專利名稱：過敏反應(yīng)在植物體中誘導(dǎo)的抗性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及賦予植物過敏反應(yīng)誘導(dǎo)的抗性。
背景技術(shù)：
活的有機(jī)體進(jìn)化形成一系列復(fù)雜的生化途徑使它們能夠?qū)Νh(huán)境中的信號進(jìn)行識別和應(yīng)答。這些途徑包括受體器官、激素、第二信使，和酶的修飾。目前，有關(guān)在植物對病原體侵襲而作出應(yīng)答過程中激活的信號傳導(dǎo)途徑知之甚少，盡管這種知識對理解疾病的易感性和抗性至關(guān)重要。植物抗性的一般形式是限制病原體在圍繞感染位點的小范圍內(nèi)增殖。在許多情況中，這種限制伴隨有宿主組織的局部死亡(即，壞死)。綜合起來，病原體限制和局部組織壞死構(gòu)成了過敏反應(yīng)的特征。除了局部防御應(yīng)答以外，許多植物還通過激活在植物非感染部分的防御而對感染作出應(yīng)答。結(jié)果，整株植物對次級感染更具有抗性。這種整體獲得的抗性可持續(xù)數(shù)周或更長時間( R.E.F.Matternews植物病毒學(xué)(學(xué)術(shù)出版社，紐約，第二版，1981))并且經(jīng)常賦予對無關(guān)病原體的交叉抗性(J.Kuc，植物疾病控制新方法，I.Chet，編(Wiley，紐約，1987)，255-274頁，在此引入僅供參考)。
整體獲得的抗性的表達(dá)與正常毒性病原體侵襲免疫的組織的失敗有關(guān)(Kuc，J.，“對植物疾病誘導(dǎo)的免疫性”，生物科學(xué)，32854-856(1982)，在此引用僅供參考)。整體獲得的抗性的建立與細(xì)胞壁羥脯氨酸水平和過氧化物酶活性的整體增加(Smith，J.A.，等，“與黃瓜、香瓜及西瓜中誘導(dǎo)的抗性有關(guān)的酸性過氧化物酶的比較研究”，分子生理植物病理，14329-338(1988)，在此引用僅供參考)及一套9個家族的所謂整體獲得的抗性基因的表達(dá)(Ward，E.R.，等，“對誘導(dǎo)整體獲得的抗性試劑應(yīng)答中協(xié)同(coordinate)的基因活性”，植物細(xì)胞，349-59(1991)，在此引入僅供參考)相互關(guān)聯(lián)。這些防御基因家族中的5個編碼其生理功能尚未確定的發(fā)病機(jī)理相關(guān)性蛋白。然而，這些蛋白中有些具有體外抗真菌活性(Bol，J.F.，等，“由病毒感染誘導(dǎo)的植物發(fā)病機(jī)理相關(guān)性蛋白”，植物病理年鑒，28113-38(1990)，在此引入僅供參考)并且在轉(zhuǎn)基因煙草中豆類殼多糖酶基因的組成型表達(dá)保護(hù)免受真菌Rhizoctonia solani的感染(Broglie，K.，等，“具有對真菌病原體Rhizoctonia solani增強(qiáng)抗性的轉(zhuǎn)基因植物”，科學(xué)，2541194-1197(1991)，在此引用僅供參考)，表明這些整體獲得的抗性蛋白可有助于免疫狀態(tài)(Uknes，S.，等，“擬南芥屬中的獲得的抗性”，植物細(xì)胞，4645-656(1992)，在此引用僅供參考)。
水楊酸似乎在誘導(dǎo)整體獲得的抗性中起到信號功能的作用因為免疫以后內(nèi)源性水平增加(Malamy，J.，等，“水楊酸在煙草對病毒感染的抗性應(yīng)答中一種可能的內(nèi)源信號”，科學(xué)2501002-1004(1990)，在此引入僅供參考)并且外源性水楊酸鹽誘導(dǎo)整體獲得的抗性基因(Yalpani，N.，等，“水楊酸是一種整體信號和病毒感染的煙草中發(fā)病機(jī)理相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)物”，植物細(xì)胞3809-818(1991)，在此引用僅供參考)，并且獲得抗性(Uknes，S.，等，“擬南芥屬中的獲得抗性”，植物細(xì)胞4645-656(1992)，在此引入僅供參考)。此外，其中的水楊酸鹽被編碼水楊酸鹽羥化酶的細(xì)菌轉(zhuǎn)基因作用所破壞的轉(zhuǎn)基因煙草植物中沒有顯示出整體的獲得性抗性(Gaffney，T.，等，“需要水楊酸用于誘導(dǎo)整體性獲得抗性”，科學(xué)261754-296(1993)在此引入僅供參考)。然而，此效應(yīng)可能反映局部而不是整體信號功能的抑制，并且黃瓜中信號傳遞的詳細(xì)動力學(xué)分析表明水楊酸鹽對長距離信號傳遞可能是不必要的(Rasmussen，J.B.，等，“以丁香假單胞菌致病變種(Pseudomonas Syringae pv.Syringae)接種后黃瓜中水楊酸積累的整體誘導(dǎo)”，植物生理，971342-1347)(1991)，在此引用僅供參考)。
用生物活性劑的免疫已進(jìn)行了廣泛研究。通過預(yù)先以栽培品種-非病原性種類(Rahe，J.E.，“在普通菜豆(Phaseolus Vulgaris)中誘導(dǎo)的對豆類炭疽病(Anthracnose)的抗性”，植物病理學(xué)591641-5(1969)；Elliston，J等，“在距離誘導(dǎo)相互作用位點的一段距離處誘導(dǎo)的對炭疽病的抗性”，植物病理學(xué)611110-12(1971)；Skipp.R.等，“豆類炭疽病中交叉保護(hù)的研究”，生理學(xué)植物病理學(xué)3299-313(1973)，在此引用僅供參考)。在癥狀出現(xiàn)之前在宿主組織中通過加熱而毒性減弱的栽培品種-病原性種類(Rahe，J.E.，等，“豆類炭疽病熱限制感染效應(yīng)的代謝性質(zhì)”，植物病理學(xué)601005-9(1970)，在此引用僅供參考)或豆類的非病原體感染，綠豆被整體地免疫以抵抗菜豆毛盤孢(Colletotrichum lindemuthianum)栽培品種病原種類導(dǎo)致的疾病。黃瓜的炭疽病病原體，葫蘆科毛盤孢(Colletotrichumlagenarium)作為抗所有種類豆類炭疽病整體保護(hù)的誘導(dǎo)物與非病原性種類同樣有效。在抗一種或更多種菜豆毛盤孢種類的栽培品種中以及在對所有報導(dǎo)的真菌種類易感且因此稱為‘缺乏對病原體的遺傳抗性’的栽培品種中(Elliston，J.，等，”豆類非病原性毛盤孢屬種類對豆類炭疽病的保護(hù)”，Phytopathologische Zeitschrift 88117-26(1976)；Elliston，J.等，“在毛盤孢屬種類和Phaseolus Vulgaris之間相容，不相容及誘導(dǎo)不相容相互作用形成的比較研究”，PhytopathologischeZeitschrift 87289-303(1976)，在此引用僅供參考)保護(hù)由葫蘆科毛盤孢誘導(dǎo)。這些結(jié)果表明在報導(dǎo)的“具有”或“缺乏”抗性基因的栽培品種中相同的機(jī)制可被誘導(dǎo)(Elliston，J，等，“植保菌素(Phytoalexin)的積累與豆類抗炭疽病局部及整體保護(hù)的關(guān)系”Phytopathologische Zeitschrift 88114-30(1977)在此引入僅供參考)。對所有種類菜豆毛盤孢易感的栽培品種不缺乏用于抗病原體抗性機(jī)制的基因也是顯而易見的。
Kuc.J.，等，“通過葫蘆科毛盤孢保護(hù)黃瓜抵抗葫蘆科毛盤孢”，生理學(xué)植物病理學(xué)7195-9(1975)，(在此引用僅供參考)，表明黃瓜植物可通過事先以相同的真菌接種子葉或第一片真葉而引起整體地保護(hù)其抵抗由葫蘆科毛盤孢導(dǎo)致的疾病。因此，黃瓜通過事先以真菌、細(xì)菌、或病毒的局部感染而被整體地保護(hù)其抵抗真菌、細(xì)菌及病毒疾病(Hammerschmidt，R.等，“保護(hù)黃瓜抵抗葫蘆科毛盤孢和黃瓜枝孢(Cladosporium Cucumerinum)”，植物病理學(xué)66790-3(1996)；Jenns，A.E.，等，“以煙草壞死病毒的局部感染保護(hù)黃瓜抵抗葫蘆科毛盤孢”，生理學(xué)植物病理學(xué)11207-12(1977)；Caruso，F(xiàn).L.，等，“通過黃瓜角斑病假單胞菌和葫蘆科毛盤孢誘導(dǎo)的黃瓜對炭疽病及角葉斑(Angular Leaf Spet)的抗性”，生理學(xué)植物病理學(xué)14191-201(1979)；Staub，T，等，“通過預(yù)先以任一真菌的局部感染整體保護(hù)黃瓜植物抵抗由黃瓜枝孢和葫蘆科毛盤孢導(dǎo)致的疾病”，生理學(xué)植物病理學(xué)，17389-93(1980)；Bergstrom，G.C.，等，“由葫蘆科毛盤孢，黃瓜角斑病假單胞菌或煙草壞死病毒局部感染黃瓜對黃瓜花葉病毒整體抗性的影響”，植物病理學(xué)72922-6(1982)；Gessler，C.，等，“通過根及葉的病原體在黃瓜中誘導(dǎo)對鐮孢屬枯萎的抗性”，植物病理學(xué)721439-41(1982)；Basham，B，等，“煙草壞死病毒在黃瓜中誘導(dǎo)對蒼耳單絲殼菌的整體抗性”，生理學(xué)植物病理學(xué)23137-44(1983)，在此引用僅供參考)。由葫蘆科毛盤孢或煙草壞死病毒感染所誘導(dǎo)的非特異性保護(hù)有效地抵抗至少13種病原體，包括專一及兼性寄生真菌，局部損傷及整體病毒，枯萎真菌(wilt fungi)及細(xì)菌。同樣地，保護(hù)由根部病原體所誘導(dǎo)并也有效地抵抗根部病原體。其它的葫蘆科植物，包括西瓜和香瓜已整體地保護(hù)其抵抗葫蘆科毛盤孢(Caruso，F(xiàn).L.，等，“通過葫蘆科毛盤孢保護(hù)西瓜和香瓜抵抗葫蘆科毛盤孢”，植物病理學(xué)671285-9(1977)，在此引用僅供參考)。
在煙草中的整體保護(hù)也被誘導(dǎo)抵抗多種疾病(Kuc.J.，等，“在煙草中免疫用于疾病的抗性”，煙草科學(xué)最新進(jìn)展9179-213(1983)，在此引入僅供參考)。由煙草花葉病毒造成的壞死性損傷增強(qiáng)了上部葉片對該病毒引起的疾病的抗性(Ross，A.F.，等，“在植物中由局部病毒感染誘導(dǎo)的整體獲得的抗性”，病毒學(xué)14340-58(1961)；Ross，A.F.，等，“局部損傷形成的整體性影響”，在植物病毒127-50頁(1966)，在此引入僅供參考)，即寄生疫霉致病變種(Phytophthoraparasitica var.nicotianae)，P.tabacina和煙草野火病假單胞菌(Pseudomonas tabaci)及降低繁殖的蚜蟲(aphid)Myzus persicae(McIntyre，J.L.，等，“通過對病毒過敏的煙草的煙草花葉病毒感染誘導(dǎo)抵抗寄生疫霉(Phytophthora Parasitica var.nicotianae)的局部和整體保護(hù)”，生理學(xué)植物病理學(xué)15321-30(1979)；McIntyre，J.L.，等，“煙草花葉病毒對煙草(Nicotiana Tabacum)的局部感染對抵抗各種病原體和昆蟲的整體抗性的影響”，植物病理學(xué)71297-301(1981)，在此引用僅供參考)。加熱滅活的P.tabaci(Lovrekovich，L.，等，“在以加熱滅活的細(xì)菌處理的煙草葉中誘導(dǎo)抗煙草野火病的反應(yīng)”，自然205823-4(1965)，在此引用僅供參考)，和茄假單胞菌(Sequeira，L.等，“細(xì)菌和宿主細(xì)胞壁的相互作用其與誘導(dǎo)抗性機(jī)制之間的關(guān)系”，生理植物病理學(xué)1043-50(1977)，在此引用僅供參考)，浸入煙草葉片中誘導(dǎo)對用于浸入的相同細(xì)菌的抗性。煙草植物也通過線蟲Pratylenchus penetrans而保護(hù)其抵抗寄生疫霉(Pparasitica var.nicotiana)(McIntyre，J.L.，等，“通過栽培品種-非病原性種類，無細(xì)胞超聲裂解物及Pratylenchus Penetrans保護(hù)煙草抵抗寄生疫霉(Phytophthora Parasitica Var.Nicotianae)”，植物病理學(xué)68235-9(1978)，在此引用僅供參考)。
Cruikshank，I.A.M.，等，“以Peronospora Tabacina亞當(dāng)對煙草的莖部侵入對于葉片對藍(lán)色霉菌反應(yīng)的影響”，澳大利亞農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所雜志26369-72(1960)，在此引入僅供參考，是第一個報導(dǎo)通過以真菌莖部注射免疫煙草葉片抗藍(lán)色霉菌(即，P.tabacina)，它也涉及矮化及提前衰老。最近發(fā)現(xiàn)從外部至木質(zhì)部的注射不僅減輕了發(fā)育阻滯而且加快了生長和發(fā)育。免疫過的煙草植株，無論在溫室還是野外的實驗中，增高約40％，干重增加40％，鮮重增加30％，并且較對照植株多4-6片葉子(Tuzun，S，等，“以Peronospora Tabacina莖部注射和Metalaxyl處理對野外中煙草的生長及保護(hù)其抵抗藍(lán)色霉菌的影響”，植物病理學(xué)74804(1984)，在此引入僅供參考)。這些植株開花比對照植株約早2-3周(Tuzun，S.，等，“在以整體保護(hù)其抵抗藍(lán)色霉菌的Peronospora Tabacina亞當(dāng)感染的煙草中因子的活動”，生理植物病理學(xué)26321-30(1985)，在此引用僅供參考)。
整體保護(hù)并不賦予對感染的絕對免疫，但降低于疾病的嚴(yán)重性并延遲癥狀的形成。損傷數(shù)目、損傷大小、及真菌病原體孢子形成的程度均減小。發(fā)病區(qū)域可減少超過90％。
當(dāng)黃瓜在初次接種后的3-6周施以“強(qiáng)化”接種時，由葫蘆科毛盤孢誘導(dǎo)的免疫持續(xù)到開花和結(jié)果(Kuc.J.，等，“通過葫蘆科毛盤孢保護(hù)黃瓜抵抗葫蘆科毛盤孢的方面”，植物病理學(xué)67533-6(1977)，在此引用僅供參考)。一旦植物開始形成果實則不能誘導(dǎo)保護(hù)。煙草植物在生長季節(jié)通過以P.tabacina的孢子囊莖部注射加以免疫。然而，為了防止整體藍(lán)色霉菌的形成，該技術(shù)僅當(dāng)植株高于20cm才有效。
從免疫黃瓜植物中去除誘導(dǎo)葉并不降低以前存在伸展葉的免疫水平。然而，以后從頂芽出現(xiàn)的葉片較其先前的其它葉片漸漸變得不受保護(hù)(Dean，R.A.，等，“在黃瓜中誘導(dǎo)的整體保護(hù)產(chǎn)生的時間和‘信號’的移動”，植物病理學(xué)76966-70(1986)，在此引用僅供參考)。Ross，A.F報導(dǎo)了類似的結(jié)果，“局部損傷形成的整體效應(yīng)”，在植物病毒127-50頁(1966)，在此引入僅供參考，免疫的煙草(局部損傷宿主)通過事先以煙草花葉病毒感染而抵抗煙草花葉病毒。相反，從莖部以P.tabacina注射而免疫的煙草植物中切下的幼枝發(fā)出的新葉是受高度保護(hù)的(Tuzun，S.，等，“通過愈傷組織煙草中誘導(dǎo)的對藍(lán)色霉菌(Peronospora Tabacina亞當(dāng)，抗性的轉(zhuǎn)移”，植物病理學(xué)751304(1985)，在此引入僅供參考)。從免疫植物的葉通過組織培養(yǎng)而再生的植物在藍(lán)色霉菌方面相對于從非免疫母本葉再生的植物表現(xiàn)出顯著的減少。年幼的再生體僅表現(xiàn)出減少的孢子形成。隨著植物老化，損傷形成及孢子形成均減少。然而，其它研究者沒有得到相同的結(jié)論，盡管在一個實驗中報導(dǎo)了孢子形成的顯著減少(Lucas，J.A.，等，“對Peronospora Hyoscyami的誘導(dǎo)抗性從被保護(hù)的煙草外植體向再生體的不可傳遞性”，植物病理學(xué)751222-5(1985)，在此引用僅供參考)。
黃瓜和西瓜的保護(hù)在溫室及野外中是有效的(Caruso，F(xiàn).L.，等，“通過葫蘆科毛盤孢野外保護(hù)黃瓜抵抗葫蘆科毛盤孢”，植物病理學(xué)671290-2(1977)，在此引用僅供參考)。在一次試驗中，保護(hù)黃瓜上葫蘆科毛盤孢的總的損傷面積不到未保護(hù)對照植物損傷面積的2％。同樣地，66株保護(hù)的，受攻擊的植物中僅1株死亡，相反69株未保護(hù)，受攻擊的西瓜中47株死亡。在肯塔基及波多黎各廣泛的野外試驗中，煙草莖部以P.tabacina的孢子囊注射在控制藍(lán)色霉菌中至少與最好的殺真菌劑，metalaxyl同樣有效。根據(jù)壞死面積和孢子形成程度，植物95-99％受保護(hù)，導(dǎo)致治愈煙草10-25％的產(chǎn)量增加。
抗細(xì)菌及病毒的誘導(dǎo)抗性似乎表現(xiàn)為疾病癥狀或病原體復(fù)制的抑制或兩者兼而有之(Caruso，F(xiàn).L.，等，“通過黃瓜角斑病假單孢菌和葫蘆科毛盤孢誘導(dǎo)黃瓜對炭疽病及角葉斑的抗性”，生理植物病理學(xué)14191-201(1979)；Doss，M.，等，“黃瓜整體獲得的對黃瓜角斑病假單孢菌的抗性，表現(xiàn)為癥狀的抑制，而不是細(xì)菌的復(fù)制”，AcatPhytopathologia Academiae Sclentiarum Hungaricae16(3-4)，269-72(1981)；Jenns，A.E.等，“通過以煙草壞死病毒、葫蘆科毛盤孢或黃瓜角斑病假單胞菌局部感染黃瓜整體誘導(dǎo)的對病原體的非特異性抗性”，Phytopathologia Mediterranea 18129-34(1979)，在此引用僅供參考)。
正如上所述，關(guān)于整體獲得抗性的研究包括以感染性病原體感染植物。盡管此領(lǐng)域的研究對于理解整體獲得抗性是如何起作用的是有用的，以感染性活性劑誘導(dǎo)這樣的抗性在商業(yè)上是沒有用的，因為這樣的植物病原體接觸能減弱或殺死植物。本發(fā)明涉及克服此種缺陷。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及賦予植物病原體抗性的方法。此方法包括在多肽或蛋白接觸植物細(xì)胞的條件下應(yīng)用非感染形式的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物(hypersensitive response elicitor)多肽或蛋白于植物中。
本發(fā)明的另一方面涉及病原體抗性植物，其細(xì)胞與非感染性過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白接觸。
本發(fā)明的另一方面涉及用于賦予植物病原體抗性的組合物。該組合物包括非感染性、過敏反應(yīng)誘導(dǎo)多肽或蛋白以及載體。
本發(fā)明具有下面的能力治療以前不可治療的植物疾?。徽w治療由于費用高人們不想單獨治療的疾??；以及避免使用治療疾病的感染性活性劑。本發(fā)明可賦予抗性而無需使用對被治療的植物或位于這些治療植物附近的植物具有病原性的活性劑。由于本發(fā)明包括使用可完全生物降解的天然產(chǎn)品，故將不會污染環(huán)境。
附圖簡述

圖1顯示了編碼解淀粉歐文氏桿菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白(即，hrpN)基因簇的遺傳結(jié)構(gòu)。頂部線顯示質(zhì)粒載體pCPP 430的限制性酶圖譜，其中E＝EcoRI，B＝BamHI，且H＝HindIII。長方形代表轉(zhuǎn)錄單位，且長方形下面的箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向。較大的箭頭表示用于過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白最終翻譯所必需的區(qū)域。pCPP 430 hrpN是pCPP430的衍生物，其中的hrpN通過插入轉(zhuǎn)座子TnStac而被突變。
圖2為質(zhì)粒載體pCPP 9的圖譜。顯著的特征是用于連接的活動化(mob)位點；λ(cos)粘性位點；及用于質(zhì)粒穩(wěn)定遺傳的分離區(qū)域(par)。B，BamHI；E，EcoRI；H，HindIII；P，PstI；S，SaII；Sm，SmaI；oriV，復(fù)制起點；Spr，壯觀霉素抗性；Smr，鏈霉素抗性。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及賦予植物病原體抗性的方法。該方法包括在多肽或蛋白接觸植物全部或部分細(xì)胞的條件下將一種非感染形式的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白應(yīng)用到全部或部分植物上。
本發(fā)明的另一方面涉及其細(xì)胞與非感染形式的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白接觸的病原體抗性植物。
本發(fā)明還有一個方面涉及用于賦予植物病原體抗性的組合物。該組合物包括非感染的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白以及載體。
用于本發(fā)明的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白可相應(yīng)于源自多種病原體的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。這種多肽或蛋白能夠在接觸誘導(dǎo)物的植物組織中誘導(dǎo)局部壞死。優(yōu)選的病原體包括解淀粉歐文氏桿菌(Erwiniaamylovora)，菊歐文氏桿菌(Erwinia chrysanthemi)，丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)，茄假單胞菌(Pseudomonas solancearum)，田野黃單胞菌(Xanthomonas campestris)，或其混合物。
對于本發(fā)明的目的，非感染形式的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白可誘導(dǎo)過敏反應(yīng)而不導(dǎo)致接觸此多肽或蛋白的植物中的疾病。這可通過許多方法完成，包括1)應(yīng)用分離的誘導(dǎo)物多肽或蛋白；2)應(yīng)用不導(dǎo)致疾病并以編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；和3)應(yīng)用在有些植物種類(但不是要應(yīng)用此細(xì)菌的那些種類)中導(dǎo)致疾病并天然含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白基因的細(xì)菌。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白質(zhì)可分離自相應(yīng)的有機(jī)體并應(yīng)用于植物。這種分離方法眾所周知，如在以下文獻(xiàn)中所述Arlat，M.，F(xiàn).Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“PopA1，一種在特異矮牽牛屬基因型中誘導(dǎo)過敏樣反應(yīng)的蛋白通過茄假單胞菌的Hrp途徑分泌”，EMBO J.13543-553(1994)；He，S.Y.，H.C.Huang，和A.collmer，“Pseudomonassyringae pv.Syringae Harpinpss一種通過Hrp途徑分泌并在植物中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的蛋白”，細(xì)胞731255-1266(1993)；和Wei，Z.-M.，R.J.Laby，C.H.Zumoff，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“由植物病原體解淀粉歐文氏桿菌產(chǎn)生的過敏反應(yīng)Harpin誘導(dǎo)物”，科學(xué)25785-88(1992)，在此引用僅供參考。也參見未決的美國專利申請系列Nos.08/200,024和08/062,024，在此引用僅供參考。然而，優(yōu)選地，本發(fā)明分離的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白經(jīng)重組制備并按下述純化。
在本發(fā)明的其它實施方案中，本發(fā)明的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白可通過應(yīng)用含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因的細(xì)菌應(yīng)用于植物。這種細(xì)菌必需能夠分泌或輸出多肽或蛋白從而使誘導(dǎo)物能夠接觸植物細(xì)胞。在這些實施方案中，過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白在植物體中(inplanta)或剛好在細(xì)菌導(dǎo)入植物之前通過該細(xì)菌而產(chǎn)生。
在本發(fā)明細(xì)菌應(yīng)用模式的一個實施方案中，該細(xì)菌不導(dǎo)致疾病并以編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化(例如，重組)。例如，在植物中不誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的大腸桿菌，可用編碼過敏反應(yīng)的誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化且然后應(yīng)用于植物。細(xì)菌種類(非大腸桿菌)也可用于本發(fā)明此實施方案中。
在本發(fā)明細(xì)菌應(yīng)用模式的另一實施方案中，該細(xì)菌不導(dǎo)致疾病并天然含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因。這種細(xì)菌的實例已在前面說明。然而，在此實施方案中這些細(xì)菌用于對該細(xì)菌傳播的疾病不易感的植物中。例如，解淀粉歐文氏桿菌在蘋果或梨中導(dǎo)致疾病但在西紅柿中不導(dǎo)致疾病。然而，這種細(xì)菌將在西紅柿中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)。因此，根據(jù)本發(fā)明的這個實施方案，解淀粉歐文氏桿菌可用于西紅柿以賦予病原體抗性而不在該種中導(dǎo)致疾病。
來自菊歐文氏桿菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有如下的相應(yīng)于序列鑒定No.1的氨基酸序列Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115 120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235 240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala該過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有34kDa的分子量，是熱穩(wěn)定的，具有大于16％的甘氨酸含量，并且基本上不含半胱氨酸。菊歐文氏桿菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白由具有下面的相應(yīng)于序列鑒定No.2核苷酸序列的DNA分子所編碼CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC 120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG 180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG 240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG 300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG 360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC 420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAA CG GTAACGGTGA GGAACCGTTT 480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG 540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA 600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC 660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT 720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC 1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG 1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT 1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT 1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA 1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA 1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA 1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA 1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC 1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA 1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC 1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC 1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141來自解淀粉歐文氏桿菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有如下的相應(yīng)于序列鑒定No.3的氨基酸序列Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu A la Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170 175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln His Ala Val Pro Val Val Leu Arg Trp Val Leu Met370 375 380Pro385該過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有約37kDa的分子量，其pI約4.3，并且其在100℃至少10分鐘是熱穩(wěn)定的。該過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白基本上沒有半胱氨酸。來自解淀粉歐文氏桿菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白在下面的文獻(xiàn)中被更為詳細(xì)地描述，即Wei，Z.-m.，R.J.Laby，C.H.ZumofF，D.W.Bauer，S.-Y.He，A.Collmer，和S.V.Beer，“Harpin，由植物病原體解淀粉歐文氏桿菌產(chǎn)生的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物”，科學(xué)25785-88(1992)，在此引用僅供參考。編碼此多肽或蛋白的DNA分子具有下面的相當(dāng)于序列鑒定號4的核苷酸序列ATGAGTCTGA ATACAAGTGG GCTGGGAGCG TCAACGATGC AAATTTCTAT CGGCGGTGCG 60GGCGGAAATA ACGGGTTGCT GGGTACCAGT CGCCAGAATG CTGGGTTGGG TGGCAATTCT 120GCACTGGGGC TGGGCGGCGG TAATCAAAAT GATACCGTCA ATCAGCTGGC TGGCTTACTC 180ACCGGCATGA TGATGATGAT GAGCATGATG GGCGGTGGTG GGCTGATGGG CGGTGGCTTA 240GGCGGTGGCT TAGGTAATGG CTTGGGTGGC TCAGGTGGCC TGGGCGAAGG ACTGTCGAAC 300GCGCTGAACG ATATGTTAGG CGGTTCGCTG AACACGCTGG GCTCGAAAGG CGGCAACAAT 360ACCACTTCAA CAACAAATTC CCCGCTGGAC CAGGCGCTGG GTATTAACTC AACGTCCCAA 420AACGACGATT CCACCTCCGG CACAGATTCC ACCTCAGACT CCAGCGACCC GATGCAGCAG 480CTGCTGAAGA TGTTCAGCGA GATAATGCAA AGCCTGTTTG GTGATGGGCA AGATGGCACC 540CAGGGCAGTT CCTCTGGGGG CAAGCAGCCG ACCGAAGGCG AGCAGAACGC CTATAAAAAA 600GGAGTCACTG ATGCGCTGTC GGGCCTGATG GGTAATGGTC TGAGCCAGCT CCTTGGCAAC 660GGGGGACTGG GAGGTGGTCA GGGCGGTAAT GCTGGCACGG GTCTTGACGG TTCGTCGCTG 720GGCGGCAAAG GGCTGCAAAA CCTGAGCGGG CCGGTGGACT ACCAGCAGTT AGGTAACGCC 780GTGGGTACCG GTATCGGTAT GAAAGCGGGC ATTCAGGCGC TGAATGATAT CGGTACGCAC 840AGGCACAGTT CAACCCGTTC TTTCGTCAAT AAAGGCGATC GGGCGATGGC GAAGGAAATC 900GGTCAGTTCA TGGACCAGTA TCCTGAGGTG TTTGGCAAGC CGCAGTACCA GAAAGGCCCG 960GGTCAGGAGG TGAAAACCGA TGACAAATCA TGGGCAAAAG CACTGAGCAA GCCAGATGAC 1020GACGGAATGA CACCAGCCAG TATGGAGCAG TTCAACAAAG CCAAGGGCAT GATCAAAAGG 1080CCCATGGCGG GTGATACCGG CAACGGCAAC CTGCAGCACG CGGTGCCGGT GGTTCTTCGC 1140TGGGTATTGA TGCCATGA 1158
來自丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有如下的相應(yīng)于序列鑒定號5的氨基酸序列Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150 155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260265 270Asn Thr Pro Gln Thr gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340該過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有34-35kDa的分子量。其富含甘氨酸(約13.5％)并缺乏半胱氨酸及酪氨酸。有關(guān)來自丁香假單胞菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的進(jìn)一步信息發(fā)現(xiàn)于He，S.Y.，H.C.Huang，和A.Collmer，“Pseudomonas syringae pv.Syringae Harpinpss一種通過Hrp途徑分泌并在植物中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的蛋白”，細(xì)胞731255-1266(1993)，在此引用僅供參考。編碼來自丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物的DNA分子具有如下的相應(yīng)于序列鑒定號6的核苷酸序列ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGCAA 780TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020
來自茄假單孢菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有如下的相應(yīng)于序列鑒定號7的氨基酸序列Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295 300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340其由如下的具有相應(yīng)于序列鑒定號8的核苷酸序列的DNA分子所編碼ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGAAG GCCGCACA GTCGGCGGGC180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020ACGCAGCCGA TGTAA1035關(guān)于來自茄假單胞菌過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的進(jìn)一步信息在下面的文獻(xiàn)中闡述Arlat，M.，F(xiàn).Van Gijsegem，J.C.Huet，J.C.Pemollet，和C.A.Boucher，“PopA1，一種在特異的矮牽牛屬基因型中誘導(dǎo)過敏樣反應(yīng)的蛋白，通過茄假單胞菌的Hrp途徑分泌”，EMBD雜志.13543-533(1994)，在此引用僅供參考。
來自田野黃單胞菌致病變種甘氨酸的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有如下的相應(yīng)于序列鑒定號9的氨基酸序列Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 25此序列是氨基末端序列，僅具有來自田野黃單胞菌致病變種甘氨酸過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的26個殘基。它與在其它田野黃單胞菌致病變種中測定的菌毛亞基蛋白相匹配。
上面的誘導(dǎo)物是例舉性的。其它的誘導(dǎo)物可通過在編碼誘導(dǎo)物基因表達(dá)的情況下培養(yǎng)誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的細(xì)菌加以鑒定。培養(yǎng)上清中的無細(xì)胞制品可通過用它們浸入適當(dāng)?shù)闹参锝M織檢測其誘導(dǎo)物活性(即，局部壞死)。
將上面的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的片段以及其它病原體全長誘導(dǎo)物片段用于本發(fā)明的方法中也是可能的。
適當(dāng)?shù)钠慰赏ㄟ^幾種方法制備。在第一種方法中，編碼已知誘導(dǎo)物蛋白基因的亞克隆通過亞克隆基因片段的常規(guī)分子遺傳操作制備。該亞克隆然后在體外或細(xì)菌細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)以產(chǎn)生可根據(jù)下述方法測試誘導(dǎo)物活性的更小蛋白或肽。
作為選擇，誘導(dǎo)物蛋白片段可通過以蛋白水解酶如胰凝乳蛋白酶或葡萄球菌蛋白酶A或胰蛋白酶酶切全長誘導(dǎo)物蛋白而制備。不同的蛋白水解酶可能根據(jù)誘導(dǎo)物蛋白的氨基酸序列在不同的位點切割誘導(dǎo)物蛋白。蛋白水解得到的有些片段可以是抗性的活性誘導(dǎo)物。
在另一種方案中，根據(jù)蛋白的一級結(jié)構(gòu)知識，誘導(dǎo)物蛋白基因的片段可通過用PCR技術(shù)及挑選的代表該蛋白特定部分的具體引物套一起而合成。然后這些片段將克隆入適當(dāng)?shù)妮d體用于增加及表達(dá)截短的肽或蛋白。
變異體也可(或作為選擇)通過，例如，缺失或添加對多肽特性、二級結(jié)構(gòu)及水療性質(zhì)具有最小影響的氨基酸來加以修飾。例如，多肽可在蛋白的N-末端連接到信號(或前導(dǎo))序列上，該序列共翻譯或反翻譯，介導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)運。多肽也可連接到連接物或其它序列上以便于多肽的合成、純化或鑒定。
本發(fā)明的蛋白或多肽優(yōu)選通過常規(guī)技術(shù)以純化的形式(優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選90％純度)制備。一般地，本發(fā)明的蛋白或多肽分泌進(jìn)入重組大腸桿菌的生長培養(yǎng)基。為了分離該蛋白，繁殖帶有重組質(zhì)粒的大腸桿菌宿主細(xì)胞、勻漿，并離心勻漿產(chǎn)物以去除細(xì)菌碎片。然后將上清進(jìn)行隨后的硫酸銨沉淀。將含有本發(fā)明多肽或蛋白的部分在適當(dāng)孔徑的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中進(jìn)行凝膠過濾以分離蛋白。如果必要，蛋白部分可通過HPLC進(jìn)一步純化。
編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的DNA分子可用常規(guī)的重組DNA技術(shù)摻入細(xì)胞中。一般來說，這包括將DNA分子插入該DNA分子對其是異源性的(即，不是正常存在的)表達(dá)整體中。該異源DNA分子以適當(dāng)有意義的方向和正確的閱讀框架插入表達(dá)整體。該載體含有用于插入的蛋白編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的元件。
Cohen和Boyer的美國專利No.4,237,224，在此引用僅供參考，描述了用限制性酶切割和以DNA連接酶連接的以重組質(zhì)粒形式的表達(dá)整體的制備。這些重組質(zhì)粒然后通過轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入并在包括生長于組織培養(yǎng)物中的原核生物及真核細(xì)胞的單細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制。
重組基因也可導(dǎo)入病毒，如牛痘病毒。重組病毒可通過將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)以病毒感染的細(xì)胞中而產(chǎn)生。
合適的載體包括，但不限于下面的病毒載體如λ載體整體gt11，gtWES.tB，Charon 4，和質(zhì)粒載體如pBR 322，pBR 325，pACYC 177，pACYC 184，pUC 8，pUC 9，pUC 18，pUC 19，pLG 339，pR 290，pKC 37，pKC 101，SV 40，pBluescript II SK+/-或KS+/-(參見“Stratagene的克隆整體”目錄(1993)，Stratagene，La Jolla，Calif，在此引用僅供參考)，pQE，pIH 821，pGEX，pET系列(參見F.WStudier等，“用T7 RNA聚合酶介導(dǎo)克隆基因的表達(dá)”，基因表達(dá)技術(shù)185卷(1990)，在此引用僅供參考)，及其任何衍生物。重組分子可通過轉(zhuǎn)化、尤其轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、移動或電穿孔導(dǎo)入細(xì)胞。DNA序列用本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的克隆方法克隆入載體，如Maniatis等所述，分子克隆實驗指南，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約(1982)，在此引用僅供參考。
許多宿主載體整體可被利用以表達(dá)蛋白編碼序列。主要地，載體整體必需與所用的宿主細(xì)胞是可相容的。宿主-載體整體包括但不限于如下以噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA、或粘粒DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；諸如含有酵母載體的酵母的微生物；以病毒(例如牛痘病毒，腺病毒等)感染的哺乳動物細(xì)胞整體；以病毒(如，桿狀病毒)感染的昆蟲細(xì)胞整體；及以細(xì)菌感染的植物細(xì)胞。這些載體表達(dá)元件的長度和特性是不同的。依據(jù)所用的宿主-載體整體，可使用許多合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯元件中的任何一個。
不同的遺傳信號和加工事件控制基因表達(dá)的多個水平(如，DNA轉(zhuǎn)錄及信使RNA(mRNA)翻譯)。
DNA轉(zhuǎn)錄依賴于啟動子的存在，后者為一種DNA序列，指導(dǎo)RNA聚合酶的結(jié)合并因此啟動mRNA合成。真核啟動子的DNA序列不同于原核啟動子的DNA序列。此外，真核啟動子及伴隨的遺傳信號不可在原核整體中被識別或不發(fā)揮作用，且此外，原核啟動子在真核細(xì)胞中不被識別并且不發(fā)揮作用。
同樣地，mRNA在原核生物中的翻譯依賴于適當(dāng)?shù)牟煌谡婧松锏脑松镄盘柕拇嬖凇RNA在原核生物中有效的翻譯需要mRNA上稱為Shine-Dalgarno(“SD”)序列的核糖體結(jié)合位點。此序列為位于起始密碼子之前的短的mRNA核苷酸序列，起始密碼子常為AUG，編碼蛋白氨基末端的甲硫氨酸。SD序列與16srRNA(核糖體RNA)的3′-末端互補并可能通過與rRNA形成雙螺旋以允許校正核糖體的定位而啟動mRNA與核糖體的結(jié)合。對于使基因表達(dá)最大化的綜述，見Roberts和Lauer，酶學(xué)方法，68473(1979)，在此引入僅供參考。
啟動子的“強(qiáng)度”(即它們啟動轉(zhuǎn)錄的能力)有所不同。為達(dá)到克隆基因表達(dá)的目的，為了獲得基因高水平的轉(zhuǎn)錄及，因此的表達(dá)，使用強(qiáng)啟動子是必要的。依據(jù)所用的宿主細(xì)胞整體，可使用許多合適啟動子中的任何一個。例如，當(dāng)克隆于大腸桿菌中，其噬菌體或質(zhì)粒中時，可使用如下啟動子，如T7噬菌體啟動子，lac啟動子，trp啟動子，recA啟動子，核糖體RNA啟動子，大腸桿菌噬菌體λ的PR及PL啟動子以及其它啟動子，包括但不限于，lacUV5，ompF，bla，lpp等，以指導(dǎo)相鄰DNA片段的高水平轉(zhuǎn)錄。此外，可使用通過重組DNA或其它合成DNA技術(shù)而制備的雜合體trp-lacUV5(tac)啟動子或其它大腸桿菌啟動子以提供用于插入基因的轉(zhuǎn)錄。
如果無需特別誘導(dǎo)可挑選抑制啟動子功能的細(xì)菌宿主細(xì)胞菌株及表達(dá)載體。在某些操作中，添加特異的誘導(dǎo)物對插入DNA的有效轉(zhuǎn)錄是必需的。例如，lac操縱子通過添加乳糖或IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)加以誘導(dǎo)。許多種其它的操縱子，如trp，pro，等，在不同的控制之下。
在原核細(xì)胞中特異的起始信號也是需要的以用于有效的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。這些轉(zhuǎn)錄及翻譯起始信號的“強(qiáng)度”可不相同，該“強(qiáng)度”通過定量基因特異性信使RNA及合成的蛋白而分別加以測定。含有啟動子的DNA表達(dá)載體也可含有各種“強(qiáng)”轉(zhuǎn)錄和/或翻譯起始信號的任意組合。例如，在大腸桿菌中有效的翻譯需要起始密碼子(ATG)5′的約7-9個堿基的Shine-Dalgarno(SD)序列以提供核糖體結(jié)合位點。因此，可利用可被宿主細(xì)胞核糖體利用的任何SD-ATG組合。這樣的組合包括但不限于來自大腸桿菌噬菌體λ的cro基因或N基因，或來自大腸桿菌色氨酸(tryptophan)E.D.C.B或A基因的SD-ATG組合。此外，可使用由重組DNA或包括摻入合成核苷酸的其它技術(shù)所制備的任何SD-ATG組合。
一旦編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的分離的DNA分子被克隆入表達(dá)整體，其便容易地?fù)饺氲剿拗骷?xì)胞。這樣的摻入可根據(jù)載體/宿主細(xì)胞整體通過上述的各種形式的轉(zhuǎn)化來完成。合適的宿主載體細(xì)胞包括，但不限于細(xì)菌、病毒、酵母、哺乳動物細(xì)胞、昆蟲、植物等。
本發(fā)明方法可用于處理多種植物以賦予病原體抗性。合適的植物包括雙子葉及單子葉植物。更為特別地是，有用的莊稼植物可包括水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、土豆、甘薯、蠶豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、卷心菜、花椰菜、硬花球花椰菜、蘿卜、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、西葫蘆、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、草莓、葡萄、懸鉤子、菠蘿、黃豆、煙草、西紅柿、高粱、及甘蔗。合適的裝飾植物的實例有擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)、非洲紫苣苔屬(Saintpaulia)，矮牽牛屬、天竺葵屬、一品紅屬、菊屬、石竹屬、以及百日菊屬。
根據(jù)本發(fā)明賦予植物病原體抗體的方法在賦予對多種病原體包括病毒、細(xì)菌及真菌的抗性中是有用的。
特別地對下面病毒的抗性可通過本發(fā)明的方法完成煙草花葉病毒和西紅柿花葉病毒。
特別地對下面細(xì)菌的抗性也可根據(jù)本發(fā)明賦予植物茄假單孢菌，丁香假單胞菌致病變種，tabaci，及田野黃單胞菌變種pelargonii。
通過使用本發(fā)明的方法可使植物特別地對以下真菌具有抗性尖孢鐮孢和蔓延疫霉。
本發(fā)明的方法可通過應(yīng)用過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白至全部或部分的待處理植物的各種方法加以完成。這可以(但不必)包括侵入過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白進(jìn)入植物。合適的使用方法包括高壓或低壓噴施，注射以及鄰近進(jìn)行誘導(dǎo)物施用時的葉片損傷。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可設(shè)想出其它合適的使用方法，只要它能使過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白與植物細(xì)胞有效地接觸。
過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白可根據(jù)本發(fā)明單獨或以與其它物質(zhì)的混合物應(yīng)用于植物。
本發(fā)明的一個方面包括用于賦予植物病原體抗性的含有在載體中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的組合物。合適的載體包括水或水溶液。在此實施方案中，組合物含有大于500nM過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
盡管不是必需，該組合物可含有額外的添加劑包括肥料、殺蟲劑、殺真菌劑及其混合物。合適的肥料包括(NH4)2NO3。合適殺蟲劑的例子為馬拉硫磷。有用的殺真菌劑包括克菌丹。
其它合適的添加劑包括緩沖劑、加濕劑、及摩擦劑?？墒褂眠@些物質(zhì)以輔助本發(fā)明的方法。
實施例實施例1-Harpin-誘導(dǎo)的西紅柿抗南方細(xì)菌性枯萎病(茄假單胞菌)的抗性種植于溫室中8×15cm平地上的2周齡西紅柿幼苗作以下處理20株植物用于以下六種處理中的一種，該處理命名為A至F，且描述如下(A)約100μl的200μg/ml粗harpin(即過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白)制品(Z-M.Wei，“Harpin，通過植物病原體解淀粉歐文氏桿菌制備的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物”，科學(xué)25785-88(1992)，在此引入僅供參考)浸入每株幼苗的最低真葉中。
(B)與用于(A)中相同的harpin制品以400-網(wǎng)眼的金剛砂噴撒至幼苗的葉片表面并且然后用大拇指輕輕摩擦。
(C)大腸桿菌DH5(pCPP 430)(質(zhì)粒載體pCPP 430的圖譜見圖1)培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基至OD260＝0.7。離心培養(yǎng)物且然后重懸于pH 6.5的5mM的磷酸鉀緩沖液中。約100μl的細(xì)胞懸液浸入到幼苗的每個葉片中。
(D)與(C)中一樣使用大腸桿菌DH5(pCPP 430∷hrpN)(質(zhì)粒載體pCPP 430∷hrpN的圖譜見圖1)。培養(yǎng)細(xì)胞，并且所用的懸液及接種量與(C)中描述的相同。
(E)對于大腸桿菌DH5(pCPP9)(見圖2)，培養(yǎng)細(xì)胞并且所用的懸液及接種量與(C)中所述相同。
(F)將葉片以5mM磷酸鉀緩沖液浸入如(C)中所述。
將攻擊的病原細(xì)菌，茄假單胞菌菌株K60培養(yǎng)于King氏培養(yǎng)基B至OD260＝0.7(約108cfu/ml)。離心培養(yǎng)物并重懸于100體積5mM的磷酸鉀緩沖液中至終濃度約1×106cfu/ml。
在西紅柿幼菌以harpin或細(xì)菌處理三天以后，將其拔出并用剪刀切下約1厘米的根。然后將幼苗浸入茄假單胞菌K60中3分鐘。接種過的植物重新種植于相同的小罐中。將植物置于溫室，并在接種后的7天記錄疾病發(fā)生率。A.以harpin處理的影響24小時以后，僅那些以harpin或大腸桿菌DH5(pCPP 430)浸入的葉片部分萎縮。以harpin和金剛砂噴撒的葉片僅顯示出斑點狀壞死。B.以harpin處理對南方細(xì)菌枯萎形成的影響。
20株浸入harpin的植物中沒有一株在接種茄假單胞菌K60一周后表現(xiàn)出任何癥狀(表1)。20株中的一株植物顯示出矮化癥狀。然而，20株浸入緩沖液的植物中有7株表現(xiàn)出矮化癥狀。與以緩沖液處理的植物相比以大腸桿菌DH5(pCPP 430-)(一種不能誘導(dǎo)過敏性萎縮的轉(zhuǎn)座子-誘導(dǎo)突變子)或大腸桿菌DH5(pCPP9)處理沒有顯示出顯著的差異。這些結(jié)果表明harpin或產(chǎn)生harpin的大腸桿菌DH5(pCPP 430)在西紅柿植物中誘導(dǎo)對茄假單胞菌K60引起的南方細(xì)菌性枯萎的抗性。表1.以茄假單胞菌K60接種7和14天后西紅柿幼苗的疾病發(fā)生率。
植物數(shù)目7天 14天處理矮化 健康 矮化健康A(chǔ).Harpin浸入 0 202 18B.Harpin噴撒 1 193 17C.大腸桿菌DH5(pCPP430) 2 183 17D.大腸桿菌DH5(pCPP430) 4 167 13E.大腸桿菌DH5(pCPP9) 5 15 6+1枯萎13F.緩沖液 7 13 8+1枯萎11無病原體 0 200 20接種后4周，以harpin或大腸桿菌DH5(pCPP 430)處理的植物比以緩沖液處理的植物高和寬。被harpin或緩沖液浸入的10株植物的平均高度列于表2。表2.以harpin或緩沖液處理以后，以茄假單胞菌K60接種4周后西紅柿植物的高度(cm)。
浸入緩沖液 浸入Harpin 浸入緩沖液未接種 以K60接種 以K60接種36 32 1141 29 2135 38 3334 35 1239 37 1535 33 3236 22 2535 35 1541 40 3737 29 38平均 36.9 33 23.9實施例2-Harp-誘導(dǎo)的西紅柿對南方細(xì)菌性枯萎病茄假單胞菌的抗性除了茄假單胞菌K60濃度約為5×44cfu/ml以外，用于浸入及接種的所有方法均與實施例1中描述的相同。
以茄假單胞菌K60接種15天后，浸入有緩沖液的植物表現(xiàn)出癥狀。20株植物中的六株15天后表現(xiàn)出矮小癥狀；21天后2株植物枯萎?？菸闹参镒罱K死亡。然而，20株harpin處理的植物中沒有一個表現(xiàn)出矮化癥狀。接種3周后，20株harpin處理的植物中3株表現(xiàn)出矮化癥狀。三周以后，植物可能喪失其誘導(dǎo)抗性是可能的。與在第一個實驗中一樣，harpin處理植物的整體干圍(girth)及高度大于以緩沖液處理的植物。實施例3-Harpin-誘導(dǎo)的西紅柿對南方細(xì)菌性枯萎病茄假單孢菌的抗性除了向含有處理的西紅柿植物的小罐中加入額外的茄假單孢菌K60接種物以外，此實驗與實施例1類似。
Harpin浸入到2周齡的西紅柿幼苗中。兩組植物中的每組浸入將約200μl的harpin以約200μg/ml的濃度懸浮于5mM的磷酸鉀緩沖液的溶液中。共浸入20株西紅柿幼苗，相同數(shù)目的西紅柿幼苗用緩沖液浸入。兩天后，通過根部浸入將植物用茄假單孢菌K60接種。將harpin-或緩沖液-浸入的植物從土壤混合物中拔出并用剪刀剪去少量的根且然后將剩余的根浸入茄假單孢菌K60的懸液中3分鐘。細(xì)菌細(xì)胞懸液的濃度約5×108cfu/ml。幼苗重新種植于相同的小罐中。將額外3ml的細(xì)菌懸液加入到每個4-英寸直徑小罐的土壤中。一周后計數(shù)疾病發(fā)生率。所有的實驗均在具有限制的溫度控制的溫室中進(jìn)行。
3周后，20株緩沖液浸入的西紅柿植物中的11株死亡并且2株枯萎的植物恢復(fù)，但保持嚴(yán)重矮化。與沒有接種的西紅柿相比僅4株植物生長正常。然而，harpin處理的植物中15株似乎是健康的；接種后3周三株植物矮化且2株植物枯萎。這些結(jié)果總結(jié)于下表3中。表3.Harpin誘導(dǎo)的西紅柿對茄假單孢菌導(dǎo)致的細(xì)菌性枯萎病的抗性接種后的周數(shù)處理1 2 3Harpin健康 20 17 15枯萎 0 1 2矮化 0 2 3緩沖液健康 8 5 4枯萎 8 12 13矮化 4 3 3實施例4-Harpin誘導(dǎo)的煙草對煙草花葉病毒的抗性一組4周齡煙草幼苗(栽培品種，Xanthi，具有N基因)的低位葉浸入濃度為200μg/ml的解淀粉歐文氏桿菌harpin中。三天以后，用煙草花葉病毒(“TMV”)攻擊植物。使用2種濃度的病毒(5μg和100μg/ml)。約50μl的病毒懸液置于一上位煙草煙片上。該葉片撒以400-目的金剛砂并輕輕地摩擦葉片。每種濃度于三株植物上進(jìn)行測試。于接種后4天及隨后的2天計數(shù)壞死性損傷并報告三個葉片上的平均數(shù)(表4)。在第10天難以區(qū)分單個的損傷因為有些壞死性損傷融合到一起。因此，記錄到的損傷數(shù)似乎少于在第7天記錄到的數(shù)目。以緩沖液處理的葉片中壞死性損傷的范圍大于harpin處理的葉片。表4.Harpin誘導(dǎo)的煙草對來自以5μg/ml病毒接種的TMV的抗性損傷/葉片的平均數(shù)處理 4天7天10天Harpin 21 32 35緩沖液 67 10276當(dāng)煙草花葉病毒接種濃度為100μg/ml時，harpin處理和緩沖液處理的煙草中形成的局部損傷數(shù)目之間無明顯差異。實施例5-Harpin誘導(dǎo)的西紅柿對鐮孢霉屬枯萎病的抗性六周齡的西紅柿植物按實施例3所述以harpin處理。真菌病原體，尖孢鐮孢，于27℃培養(yǎng)于利馬豆瓊脂培養(yǎng)基中5天。具有網(wǎng)狀菌絲體的兩個完整瓊脂板于20ml 5mM的磷酸鉀緩沖液中混合2分鐘。harpin或緩沖液處理的西紅柿植物的根部通過插入一木樁至小罐土壤中加以損傷。然后，將3ml的真菌懸液倒入4英寸的每只小罐的土壤中。接種的植物保持于24℃控制環(huán)境的溫室中并每天光照16個小時。接種7天后記錄疾病發(fā)生率。每種處理應(yīng)用于10株植物。結(jié)果列于下表5。表5. harpin或緩沖液處理對西紅柿鐮孢霉屬枯萎病的影響在所示的接種后時間表現(xiàn)出枯萎癥狀的植株數(shù)目(在10株中)處理 7天 10天15天20天Harpin1 2 4 4(死亡1)緩沖液3 6 7 7(死亡4)實施例6-Harpin誘導(dǎo)的煙草對野火病(丁香假單胞菌致病變種tabaci)的抗性Harpin浸入到4周齡煙草植物(20cm高)的單組低位葉中。3天以后，丁香假單胞菌致病變種tabaci的懸液浸入到單組上位葉中。4天以后，記錄疾病發(fā)生率，如表6中所列。表6.低位葉以harpin處理以后用丁香假單胞菌致病變種tabaci接種的煙草葉片中野火病的感染癥狀p.s.tabaci濃度 以Harpin處理 沒有以Harpin處理104cfu/m 無癥狀 壞死并浸透水105cfu/ml無癥狀 壞死并浸透水106cfu/ml無癥狀 壞死并浸透水107cfu/ml無癥狀 壞死并浸透水108cfu/ml壞死壞死并浸透水實施例7-Harpin-誘導(dǎo)的牻牛兒苗屬(Pelargonium hortorum)對細(xì)菌性葉斑(田野黃單胞菌致病變種pelargonii)的抗性此實驗以培養(yǎng)于溫室中單個4“或6”小罐中的人工土壤混合物中的去根牻牛兒苗屬來進(jìn)行。每株植物上的2片低位葉以0.05M的磷酸鉀緩沖液pH 6.5(對照)，或harpin或大腸桿菌DH5(pCPP 430)(完整克隆的解淀粉歐文氏桿菌基因簇)懸液浸入。浸入后的2～7天，所有的植物以細(xì)菌性葉斑病原體，田野黃單胞菌致病變種pelargonii的純培養(yǎng)物接種。細(xì)菌懸液(5×106cfu/ml)以低壓噴霧至植物上位及下位的葉表面。每種處理應(yīng)用于2組植物(在表7中命名為“A”和“B”)。植物維持于密閉室中48小時并通過冷霧噴霧器補充噴霧。然后，在分析疾病發(fā)生前將植物維持于溫室小凳上10天，控制周圍的濕度及23℃～32℃的溫度。表7.harpin和解淀粉歐文氏桿菌hrp基因簇對牻牛兒苗屬細(xì)菌性葉斑形成的影響。
處理和以田野黃單胞菌致病變種pelargonii接種之間的時間處理 7天5天 4天 3天 2天植物 植物 植物 植物 植物A B A B A B A B A B緩沖液3*5 5 4 3 2 4 3 4 5Harpin0 0 0 0 0 0 1 0 0 0DH5(pCPP430) 0 0 NT NT 0 0 0 1 1 0*表中的數(shù)字為接種后10天表現(xiàn)出疾病癥狀(顯著的壞死、缺綠病、或枯萎)葉片的數(shù)目。實施例8-幾種harpins在誘導(dǎo)對丁香假單胞菌致病變種tabaci引起的野火病抗性中的活性煙草植物(Nicotiana tabacum var.Xanthi)種植于溫室中。在4周齡時，harpin制品浸入到每株植物單一組的兩個低位葉片中。12株植物以每種harpin制品處理，并且三株以用于制備harpins的相同磷酸鉀緩沖液處理。在以harpin制品浸入葉片的組中24小時內(nèi)形成過敏性壞死，但以緩沖液處理的組中沒有形成過敏性壞死。
在harpin處理后的7、10、11、和12天，所有植物通過浸入每組中的上位葉而接種104-106細(xì)胞/ml的丁香假單胞菌致病變種tabaci懸液。在評估疾病形成之前植物于溫室中培養(yǎng)7天。結(jié)果列于下表8表8Harpin來源處理和接種之間的天數(shù)12 11 10 7log[接種] 4 5 6 4 5 6 4 5 6 4 5 6無(緩沖液) + + ++ + + ++ + + ++ + + ++丁香假單胞菌 - - +- - +- - +- - +菊歐文氏桿菌 - - +- - +- - +- - +解淀粉歐文氏桿菌 - - +- - -- - +- - +
-＝?jīng)]有癥狀，+＝壞死并具有黃暈，典型野火病++＝嚴(yán)重壞死并具有黃暈，典型野火病結(jié)果表明來自三種細(xì)菌的harpin制品在誘導(dǎo)對野火病原體的抗性中均是有效的。以任何一種harpin處理的植物在使用兩種較低接種濃度后未表現(xiàn)出任何癥狀。以更高的濃度接種后，以緩沖液處理的植物中癥狀較harpin處理的植物中癥狀更為嚴(yán)重。實施例9-Harpin誘導(dǎo)的對蔓延疫霉引起的晚疫病的抗性。
晚疫病病原體主要影響土豆和西紅柿。其導(dǎo)致臭名昭著的愛爾蘭土豆饑荒。harpin在誘導(dǎo)對該病原體抗性中的活性用種植于溫室中的西紅柿幼苗加以測定。三周齡的幼苗(栽培品種“Mama Mia”，約6～8英寸高)以harpin處理且隨后以蔓延疫霉接種。每株植物的兩組低位葉片以harpin溶液、產(chǎn)生和分泌harpin的大腸桿菌DH5(pCPP 430)懸液或磷酸鉀緩沖液浸入。
浸入2、3或4天后，植物以蔓延疫霉的菌絲體懸液接種。使用對西紅柿高度有毒的菌株美國7號。菌絲體懸液通過輕輕混合于21℃在2只大麥一面瓊脂平板上培養(yǎng)2天的真菌而制備。用畫家的粗畫刷將該懸液刷至每株處理過的植物的葉片上表面及下表面。
處理及接種過的植物于溫室中設(shè)計成維持20-23℃溫度的特別構(gòu)建的有霧小室中培養(yǎng)，同時維持高的相對濕度。濕度通過幾臺在純水上以最大速度操作的冷霧噴霧器提供。以蔓延疫霉接種13天后計算疾病的發(fā)生率，并將結(jié)果列于下表9。每種處理應(yīng)用于4株單個植物。表9.接種13天后存在于西紅柿葉片中晚疫病損傷的數(shù)目。處理 處理和接種之間的天數(shù)43 2植物A B C DA B C D A B C D緩沖液3 2 0 01 2 2 0 0 0 4 1Harpin0 0 1 00 0 0 1 2 1 0 0DH5(pCPP430) 0 0 0 10 2 2 1 0 1 1 0以harpin的處理在處理和接種的所有間隔中減少了植物中形成損傷的數(shù)目。通過預(yù)先以產(chǎn)生和分泌harpin的DH5(pCPP 430)處理，形成的晚疫病損傷數(shù)目也減少。
盡管為了說明的目的詳細(xì)描述了本發(fā)明，應(yīng)該明白這種細(xì)節(jié)僅是為了說明的目的，并且本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不偏離由下面權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍的情況下可作出改變。
序列表(1)一般信息(i)申請人康奈爾研究基金，公司(ii)發(fā)明題目過敏反應(yīng)在植物中誘導(dǎo)的抗性(iii)序列數(shù)目9(iv)通訊地址(A)地址Nixon，Hargrave，Devans & Doyle LLP(B)街道Clinton Square，P.O.Box 1051(C)城市Rochester(D)州紐約(E)國家美國(F)郵編14603(v)計算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件專利釋放#1.0，#1.3版(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)?B)提交日期(C)分類(vii)優(yōu)先申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柮绹?8/475,775(B)提交日期1995年6月7日(viii)律師/代理信息(A)姓名Goldman，Michael L.
(B)注冊號30,727(C)參考/備審案目錄號19603/10051(ix)電信信息(A)電話(716)263-1304(B)電傳(716)263-1600(2)序列鑒定號1信息(i)序列特征(A)長度338個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列鑒定號1Met Gln Ile Thr Ile Lys Ala His Ile Gly Gly Asp Leu Gly Val Ser1 5 10 15Gly Leu Gly Ala Gln Gly Leu Lys Gly Leu Asn Ser Ala Ala Ser Ser20 25 30Leu Gly Ser Ser Val Asp Lys Leu Ser Ser Thr Ile Asp Lys Leu Thr35 40 45Ser Ala Leu Thr Ser Met Met Phe Gly Gly Ala Leu Ala Gln Gly Leu50 55 60Gly Ala Ser Ser Lys Gly Leu Gly Met Ser Asn Gln Leu Gly Gln Ser65 70 75 80Phe Gly Asn Gly Ala Gln Gly Ala Ser Asn Leu Leu Ser Val Pro Lys85 90 95Ser Gly Gly Asp Ala Leu Ser Lys Met Phe Asp Lys Ala Leu Asp Asp100 105 110Leu Leu Gly His Asp Thr Val Thr Lys Leu Thr Asn Gln Ser Asn Gln115120 125Leu Ala Asn Ser Met Leu Asn Ala Ser Gln Met Thr Gln Gly Asn Met130 135 140Asn Ala Phe Gly Ser Gly Val Asn Asn Ala Leu Ser Ser Ile Leu Gly145 150 155 160Asn Gly Leu Gly Gln Ser Met Ser Gly Phe Ser Gln Pro Ser Leu Gly165 170 175Ala Gly Gly Leu Gln Gly Leu Ser Gly Ala Gly Ala Phe Asn Gln Leu180 185 190Gly Asn Ala Ile Gly Met Gly Val Gly Gln Asn Ala Ala Leu Ser Ala195 200 205Leu Ser Asn Val Ser Thr His Val Asp Gly Asn Asn Arg His Phe Val210 215 220Asp Lys Glu Asp Arg Gly Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met Asp225 230 235240Gln Tyr Pro Glu Ile Phe Gly Lys Pro Glu Tyr Gln Lys Asp Gly Trp245 250 255Ser Ser Pro Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser Lys260 265 270Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Gly Ala Ser Met Asp Lys Phe Arg Gln275 280 285Ala Met Gly Met Ile Lys Ser Ala Val Ala Gly Asp Thr Gly Asn Thr290 295 300Asn Leu Asn Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Ser Leu Gly Ile Asp Ala305 310 315 320Ala Val Val Gly Asp Lys Ile Ala Asn Met Ser Leu Gly Lys Leu Ala325 330 335Asn Ala(2)序列鑒定號2信息(i)序列特征(A)長度2141個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型 DNA(基因組)(xi)序列描述序列鑒定號2CGATTTTACC CGGGTGAACG TGCTATGACC GACAGCATCA CGGTATTCGA CACCGTTACG 60GCGTTTATGG CCGCGATGAA CCGGCATCAG GCGGCGCGCT GGTCGCCGCA ATCCGGCGTC120GATCTGGTAT TTCAGTTTGG GGACACCGGG CGTGAACTCA TGATGCAGAT TCAGCCGGGG180CAGCAATATC CCGGCATGTT GCGCACGCTG CTCGCTCGTC GTTATCAGCA GGCGGCAGAG240TGCGATGGCT GCCATCTGTG CCTGAACGGC AGCGATGTAT TGATCCTCTG GTGGCCGCTG300CCGTCGGATC CCGGCAGTTA TCCGCAGGTG ATCGAACGTT TGTTTGAACT GGCGGGAATG360ACGTTGCCGT CGCTATCCAT AGCACCGACG GCGCGTCCGC AGACAGGGAA CGGACGCGCC420CGATCATTAA GATAAAGGCG GCTTTTTTTA TTGCAAAACG GTAACGGTGA GGAACCGTTT480CACCGTCGGC GTCACTCAGT AACAAGTATC CATCATGATG CCTACATCGG GATCGGCGTG540GGCATCCGTT GCAGATACTT TTGCGAACAC CTGACATGAA TGAGGAAACG AAATTATGCA600AATTACGATC AAAGCGCACA TCGGCGGTGA TTTGGGCGTC TCCGGTCTGG GGCTGGGTGC660TCAGGGACTG AAAGGACTGA ATTCCGCGGC TTCATCGCTG GGTTCCAGCG TGGATAAACT720GAGCAGCACC ATCGATAAGT TGACCTCCGC GCTGACTTCG ATGATGTTTG GCGGCGCGCT 780GGCGCAGGGG CTGGGCGCCA GCTCGAAGGG GCTGGGGATG AGCAATCAAC TGGGCCAGTC 840TTTCGGCAAT GGCGCGCAGG GTGCGAGCAA CCTGCTATCC GTACCGAAAT CCGGCGGCGA 900TGCGTTGTCA AAAATGTTTG ATAAAGCGCT GGACGATCTG CTGGGTCATG ACACCGTGAC 960CAAGCTGACT AACCAGAGCA ACCAACTGGC TAATTCAATG CTGAACGCCA GCCAGATGAC 1020CCAGGGTAAT ATGAATGCGT TCGGCAGCGG TGTGAACAAC GCACTGTCGT CCATTCTCGG 1080CAACGGTCTC GGCCAGTCGA TGAGTGGCTT CTCTCAGCCT TCTCTGGGGG CAGGCGGCTT 1140GCAGGGCCTG AGCGGCGCGG GTGCATTCAA CCAGTTGGGT AATGCCATCG GCATGGGCGT 1200GGGGCAGAAT GCTGCGCTGA GTGCGTTGAG TAACGTCAGC ACCCACGTAG ACGGTAACAA 1260CCGCCACTTT GTAGATAAAG AAGATCGCGG CATGGCGAAA GAGATCGGCC AGTTTATGGA 1320TCAGTATCCG GAAATATTCG GTAAACCGGA ATACCAGAAA GATGGCTGGA GTTCGCCGAA 1380GACGGACGAC AAATCCTGGG CTAAAGCGCT GAGTAAACCG GATGATGACG GTATGACCGG 1440CGCCAGCATG GACAAATTCC GTCAGGCGAT GGGTATGATC AAAAGCGCGG TGGCGGGTGA 1500TACCGGCAAT ACCAACCTGA ACCTGCGTGG CGCGGGCGGT GCATCGCTGG GTATCGATGC 1560GGCTGTCGTC GGCGATAAAA TAGCCAACAT GTCGCTGGGT AAGCTGGCCA ACGCCTGATA 1620ATCTGTGCTG GCCTGATAAA GCGGAAACGA AAAAAGAGAC GGGGAAGCCT GTCTCTTTTC 1680TTATTATGCG GTTTATGCGG TTACCTGGAC CGGTTAATCA TCGTCATCGA TCTGGTACAA 1740ACGCACATTT TCCCGTTCAT TCGCGTCGTT ACGCGCCACA ATCGCGATGG CATCTTCCTC 1800GTCGCTCAGA TTGCGCGGCT GATGGGGAAC GCCGGGTGGA ATATAGAGAA ACTCGCCGGC 1860CAGATGGAGA CACGTCTGCG ATAAATCTGT GCCGTAACGT GTTTCTATCC GCCCCTTTAG 1920CAGATAGATT GCGGTTTCGT AATCAACATG GTAATGCGGT TCCGCCTGTG CGCCGGCCGG 1980GATCACCACA ATATTCATAG AAAGCTGTCT TGCACCTACC GTATCGCGGG AGATACCGAC 2040AAAATAGGGC AGTTTTTGCG TGGTATCCGT GGGGTGTTCC GGCCTGACAA TCTTGAGTTG 2100GTTCGTCATC ATCTTTCTCC ATCTGGGCGA CCTGATCGGT T 2141(2)序列鑒定號3信息(i)序列特征(A)長度385個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列鑒定號3Met Ser Leu Asn Thr Ser Gly Leu Gly Ala Ser Thr Met Gln Ile Ser1 5 10 15Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Asn Gly Leu Leu Gly Thr Ser Arg Gln20 25 30Asn Ala Gly Leu Gly Gly Asn Ser Ala Leu Gly Leu Gly Gly Gly Asn35 40 45Gln Asn Asp Thr Val Asn Gln Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Met Met50 55 60Met Met Met Ser Met Met Gly Gly Gly Gly Leu Met Gly Gly Gly Leu65 70 75 80Gly Gly Gly Leu Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Leu Gly Glu85 90 95Gly Leu Ser Asn Ala Leu Asn Asp Met Leu Gly Gly Ser Leu Asn Thr100 105 110Leu Gly Ser Lys Gly Gly Asn Asn Thr Thr Ser Thr Thr Asn Ser Pro115 120 125Leu Asp Gln Ala Leu Gly Ile Asn Ser Thr Ser Gln Asn Asp Asp Ser130 135 140Thr Ser Gly Thr Asp Ser Thr Ser Asp Ser Ser Asp Pro Met Gln Gln145 150 155 160Leu Leu Lys Met Phe Ser Glu Ile Met Gln Ser Leu Phe Gly Asp Gly165 170175Gln Asp Gly Thr Gln Gly Ser Ser Ser Gly Gly Lys Gln Pro Thr Glu180 185 190Gly Glu Gln Asn Ala Tyr Lys Lys Gly Val Thr Asp Ala Leu Ser Gly195 200 205Leu Met Gly Asn Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly210 215 220Gly Gly Gln Gly Gly Asn Ala Gly Thr Gly Leu Asp Gly Ser Ser Leu225 230 235 240Gly Gly Lys Gly Leu Gln Asn Leu Ser Gly Pro Val Asp Tyr Gln Gln245 250 255Leu Gly Asn Ala Val Gly Thr Gly Ile Gly Met Lys Ala Gly Ile Gln260 265 270Ala Leu Asn Asp Ile Gly Thr His Arg His Ser Ser Thr Arg Ser Phe275 280 285Val Asn Lys Gly Asp Arg Ala Met Ala Lys Glu Ile Gly Gln Phe Met290 295 300Asp Gln Tyr Pro Glu Val Phe Gly Lys Pro Gln Tyr Gln Lys Gly Pro305 310 315 320Gly Gln Glu Val Lys Thr Asp Asp Lys Ser Trp Ala Lys Ala Leu Ser325 330 335Lys Pro Asp Asp Asp Gly Met Thr Pro Ala Ser Met Glu Gln Phe Asn340 345 350Lys Ala Lys Gly Met Ile Lys Arg Pro Met Ala Gly Asp Thr Gly Asn355 360 365Gly Asn Leu Gln His Ala Val Pro Val Val Leu Arg Trp Val Leu Met370 375 380Pro385(2)序列鑒定號4信息(i)序列特征(A)長度1158個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列鑒定號4ATGAGTCTGA ATACAAGTGG GCTGGGAGCG TCAACGATGC AAATTTCTAT CGGCGGTGCG60GGCGGAAATA ACGGGTTGCT GGGTACCAGT CGCCAGAATG CTGGGTTGGG TGGCAATTCT 120GCACTGGGGC TGGGCGGCGG TAATCAAAAT GATACCGTCA ATCAGCTGGC TGGCTTACTC 180ACCGGCATGA TGATGATGAT GAGCATGATG GGCGGTGGTG GGCTGATGGG CGGTGGCTTA 240GGCGGTGGCT TAGGTAATGG CTTGGGTGGC TCAGGTGGCC TGGGCGAAGG ACTGTCGAAC 300GCGCTGAACG ATATGTTAGG CGGTTCGCTG AACACGCTGG GCTCGAAAGG CGGCAACAAT 360ACCACTTCAA CAACAAATTC CCCGCTGGAC CAGGCGCTGG GTATTAACTC AACGTCCCAA 420AACGACGATT CCACCTCCGG CACAGATTCC ACCTCAGACT CCAGCGACCC GATGCAGCAG 480CTGCTGAAGA TGTTCAGCGA GATAATGCAA AGCCTGTTTG GTGATGGGCA AGATGGCACC 540CAGGGCAGTT CCTCTGGGGG CAAGCAGCCG ACCGAAGGCG AGCAGAACGC CTATAAAAAA 600GGAGTCACTG ATGCGCTGTC GGGCCTGATG GGTAATGGTC TGAGCCAGCT CCTTGGCAAC 660GGGGGACTGG GAGGTGGTCA GGGCGGTAAT GCTGGCACGG GTCTTGACGG TTCGTCGCTG 720GGCGGCAAAG GGCTGCAAAA CCTGAGCGGG CCGGTGGACT ACCAGCAGTT AGGTAACGCC 780GTGGGTACCG GTATCGGTAT GAAAGCGGGC ATTCAGGCGC TGAATGATAT CGGTACGCAC 840AGGCACAGTT CAACCCGTTC TTTCGTCAAT AAAGGCGATC GGGCGATGGC GAAGGAAATC 900GGTCAGTTCA TGGACCAGTA TCCTGAGGTG TTTGGCAAGC CGCAGTACCA GAAAGGCCCG 960GGTCAGGAGG TGAAAACCGA TGACAAATCA TGGGCAAAAG CACTGAGCAA GCCAGATGAC 1020GACGGAATGA CACCAGCCAG TATGGAGCAG TTCAACAAAG CCAAGGGCAT GATCAAAAGG 1080CCCATGGCGG GTGATACCGG CAACGGCAAC CTGCAGCACG CGGTGCCGGT GGTTCTTCGC 1140TGGGTATTGA TGCCATGA 1158(2)序列鑒定號5信息(i)序列特征(A)長度341個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列鑒定號5Met Gln Ser Leu Ser Leu Asn Ser Ser Ser Leu Gln Thr Pro Ala Met1 5 10 15Ala Leu Val Leu Val Arg Pro Glu Ala Glu Thr Thr Gly Ser Thr Ser20 25 30Ser Lys Ala Leu Gln Glu Val Val Val Lys Leu Ala Glu Glu Leu Met35 40 45Arg Asn Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ser Pro Leu Gly Lys Leu Leu Ala50 55 60Lys Ser Met Ala Ala Asp Gly Lys Ala Gly Gly Gly Ile Glu Asp Val65 70 75 80Ile Ala Ala Leu Asp Lys Leu Ile His Glu Lys Leu Gly Asp Asn Phe85 90 95Gly Ala Ser Ala Asp Ser Ala Ser Gly Thr Gly Gln Gln Asp Leu Met100 105 110Thr Gln Val Leu Asn Gly Leu Ala Lys Ser Met Leu Asp Asp Leu Leu115 120 125Thr Lys Gln Asp Gly Gly Thr Ser Phe Ser Glu Asp Asp Met Pro Met130 135 140Leu Asn Lys Ile Ala Gln Phe Met Asp Asp Asn Pro Ala Gln Phe Pro145 150155 160Lys Pro Asp Ser Gly Ser Trp Val Asn Glu Leu Lys Glu Asp Asn Phe165 170 175Leu Asp Gly Asp Glu Thr Ala Ala Phe Arg Ser Ala Leu Asp Ile Ile180 185 190Gly Gln Gln Leu Gly Asn Gln Gln Ser Asp Ala Gly Ser Leu Ala Gly195 200 205Thr Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Ser Ser Phe Ser Asn Asn Ser Ser210 215 220Val Met Gly Asp Pro Leu Ile Asp Ala Asn Thr Gly Pro Gly Asp Ser225 230 235 240Gly Asn Thr Arg Gly Glu Ala Gly Gln Leu Ile Gly Glu Leu Ile Asp245 250 255Arg Gly Leu Gln Ser Val Leu Ala Gly Gly Gly Leu Gly Thr Pro Val260 265 270Asn Thr Pro Gln Thr Gly Thr Ser Ala Asn Gly Gly Gln Ser Ala Gln275 280 285Asp Leu Asp Gln Leu Leu Gly Gly Leu Leu Leu Lys Gly Leu Glu Ala290 295 300Thr Leu Lys Asp Ala Gly Gln Thr Gly Thr Asp Val Gln Ser Ser Ala305 310 315 320Ala Gln Ile Ala Thr Leu Leu Val Ser Thr Leu Leu Gln Gly Thr Arg325 330 335Asn Gln Ala Ala Ala340(2)序列鑒定號6信息(i)序列特征(A)長度1026個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列鑒定號6ATGCAGAGTC TCAGTCTTAA CAGCAGCTCG CTGCAAACCC CGGCAATGGC CCTTGTCCTG60GTACGTCCTG AAGCCGAGAC GACTGGCAGT ACGTCGAGCA AGGCGCTTCA GGAAGTTGTC 120GTGAAGCTGG CCGAGGAACT GATGCGCAAT GGTCAACTCG ACGACAGCTC GCCATTGGGA 180AAACTGTTGG CCAAGTCGAT GGCCGCAGAT GGCAAGGCGG GCGGCGGTAT TGAGGATGTC 240ATCGCTGCGC TGGACAAGCT GATCCATGAA AAGCTCGGTG ACAACTTCGG CGCGTCTGCG 300GACAGCGCCT CGGGTACCGG ACAGCAGGAC CTGATGACTC AGGTGCTCAA TGGCCTGGCC 360AAGTCGATGC TCGATGATCT TCTGACCAAG CAGGATGGCG GGACAAGCTT CTCCGAAGAC 420GATATGCCGA TGCTGAACAA GATCGCGCAG TTCATGGATG ACAATCCCGC ACAGTTTCCC 480AAGCCGGACT CGGGCTCCTG GGTGAACGAA CTCAAGGAAG ACAACTTCCT TGATGGCGAC 540GAAACGGCTG CGTTCCGTTC GGCACTCGAC ATCATTGGCC AGCAACTGGG TAATCAGCAG 600AGTGACGCTG GCAGTCTGGC AGGGACGGGT GGAGGTCTGG GCACTCCGAG CAGTTTTTCC 660AACAACTCGT CCGTGATGGG TGATCCGCTG ATCGACGCCA ATACCGGTCC CGGTGACAGC 720GGCAATACCC GTGGTGAAGC GGGGCAACTG ATCGGCGAGC TTATCGACCG TGGCCTGC AA 780TCGGTATTGG CCGGTGGTGG ACTGGGCACA CCCGTAAACA CCCCGCAGAC CGGTACGTCG 840GCGAATGGCG GACAGTCCGC TCAGGATCTT GATCAGTTGC TGGGCGGCTT GCTGCTCAAG 900GGCCTGGAGG CAACGCTCAA GGATGCCGGG CAAACAGGCA CCGACGTGCA GTCGAGCGCT 960GCGCAAATCG CCACCTTGCT GGTCAGTACG CTGCTGCAAG GCACCCGCAA TCAGGCTGCA 1020GCCTGA 1026(2)序列鑒定號7信息(i)序列特征(A)長度344個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列鑒定號7Met Ser Val Gly Asn Ile Gln Ser Pro Ser Asn Leu Pro Gly Leu Gln1 5 10 15Asn Leu Asn Leu Asn Thr Asn Thr Asn Ser Gln Gln Ser Gly Gln Ser20 25 30Val Gln Asp Leu Ile Lys Gln Val Glu Lys Asp Ile Leu Asn Ile Ile35 40 45Ala Ala Leu Val Gln Lys Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Asn Thr Gly50 55 60Asn Thr Gly Asn Ala Pro Ala Lys Asp Gly Asn Ala Asn Ala Gly Ala65 70 75 80Asn Asp Pro Ser Lys Asn Asp Pro Ser Lys Ser Gln Ala Pro Gln Ser85 90 95Ala Asn Lys Thr Gly Asn Val Asp Asp Ala Asn Asn Gln Asp Pro Met100 105 110Gln Ala Leu Met Gln Leu Leu Glu Asp Leu Val Lys Leu Leu Lys Ala115 120 125Ala Leu His Met Gln Gln Pro Gly Gly Asn Asp Lys Gly Asn Gly Val130 135 140Gly Gly Ala Asn Gly Ala Lys Gly Ala Gly Gly Gln Gly Gly Leu Ala145 150 155 160Glu Ala Leu Gln Glu Ile Glu Gln Ile Leu Ala Gln Leu Gly Gly Gly165 170 175Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly180 185 190Ala Asp Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asn Gly Ala195 200 205Asp Gly Gly Asn Gly Val Asn Gly Asn Gln Ala Asn Gly Pro Gln Asn210 215 220Ala Gly Asp Val Asn Gly Ala Asn Gly Ala Asp Asp Gly Ser Glu Asp225 230 235 240Gln Gly Gly Leu Thr Gly Val Leu Gln Lys Leu Met Lys Ile Leu Asn245 250 255Ala Leu Val Gln Met Met Gln Gln Gly Gly Leu Gly Gly Gly Asn Gln260 265 270Ala Gln Gly Gly Ser Lys Gly Ala Gly Asn Ala Ser Pro Ala Ser Gly275 280 285Ala Asn Pro Gly Ala Asn Gln Pro Gly Ser Ala Asp Asp Gln Ser Ser290 295300Gly Gln Asn Asn Leu Gln Ser Gln Ile Met Asp Val Val Lys Glu Val305 310 315 320Val Gln Ile Leu Gln Gln Met Leu Ala Ala Gln Asn Gly Gly Ser Gln325 330 335Gln Ser Thr Ser Thr Gln Pro Met340(2)序列鑒定號8信息(i)序列特征(A)長度1035個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列鑒定號8ATGTCAGTCG GAAACATCCA GAGCCCGTCG AACCTCCCGG GTCTGCAGAA CCTGAACCTC 60AACACCAACA CCAACAGCCA GCAATCGGGC CAGTCCGTGC AAGACCTGAT CAAGCAGGTC120GAGAAGGACA TCCTCAACAT CATCGCAGCC CTCGTGCAGA AGGCCGCACA GTCGGCGGGC180GGCAACACCG GTAACACCGG CAACGCGCCG GCGAAGGACG GCAATGCCAA CGCGGGCGCC240AACGACCCGA GCAAGAACGA CCCGAGCAAG AGCCAGGCTC CGCAGTCGGC CAACAAGACC300GGCAACGTCG ACGACGCCAA CAACCAGGAT CCGATGCAAG CGCTGATGCA GCTGCTGGAA 360GACCTGGTGA AGCTGCTGAA GGCGGCCCTG CACATGCAGC AGCCCGGCGG CAATGACAAG 420GGCAACGGCG TGGGCGGTGC CAACGGCGCC AAGGGTGCCG GCGGCCAGGG CGGCCTGGCC 480GAAGCGCTGC AGGAGATCGA GCAGATCCTC GCCCAGCTCG GCGGCGGCGG TGCTGGCGCC 540GGCGGCGCGG GTGGCGGTGT CGGCGGTGCT GGTGGCGCGG ATGGCGGCTC CGGTGCGGGT 600GGCGCAGGCG GTGCGAACGG CGCCGACGGC GGCAATGGCG TGAACGGCAA CCAGGCGAAC 660GGCCCGCAGA ACGCAGGCGA TGTCAACGGT GCCAACGGCG CGGATGACGG CAGCGAAGAC 720CAGGGCGGCC TCACCGGCGT GCTGCAAAAG CTGATGAAGA TCCTGAACGC GCTGGTGCAG 780ATGATGCAGC AAGGCGGCCT CGGCGGCGGC AACCAGGCGC AGGGCGGCTC GAAGGGTGCC 840GGCAACGCCT CGCCGGCTTC CGGCGCGAAC CCGGGCGCGA ACCAGCCCGG TTCGGCGGAT 900GATCAATCGT CCGGCCAGAA CAATCTGCAA TCCCAGATCA TGGATGTGGT GAAGGAGGTC 960GTCCAGATCC TGCAGCAGAT GCTGGCGGCG CAGAACGGCG GCAGCCAGCA GTCCACCTCG 1020ACGCAGCCGA TGTAA 1035(2)序列鑒定號9信息(i)序列特征(A)長度26個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述序列鑒定號9Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile Val Val Ala Ile Ile Ala Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr Gln Asp Tyr20 2權(quán)利要求
1.一種賦予植物病原體抗性的方法，包括在多肽或蛋白與植物細(xì)胞接觸的條件下將非感染形式的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白施加于植物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自選自解淀粉歐文氏桿菌，菊歐文氏桿菌，丁香假單胞菌，茄假單胞菌，田野黃單胞菌，及其混合物的病原體的誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自菊歐文氏桿菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號1的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有34kDa的分子量。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自解淀粉歐文氏桿菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號3的氨基酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有37kDa的分子量。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號5的氨基酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有34-35kDa的分子量。
12.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自茄假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號7的氨基酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自田野黃單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號9的氨基酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的植物選自雙子葉和單子葉植物。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的植物選自水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、玉米、土豆、甘薯、蠶豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、卷心菜、花椰菜、硬花球花椰菜、蘿卜、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、西葫蘆、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、草莓、葡萄、懸鉤子、菠蘿、黃豆、煙草、西紅柿、高粱及甘蔗。
18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中的植物選自擬南芥菜(Arabidopsisthaliana)、非洲紫苣苔屬(Saintpaulia)、矮牽牛屬、天竺葵屬、一品紅屬、菊屬、石竹屬、以及百日菊屬。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的植物抵抗的病原體選自病毒、細(xì)菌、真菌及其組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的應(yīng)用通過噴撒、注射或在鄰近所述的應(yīng)用發(fā)生時的時間擦傷葉片而實現(xiàn)。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白作為進(jìn)一步包括載體的組合物應(yīng)用于植物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的載體選自水和水溶液。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的組合物含有大于500nM的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
24.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的組合物進(jìn)一步含有選自肥料、殺蟲劑、殺真菌劑及其組合物的添加劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白是。以分離的形式。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白作為不導(dǎo)致疾病并以編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌而施用。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白作為細(xì)菌而應(yīng)用，該細(xì)菌在有些植物種類中導(dǎo)致疾病，但在那些欲進(jìn)行所述的施用的種類中不導(dǎo)致疾病，并且含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的應(yīng)用導(dǎo)致多肽或蛋白浸入植物中。
29.病原體抗性植物，其細(xì)胞與非感染性過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白接觸。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自選自解淀粉歐文氏桿菌，菊歐文氏桿菌，丁香假單胞菌，茄假單胞菌，田野黃單胞菌，及其混合物的病原體的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自菊歐文氏桿菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號1的氨基酸序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求30的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自解淀粉歐文氏桿菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號3的氨基酸序列。
35.根據(jù)權(quán)利要求30的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
36.根據(jù)權(quán)利要求35的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號5的氨基酸序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求30的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自茄假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號7的氨基酸序列。
39.根據(jù)權(quán)利要求30的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自田野黃單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白具有相應(yīng)于序列鑒定號9的氨基酸序列。
41.根據(jù)權(quán)利要求29的病原體抗性植物，其中的植物選自單子葉和雙子葉植物。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的病原體抗性植物，其中的植物選自水稻、小麥、大麥、黑麥、棉花、向日葵、花生、土豆、甘薯、蠶豆、豌豆、菊苣、萵苣、苣荬菜、卷心菜、花椰菜、硬花球花椰菜、蘿卜、小蘿卜、菠菜、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、西葫蘆、南瓜、夏南瓜、黃瓜、蘋果、梨、甜瓜、草莓、葡萄、懸鉤子、菠蘿、黃豆、煙草、西紅柿、高粱及甘蔗。
43.根據(jù)權(quán)利要求41的病原體抗性植物，其中的植物選自擬南芥菜(Arabidopsis thaliana)、非洲紫苣苔屬(Saintpaulia)、矮牽牛屬、天竺葵屬、一品紅屬、菊屬、石竹屬、以及百日菊屬。
44.根據(jù)權(quán)利要求30的病原體抗性植物，其中的植物對其具有抗性的病原體選自病毒、細(xì)菌、真菌及其組合。
45.根據(jù)權(quán)利要求29病原體抗性植物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白為分離的形式。
46.根據(jù)權(quán)利要求29的病原體抗性植物，其中的植物細(xì)胞與不導(dǎo)致疾病并以編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化的細(xì)菌接觸。
47.根據(jù)權(quán)利要求29的病原體抗性植物，其中的植物細(xì)胞與細(xì)菌接觸，該細(xì)菌在此植物中不導(dǎo)致疾病，但的確在其它植物種類中導(dǎo)致疾病，并含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因。
48.根據(jù)權(quán)利要求29的病原體抗性植物，其中的植物以多肽或蛋白滲入。
49.一種用于賦予植物病原體抗性的組合物，包括非感染性的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白以及載體。
50.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自選自解淀粉歐文氏桿菌，菊歐文氏桿菌，丁香假單胞菌，茄假單胞菌，田野黃單胞菌，以及其混合物的病原體的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自菊歐文氏桿菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
52.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自解淀粉歐文氏桿菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
53.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自丁香假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
54.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自茄假單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
55.根據(jù)權(quán)利要求50的組合物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白相應(yīng)于來自田野黃單胞菌的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
56.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中的載體選自水和水溶液。
57.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中的組合物含有大于500nM的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白。
58.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中的組合物進(jìn)一步含有選自肥料、殺蟲劑、殺真菌劑及其混合物的添加劑。
59.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白為分離的形式。
60.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白由組合物中的細(xì)菌產(chǎn)生或能由其產(chǎn)生，所述的細(xì)菌不導(dǎo)致疾病并以編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因轉(zhuǎn)化。
61.根據(jù)權(quán)利要求49的組合物，其中的過敏反應(yīng)多肽或蛋白由能夠在植物中導(dǎo)致疾病并含有編碼過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白的基因的細(xì)菌產(chǎn)生或能夠由此產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及賦予植物病原體抗性的方法。其包括在多肽或蛋白接觸植物細(xì)胞的條件下給植物施用非感染形式的過敏反應(yīng)誘導(dǎo)物多肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明也涉及病原體抗性植物和用于賦予植物病原體抗性的組合物。
文檔編號C12R1/38GK1192647SQ96196146
公開日1998年9月9日 申請日期1996年6月5日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者魏鐘民, S·V·比爾 申請人:康乃爾研究基金會有限公司