專利名稱：修飾方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種修飾方法。
特別是，本發(fā)明涉及體內修飾方法。
半乳甘露聚糖是一類異源細胞壁多糖，它們由具有不同數(shù)目α-1-6連接的半乳糖側鏈的β-1-4連接方式甘露聚糖主鏈組成。
最主要工業(yè)使用的半乳甘露聚糖得自豆類瓜爾豆(Cyamopsistetragonolobus)和長角豆(Ceratonia siliqua)的胚乳。這些半乳甘露聚糖的半乳糖含量不同，瓜爾豆半乳糖與甘露糖之比大約為1∶1.6，而長角豆樹膠(LBG)的該比率大約為1∶34。
半乳糖含量的差異對瓜爾豆膠和LBG的功能性質具有顯著影響。這兩種半乳甘露聚糖低濃度(1-2％)下形成高粘度溶液，但LBG具有的另一性質是能夠形成具有其它多糖(諸如噸膠、角叉菜膠和瓊脂糖)的堅硬凝膠。食品工業(yè)將LBG廣泛用于乳制品(主要是冰淇淋)、色拉調料、調味汁、低卡路里產(chǎn)品和寵物食品。然而，LBG的使用由于價格高和供應不規(guī)律而受限制。
因此，希望大規(guī)模生產(chǎn)諸如因為提高甘露糖與半乳糖之比(諸如類似于LBG)而具有改進功能性質的半乳甘露聚糖。
由于瓜爾豆膠和LBG之間種屬化學的相似性，并且瓜爾豆膠的價格低得多，因此已經(jīng)試圖在體外將瓜爾豆膠轉化為具有類LBG性質和具有類似于LBG相似化學組成的半乳甘露聚糖。
這樣一種體外處理的實例包括使用α-半乳糖苷酶。在該方面，參見McCleary等1983和EP-A-0255153。
通過使用由瓜爾豆種子純化的α-半乳糖苷酶，獲得半乳糖含量為10-34％的瓜爾豆膠(Bulpin等1990)。改性瓜爾豆膠膠凝行為的分析表明，將凝膠與角叉菜膠混合形成的半乳糖含量為24％的制劑表現(xiàn)出的流變學性質與LBG相似。相比之下，未處理瓜爾豆膠的半乳糖含量為38％，LBG的半乳糖含量為23％。
然而，從工業(yè)觀點來看，瓜爾豆膠的體外脫半乳糖基涉及許多問題。
首先，由于必須除去瓜爾豆膠中大約40％的半乳糖，因此必須制備大量的α-半乳糖苷酶。
第二，在保溫期間，非常重要的是甘露聚糖主鏈不發(fā)生水解，必需使用高度純化的α-半乳糖苷酶制劑，以避免任何微量的甘露聚糖酶活性。已經(jīng)公布了從瓜爾豆膠種子異源生產(chǎn)α-半乳糖苷酶的方法(Overbeeke等1986)。然而，在研究對瓜爾豆膠作用之前，純化來自測試物種生產(chǎn)的α-半乳糖苷酶，提示甘露聚糖酶的問題仍有待解決。
第三，半乳甘露聚糖的產(chǎn)量降低，因為半乳糖含量降低40％相當于減少大約15％的改性瓜爾豆膠。在成品中，釋放的半乳糖可能是不希望有的，可能必須除去。
第四，在與α-半乳糖苷酶保溫期間有相當大的半乳甘露聚糖解聚風險。
此外，有污染微生物在釋放內源β-甘露聚糖酶的反應混合物上形成菌落的風險。
最后，必須從反應混合物中除去水。除該方法的費用外，也導致可以用來獲得最適反應條件的緩沖液濃縮。
這些實例證明，修飾瓜爾豆膠的現(xiàn)行方法牽涉多個問題，其中一些與相當大的費用有關。
因此，需要改進的瓜爾豆膠修飾方法。
在該方面，我們現(xiàn)在認識到，如果利用重組DNA技術在植物(諸如瓜爾豆植株)體內修飾含甘露糖/半乳糖的化合物(諸如瓜爾豆膠)將是有益的。
因此，廣義來講，本發(fā)明涉及在能夠合成該化合物的生物(或其部分)中含甘露糖/半乳糖化合物(諸如瓜爾豆膠)的體內修飾，其中該生物所用的方法對該生物為非天然的方法，諸如利用DNA技術的方法。發(fā)生的修飾可以與該化合物(例如甘露糖和/或半乳糖)的一個或多個前體有關，或與該化合物本身有關(即包含該化合物的一個化合物的甘露糖和/或半乳糖單元的修飾)。
特別是，本發(fā)明涉及一個體內修飾方法，它影響，最好是提高能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。該體內修飾方法不是天然產(chǎn)生的方法。
因此，使用本發(fā)明的體內修飾方法，可以改變生物體內內部甘露糖與半乳糖之比和/或其甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。
體內改性瓜爾豆膠生產(chǎn)的一個要求是將合適基因導入瓜爾豆的方法的實用性。這由Jrsboe和Okkels(1994)在有限程度上完成，他們轉移了一個可選擇或可篩選的用來開發(fā)轉化方法的基因。這些作者沒有報道用一個基因轉化影響甘露糖與半乳糖之比。從生物技術的觀點來看，這是重要的一點，生產(chǎn)體內改性的瓜爾豆膠的主要障礙是缺乏半乳甘露聚糖生物合成的知識。至今尚未分離并表征體內控制瓜爾豆膠生物合成的基因或基因產(chǎn)物。然而，我們現(xiàn)在已經(jīng)確定了控制瓜爾豆膠體內生物合成的某些基因或基因產(chǎn)物，因此我們能夠使瓜爾豆膠體內改性。
在一個推薦方面，本發(fā)明涉及一個體內修飾方法，它影響(最好是提高)能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，該體內修飾方法包括表達編碼一個基因產(chǎn)物的核苷酸序列，該基因產(chǎn)物具有的影響是(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；并且其中該核苷酸序列對該生物(或其部分)而言不是天然的核苷酸序列。
在另一推薦方面，本發(fā)明涉及一個體內修飾方法，它影響(最好是提高)能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，該體內修飾方法包括提供一個基因產(chǎn)物，該基因產(chǎn)物能夠影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；該方法影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；其中該基因產(chǎn)物尚未用對該生物(或其部分)為天然核苷酸序列的核苷酸序列表達。
本發(fā)明的另一廣義方面涉及使用一種核苷酸序列，以在體內影響(最好是提高)能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，其中編碼一基因產(chǎn)物的核苷酸序列影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；并且其中該核苷酸序列對該生物(或其部分)而言不是天然的核苷酸序列。
本發(fā)明的另一廣義方面涉及使用一種基因產(chǎn)物，以在體內影響(最好是提高)能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比，或含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，其中該基因產(chǎn)物影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；其中該基因產(chǎn)物尚未用對該生物(或其部分)為天然核苷酸序列的核苷酸序列表達。
“含甘露糖/半乳糖化合物”一詞是指包含至少一個甘露糖基團和至少一個半乳糖基團的化合物。
在這些推薦方面中的每個方面，該含甘露糖/半乳糖化合物最好為半乳甘露聚糖。
在這些推薦方面中的每個方面，更優(yōu)選該含甘露糖/半乳糖化合物為瓜爾豆膠。
在這些推薦方面中的每個方面，更優(yōu)選能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物為瓜爾豆植株，其含甘露糖/半乳糖化合物為半乳甘露聚糖。然而，包括其它產(chǎn)生半乳甘露聚糖的植物，諸如葫蘆巴和苜蓿。被認為不產(chǎn)生適量半乳甘露聚糖的植物屬于茄科和煙草種。
“能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)”也包括能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的任何合適生物，特別是植物，使得該生物甘露糖與半乳糖體內內部之比改變。該術語也包括能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物的任何部分，使得該部分的甘露糖與半乳糖之比改變。該術語也包括在生物內或在組織培養(yǎng)基中的部分。該部分最好是在該生物本身內。一個部分的一個實例是種子。
“對該生物而言為天然核苷酸序列”是指在其天然環(huán)境中并且操作性地連接與其天然相關的啟動子的整個核苷酸序列，該啟動子也在其天然環(huán)境中。
“甘露糖和半乳糖前體”包括作為含甘露糖/半乳糖化合物(最好是半乳甘露聚糖)生物合成前體的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物。另外，該術語包括隨后用作含甘露糖/半乳糖化合物(最好是半乳甘露聚糖)生物合成前體的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物。該術語最好是指用作含甘露糖/半乳糖化合物(最好是瓜爾豆半乳甘露聚糖)生物合成前體的甘露糖本身或其衍生物和/或半乳糖本身或其衍生物(諸如甘露糖-6-磷酸鹽或GDP-甘露糖)。
“基因產(chǎn)物”包括肽、多肽、蛋白質、酶和RNA，該術語最好是指酶。
該生物體(或其部分)內甘露糖與半乳糖之比或該生物的含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比最好高于該瓜爾豆植株或其半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比。
該生物體內甘露糖與半乳糖之比或該生物的含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比更優(yōu)選大致類似于長角豆或其半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比。
該生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物最好為瓜爾豆植株或瓜爾豆膠。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明方法制備的含甘露糖/半乳糖化合物。該含甘露糖/半乳糖化合物將稱為按照本發(fā)明的含甘露糖/半乳糖化合物。
此外，本發(fā)明也包括包含按照本發(fā)明的含甘露糖/半乳糖化合物的食料。
另外，本發(fā)明也包括包含按照本發(fā)明的含甘露糖/半乳糖化合物與另一種多糖混合的組合物，諸如一種食料。該另一種糖最好是任何一種或多種噸膠、角叉菜膠和瓊脂糖。
另外，本發(fā)明包括制備按照本發(fā)明組合物或食料的方法，它包含將按照本發(fā)明的含甘露糖/半乳糖化合物與另一合適組分混合。
用一種或多種合適策略，可以達到本發(fā)明的廣義方面，其中每種策略組成本發(fā)明的一個推薦實施方案。
第一種策略涉及一種或多種基因產(chǎn)物或其編碼核苷酸序列，其中這些基因產(chǎn)物可用于GDP-甘露糖的生物合成中。該策略涉及一種或多種編碼酶的基因的轉化，這些酶是GDP-甘露糖生物合成所需的，這些酶即為磷酸甘露糖異構酶(PMI)和/或GDP-甘露糖焦磷酸化酶。
在該方面，據(jù)信可用于GDP-甘露糖生物合成的一種或多種基因產(chǎn)物提高甘露糖-6-磷酸的水平，它隨后提高含甘露糖/半乳糖化合物(諸如半乳甘露聚糖)的甘露糖與半乳糖之比。
第一種策略的推薦方面涉及至少使用PMI和/或其編碼核苷酸序列。據(jù)信該PMI基因產(chǎn)物提高甘露糖-6-磷酸的水平，它隨后提高含甘露糖/半乳糖化合物(諸如半乳甘露聚糖)的甘露糖與半乳糖之比。更優(yōu)選該PMI為植物PMI。
第二種策略涉及使用α-半乳糖苷酶及其編碼核苷酸序列。用該策略，可以利用α-半乳糖苷酶，諸如來自番瀉樹或咖啡豆的α-半乳糖苷酶，以在體內改變含甘露糖/半乳糖化合物(諸如半乳甘露聚糖)的甘露糖與半乳糖之比。
第三種策略涉及第一種策略與第二種策略的組合，這些策略可以以任何順序使用或同時使用。
本發(fā)明的推薦方面涉及包含表達任何一種或多種本發(fā)明核苷酸序列的構建物。
本發(fā)明的另一推薦方面涉及包含或表達任何一種或多種本發(fā)明核苷酸序列的載體。
本發(fā)明的另一推薦方面涉及包含或表達任何一種或多種本發(fā)明的載體、構建物或核苷酸序列的質粒。
本發(fā)明的另一推薦方面涉及包含或表達任何一種或多種本發(fā)明的質粒、載體、構建物或核苷酸序列的轉基因生物(或其部分)。
本發(fā)明的其它推薦方面包括表達或允許表達或轉化任何一種或多種核苷酸序列、構建物、質粒、載體、細胞、組織、器官或生物以及他們的產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明的其它推薦方面包括使用這些基因產(chǎn)物制備或處理食料，包括動物飼料。
本發(fā)明也涉及分離用本發(fā)明方法制備的瓜爾豆膠。
本發(fā)明也涉及用本發(fā)明方法制備的瓜爾豆膠。
現(xiàn)在通過參看本發(fā)明的其它推薦方法，更詳細地描述本發(fā)明的第一種策略。
按照本發(fā)明該方面的第一個推薦方面，提供包含

圖1所示氨基酸序列的酶或其變異體、同源物或其片段。
按照本發(fā)明該方面的第二個推薦方面，提供第一個方面的酶的編碼核苷酸序列或與其互補的序列。
按照本發(fā)明該方面的第三個方面，提供包含圖1所示序列的核苷酸序列或其變異體、同源物或其片段，或與其互補的序列。
按照本發(fā)明該方面的第四個方面，提供包含或表達按照先前方面中任一方面發(fā)明的構建物。
按照本發(fā)明該方面的第五個方面，提供包含或表達按照先前方面中任一方面發(fā)明的載體。
按照本發(fā)明該方面的第六個方面，提供包含或表達按照先前方面中任一方面發(fā)明的質粒。
按照本發(fā)明該方面的第七個方面，提供包含或表達按照先前方面中任一方面發(fā)明的轉基因生物(或其部分)。
在本發(fā)明該方面的這些推薦方面中，該核苷酸序列或該酶最好是本發(fā)明上述方面定義的或其中含有的或通過上述方面表達的核苷酸序列或酶。
本發(fā)明該方面的其它方面包括表達或允許表達或轉化任何一種核苷酸序列、構建物、質粒、載體、細胞、組織、器官或生物及其產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明該方面的其它方面包括使用該酶制備或處理食料，包括動物飼料。
因此，本發(fā)明該方面的一個推薦方面涉及磷酸甘露糖異構酶(“PMI”)和編碼該酶的核苷酸序列。特別是，本發(fā)明的推薦方面涉及重組PMI。
此外，本發(fā)明的推薦方面涉及使用該重組PMI改變生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，尤其是半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比。
本發(fā)明的一個主要優(yōu)點在于，通過使用該重組PMI，可以提高生物(或其部分)的甘露糖與半乳糖之比和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，特別是體內改性的瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。通過插入?yún)⑴c含甘露糖/半乳糖化合物(諸如甘露糖-6-磷酸)生物合成的一個或多個基因產(chǎn)物的一個或多個編碼基因，達到該優(yōu)點，該基因最優(yōu)選為本發(fā)明的核苷酸序列。
其它主要優(yōu)點在于，該重組酶可以容易地大量制備。此外，該核苷酸序列當插入(最好是穩(wěn)定插入)生物(或其部分)的基因組時，可以用來改變體內甘露糖與半乳糖濃度之比。
該核苷酸序列最好為DNA序列。
在一個高度推薦的實施方案中，該核苷酸序列為重組DNA序列。
該核苷酸序列最好得自保藏物NCIMB 40774。
在一個高度推薦的實施方案中，用重組DNA技術表達該酶。
該酶最好用得自保藏物NCIMB 40774的核苷酸序列表達。
該生物最好為植物。
該植物更優(yōu)選為瓜爾豆植株。
該含甘露糖/半乳糖化合物最好為瓜爾豆膠。
該酶或編碼該酶的核苷酸序列可以在體內與一種或多種其它酶或其編碼核苷酸序列一起使用，這些其它酶或其編碼核苷酸序列最好用重組DNA技術制備。PMI酶或編碼PMI酶的核苷酸序列也可以在體外使用。該PMI酶或其編碼核苷酸序列也可以與一種或多種其它酶或其編碼核苷酸序列一起使用，這些酶或其編碼核苷酸序列最好用重組DNA技術制備。
與該酶有關的“變異體”、“同源物”或“片段”包括該序列的一個(或多個)氨基酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或加入，只要產(chǎn)生的氨基酸序列具有PMI活性，最好至少具有圖1所示酶的相同活性。具體地說，“同源物”一詞包括結構和/或功能同源，只要產(chǎn)物的酶具有PMI活性。關于序列同源性，最好至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％與圖1所示序列同源。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％與圖1所示序列同源。
與編碼該酶的核苷酸序列有關的“變異體”、“同源性”或“片段”包括該序列的一個(或多個)核酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或加入，只要產(chǎn)生的核苷酸序列編碼的酶具有PMI活性，最好至少具有圖1所示酶的相同活性。具體地說，“同源性”一詞包括結構和/或功能同源性，只要產(chǎn)物的核苷酸序列編碼的酶具有PMI活性。關于序列同源性，優(yōu)選至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％與圖1所示序列同源。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％與圖1所示序列同源。
上述術語與該序列的等位變異同義。
“互補”一詞是指本發(fā)明也包括可以與本發(fā)明核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
現(xiàn)在通過參考本發(fā)明其它推薦方面，更詳細地描述本發(fā)明的第二種策略。
按照本發(fā)明該方面的第一個推薦方面，提供包含圖4所示氨基酸序列的酶或其變異體、同源物或其片段。
按照本發(fā)明該方面的第二個推薦方面，提供第一個方面的酶的編碼核苷酸序列或與其互補的序列。
按照本發(fā)明該方面的第三個推薦方面，提供包含圖4所示序列的核苷酸序列或其變異體、同源物或其片段，或與其互補的序列。
按照本發(fā)明該方面的第四個推薦方面，提供包含或表達按照前述任一方面發(fā)明的構建物。
按照本發(fā)明該方面的第五個推薦方面，提供包含或表達前述任一方面發(fā)明的載體。
按照本發(fā)明該方面的第六個推薦方面，提供包含或表達前述任一方面發(fā)明的質粒。
按照本發(fā)明該方面的第七個推薦方面，提供包含或表達前述任一方面發(fā)明的轉基因生物(或其部分)。
在本發(fā)明該方面的這些推薦方面中，該核苷酸序列或該酶最好是本發(fā)明上述方面中定義或包含或通過上述方面表達的核苷酸序列或酶。
本發(fā)明該方面的其它推薦方面包括表達或允許表達或轉化任一核苷酸序列、構建物、質粒、載體、細胞、組織、器官或生物及其產(chǎn)物。
本發(fā)明該方面的其它推薦方面包括使用該酶制備或處理食料，包括動物飼料。
本發(fā)明該方面的一個推薦方面因此涉及α-半乳糖苷酶和編碼該酶的核苷酸序列。
特別是，本發(fā)明的推薦方面涉及重組α-半乳糖苷酶。
另外，本發(fā)明的推薦方面涉及使用該重組α-半乳糖苷酶，以改變或者生物(或其部分)和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，尤其是半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比。
本發(fā)明的一個主要優(yōu)點是通過利用該重組α-半乳糖苷酶，可能提高一種生物(或其部分)和/或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，特別是體內修飾的瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。
其它主要優(yōu)點是該重組酶可以容易地大量制備。此外，該核苷酸序列當插入(最好是穩(wěn)定插入)一種生物(或其部分)的基因組時，可以用來改變體內甘露糖與半乳糖濃度之比。
該核苷酸序列最好是一種DNA序列。在高度推薦的實施方案中，該核苷酸序列是重組DNA序列。
該核苷酸序列最好得自保藏物NCIMB 40831。
在一個高度推薦的實施方案中，使用重組DNA技術表達該酶。
該酶最好用得自保藏物NCIMB 40831的核苷酸序列表達。
該生物最好是一種植物。
該植物更優(yōu)選是瓜爾豆植株。
該含甘露糖/半乳糖化合物最好是瓜爾豆膠。
該酶或編碼該酶的核苷酸序列可以在體內與一種或多種其它酶或其編碼核苷酸序列一起使用，這些酶或其編碼核苷酸序列最好用重組DNA技術制備。α-半乳糖苷酶或編碼α-半乳糖苷酶的核苷酸序列也可以在體外使用。該α-半乳糖苷酶或其編碼核苷酸序列也可以與一種或多種其它酶或其編碼核苷酸序列一起使用，這些酶或其編碼核苷酸序列最好用重組DNA技術制備。
與該酶有關的“變異體”、“同源物”或“片段”包括該序列的一個(或多個)氨基酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或加入，只要產(chǎn)生的氨基酸序列具有α-半乳糖苷酶活性，最好至少具有圖4所示酶的相同活性。具體地說，“同源物”一詞包括結構和/或功能同源物，只要產(chǎn)物的酶具有α-半乳糖苷酶活性。關于序列同源物，最好至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％與圖4所示序列同源。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％與圖4所示序列同源。
與編碼該酶的核苷酸序列有關的“變異體”、“同源物”或“片段”包括該序列的一個(或多個)核苷酸的任何置換、變異、修飾、取代、缺失或加入，只要產(chǎn)生的核苷酸序列編碼的酶具有α-半乳糖苷酶活性，最好至少具有圖4所示酶的相同活性。具體地說，“同源物”一詞包括結構和/或功能同源物，只要產(chǎn)物的核苷酸序列編碼的酶具有α-半乳糖苷酶活性。關于序列同源物，最好至少75％，更優(yōu)選至少85％，更優(yōu)選至少90％與圖4所示序列同源。更優(yōu)選至少95％，更優(yōu)選至少98％與圖4所示序列同源。
上述術語與該序列的等位變異同義。
“互補”一詞是指本發(fā)明也包括可以與本發(fā)明核苷酸序列雜交的核苷酸序列。
與本發(fā)明有關的“核苷酸”一詞包括基因組DNA、cDNA、合成DNA和RNA。它最好是指DNA，更優(yōu)選為本發(fā)明編碼序列的cDNA。
與諸如“結合物”、“盒”和“雜種”之類術語同義的術語“構建物”包括直接或間接與一個啟動子連接或融合的核苷酸序列。間接連接的實例是提供適當?shù)拈g隔基團，諸如內含子序列，諸如Shl內含子或ADH內含子，置于該啟動子和該核苷酸序列中間。在所有情況下，都非常推薦該術語不包括通常相連該酶野生型編碼基因與該野生型基因啟動子當它們兩者處于其天然環(huán)境中發(fā)生的天然重組。因此，本發(fā)明一個高度推薦實施方案涉及操作性地與異源啟動子連接的本發(fā)明核苷酸序列。
該構建物甚至可以含有或表達一種標記，后者允許在轉移遺傳構建物的植物中(諸如瓜爾豆)中選擇該遺傳構建物。存在可以使用的各種標記，它們例如為編碼甘露糖-6-磷酸異構酶(尤其對于植物)的那些標記或提供除草劑抗性或抗生素抗性(例如抗G418、潮霉素、博來霉素、卡那霉素和慶大霉素)的那些標記。
“載體”一詞包括表達載體和轉化載體。
“表達載體”一詞是指能夠體內或體外表達的構建物。
“轉化載體”一詞是指能夠從一種物種轉移到另一種物種的構建物，諸如質粒從大腸桿菌轉移至農桿菌轉移到植物。
“組織”一詞包括組織本身和器官。
與本發(fā)明有關的“生物”包括可以包含編碼按照本發(fā)明酶的核苷酸序列和/或得自它的產(chǎn)物的任何生物，和/或其中按照本發(fā)明的核苷酸序列存在于該生物中時可以表達。
該生物最好是瓜爾豆植株。
本發(fā)明有關的“轉基因生物”包括包含編碼按照本發(fā)明酶的核苷酸序列和/或得自它的產(chǎn)物的任何生物，和/或其中按照本發(fā)明的核苷酸序列在該生物中可以表達。該核苷酸最好整合到該生物的基因組中。
該轉基因生物最好是一種植物，更優(yōu)選是瓜爾豆植株。
本發(fā)明的轉基因生物包括包含任何一種或多種按照本發(fā)明酶的編碼核苷酸序列、按照本發(fā)明的構建物、按照本發(fā)明的載體、按照本發(fā)明的質粒、按照本發(fā)明的細胞、按照本發(fā)明的組織或其產(chǎn)物，包括其組合。例如該轉基因生物也可以包含任何在一種或多種異源啟動子控制下的一種或多種編碼本發(fā)明酶的核苷酸序列。
在一個高度推薦的實施方案中，該轉基因生物(或其部分)不包含啟動子和編碼按照本發(fā)明酶的核苷酸序列的組合，其中該啟動子和該核苷酸序列對該生物(或其部分)都是天然的，并處于其天然環(huán)境中。因此，在該高度推薦的實施方案中，當按照本發(fā)明的天然核苷酸編碼序列在也處于其天然環(huán)境中的天然啟動子控制下時，本發(fā)明不包括處于其天然環(huán)境中的按照本發(fā)明的天然核苷酸編碼序列。另外，在該高度推薦的實施方案中，當按照本發(fā)明的天然酶處于其天然環(huán)境中并它由也處于其天然環(huán)境中的天然核苷酸序列編碼時，而且該核苷酸序列在也處于其天然環(huán)境中的其天然啟動子控制下時，本發(fā)明不包括該按照本發(fā)明的天然酶。
“啟動子”以本領域的通常意義使用，例如在Jacob-Mond基因表達理論中的RNA聚合酶結合位點。
該啟動子還包括一個或多個特征，以確?；蛱岣咴诤线m宿主中的表達。例如，這些特征可以是諸如Pribnow框或TATA框之類的保守區(qū)。啟動子甚至可以含有影響(諸如保持、增強、降低)本發(fā)明核苷酸序列表達水平的其它序列。例如，合適的其它序列包括Shl內含子或ADH內含子。其它序列包括誘導型元件，諸如溫度、化學藥品、光或應激反應誘導型元件。
此外，可以存在提高轉錄或翻譯的合適元件。后一種元件的實例是TMV 5’信號序列(參見Sleat Gene 217217-225；和DawsonPlant Mol.Biol.2397)。
因此，一方面，按照本發(fā)明的核苷酸序列在允許該核苷酸序列表達的啟動子控制下。在該方面，該啟動子可以是細胞和組織特異性啟動子。例如，如果該生物是一種植物，那么該啟動子可以是影響該核苷酸序列在一個或多個種子、莖、芽、根和葉組織中表達的啟動子。
作為實例，本發(fā)明核苷酸序列的啟動子可以是PCT/EP95/02195中描述的α-Amy 1啟動子(或者已知為Amy 1啟動子、Amy 637啟動子或α-Amy 637啟動子)。
或者，本發(fā)明核苷酸序列的啟動子可以是PCT/EP95/02196中描述的α-Amy 3啟動子(或者已知為Amy 3啟動子、Amy 351啟動子或α-Amy 351啟動子)。關于該Amy 351啟動子，可以失活其一部分，使得該部分失活的啟動子以更特異性的方式，諸如僅在特定組織類型或器官中表達該核苷酸序列?！笆Щ睢币辉~是指修飾該啟動子的表達方式，但其中該部分失活的啟動子仍作為啟動子起作用的意義上的部分失活。然而，如上所述，該修飾啟動子能夠在至少一種(但不是全部)原始啟動子的特定組織表達該核苷酸序列。其它啟動子序列部分失活的實例(不必是Amy 351啟動子的部分失活)包括改變該啟動子序列、或與該核苷酸序列部分的結合物質的折疊方式，使得該核苷酸的一部分不被例如RNA聚合酶識別。部分失活Amy 351啟動子的另一種優(yōu)選方式是縮短它，形成其片段。另一種方式可能突變至少一部分該序列，使得RNA聚合酶不能與該部分或另一部分結合。
另一種修飾是使調節(jié)蛋白(例如已知來自絲狀真菌的CreA蛋白)的結合位點突變，以發(fā)揮碳分解代謝物抑制作用，因此消除該天然啟動子的分解代謝物的抑制作用。
在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis T.(編輯)Molecular Cloning.A laboratory manual.第二版，冷泉港實驗室出版，紐約，1989中可以發(fā)現(xiàn)重組DNA技術的一般內容。
即使在EP-B-0470145和CA-A-2006454中沒有公開本發(fā)明的酶和核苷酸序列，但那兩個文獻確實提供了一些可以用來制備按照本發(fā)明的轉基因植物的有用的技術背景評論?，F(xiàn)在在以下評論中包括一些這些背景評論的改編。
構建遺傳修飾植物的基本原理是在該植物基因組中插入遺傳信息，以便獲得該插入遺傳物質的穩(wěn)定保持。
存在幾種插入該遺傳信息的技術，兩種主要的原理是直接導入該遺傳信息和采用載體系統(tǒng)導入該遺傳信息。在Potrykus(Annu Rev PlantPhysiol Plant Mol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)的論文中可以發(fā)現(xiàn)一般技術的綜述。
因此，一方面本發(fā)明涉及一種載體系統(tǒng)，它攜帶按照本發(fā)明的核苷酸序列或構建物，并能夠將該核苷酸序列或該構建物導入生物(諸如一種植物)的基因組中。
該載體系統(tǒng)可以包含一種載體，但它可以包含兩種載體。在兩種載體的情況下，該載體系統(tǒng)通常稱為雙載體系統(tǒng)。在Gynheung An等，(1980)，Binary Vectors，Plant Molecular Biology Manual A3，1-19中詳細地描述了雙載體系統(tǒng)。
用給定啟動子或核苷酸序列或構建物轉化植物細胞的一個廣泛使用的系統(tǒng)基于使用來自根癌農桿菌的Ti質?；騺碜悦r桿菌的Ri質粒，An等，(1986)，Plant Physiol.81，301-305和Butcher D.N.等，(1980)，Tissue Culture Methods for Plant Pathologists，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208。
已經(jīng)構建了幾種不同的Ti質粒和Ri質粒，它們適用于構建上述植物或植物細胞構建物。這樣一種Ti質粒的非限制性實例是pGV3850。
本發(fā)明的核苷酸序列或構建物應該最好插入該Ti質粒的T-DNA末端序列之間或鄰近T-DNA序列，以便避免恰好在T-DNA邊界周圍的序列斷裂，這些區(qū)中的至少一個區(qū)似乎是修飾T-DNA插入該植物基因組中所必需的。
正如從上述解釋所理解的，如果該生物為一種植物，那么本發(fā)明的載體系統(tǒng)最好是含有感染該植物必需的序列(例如vir區(qū))和至少一個T-DNA序列邊界部分的載體系統(tǒng)，其中該邊界部分位于同一載體上作為遺傳構建物。
另外，該載體系統(tǒng)最好是根癌農桿菌Ti質?；蛎r桿菌Ri質?；蛩鼈兊难苌?，這些質粒是眾所周知的，并廣泛用于轉基因植物的構建，存在基于這些質?；蚱溲苌锏脑S多載體系統(tǒng)。
在轉基因植物的構建中，本發(fā)明的核苷酸序列或構建物在插入該植物中之前，可以首先在可以復制該載體并易于操作的微生物中構建。一種有用的微生物實例是大腸桿菌，但可以使用具有上述性質的其它微生物。當在大腸桿菌中已經(jīng)構建了上面限定的載體系統(tǒng)的載體時，必要時可以將其轉移到合適的農桿菌菌株中，例如根癌農桿菌中。因此，最好將含有本發(fā)明核苷酸序列或構建物的Ti質粒轉移到合適的農桿菌菌株(例如根癌農桿菌)中，以便獲得含有本發(fā)明核苷酸序列或構建物的農桿菌細胞，隨后將該DNA轉移到待修飾的植物細胞中。
正如CA-A-2006454中報道的，可利用大量的克隆載體，它們含有在大腸桿菌中的復制系統(tǒng)和一種允許篩選轉化細胞的標記。這些載體包括例如pBR322、pUC系列、M13 mp系列、pACYC 184等。
這樣，本發(fā)明的核苷酸序列或構建物可以導入該載體中的合適限制位置中。含有的質粒用來在大腸桿菌中轉化。在合適的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌細胞，然后收獲這些細胞，并將其裂解。然后回收該質粒。一種分析方法是一般使用的序列分析、限制分析、電泳和進一步的生化分子生物學方法。每次操作后，可以限制性酶切所用的DNA序列，并將其與下一個DNA序列連接?？梢栽谕毁|?；虿煌|粒中克隆每種序列。
在每次將按照本發(fā)明的構建物或核苷酸序列導入植物中后，可能必需存在和/或插入其它DNA序列。例如如果使用植物細胞的Ti質粒或Ri質粒轉化，那么作為導入基因的側翼區(qū)，可以連接至少Ti質粒和Ri質粒的T-DNA的右邊界，然而通?？梢赃B接T-DNA的右邊界和左邊界。已經(jīng)廣泛研究了使用T-DNA轉化植物細胞，并在EP-A-120516；HoekemaThe Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B.，Alblasserdam，1985，第V章，；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.，41-46；和An等，EMBO J.(1985)4277-284中進行了描述。
用農桿菌直接感染植物組織是一種簡單的技術，它已經(jīng)廣泛使用，并在Butcher，D.N.等，(1980)，Tissue Culture Methods for PlantPathologists，編輯D.S.Ingrams和J.P.Helgeson，203-208中進行了描述。關于該主題的其它內容參見Potrykus(Annu Rev Plant Physiol PlantMol Biol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-TechMarch/April 1994 17-27)。用該技術，可以在植物的某些部分或某些組織上感染該植物，這些部分或組織例如為葉、根、莖的一部分或該植物的另一部分。
用攜帶本發(fā)明核苷酸序列的農桿菌直接感染植物組織，該感染植物通常是受傷的，例如通過用剃刀切割該植物或用針將該植物穿孔，或用研磨劑摩擦該植物。然后用農桿菌接種傷口。然后讓接種的植物或植物部分在合適的培養(yǎng)基上生長，并讓其發(fā)育為成熟植株。
構建植物細胞時，可以按照眾所周知的組織培養(yǎng)方法生長并保持這些細胞，這些方法諸如在合適的添加諸如氨基酸、植物激素、維生素之類的必需生長因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。
可以采用由細胞或組織培養(yǎng)物再生植株的已知方法，例如通過采用抗生素篩選轉化苗和通過在含有合適營養(yǎng)物、植物激素等的培養(yǎng)基中亞培養(yǎng)苗，完成轉化細胞再生為遺傳修飾的植株。
可以在EP-A-0449375中發(fā)現(xiàn)植物轉化的其它內容。
在丹麥專利申請第940662號(于1994年6月10日申請)中可以發(fā)現(xiàn)甚至其它有用的轉化胎兒動植物的內容。
因此，本發(fā)明涉及使用基因產(chǎn)物(例如參與甘露糖生物合成的PMI酶)提高生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。另外，本發(fā)明涉及該核苷酸序列和它編碼的基因產(chǎn)物。
本發(fā)明基于該令人驚訝的發(fā)現(xiàn)通過插入編碼下述基因產(chǎn)物的一個或多個基因，可以提高瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比，其中這些基因產(chǎn)物參與含甘露糖/半乳糖化合物(諸如甘露糖-6-磷酸，即PMI)的生物合成。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)與根據(jù)本領城內容預期的相反。在該方面，由來自葫蘆巴和瓜爾豆發(fā)育中的胚乳未純化制劑的分析，Edwards提示GDP-甘露糖可能是半乳甘露聚糖生物合成的前體(Edwards等，1989，Reid和Edwards 1995)。通過反應混合物中不同量的GDP-甘露糖的分析，作者總結出甘露糖與半乳糖之比的控制可能在于合成半乳甘露聚糖的糖基轉移酶本身特異性的水平。這可能啟示，糖基轉移酶可能是瓜爾豆膠體內修飾的遺傳操作的關鍵靶。
因此，總之，本發(fā)明的該推薦方面涉及將磷酸甘露糖異構酶基因插入植物中，最好插入瓜爾豆中。
該策略的基本原理基基于我們對插入瓜爾豆半乳甘露聚糖中的甘露糖得自GDP-甘露糖的理解。然而，在瓜爾豆中合成該GDP-甘露糖的方式是未知的。典型方法是通過GDP-葡萄糖異構化，但某些初步數(shù)據(jù)提示，在某些豆類中，至少可以通過將果糖-6-磷酸異構化為甘露糖-6-磷酸，而甘露糖-6-磷酸異構化為甘露糖-1-磷酸，隨后它轉化為GDP-甘露糖來合成GDP-甘露糖。但甚至如果后一種途徑應該是可操作的，那么PMI活性的提高本身預期不能影響半乳甘露聚糖組合物，因為第一，果糖-6-磷酸到甘露糖-6-磷酸的異構化是完全可逆反應，第二，Reid和Edwards(1995)已經(jīng)預言，該甘露糖與半乳糖之比由半乳甘露聚糖合成酶的特異性決定。關于該策略，正如可明顯看出的，甚至當在瓜爾豆中采用弱表達啟動子時，我們已經(jīng)得到甘露糖與半乳糖之比的提高。但是，采用較強的啟動子，甚至可以達到更高的比率水平。
本發(fā)明也基于下述令人驚訝的發(fā)現(xiàn)通過插入一種或多種參與瓜爾豆或其前體生物合成的基因產(chǎn)物的一種或多種編碼基因，可以提高瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。如上所述，在本發(fā)明的一個推薦方面中，該基因編碼PMI。在另一個推薦方面，該基因編碼α-半乳糖苷酶，最好是咖啡豆α-半乳糖苷酶或番瀉樹α-半乳糖苷酶，更優(yōu)選番瀉樹α-半乳糖苷酶。
包含本發(fā)明PMI基因的以下樣品按照布達佩斯條約通過識別保藏于1995年11月9日保藏在在工業(yè)和海洋細菌有限公司的國家保藏中心(NCIMB)(23 St.Machar Drive，Aberdeen，Scotland，United Kingdom，AB2 1 RY)含有質粒pPMI-60的大腸桿菌K12。
保藏號為NCIMB 40774。
本發(fā)明也包括得自該保藏物的核苷酸序列及其編碼產(chǎn)物。
包含本發(fā)明α-半乳糖苷酶基因的以下樣品按照布達佩斯條約通過識別保藏于1996年11月28日保藏在工業(yè)和海洋細菌有限公司的國家保藏中心(NCIMB)(23 St.Machar Drive，Aberdeen，蘇格蘭，英國，AB21 RY)含有質粒pT7-SEcDNA5的大腸桿菌K12。
保藏號為NCIMB 40831。
本發(fā)明也包括得自該保藏物的核苷酸序列及其編碼產(chǎn)物。
現(xiàn)在通過實施例描述本發(fā)明。在以下實施例中，參考附圖，其中圖1表明按照本發(fā)明的一個酶的氨基酸序列和按照本發(fā)明的一個核苷酸序列的序列；圖2是pcDNAII的質粒圖譜；圖3是pSG-Man5的質粒圖譜；圖4表明另一種按照本發(fā)明的酶的氨基酸序列和另一種按照本發(fā)明的核苷酸序列的序列；圖5是pPS48的質粒圖譜；圖6是pPS48SEGAL的質粒圖譜；圖7是pBKL4的質粒圖譜；圖8是pBKIASEGAL的質粒圖譜；圖9是pPS48-GALIII的質粒圖譜；以及圖10是pBKL4GALIII的質粒圖譜。
采用PMI基因體內修飾瓜爾豆膠來自瓜爾豆的磷酸甘露糖異構酶的克隆在質粒pcDNAII(Invitrogen公司)中構建代表來自未成熟瓜爾豆胚乳的mRNA的cDNA表達文庫，將其轉化到大腸桿菌菌株Top10F～(Invitrogen公司)中。通過從大量隨機挑出的分離菌落中純化質粒，控制cDNA文庫的質量。這些質粒的限制酶消化表明全部含有至少500bp的一種插入。
大腸桿菌菌種CD1 man-含有一個失活PMI基因，因此不能代謝甘露糖(Darzins等1985)。該菌種用于以下互補研究。
用Hanahan(1985)的方法，將CD1 man-細胞制成感受態(tài)。獲得效價為3-4×106個轉化細胞/μg的文庫質粒cDNA。當用Bluescript對照質粒轉化細胞時，發(fā)現(xiàn)相似的效價。
在互補研究之前，進行大量的對照實驗，其中將轉化細胞平板接種到含有M9鹽(Maniatis等1982)、加入0.05g/l亮氨酸、0.05g/l甲硫氨酸、0.05g/l蘇氨酸、1.0g/l鹽酸硫胺素、50mg/l氨芐青霉素、6.0g/l甘露糖和9.0g/l瓊脂糖的選擇培養(yǎng)基上。該培養(yǎng)基下文稱為M9-SGP。
在一個實驗中，用在其天然啟動子(Mils和Guest 1984)控制下的大腸桿菌PMI基因轉化CD1 man-感受態(tài)細胞，而在另一個實驗中，用在植物啟動子CaMV 35S(pSGMAN1，參見Bojsen等1993)控制下的大腸桿菌PMI基因轉化這些細胞。在這些兩個實驗中，將轉化細胞平板接種到M9-SGP上，產(chǎn)生大量的大菌落。當感受態(tài)CD1 man-細胞不用或用Bluescript對照質粒轉化時，沒有獲得大菌落，但觀察到大量非常小的幾乎不可見的菌落。因此，該M9-SGP選擇培養(yǎng)基適用于篩選含有活性PMI基因的細胞。
用從該瓜爾豆胚乳cDNA文庫中分離的質粒DNA轉化感受態(tài)CD1 man-細胞。將轉化的CD1 man-細胞平板接種到選擇底物M9-SGP上。于37℃培養(yǎng)2天后，大多數(shù)平板接種的細胞似乎是非常小的菌落，而少于0.1％的菌落則大得多。
純化來自較大菌落的質粒，將其再次轉化到感受態(tài)CD1 man-細胞中。分析20個不同再次轉化菌落粗提取物的PMI活性。通過Gill等(1986)描述的偶聯(lián)酶促分析測定PMI活性。其中一個檢測的菌落含有非常高的PMI活性。該克隆命名為PMI-60，其保藏號為NCIMB40774。
為了測試是否該插入物來源于瓜爾豆的PMI-60中，按照Dellaporta等(1983)的方法，從葉中純化瓜爾豆基因組DNA，用限制酶消化，按照Feinberg和Vogelstein的方法(1983)進行Southern印跡分析，并用得自PMI-60、用P-32標記的質粒DNA進行探測。分別于68℃用6×SSC和于68℃用0.2×SSC進行雜交和洗滌(Maniatis等1982)。PMI-60探針與大量消化的瓜爾豆基因組DNA片段雜交。
通過應用引物步查的雙脫氧測序法(Sanger和Coulson 1977)，首先用熒光素標記的引物(反向引物和通用引物)，隨后用熒光素-dATP進行內部標記，對質粒PMI-60(稱為pPMI-60)的插入物進行測序。
cDNA克隆的大小為1.66kb，其中PMI基因包括1.29kb。PMI的起始密碼子和終止密碼子分別位于0.09kb和1.38kb處。該插入含有的假定多腺苷酸化信號位于終止密碼子下游的0.11kb處，為poly A終止的。
通過與其它已知PMI序列的比較，進一步找出該插入的鑒定的特征。在翻譯起始下游的137-145氨基酸處發(fā)現(xiàn)一個保守區(qū)DGNHKPEM，它被認為涉及磷酸甘露糖異構酶的活性PMI位點(Coulin等1993)。
因此，PMI-60中插入物的存在導致在含有甘露糖的選擇培養(yǎng)基上的快速生長、PMI活性高和與瓜爾豆DNA雜交。此外，與來自其它PMI基因的某些序列有同源性。這些數(shù)據(jù)證明，PMI-60中的該插入物是來自瓜爾豆的PMI基因。
該PMI序列是第一個從植物中克隆和測序的PMI序列。采用磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因的轉化以下轉化研究表明，通過插入磷酸甘露糖異構酶(PMI)(諸如來自大腸桿菌或瓜爾豆的磷酸甘露糖異構酶)，可以提高瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。根據(jù)可利用的底物，重組PMI催化果糖-6-磷酸轉化為甘露糖-6-磷酸，或催化甘露糖-6-磷酸轉化為果糖-6-磷酸。瓜爾豆的轉化通過Jrsboe和Okkels(1994)描述的根癌農桿菌介導的基因轉移，獲得轉基因瓜爾豆植株，上述論文的內容通過引用結合到本文中。推薦的根癌農桿菌菌種是這些研究中的LBA 4404。
稱為pDO18的質粒中T-DNA中的插入含有3個基因(右邊界至左邊界)β-葡糖苷酸酶(GUS)基因、磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因和新霉素磷酸轉移酶(NPTII)基因。用Bojsen等(1993)中詳細描述的35S啟動子驅動每種基因的表達。用HPLC分析瓜爾豆膠手工制備無胚和種皮的純胚乳，按照Edwards等(1992)的方法，在勻漿期間用70％乙醇重復處理。將乙醇沉淀加入2ml 2 N三氟乙酸(TFA)中，于120℃水解2小時。通過于50℃蒸發(fā)除去TFA。將干燥的沉淀溶于500μl HPLC級H2O，將25μl樣品加到Aminex HPX-87P柱(300×7.8mm)上。在層析柱烘箱中將該柱加熱至80℃，用H2O洗脫。用RI檢測器檢測糖洗脫液。使用該系統(tǒng)，基線分離甘露糖和半乳糖。測定各個峰面積，并計算甘露糖與半乳糖之比。得自Sigma的瓜爾豆膠和LBG與來自非轉基因瓜爾豆植株的胚乳樣品一起用作標準。獲得的Sigma瓜爾豆膠和非轉基因胚乳的甘露糖與半乳糖之比都為1.6∶1，而Sigma的LBG的甘露糖與半乳糖之比為3.5∶1。這些比率與一般接受的那些比率非常一致(Reid和Edwards 1995)。在PMI轉化的瓜爾豆中的甘露糖與半乳糖之比分析了含有PMI基因的幾種獨立的瓜爾豆轉化體在胚乳半乳甘露聚糖中的甘露糖與半乳糖之比，參見下表。<
每個轉化體都提高了瓜爾豆膠的甘露糖與半乳糖之比。
通過插入來自瓜爾豆的磷酸甘露糖異構酶(PMI)基因，進行相似的研究。在該方面，據(jù)信根據(jù)可利用的底物，該瓜爾豆PMI催化果糖-6-磷酸轉化為甘露糖-6-磷酸，或催化甘露糖-6-磷酸轉化為果糖-6-磷酸。采用α-半乳糖苷酶基因體內修飾瓜爾豆膠在以下實施例中，表明α-半乳糖苷酶基因插入瓜爾豆可以導致瓜爾豆膠的體內修飾。番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA的克隆和測序如下通過PCR分離來自番瀉樹胚乳的α-半乳糖苷酶cDNA克隆。
按照Logemann等(Anal.Biochem.163(1987)16-20)的方法，從番瀉樹胚乳中純化總RNA。在PCR后，用Perkin Elmer的RT-PCR試劑盒，按照該試劑盒的方法進行逆轉錄。簡單地說，將大約1mg總RNA和1mg寡聚dT與逆轉錄酶一起于42℃保溫45分鐘后，于99℃保溫5分鐘，于5℃保溫5分鐘。
為了進行以下PCR，使用兩種得自瓜爾豆α-半乳糖苷酶cDNA序列(Overbeeke等，Plant Mol.Biol.13(1989)541-550)的寡核苷酸P1(5’-CAACGGGGCTTGCTGCTTTAGG)和P2(5’-GCCTATGTCA-GACCAGGATGC)，它們在瓜爾豆α-半乳糖苷酶cDNA序列中分別位于位置415-437和1248-1270。
PCR條件為于94℃ 1分鐘，于55℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進行35個循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。
通過瓊脂糖凝膠電泳，分析PCR產(chǎn)物，獲得850bp的單一產(chǎn)物。
將命名為SEGAL的DNA產(chǎn)物克隆到pR7Blue載體(Novagen)中，采用Termo測序酶熒光循環(huán)測序試劑盒(Amershem)和ALF DNA測序儀(Pharmacia)測定該核苷酸序列。
通過先前描述的稱為3’和5’RACE方法(Nielsen等，Plant Mol.Biol.31(1996)539-552)，獲得番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA的3’和5’端。簡而言之，關于3’RACE，將大約1mg上述總RNA和2.5pmol下述引物與逆轉錄酶一起，于42℃保溫45分鐘，QT(5’CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGC(T)17)然后于99℃保溫5分鐘，于5℃保溫5分鐘。
通過2輪PCR擴增該cDNA。
第一次PCR的下游引物為Q0(5’-CCAGTGAGCAGAGTGACG)，而上游引物為3’GSP1(5’-GTCCTCTGAGTGATAACAGAGTGG)，該上游引物為一種基因特異性引物，得自番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置1096-1118的片段SEGAL的850bp核苷酸序列。
在第二次PCR中，下游引物為Q1(5’-GAGGACTCGAGCTCAAGC)而上游引物為3’GSP2(5’-GGTGTTGTGGAATAGAAGTTCATC)，該上游引物為一種基因特異性引物，得自番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置1123-1146的片段SEGAL的850bp核苷酸序列。
第一次PCR的PCR條件為于94℃ 1分鐘，于60℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進行35個循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。第二次PCR的條件為于94℃ 1分鐘，于50℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進行35個循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。
通過瓊脂糖凝膠電泳分析第二次PCR后的PCR產(chǎn)物，獲得530bp的單一產(chǎn)物。
將命名為3’SEGAL的DNA產(chǎn)物克隆到pT7Blue載體(Novagen)中，采用Termo測序酶熒光循環(huán)測序試劑盒(Amersham)和ALF DNA測序儀(Pharmacia)測定該核苷酸序列。
關于5’RACE，使用來自Gibco BRL的5’RACE系統(tǒng)與由片段SEGAL的850bp核苷酸序列構建的3重基因特異性引物。簡而言之，將大約1mg上述所用的相同總RNA和2.5pmol番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置561-582的該基因特異性引物，于70℃保溫10分鐘，5’GSP1(5’-TTGCACCTTGGTCTTCATGTCC)，然后加入逆轉錄酶，于42℃保溫30分鐘，于70℃保溫15分鐘，加入RNA酶H，再于55℃保溫10分鐘。
按照Gibco BRL方法將該cDNA加dC尾。該加尾cDNA進行兩輪PCR。
在第一輪PCR中，使用上游ANKER引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG)與番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置510-536的下述基因特異性下游引物一起使用5’GSP2(5-CATAGCTTTACTGCATGTTTGGTTTCC)，在第二輪PCR中，使用上游UNI引物(5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACG)和番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置438-462的下述基因特異性下游引物5’GSP3(5’-CAGCCAGAGCCTTAATTCCTGAAGG)，第一輪PCR的PCR條件為于94℃ 1分鐘，于51℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進行10個循環(huán)，然后于94℃ 1分鐘，于59℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進行25個循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。
第二輪PCR的條件為于94℃ 1分鐘，于59℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進行35個循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘，通過瓊脂糖凝膠電泳分析第二輪PCR后的PCR產(chǎn)物，獲得480bp的單一產(chǎn)物。
將命名為5’SEGAL的DNA產(chǎn)物克隆到pT7Blue載體(Novagen)中，采用Termo測序酶熒光循環(huán)測序試劑盒(Amersham)和ALF DNA測序儀(Pharmacia)測定該核苷酸序列。
由上述獲得的3個PCR克隆5’SEGAL、SEGAL和3’SEGAL組合包含1630bp的番瀉樹α-半乳糖苷酶的完整核苷酸序列，示于圖4中。該核苷酸序列的分析揭示(圖4)一個編碼406個氨基酸殘基的開放讀框，第一個甲硫氨酸位于第93核苷酸位置，翻譯終止密碼子位于第1311核苷酸位置。得出的氨基酸序列示于圖4中的核苷酸序列之上。含有番瀉樹α-半乳糖苷酶的植物轉化載體的構建如下構建包含番瀉樹α-半乳糖苷酶的表達載體。
通過在pUC8(Vieira和Messing，Gene 19(1982)259-268)中插入含有雙份-90至-420區(qū)的0.75kb的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S RNA啟動子(E35S)(Kay等，Science 236(1987)1299-1302)、含有CaMV 35SRNA多腺苷酸化序列(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一個合成寡核苷酸接頭(PstI-BamHI-SmaI-SacI-SalI-SphI)的0.21kb片段，構建載體pPS48(圖5)。
通過PCR將3個DNA片段5’SEGAL、SEGAL和3’SEGAL連接在一起，重建一個番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA克隆，它含有該編碼序列和非翻譯的5’端的大多數(shù)。
采用引物5’GSP3和B255，再擴增片段5’SEGAL，它含有一個BamHI位點加上番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置14-36的核苷酸(5’-ATTGGATCCACTCACAC-GTATACACTACAC)采用引物3’GSP2和B254，再擴增片段3’SEGAL，它含有一個SphI位點加上番瀉樹α-半乳糖苷酶cDNA(圖4)中位置1353-1373的核苷酸(5’-TTAGCATGCCCTTGGGATTGTATT-TCCTC)，將這些PCR片段與片段SEGAL混合，通過采用鄰接引物B254和B255擴增連接的序列。
PCR的條件為對于5’SEGAL，于94℃ 1分鐘，于57℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進行35個循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。對于3’SEGAL，于94℃ 1分鐘，于48℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進行35個循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。對于最后連接3個片段的PCR，于94℃ 1分鐘，于58℃ 2分鐘，于72℃ 2分鐘，進行35個循環(huán)，然后于72℃ 10分鐘。
通過瓊脂糖凝膠電泳分析最后一輪PCR的PCR產(chǎn)物，獲得1380bp的單一產(chǎn)物。
將該DNA產(chǎn)物克隆況pT7Blue載體(Novagen)中，采用Termo測序酶熒光循環(huán)測序試劑盒(Amersham)和ALF DNA測序儀測定該核苷酸序列。
通過用BamHI和SphI消化，分離該DNA片段，并將其克隆到表達載體pPS48中，產(chǎn)生pPS48SEGAL(圖6)。
如下構建包含番瀉樹α-半乳糖苷酶表達盒的植物轉化載體。
通過缺失NPTII盒，并插入一個合成寡核苷酸接頭(EcoRI-ClaI-SalI-HindIII-SpeI-KpnI-BamHI)和一個在GUS盒和左邊界之間含有鄰接CaMV 35S RNA啟動子(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一個來自章魚堿合成酶基因的多腺苷酸化序列(Caplan等，Science 22(1983)815-821)的NPTII基因的新NPTII盒，由pBI121(Clontec Laboratories)構建載體pBKL4(圖7)。
從pPS48SEGAL切下番瀉樹α-半乳糖苷酶表達盒，將其插入pBKL4中。
將產(chǎn)生的質粒pBKL4SEGAL(圖8)轉化到根癌農桿菌LBA4404菌株(Hockema等，Nature 303(1983)179-180)中，用于植物轉化。用番瀉樹α-半乳糖苷酶轉化瓜爾豆采用根癌農桿菌轉化，按照Jrsboe和Okkels(1994)詳細描述的方法(其內容通過引用結合到本文中)，將來自番瀉樹的α-半乳糖苷酶基因轉化到瓜爾豆中。分析用番瀉樹α-半乳糖苷酶基因轉化的瓜爾豆植株的甘露糖與半乳糖之比。
將番瀉樹α-半乳糖苷酶基因轉化的瓜爾豆植株的純胚乳在2N三氟乙酸中水解(參見上述細節(jié))后，用HPLC進行分析。
示于下表中的結果得自4個獨立的含有番瀉樹α-半乳糖苷酶基因的瓜爾豆轉化體胚乳的分析。
按相對于未轉化對照胚乳而言，以甘露糖與半乳糖之比增加的百分比給出結果。
含有咖啡豆α-半乳糖苷酶的植物轉化載體的構建。
如下構建包含咖啡豆α-半乳糖苷酶編碼序列的表達載體。
通過在pUC8(Vieira和Messing，Gene 19(1982)259-268)中插入含有雙份-90至-420區(qū)的0.75bp的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S RNA啟動子(E35S)(Kay等，Science 236(1987)1299-1302)、含有CaMV 35SRNA多腺苷酸化序列(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一個合成寡核苷酸接頭(PstI-BamHI-SmaI-SacI-SalI-SphI)的0.21bp片段。構建載體pPS48(圖5)。
通過采用一個上游引物(咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA序列中的位置13-35)5’-TTGGATCCACCCAAAA-GCTGGTGCTCC和下游引物(在咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA序列中的位置1229-1264)5’-TTAGCATGCCTGTTAATCACTGTGGG的聚合酶鏈式反應(PCR)，從質粒pCB-BZ(Zhu和Goldstein Gene 140(1994)227-231)分離含有咖啡豆α-半乳糖苷酶編碼序列的DNA片段，產(chǎn)生一個在α-半乳糖苷酶基因5’端含有一個BamHI位點和3’端一個SphI位點的1.2kb DNA片段。
將該DNA片段克隆到pT7Blue(Novagen)中，采用TGermo測序酶熒光循環(huán)測序試劑盒(Amersham)和ALF DNA測序儀(Pharmacia)測定該核苷酸序列。
通過用BamHI和SphI消化，分離該DNA片段，并將其克隆到載體pPS48中，產(chǎn)生pPS48-GALIII(圖9)。
如下構建包含咖啡豆α-半乳糖苷酶表達盒的植物轉化載體。
通過缺失NPTII盒，并插入一個合成寡核苷酸接頭(EcoRI-ClaI-SalI-HindIII-SpeI-KpnI-BamHI)和一個在GUS盒和左邊界之間含有鄰接CaMV 35S RNA啟動子(Odell等，Nature 313(1985)810-812)和一個來自章魚堿合成酶基因的多腺苷酸化序列(Caplan等，Science 222(1983)815-821)的NPTII基因的新NPTII盒，由pBIl2l(Clontec Laboratories)構建載體pBKL4(圖7)。
通過用XbaI消化從pPS48-GALIII切下咖啡豆α-半乳糖苷酶表達盒，將其插入SpeI消化的pBKL4中。
將產(chǎn)生的質粒pBKL4-GALIII(圖10)轉化到根癌農桿菌LBA4404菌株(Hockema等，Nature 303(1983)179-180)中，用于植物轉化。用咖啡豆α-半乳糖苷酶轉化瓜爾豆采用根癌農桿菌轉化，按照Jrsboe和Okkels(1994)詳細描述的方法，將來自咖啡豆的α-半乳糖苷酶基因轉化到瓜爾豆中。分析用咖啡豆α-半乳糖苷酶基因轉化的瓜爾豆植株胚乳的甘露糖與半乳糖之比。
將用咖啡豆α-半乳糖苷酶基因轉化的瓜爾豆植株的純胚乳在2N三氟乙酸中水解(參見上述細節(jié))后，用HPLC進行分析。示于下表中的結果得自4個獨立的含有咖啡豆α-半乳糖苷酶基因的瓜爾豆轉化體胚乳的分析。按相對于未轉化對照胚乳而言，以甘露糖與半乳糖之比增加的百分比給出結果
>瓜爾豆膠體內修飾的討論在上述兩個實施例中，表明將α-半乳糖苷酶基因插入瓜爾豆中，可以導致瓜爾豆膠的體內修飾，這由轉基因的半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比高于非轉基因對照的半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比的事實證明。
除用磷酸甘露糖異構酶基因的實施例(參見上述)外，這些是在植物細胞壁貯藏多糖體內修飾方面提出的第一個數(shù)據(jù)。概述這些結果表明，構建能夠形成瓜爾豆膠使得影響甘露糖與半乳糖之比的轉基因植物是可能的。
在該方面，PMI轉化系、咖啡豆α-半乳糖苷酶轉化系和番瀉樹α-半乳糖苷酶轉化系產(chǎn)生的甘露糖與半乳糖之比都高于非轉化系。例如，與甘露糖與半乳糖之比之比為1.65的非轉化系相比，咖啡豆α-半乳糖苷酶轉化體的甘露糖與半乳糖之比高至1.75，而某些番瀉樹α-半乳糖苷酶轉化體的甘露糖與半乳糖之比甚至高至2。這些結果非常令人驚訝。
正如本領域技術人員顯而易見的，體內修飾的程度取決于轉化到瓜爾豆中的基因編碼的半乳甘露聚糖相關酶的活性。因此，該啟動子的置換或修飾或其它調節(jié)核苷酸序列或氨基酸序列可能導致不同于上述實施例中所述那些半乳甘露聚糖的體內修飾。
本發(fā)明的其它修改對本領域技術人員是顯而易見的。
如上所述，圖1提出了編碼PMI酶的核苷酸序列和該PMI酶的氨基酸序列。為了消除疑問，該核苷酸序列可以稱為SEQ ID No.1，而該氨基酸序列可以稱為SEQ ID No.2。
如上所述，圖4提出了編碼α-半乳糖苷酶的核苷酸序列和該α-半乳糖苷酶的氨基酸序列。為了消除疑問，可以將該核苷酸序列稱為SEQID No.3，而將該氨基酸序列稱為SEQ ID No.4。
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權利要求
1.體內修飾方法，它影響能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。
2.體內修飾方法，它影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比；該體內修飾方法包括表達編碼一種基因產(chǎn)物的核苷酸序列，該基因產(chǎn)物影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比。其中該核苷酸序列對該生物(或其部分)不是天然核苷酸序列。
3.體內修飾方法，它影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比；該體內修飾方法包括允許一種能夠對以下具有影響的基因產(chǎn)物(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比，影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；其中該基因產(chǎn)物不由對該生物(或其部分)為天然核苷酸序列的核苷酸序列表達。
4.一種核苷酸序列的用途，該核苷酸序列在體內影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，其中該核苷酸序列編碼的基因產(chǎn)物影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；并且其中該核苷酸序列對該生物(或其部分)不是天然核苷酸序列。
5.一個基因產(chǎn)物的用途，該核苷酸序列在體內影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或者其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比，其中該基因產(chǎn)物影響(a)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖組分的甘露糖與半乳糖之比；和/或(b)含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖和半乳糖前體的甘露糖與半乳糖之比；其中該基因產(chǎn)物不由對該生物(或其部分)為天然核苷酸序列的核苷酸序列表達。
6.按照權利要求1-5中任一項的發(fā)明，其中該含甘露糖/半乳糖化合物為半乳甘露聚糖。
7.按照權利要求1-6中任一項的發(fā)明，其中能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的該生物為瓜爾豆植株。
8.按照權利要求1-6中任一項的發(fā)明，其中該生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的體內甘露糖與半乳糖之比高于該瓜爾豆植株或其半乳甘露聚糖。
9.按照權利要求1-8中任一項的發(fā)明，其中該生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的體內甘露糖與半乳糖之比與角豆或其半乳甘露聚糖的甘露糖與半乳糖之比大致相似。
10.按照權利要求2-9中任一項的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物為至少一種可用于GDP-甘露糖生物合成的基因產(chǎn)物。
11.按照權利要求10的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物為圖1所示的蛋白質或其變變異體、同源物或衍生物。
12.按照權利要求10或11的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物由圖1所示核苷酸序列編碼，或是其變異體、同源物或衍生物和/或得自NCIMB40774。
13.按照權利要求2-9中任一項的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物為α-半乳糖苷酶。
14.按照權利要求13的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物為圖4所示的蛋白質或其變異體、同源物或衍生物。
15.按照權利要求13或14的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物由圖4所示核苷酸序列編碼，或為其變異體、同源物或衍生物和/或得自NCIMB40831。
16.一種酶，它包含圖1所示氨基酸序列或其變異體、同源物或衍生物。
17.編碼權利要求16的酶的核苷酸序列或與其互補和/或可得自NCIMB 40774的序列。
18.按照權利要求17的核苷酸序列，其中該核苷酸序列為DNA序列。
19.一種核苷酸序列，它包含圖1所示序列、或其變異體、同源物或片段或與其互補和/或得自NCIMB 40774的序列。
20.一種構建物，它包含或表達按照權利要求16-19中任一項的發(fā)明。
21.一種載體，它包含或表達按照權利要求16-20中任一項的發(fā)明。
22.一種質粒，它包含或表達按照權利要求16-21中任一項的發(fā)明。
23.一種轉基因生物(或其部分)，它包含或表達按照權利要求16-22中任一項的發(fā)明。
24.按照權利要求23的生物(或其部分)，其中該生物為瓜爾豆植株。
25.按照權利要求10的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物由按照權利要求16-24中任一項的發(fā)明表達或為按照權利要求16-24中任一項的發(fā)明。
26.一種酶，它包含圖4所示氨基酸序列或其變異體、同源物或其片段。
27.編碼權利要求26的酶的核苷酸序列、或與其互補的和/或可得自NCIMB 40831的序列。
28.按照權利要求27的核苷酸序列，其中該核苷酸序列為DNA序列。
29.一種核苷酸序列，它包含圖4所示序列或其變異體、同源物或其片段、或與其互補的和/或得自NCIMB 40831的序列。
30.一種構建物，它包含或表達按照權利要求26-29中任一項的發(fā)明。
31.一種載體，它包含或表達按照權利要求26-30中任一項的發(fā)明。
32.一種質粒，它包含或表達按照權利要求26-31中任一項的發(fā)明。
33.一種轉基因生物(或其部分)，它包含或表達按照權利要求26-32中任一項的發(fā)明。
34.按照權利要求33的轉基因生物(或其部分)，其中該生物為瓜爾豆植株。
35.按照權利要求9的發(fā)明，其中該基因產(chǎn)物由按照權利要求26-34中任一項的發(fā)明表達或為按照權利要求26-34中任一項的發(fā)明。
36.含甘露糖/半乳糖化合物，它用權利要求1-3中任一項或從屬于它的任一權利要求的方法制備。
37.一種食料，包含按照權利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
38.一種組合物，它包含與另一多糖混合的按照權利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
39.一種組合物，它包含與噸膠、角叉菜膠和瓊脂糖中任一種或多種混合的按照權利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
40.制備一種組合物和一種食料的方法，其中該組合物或該食料包含與另一合適組分混合的按照權利要求36的含甘露糖/半乳糖化合物。
41.大致如本文描述的方法。
42.大致如本文描述并參考圖1的核苷酸序列。
43.大致如本文描述并參考圖1的酶。
44.大致如本文描述并參考圖4的核苷酸序列。
45.大致如本文描述并參考圖4的酶。
全文摘要
描述一種體內修飾方法。該體內修飾方法影響或者能夠產(chǎn)生含甘露糖/半乳糖化合物的生物(或其部分)或其含甘露糖/半乳糖化合物的甘露糖與半乳糖之比。
文檔編號C12N9/90GK1207772SQ96199781
公開日1999年2月10日 申請日期1996年12月2日 優(yōu)先權日1995年12月4日
發(fā)明者M·約斯波伊, J·布倫斯特德特, S·G·佩特森 申請人:丹尼斯科有限公司