親家族中觀察到的純合子的最小片段。黑色水平箭頭表示一段間隔，在其間對特定基因制圖。
有三個基因預先繪制在2p21區(qū)域上非紅細胞形式的β-血影蛋白或β-胞襯蛋白(SPTBN1)[Chang，J.G.et al.，Genomics17287(1993)；Hu，R.J.et al.，Biol.Chem.26718715(1992)]；Ras的鳥嘌呤核苷酸交換因子(hSOS1)[Chardin，P.et al.，Science2601338(1993)；Webb，G.C.et al.，Genomics 1814(1993)]；和干擾素誘導dsRNA依賴蛋白質激酶(PRKR)[Barber，G.N.et al.，Genomics 16765(1993)；Squire，J.et al.，ibid 16768(1993)；Hanash，S.M.et al.，Genes Chromosom Cancer 834 1993)]。對于這種情況，這些基因是可能的候選基因。通過用GeneBridge 4放射雜交(RH)測試組篩查它們，及繪制它們相對于WhiteheadRh框架的圖(Hudson，T.et al.，Science 2701945(1995))，來精確基因位置。使用91細胞系的原始MIT順序。在WhiteheadInstitute for Genome Research的制圖服務器上，對RH數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。詳細RH圖譜資料可從http//www-genome.wi.mit.edu網(wǎng)址獲取。RH測試組的篩查，通過基因特異聚合酶鏈反應試驗完成。較好的是，測試內含子或3-前導非翻譯序列，以防止地鼠DNA本底的交叉擴增。這些基因的圖譜位置確定如下(見圖1)SPTBN1距標記WI-4077為1.51cR(LOD＞3.0)；hSOS1距標記WI-10326為1.51 cR(LOD＞3.0)；PRKR距D2S177為1.51cR(LOD＞3.0)。因此，由于SPTBN1位于D2S1356的著絲粒方向，這樣作為GLC3A的候選基因就被排除了。
檢測包含GLC3A位點的重疊克隆系圖[Hudson，T.et al.，Science 2701945(1995)；Shuler，G.D.et al.，Science 274540(1996)]，顯示出標記WI-7936距D2S177非常近。這個序列標志位點(STS)與人類細胞色素P4501B1基因相對應[Sutter，T.R.et al.，J.Biol.Chem.26913092(1994)]。當BLAST研究確定，從該基因的3-前導非翻譯區(qū)域已衍生得到表達序列標簽(EST)標記TIGR-A004S39時[Popielarz，M.et al.，J.Biol.Chem.27017830(1995)]，編碼9G8拼接因子(SERS7)的第五個基因就確定了。在染色體2RH圖上，這個EST已經(jīng)繪制在標記D2S177旁邊[Hudson，T.et al.，Science 2701945(1995)；Shuler，G.D et al.，Science 274540(1996)]。所有這些基因認為是潛在的候選基因；將幾個基因的編碼序列用直接測序法進行突變篩查。
將單層人類皮膚成纖維細胞保存在37℃ CO2孵化器中，置于補充了10％的牛胎血清和抗生素(青霉素-G，硫酸鏈酶素，Gibco/BRL，目錄號15140-015)的MEM介質(Gibco/BRL，目錄號11095-080)中。依據(jù)生產(chǎn)商的原型，用TRIzol(Gibco/BRL)試劑制備全部RNA。第一條鏈的合成是用50ng隨機六位體，從10μl的RNA樣品啟動的。反應在20mM Tris-HCl(pH 8.4)，40mM KCl，2.5mM MgCl，0.5mM每種dNTP，0.01M DDT，和200USuperScript II RT中，總體積20μl，42℃進行1小時。CYP1B1基因的編碼序列用cDNA基的引物擴增CYP1(CYP1F 5’-GGTTCCTGTTGACGTCTTG-3’(SEQ ID NO.2)，CYP1R 5’-CTTCCAGTGCTCCGAGTAG-3’(SEQ ID NO.3)；CYP2(CYP2F 5’-GTGGTGCTGAATGGCGAG-3’(SEQ ID NO.4)，
CYP2R 5’-TACTGCAGCCAGGGCATC-3’(SEQ ID NO.5)；CYP3(CYP3F 5’-GTGGCCAACGTCATGAGTG-3’(SEQ ID NO.6)，CYP3R 5’-TCATAAAGGAAGGCCAGGAC-3’(SEQ ID NO.7)；CYP4(CYP4F 5’-AGACTCGAGTGCAGGCAG-3’(SEQ ID NO.8)，CYP4R 5’-TCCTCATCTCCGAAGATGGT-3’(SEQ ID NO.9)；依據(jù)生產(chǎn)商的要求，用重組Taq聚合酶(Gibco/BRL)進行PCR擴增。擴增的PCR片段直接提純，或用Wizard PCR preps DNA提純系統(tǒng)(Promega)從瓊脂糖凝膠中提純。在ABI-373測序儀(Perkin Elmer)上用Taq聚合酶FS進行染色終止子測序。
首先，篩查hSOS1和PRKR基因的編碼序列；當沒有觀察到序列變異型時，CYP1B1基因的突變篩查就完成了。
這種篩查的結果是，確定了13個堿基對同源缺失(家族26，患病個體10)，核苷酸1410到1422[即，GAGTGCAGGCAGA(SEQ ID NO.1)]從CYP1B1基因的編碼序列(即，外顯子III)移出。這種突變導致移碼，截斷開放讀框，即在缺失下游的203個堿基對(或最后原始氨基酸Thr-354后的68個氨基酸)處產(chǎn)生提前出現(xiàn)的終止密碼子(TGA)。確定基因內含子/外顯子的接合，以對基因組DNA篩查進一步測試。使用cDNA基的引物組CYP1-4作大范圍的PCR擴增，以發(fā)現(xiàn)含有CYP1B1編碼序列的基因組區(qū)域。將從含有YAC806-F-8株系制備的全部酵母DNA[Hudson，T.et al.，Science 2701945(1995)]用作模板。在總體積50μl，含有60mM Tris-SO4(25℃pH 9.1)，18mM(NH4)2SO4，1.5mM MgSO4，0.2mM每種DNTP，和2μl eLONGase酶混合物(Gibco/BRL)中，用20pmol的每種引物，對約50ng的全部酵母DNA進行PCR擴增。擴增條件包括在94℃1分鐘的初始變性，接著在94℃進行35個周期的變性30秒，在53℃退火30秒，在68℃延伸6分鐘。結果，尺寸范圍從1kb到3kb的四個PCR片段被擴增。如上所述，對這些片段進行提純和測序。通過比較擴增片段的序列和參考cDNA的序列，確定CYP1B1基因中的內含子/外顯子的接合[Sutter，T.R.et al.，J.Biol.Chem.26913092(1994)]。為從基因組DNA擴增CYP1B1編碼序列，安裝了三個引物組。在所述長距離PCR(1.6kb)條件下，為了對于外顯子II進行擴增，將引物CYP1F與內含子引物5’-CCTCCCAGAGGCTTTACCT-3’(SEQ ID NO.1O)配對。對于位于外顯子III中的編碼區(qū)域的擴增，將內含子引物5’-TAAGAATTTTGCTCACTTGC-3’(SEQ ID NO.11)與引物CYP4F(693個堿基對片段)配對。包含CYP1B1編碼序列3’-末端的134個堿基對，用引物5’-TCAATGTCACTCTCAGAGAG-3’(SEQ ID NO.12)和CYP4R擴增?？偨Y得出，CYP1B1基因含有三個外顯子和兩個內含子，如表1所示。
表1 CYP1B1基因中的外顯子
*3121堿基對3’-非翻譯的序列基因結構如圖2所示。數(shù)字表示基因的cDNA序列，編碼區(qū)域用黑色表示。基因的全部編碼序列包含在外顯子II和III中。本文所確定的CYP1B1的基因結構與最近公開的結果[Tang，Y.M.et al.，J.Biol.Chem.27128324(1996)]一致。
通過對含有缺失區(qū)域的124個堿基對PCR片段的丙烯酰胺凝膠電泳，在家族26及其疾病顯型的近親中，存在13個堿基對的缺失得到證實。為進行快速突變篩查，用CYP3R以及引物5’-CAAACAGGTATCCTGATGTG-3’(SEQ ID NO.17)，將含有13個堿基對缺失的124個堿基對從基因組DNA擴增。將PCR產(chǎn)品在含有5％丙烯酰胺/Bis溶液(19∶1)，15％脲，1XTBE(參閱圖3A)的聚丙烯酰胺微量凝膠上進行分析。在另一個家族(家族17圖3A)中也檢測到了相同的13個堿基對缺失，并隨后證實以區(qū)別顯型疾病的成員。在雜合子個體中觀察到的第三帶表示異源雙鏈。家族17是患病父親和正常母親的近親婚配。在這樣的家系中，對于13個堿基對缺失，父親是純合子，而母親是同樣缺失的雜合子。因此，所有患病的和正常的后代單獨從其父親遺傳缺失的單一復制，而患病的后代，另外從其母親遺傳13個堿基對缺失。
通過上述快速突變篩查，在另外兩個家族(家族10和11)中觀察到了第二種突變，他們表現(xiàn)出，在位于外顯子II(圖2和圖3B)中核苷酸位置1209和1214之間的六個胞嘧啶片段上，額外胞嘧啶的純合插入。這也證實了是一種移碼突變，產(chǎn)生了提前出現(xiàn)終止密碼子(TAG)，在插入位置下游的106個堿基對(或原始氨基酸Pro-289下游的36個氨基酸)處。
在另一個近親家族(家族15)中，檢測到了第三種突變。這是開始于內含子II的大型缺失，移出了某部分外顯子III的編碼序列，超過了上面提到的13個堿基對的缺失(圖2，3C)。采用上述快速突變篩查測試法。將在外顯子III中檢測到的突變，用引物5’-GACAAGTTCTTGAGGCACTGC-3’(SEQ ID NO.18)和5’-ACGTTCTCCAAATCCAGCC-3’(SEQ ID NO.19)從基因組DNA擴增。將擴增的片段在變性條件下(1M脲，50-54℃)，在測序類丙烯酰胺凝膠上進行電泳。通過銀著色使凝膠可視。PCR擴增模型顯示外顯子III的5-始端和相鄰的內含子區(qū)域缺失，但外顯子的3-始端保持完整(圖3C)。上面的帶表示含有完整外顯子II和相鄰5-始端內含子的1.6kb片段。第二個片段含有外顯子III中完整的編碼序列。最小的擴增產(chǎn)品含有從CYP1B1編碼序列的3’-末端的134個堿基對。由于內含子II的3-始端拼接受體位點已經(jīng)缺失，這種突變應會干擾CYP1B1基因的正常拼接，導致截斷蛋白質的合成，或無等位基因。
在個體中檢測到第四種突變。這種突變是核苷酸1546-1555的10個堿基對的重復(TCATGCCACC，SEQ ID NO.20)，導致了產(chǎn)生提前出現(xiàn)終止密碼子的移碼突變。提前出現(xiàn)終止密碼子導致氨基酸403后所有氨基酸缺失(最后140個氨基酸缺失)。
對隨機選取的正常個體(330個土耳其人，140個其他白種人)進行470個染色體分析，沒有檢測出上述四種突變等位基因存在，使這些序列變異型表示罕見多態(tài)現(xiàn)象的可能性變小。這些突變僅在18個患病個體中觀察到了，而沒有在全部7個家族(包括5個近親家族)的正常成員，和那些肯定沒有攜帶這些突變的家族的正常群體中觀察到，這有力地說明了，CYP1B1基因是位于2p21上的GLC3A的基因。
第五種突變是核苷酸1737上的胞嘧啶的單個堿基缺失。這種突變同樣導致，產(chǎn)生提前出現(xiàn)終止密碼子的移碼突變。提前出現(xiàn)終止密碼子導致80個氨基酸的缺失(氨基酸463后的全部氨基酸)。
第六種突變是核苷酸1188單個堿基，G→T的轉換。這種突變，在氨基酸281后，產(chǎn)生提前出現(xiàn)TAA終止密碼子，導致從全長蛋白質上移出263個氨基酸。
核苷酸1482上單個堿基對C→T的轉換也被檢測到。這種改變導致脯氨酸到亮氨酸氨基酸編碼的改變。
其他突變也已經(jīng)被確定。這些突變或是散發(fā)性的，或是家族性的，在不同地域群體中的(土耳其，美國，巴基斯坦，英國，西班牙，法裔加拿大地區(qū)的家族)，一個或多個個體或家族中發(fā)現(xiàn)。所發(fā)現(xiàn)的突變有核苷酸517上的單個堿基的改變(G→T轉換)，導致了從色氨酸到半胱氨酸編碼氨基酸的改變；核苷酸528上的單個堿基的改變(G→A轉換)，導致了從甘氨酸到谷氨酸編碼氨基酸的改變；核苷酸846上插入胸腺嘧啶，造成移碼突變，導致從蛋白質的羧基端377個氨基酸的缺失；核苷酸1439上的單個堿基的改變(G→T轉換)，導致了從甘氨酸到色氨酸編碼氨基酸的改變；核苷酸1505上的單個堿基的改變(G→A轉換)，導致了從谷氨酸到賴氨酸編碼氨基酸的改變；核苷酸1515上的單個堿基的改變(G→A轉換)，導致了從精氨酸到組氨酸編碼氨基酸的改變；核苷酸1656上的單個堿基的改變(C→T轉換)，導致了從脯氨酸到亮氨酸編碼氨基酸的改變；核苷酸1691上缺失單個堿基(G)，造成移碼突變，導致從蛋白質的羧基端95個氨基酸的缺失；核苷酸1751上的單個堿基的改變(C→T轉換)，導致了從精氨酸到色氨酸編碼氨基酸的改變；開始于核苷酸1749的27個核苷酸的重復，造成移碼突變，導致從蛋白質的羧基端76個氨基酸的缺失。
上面描述的突變在表2中歸納列出。表2中的“蛋白質中的位置”是指含有突變的蛋白質結構的區(qū)域；“限制位點”是指限制位點的加入或缺失。限制位點中的改變可以被使用，例如，按照以上所述，通過限制酶消化進行突變分析。前五個突變是在外顯子II內；剩余的突變作用外顯子III。
表2與原發(fā)性先天青光眼有關的突變
**位置是核苷酸改變、插入、或缺失的位置，或核苷酸重復開始的位置，除非另外指出。
如果，上述突變基因產(chǎn)生了穩(wěn)定的蛋白質，那么，該產(chǎn)品應會從羧基端缺少從80到377氨基酸。這個片段含有眾所周知的細胞色素P450氨基酸序列非變異型半胱氨酸(即，CYP1B1的Cys-470)。這個殘基提供了軸鍵正鐵血紅素配位體，定義了細胞色素P450蛋白質的許多功能和光譜特性[Hudson，T.et al.，Science 2701945(1995)；Gonzalez，F(xiàn).J.，Pharmacol.Rev.40243(1989)]。相鄰的殘基Phe-463到Gly-472，與蛋白質序列模式相對應，確定了細胞色素P450的半胱氨酸正鐵血紅素-鐵配位體[記號序列(PROSITE accession)PS00086；Hudson，T.et al.，Science 2701945(1995)；Bairoch，A.，Nucl.Acids Res.20(suppl)2013(1992)]。這種重要的區(qū)域的移出，會干擾截斷的分子實施正常的生理功能的能力。
CYP1B1編碼序列核苷酸1640上G到C的轉換，將Val-432改變?yōu)長eu，也已經(jīng)檢測到(圖2)。所發(fā)現(xiàn)的是，這個改變將建立Eco57I限制位點，從而提供了快速篩查法。對總計70個正常個體(47個土耳其人和23個其他白種人)進行是否存在或不存在此種改變的篩查。36個個體(51.4％)發(fā)現(xiàn)是此種改變的雜合子。剩余34個是純合子個體(48.6％)。27個測試個體含有亮氨酸，7個個體含有纈氨酸。這種改變所處的氨基酸的位置不是CYP1B1保留序列的部分；而且，纈氨酸和亮氨酸都是中性親水氨基酸，帶有相似的脂族側基，僅有單個CH2基團不同。這樣，這種改變表示的是與顯型原發(fā)性先天青光眼不相關的多態(tài)現(xiàn)象。等同物原則本領域的技術人員僅使用常規(guī)的試驗，即能辨別或確定本文特定描述的發(fā)明的具體實施的許多等同物。這樣的等同物都將包含在下列權利要求書的范圍內。
序列表(1)通用資料(i)申請人/發(fā)明人(A)名稱康涅狄格大學The University of Connecticut(B)街道213 Whetten Graduate Center438 Whitney Road Extension(C)城市Storrs(D)州/省康涅狄格Connecticut(E)國家美國U.S.A.
(F)郵編/區(qū)號06269-1133(i)申請人/發(fā)明人(A)名稱Mansoor Sarfarazi(B)街道395 Brittany Farms Road，#212(C)城市New Britain(D)州/行政區(qū)康涅狄格Connecticut(E)國家美國U.S.A.
(F)郵編/區(qū)號06053(ii)發(fā)明題目青光眼的診斷和治療Diagnosis and Treatment of Glaucoma(iii)序列號；20(iv)通信地址(A)地址David E.Brook，Esq.
(B)街道Hamilton，Brook，Smith & ReynoldsP.C.Tow Militia Drive(C)城市Lexington(D)州麻薩諸塞Massachusetts(E)國家美國U.S.A.
(F)郵編；02173(v)計算機數(shù)據(jù)形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件；Patent In Release#1.0，Version#1.30(vi)當前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)申請日期(C)類別(vii)在前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/926,492(B)申請日期1997年9月13日(vii)在前申請數(shù)據(jù)；(A)申請?zhí)朥S 08/800,036(B)申請日期1997年2月13日(viii)律師/代理人資料(A)名稱Brook，David E.
(B)注冊號22,592(C)文獻/摘要號UCT97-01(ix)通訊資料；(A)電話(617)861-6240(B)電傳(617)861-9540(2)關于SEQ ID NO；1；(i)序列特征；(A)長度13堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO1；GAGTGCAGGC AGA(2)關于SEQ ID NO2；序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；2；GGTTCCTGTT GACGTCTTG(2)關于SEQ ID NO3；(i)序列特征；(A)長度；19堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；3；CTTCCAGTGC TCCGAGTAG(2)關于SEQ ID NO4；(i)序列特征；(A)長度；18堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；4；GTGGTGCTGA ATGGCGAG(2)關于SEQ ID NO5；(i)序列特征；(A)長度；18堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；5；TACTGCAGCC AGGGCATC(2)關于SEQ ID NO6；(i)序列特征；(A)長度；19堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；6；GTGGCCAACG TCATGAGTG(2)關于SEQ ID NO7；(i)序列特征；(A)長度；20堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；7；TCATAAAGGA AGGCCAGGAC(2)關于SEQ ID NO8；(i)序列特征；(A)長度；18堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；8；AGACTCGAGT GCAGGCAG(2)關于SEQ ID NO9；(i)序列特征；(A)長度；20堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；9；TCCTCATCTC CGAAGATGGT(2)關于SEQ ID NO9；(i)序列特征；(A)長度；20堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；9；TCCTCATCTC CGAAGATGGT(2)關于SEQ ID NO10；(i)序列特征；(A)長度；19堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；10；CCTCCCAGAG GCTTTACCT(2)關于SEQ ID NO11；(i)序列特征；(A)長度；20堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；11；TAAGAATTTT GCTCACTTGC(2)關于SEQ ID NO12；(i)序列特征；(A)長度；20堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；12；TCAATGTCAC TCTCAGAGAG(2)關于SEQ ID NO13；(i)序列特征；(A)長度；11堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；13；CGCAGGTCAG T(2)關于SEQ ID NO14；(i)序列特征；(A)長度；10堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；14；CCCAGCATGG(2)關于SEQ ID NO15；(i)序列特征；(A)長度；11堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；15；ACCAGGTAAA G(2)關于SEQ ID NO16；(i)序列特征；(A)長度；10堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；16；AACAGGTATC(2)關于SEQ ID NO17；(i)序列特征；(A)長度；20堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；17；CAAACAGGTA TCCTGATGTG(2)關于SEQ ID NO18；(i)序列特征；(A)長度；21堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；18；GACAAGTTCT TGAGGCACTG C(2)關于SEQ ID NO19；(i)序列特征；(A)長度；19堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；19；ACGTTCTCCA AATCCAGCC(2)關于SEQ ID NO20；(i)序列特征；(A)長度；10堿基對(B)類型；核酸(C)鏈型；單鏈(D)拓撲；線性(xi)序列描述；SEQ ID NO；20；TCATGCCACC
權利要求
1.一種個體青光眼的診斷方法，包括檢測與青光眼有關的基因中的突變，其中，基因中存在突變的表示患有青光眼。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，與青光眼有關的基因中的突變的存在，是通過限制性消化直接突變分析檢測的。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，與青光眼有關的基因中的突變的存在，是通過核酸探針與測試樣品中的與青光眼有關的基因的雜交檢測的。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，與青光眼有關的基因中的突變的存在，是通過肽核酸探針與測試樣品中的與青光眼有關的基因的雜交檢測的。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，與青光眼有關的基因中的突變的存在，是通過對與青光眼有關的基因的序列分析檢測的。
6.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，與青光眼有關的基因中的突變的存在，是通過等位基因特異寡核苷酸探針與測試樣品中的與青光眼有關的基因的雜交檢測的。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，青光眼是開角型青光眼。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，與開角型青光眼有關的基因位于8q24。
9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其中，與開角型青光眼有關的基因位于10p。
10.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，青光眼是原發(fā)性先天青光眼。
11.根據(jù)權利要求10所述的方法，其中，與青光眼有關的基因是CYP1B1。
12.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，突變是一個或多個核苷酸的缺失。
13.根據(jù)權利要求12所述的方法，其中，突變是從包括下列缺失的組中選取的核苷酸1414-1422的缺失；核苷酸1727的缺失；內含子II和外顯子III的部分缺失；核苷酸1691的缺失。
14.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，突變是一個或多個核苷酸的插入。
15.根據(jù)權利要求14所述的方法，其中，突變是從下列組中選取的，包括在核苷酸1209-1214中單個胞嘧啶殘基的插入；在核苷酸846上單個胸腺嘧啶殘基的插入。
16.根據(jù)權利要求11的方法，其中，突變是幾個核苷酸的重復。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中，突變是從下列組中選取的，包括核苷酸1546-1555的重復；核苷酸1749-1775的重復。
18.根據(jù)權利要求11所述的方法，其中，突變是一個或多個核苷酸的改變。
19.根據(jù)權利要求18所述的方法，其中，突變是從下列組中選取的，包括核苷酸1428C到T的改變；核苷酸1187G到T的改變；核苷酸517G到C的改變；核苷酸528G到A的改變；核苷酸1439G到T的改變；核苷酸1505G到A的改變；核苷酸1515G到A的改變；核苷酸1656C到T的改變；核苷酸1751C到T的改變。
20.一種青光眼的診斷方法，包括檢測與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達的改變，其中蛋白質表達中存在改變的表示患有青光眼。
21.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，改變是與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達中的質的改變。
22.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，改變是與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達中的量的改變。
23.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，改變是與青光眼有關的基因編碼蛋白質表達中的量的改變和質的改變。
24.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，與青光眼有關的突變基因編碼蛋白質特異結合的抗體，在檢定蛋白質表達中使用。
25.根據(jù)權利要求20所述的方法，其中，與青光眼有關的非突變基因編碼蛋白質特異結合的抗體，在檢定蛋白質表達中使用。
26.一種用于診斷青光眼的試劑盒，包括和與青光眼有關的突變基因特異雜交的探針。
27.一種和與青光眼有關的突變基因特異雜交的核酸探針。
28.一種和與青光眼有關的突變基因特異雜交的肽核酸探針。
29.一種和與青光眼有關的突變基因編碼蛋白質特異結合的抗體。
30.與青光眼有關的基因編碼蛋白質在生產(chǎn)治療青光眼的藥劑中的應用。
31.和與青光眼有關的基因編碼蛋白質特異結合的抗體在生產(chǎn)治療青光眼的藥劑中的應用。
32.含有與青光眼有關的基因的核酸在生產(chǎn)治療青光眼的藥劑中的應用。
全文摘要
本文公開了,通過檢測與青光眼有關的基因中的突變,例如CYP1B1基因,診斷青光眼,尤其是原發(fā)性先天青光眼的方法。本文公開的方法包括雜交分析,如Southern或Northern分析,其使用的是突變核酸探針和與青光眼有關的基因雜交;使用限制消化酶的直接突變分析;對與青光眼有關的基因測序;等位基因特異寡核苷酸探針與擴增的基因組DNA的雜交;或確定與青光眼有關的基因編碼突變蛋白質的存在。本文也公開了在診斷青光眼中使用的工具。此外,本文公開了治療青光眼的方法,包括服用與青光眼有關的基因編碼的蛋白質;服用基因,基因結構物或其它的核酸結構物,或服用其他治療劑。
文檔編號C12P21/08GK1250484SQ98803289
公開日2000年4月12日 申請日期1998年2月12日 優(yōu)先權日1997年2月13日
發(fā)明者曼索爾·薩法雷茲 申請人:康涅狄格大學