專利名稱：食品微生物檢測板及其制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種食品細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群檢測板，其制備方法及應(yīng)用。
食品在加工、運(yùn)輸、保存和銷售等過程中，經(jīng)常受到外界環(huán)境中微生物的污染。食品細(xì)菌污染能引起腐敗變質(zhì)，甚至引起食物中毒，是食品衛(wèi)生中最常見的有害因素之一。我國頒布的《食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定，食品衛(wèi)生的常規(guī)監(jiān)測，要求檢驗(yàn)細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群，國家標(biāo)準(zhǔn)方法雖然準(zhǔn)確，但操作比較復(fù)雜，檢出需要的時(shí)間長。近年來，國內(nèi)研究出的一些快速簡易檢測方法，不同程度上可以加快檢出時(shí)間，簡化操作程序，但是在這些方法中，有的只能檢測細(xì)菌總數(shù)，有的只能檢測大腸菌群，均不能同時(shí)完成上述兩個(gè)指標(biāo)的檢驗(yàn)，而且有些方法僅僅是針對(duì)某類食品的。
另外，大腸菌群系指一群能在36℃24小時(shí)內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，實(shí)際上包括腸桿菌科中四種常見細(xì)菌大腸埃希氏菌(E.coli)、費(fèi)勞地氏檸檬酸桿菌(C.freundii)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、陰溝腸桿菌(E.cloacae)。所以大腸菌群并不是單一的細(xì)菌，而是作為衛(wèi)生指標(biāo)而選擇的一類細(xì)菌?，F(xiàn)有的一些檢測培養(yǎng)基僅僅用于檢測某一種細(xì)菌，如專門檢測大腸埃希氏菌(E.coli)。
為滿足食品衛(wèi)生檢測的需要，我們研制出一種能同時(shí)檢測食品細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的食品簡易檢測板。該檢測板所使用的培養(yǎng)基對(duì)大腸菌群檢測的范圍比現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基檢測范圍廣。并且，本發(fā)明的檢測板所使用的培養(yǎng)基采用特定成分的配比及含量，從而達(dá)到檢測中對(duì)不同類群細(xì)菌的選擇性或全面性。
以往的技術(shù)(包括國家標(biāo)準(zhǔn)方法)對(duì)于檢測總菌數(shù)和大腸菌群數(shù)分別采用不同的方法，根本不可能將兩種檢測方法進(jìn)行組合，而本發(fā)明在分別對(duì)兩種檢測方法進(jìn)行簡化的同時(shí)，為這兩種組合提供了可能。
本發(fā)明的檢測板可以使操作簡便、結(jié)果快速、費(fèi)用經(jīng)濟(jì)而且準(zhǔn)確性達(dá)到了國家標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明的目的在于提供一種能同時(shí)檢測食品細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的食品簡易檢測板。
本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供制備上述檢測板的方法。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供用該檢測板同時(shí)檢測食品細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的應(yīng)用。
本發(fā)明的檢測板為長方形板，其尺寸大小可以是5.0×3.6×0.2cm，由板的中心縱向分為兩部分，分別裝入培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基2(

圖1)，該板一側(cè)可帶有一手持的把手(圖2)。作為本領(lǐng)域的專業(yè)人員應(yīng)該理解，該檢測板尺寸大小形狀的變化是一般知識(shí)，因此對(duì)于其尺寸大小及形狀的任何修改及改變均包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
培養(yǎng)基1是用于細(xì)菌總數(shù)檢測的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基2用于測定大腸菌群，其組成與制備方法如下。
培養(yǎng)基1成分含量牛腦浸液＊150～250毫升牛心浸液＊150～250毫升蛋白胨10克葡萄糖2克氯化鈉5克磷酸氫二鉀2.5克瓊脂15克蒸餾水加至1000毫升PH7.0-7.4＊心腦浸液將新鮮去脂及筋膜絞碎的牛心和牛腦各500克，分別置于2000毫升三角燒瓶中，各加蒸餾水1000毫升混勻，放在冰箱中過夜。次日，分別用瓷勺撇去浮油，再放在45℃水浴中1小時(shí)，然后加熱煮沸30分鐘，紗布過濾，然后用蒸餾水分別補(bǔ)至1000毫升，15磅20分鐘滅菌。
將按上述配方制備的培養(yǎng)基15磅加熱滅菌15分鐘，滅菌后冷卻至50℃左右。按每100ml培養(yǎng)基加入5mlTTC(氯化三苯四唑，5%水溶液)的比例加入TTC，混勻。
在培養(yǎng)基1中，優(yōu)選含有200ml牛腦浸液和250ml牛心浸液。
培養(yǎng)基2成分含量牛肉膏＊3克蛋白胨20克乳糖10克去氧膽酸鈉1.0克硫代硫酸鈉2.3克檸檬酸鈉1.0克檸檬酸鐵銨1.0克中性紅0.03克瓊脂15克蒸餾水加至1000毫升PH6.8～7.0＊牛肉膏用新鮮牛肉去其脂肪、肌膜及肌腱，絞碎后加兩倍(重量)水浸泡一液，煮沸后過濾，將凝固蛋白除去，成肉浸汁，經(jīng)70℃真空蒸發(fā)而制成。
將15磅按上述配方制備的培養(yǎng)基加熱滅菌15分鐘。
用本發(fā)明檢測板檢測食品細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如下。
材料1.菌株銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa)、氣味黃桿菌(Flavobacteriumodoratum)、君子蘭鏈球菌(Streptococcusmimiatus)、自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacterautotrophicus)、植生克雷伯氏菌(Klebsiellaplanticola)、乳桿菌(Lactobacillussp.)、嗜麥芽假單孢菌(Pseudomoenasmaltophilia)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、短小芽孢桿菌(Bacillusbrevis)、(以上由中國科學(xué)院微生物研究所提供)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)(由黑龍江省衛(wèi)生防疫站提供)。
2.培養(yǎng)基(1)細(xì)菌總數(shù)培養(yǎng)基(上述培養(yǎng)基1);
(2)大腸菌群培養(yǎng)基(上述培養(yǎng)基2);
(3)肉汁胨;
(4)PYG培養(yǎng)基。
方法1.培養(yǎng)基選擇性、特異性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)將培養(yǎng)基制成平板，表面干燥后，以24小時(shí)液體培養(yǎng)物一白金環(huán)接種，30℃培養(yǎng)24小時(shí)和48小時(shí)后觀察，同時(shí)以肉汁胨和PYG培養(yǎng)基做對(duì)照。
將制備的經(jīng)無菌試驗(yàn)合格的10塊檢測板置4℃冰箱貯存，1個(gè)月、3個(gè)月及半年后取出，用大腸埃希氏菌懸液稀釋液接種后，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，以國標(biāo)法對(duì)照觀察結(jié)果，計(jì)算兩法的符合率。
2.預(yù)備實(shí)驗(yàn)(1)取大腸埃希氏菌24小時(shí)營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用滅菌生理鹽水配成每毫升中含800、400、200、100、50、20個(gè)細(xì)菌的菌懸液。
(2)將檢測板在上述各濃度的菌懸液中浸蘸，然后用滅菌濾紙吸干多余菌液，37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，記錄板上長出的菌落數(shù)。同時(shí)，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌懸液作為一個(gè)待檢樣品，分別用國際法檢測細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的MPN值。
(3)計(jì)算檢測板法和國標(biāo)法的相關(guān)系數(shù)，分析相關(guān)關(guān)系。
(參見《衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)》，第2版，楊樹勤，人民衛(wèi)生出版社，1985，第103-109頁。)3.正式實(shí)驗(yàn)按國標(biāo)法將檢樣做前處理，檢測細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的MPN值。同時(shí)，將各檢測板在不同稀釋度的檢樣中浸蘸，用滅菌濾紙吸干多余液體，37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，記錄其菌落數(shù)。
4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將國標(biāo)法測得的細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的MPN值。和對(duì)應(yīng)10倍稀釋的檢測板上長出的菌落數(shù)輸入計(jì)算機(jī)，按95%可信限刪去不可信數(shù)據(jù)，分別作相關(guān)關(guān)系分析，得出直線回歸方程(參見《衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)》，如上所述)。
5.標(biāo)準(zhǔn)板的制備根據(jù)得出的直線回歸方程，并計(jì)算出下述代表不同污染程度標(biāo)準(zhǔn)板上的菌落數(shù)。
未被污染國家標(biāo)準(zhǔn)值以下可食用的污染國家標(biāo)準(zhǔn)值5倍以下輕度污染國家標(biāo)準(zhǔn)值25倍以內(nèi)中度污染國家標(biāo)準(zhǔn)值125倍以內(nèi)重度污染國家標(biāo)準(zhǔn)值125倍以上6.考核應(yīng)用在石家莊、呼和浩特、沈陽、哈爾濱、齊齊哈爾、海拉爾等地的衛(wèi)生防疫站，對(duì)1058份檢樣同時(shí)用國標(biāo)法和檢測板法進(jìn)行檢測。
結(jié)果討論1.各種細(xì)菌在兩種培養(yǎng)基上的生長情況。
將已知菌株接種四種培養(yǎng)基，30℃24～48小時(shí)后的生長情況見表1。
表1各種細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長情況的比較
注+～生長;-～不生長;+-～生長不良。
不能在肉汁胨和PYG培養(yǎng)基上生長的細(xì)菌，能在檢測板法用于檢測細(xì)菌總數(shù)的培養(yǎng)基上生長。同時(shí)，生長不良的菌群能很好生長。細(xì)菌的脫氫酶使TTC還原形成紅色菌落，質(zhì)地淡黃色，易于辨認(rèn)和計(jì)數(shù)。
用于檢測大腸菌群的檢測板培養(yǎng)基，由于含抑制劑和指示劑，只生長大腸菌群的細(xì)菌，并形成特征的粉色及紅黑色菌落，質(zhì)地紅褐色，變形菌不彌漫生長。
2.預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，檢測板法和國標(biāo)法檢測細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的相關(guān)系數(shù)分別為0.96和0.98，相關(guān)程度很高，從而為實(shí)驗(yàn)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。
3.用檢測板檢測樣品340份，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，其95%可信限內(nèi)的數(shù)據(jù)，細(xì)菌總數(shù)為314份，大腸菌群為322份。將所得數(shù)據(jù)做散點(diǎn)圖，結(jié)果呈線性，說明檢測板法和國標(biāo)法呈直線相關(guān)關(guān)系。其相關(guān)系數(shù)和直線回歸方程如表2。
表2檢測板法和國標(biāo)法檢測細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群值的相關(guān)回歸關(guān)系檢測項(xiàng)目細(xì)菌總數(shù)大腸菌群值相關(guān)系數(shù)0.99260.9999直線回歸方程Y=-5008+208XY=-51+45X＊Y-國標(biāo)法測得和細(xì)菌總數(shù)及MPN值。
X-檢測板法測得的細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群個(gè)數(shù)。
上述結(jié)果說明，兩法的相關(guān)程度很高，檢測板法的結(jié)果可信，可以代替國標(biāo)法評(píng)價(jià)食品的污染情況。另外，從上述兩種回歸方程中看出，檢測板的培養(yǎng)基比較敏感，就測定細(xì)菌總數(shù)而言，用國標(biāo)法測得的結(jié)果＜1(即0＝-5008+208X，X＝24～25)，在我們研制的小板上卻能生長24～25個(gè)菌落，有些在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上不生長的細(xì)菌，在檢測板法用的培養(yǎng)基上也能生長，和生長實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。
大腸菌群的檢測結(jié)果也是如此。若用國標(biāo)法測得的MPN值為30，即每毫升檢樣中的大腸菌群數(shù)＜1，而檢測板的接種量僅為0.2ml左右，如此推斷小板上不應(yīng)有細(xì)菌生長，但實(shí)際上長出1～2個(gè)菌落，這是由于培養(yǎng)基的營養(yǎng)條件較好的緣故。雖然檢測板的培養(yǎng)基敏感，能檢測出國標(biāo)法檢測不出的細(xì)菌，但是我們是用國標(biāo)法為對(duì)照得出的回歸方程，它綜合了檢測板的面積，接種量等諸多因素的影響，故檢測結(jié)果是可信的。
4.根據(jù)我國的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)驗(yàn)所得的回歸方程，確定標(biāo)準(zhǔn)板的表示范圍如表3。
表3食品細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群檢測標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)板的表示范圍
盡管各種食品的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)不同，但我們制出的標(biāo)準(zhǔn)板是統(tǒng)一的，因?yàn)橐呀?jīng)從檢樣的稀釋數(shù)上加以平衡;標(biāo)準(zhǔn)中細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群MPN值低的樣品，稀釋倍數(shù)要相對(duì)地小，反之要相對(duì)增大。各種食品的具體稀釋倍數(shù)見附表。在檢測工作中，只要對(duì)檢樣做適當(dāng)稀釋，直接接種檢測板，經(jīng)18～24小時(shí)培養(yǎng)后，將生長的菌落和標(biāo)準(zhǔn)板相對(duì)照，即可推定細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群MPN值的大致范圍，直觀判定被檢食品的污染程度。
5.以國標(biāo)法對(duì)照，用我們研制的食品細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群檢測板，共檢測1058份各類食品，二法所得結(jié)果的符合率達(dá)97%以上(表4)。制出的10塊檢測板，經(jīng)1個(gè)月、3個(gè)月及半年后從4℃冰箱中取出，再接種大腸埃希氏菌稀釋液，除一塊小板因污染真菌外，其他小板測得的結(jié)果均相符，說明檢測板使用的培養(yǎng)基質(zhì)量穩(wěn)定，敏感性無改變。
以上結(jié)果說明檢測板法測出的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，勿需另配制培養(yǎng)基及洗刷滅菌器材，并具有操作簡單，使用方便，省時(shí)省力，易于判定等優(yōu)點(diǎn)，適用于廣大基層單位。
表41058份食品檢樣兩法檢測結(jié)果的復(fù)合率
權(quán)利要求
1.能同時(shí)檢測食品細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的食品簡易檢測板，其特征在于該板為長方形板，由板的中心縱向分為兩部分，分別裝入檢測細(xì)菌總數(shù)的培養(yǎng)基和檢測大腸菌群的培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測板，其中所述檢測細(xì)菌總數(shù)的培養(yǎng)基由下列成分組成成分 含量牛腦浸液 150～250毫升牛心浸液 150～250毫升蛋白胨 10克葡萄糖 2克氯化鈉 5克磷酸氫二鉀 2.5克瓊脂 15克蒸餾水 加至1000毫升PH7.0-7.4在每100毫升上述培養(yǎng)基中還含有5毫升氯化三苯四唑的5%水溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測板，其中所述檢測大腸菌群的培養(yǎng)基由下列成分組成成分 含量牛肉膏 3克蛋白胨 20克乳糖 10克去氧脫酸鈉 1.0克硫化硫酸鈉 2.3克檸檬酸鈉 1.0克檸檬酸鐵銨 1.0克中性紅 0.03克瓊脂 15克蒸餾水 加至1000毫升PH6.8-7.0
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測板，其中檢測板為5.0×3.6×0.2cm大小的長方形板。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測板，在其一側(cè)還帶有一手持的把手。
6.用權(quán)利要求1所述的檢測板同時(shí)檢測食品細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種食品細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群檢測板，該板可一次同時(shí)完成細(xì)菌總數(shù)及大腸菌群的檢測。本發(fā)明還涉及該檢測板的制備及應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/08GK1077750SQ9310583
公開日1993年10月27日 申請(qǐng)日期1993年5月25日 優(yōu)先權(quán)日1993年5月25日
發(fā)明者劉秀琴, 白金蓮, 金麗萍, 盛潔, 盛強(qiáng), 蔡妙英, 魏京, 李桂賢 申請(qǐng)人:海拉爾市衛(wèi)生防疫站