本發(fā)明屬于食醋生物，具體涉及一種富含納豆激酶、γ-氨基丁酸和活性益生菌的雙菌發(fā)酵醋泡黑豆凍干粉及其制備方法。

背景技術：

1、山西老陳醋獨特的釀造工藝，使產品不僅具有“酸、甜、綿、香、鮮”的多層次豐富的風味品質，并且富含有機酸、氨基酸、黃酮、川芎嗪、類黑精、γ-氨基丁酸、洛伐他汀等多種生理活性成分。在許多古代中醫(yī)典籍中，醋被廣泛應用于中醫(yī)治療和保健實踐中，經常被用作中藥泡制輔料，其作用主要體現(xiàn)在：（1）能增強中藥材中有效成分的溶解度，如玄胡經醋泡制后，其中的游離生物堿轉化為醋酸鹽，使生物堿的提取率提升1倍；（2）引藥入肝經，增強活血祛瘀，理氣止痛作用，如莪術、乳香、沒藥等活血化瘀藥及香附、青皮等理氣藥經常用醋泡制；（3）緩和藥性，降低毒副作用，如大戟、甘遂等經醋泡制后，其瀉下作用緩和；（4）去除藥物的腥臭氣味，利于粉碎和煎出有效成分，提高療效，如龜板、鱉甲等動物骨骼藥經醋泡制后入藥。

2、黑豆產地分布廣泛，產區(qū)主要集中在東北、河北、山西和陜西等地。黑豆不僅富含蛋白質、維生素、礦物質等多種營養(yǎng)物質，還含有豐富的花青素等多酚類化合物，其營養(yǎng)功能價值遠優(yōu)于黃豆，具有悠久的藥食同源史?！侗静菥V目》記載：“黑豆有補腎養(yǎng)血、清熱解毒、活血化瘀、烏發(fā)明目、延年益壽功效”。現(xiàn)代研究表明，黑豆具有抗氧化、降血壓、抗腫瘤、抗炎等作用。隨著黑豆中活性肽、亞油酸、多酚、黃酮、低聚糖等有效成分不斷被分離、提取、解析及活性功能驗證，黑豆的營養(yǎng)保健價值引起了國內外研究者的廣泛關注。

3、中醫(yī)藥典籍中記載了許多關于醋漬食品的偏方，比較典型的有醋泡大豆、醋泡黑豆、醋泡花生、醋泡雞蛋、醋泡姜等，其中尤以醋泡黑豆的營養(yǎng)保健價值最高。據報道，醋泡黑豆具有美容、減肥、補腎、明目、烏發(fā)功能，可有效改善便秘、高血壓、高血脂、腰酸腿痛、糖尿病、慢性疲勞、寒癥、高膽固醇、冠心病等作用。

4、張秀紅等比較分析了煮制、炒制、烤制、高壓及生制5種加工工藝條件對醋泡黑豆風味和抗氧化活性影響。江帆等通過優(yōu)化黑豆生熟度、浸泡溫度等工藝條件，最終使產品中的總酚和總黃酮的含量顯著提升。申請?zhí)枮?02311159236.5的發(fā)明專利“一種含有活性肽的醋泡小黑豆食品及加工方法”，通過采用氣流膨化黑豆，添加酸性蛋白酶等方法，得到富含多肽和酪氨酸酶活性的醋泡黑豆產品。

5、綜上所述，目前關于醋泡黑豆產品的加工工藝多沿用傳統(tǒng)蒸煮、炒制后簡單浸泡；或者采用添加酶的方式提升黑豆蛋白分解多肽含量；缺乏加工過程中營養(yǎng)及功效成分的轉換、富集及在終產品和儲藏過程中的活性成分含量及穩(wěn)定性監(jiān)測；并且，市場上醋泡豆、醋泡花生類產品多采用真空袋或玻璃罐包裝形式，存在保存期內容物浸泡不均，質地變干，口感風味變差等問題；另外，鮮有關于采用益生菌富集發(fā)酵提升醋泡產品功能因子含量的研究，及聯(lián)合功能醋液醋漬工藝系統(tǒng)優(yōu)化，進而開發(fā)高值化食醋大健康產品。

6、醋作為大健康食品的載體，受到大眾廣泛認可，藥食同源醋產品的開發(fā)是食醋產業(yè)高質量發(fā)展的一個主要方向，功效成分種類明確、含量明確的高質量醋泡黑豆等醋泡養(yǎng)生健康產品具有廣闊良好的發(fā)展前景。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種富含納豆激酶、γ-氨基丁酸和活性益生菌的雙菌發(fā)酵醋泡黑豆凍干粉及其制備方法，將黑豆浸泡過夜，高溫高壓滅菌后，接入山西老陳醋醋醅來源優(yōu)良益生菌菌株植物乳桿菌和解淀粉芽孢桿菌混合發(fā)酵，之后采用桑葚-老陳醋陳漿浸泡，浸泡結束后將豆撈出與之前濾出的醋泡桑葚混合，粉碎，真空冷凍干燥得醋泡黑納豆凍干粉，再添加活性老陳醋醋醅源植物乳桿菌，即得成品。

2、本發(fā)明在傳統(tǒng)醋泡黑豆加工工藝中創(chuàng)新引入老陳醋源益生菌發(fā)酵、桑葚-老陳醋陳漿浸泡，活性益生菌粉添加等創(chuàng)新工藝，產品中富含納豆激酶、r-氨基丁酸、異黃酮苷元、原花青素、益生菌等活性成分，并且突破了傳統(tǒng)醋泡黑豆產品形式，醋泡黑豆益生菌凍干粉產品可以與早餐代餐粉、飲品等食品達到很好融合，拓展并提升了老陳醋大健康食品的市場空間、消費人群和發(fā)展前景。

3、本發(fā)明由如下技術方案實現(xiàn)：一種富含納豆激酶、γ-氨基丁酸和活性益生菌的雙菌發(fā)酵醋泡黑豆凍干粉的制備方法，包括如下步驟：

4、（1）制備桑葚-老陳醋陳漿浸泡液：將桑葚干與陳釀8年老陳醋陳漿按照質量體積比為1：5的比例浸泡1個月，將醋液濾出，以濾出醋液為計算基準，加入醋液質量體積比為20%的蜂蜜，0.03%的白砂糖、0.03%的食用鹽，煮沸40分鐘，冷卻至60℃，即得桑葚-老陳醋陳漿浸泡液，濾出的醋泡桑葚備用；

5、（2）制備凍干粉：洗凈的黑豆在去離子水中浸泡一夜，將其用紗布瀝干后，121℃、滅菌20min，溫度降至≤40℃后，接種6%解淀粉芽孢桿菌和3%植物乳桿菌種子液，并置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，之后4℃后熟24h制得發(fā)酵黑豆；

6、發(fā)酵黑豆與步驟（1）所得桑葚-老陳醋陳漿浸泡液按質量體積比為1：1.5混合，浸泡14天后，將豆撈出與步驟（1）中所得醋泡桑葚混合，粉碎60目后，經真空冷凍干燥得醋泡黑豆凍干粉。真空冷凍干燥條件為：凍干厚度1.5?cm，先放置于―80℃冰箱預凍2h，之后設置冷阱溫度-51?℃，真空度0.09?mbar，真空冷凍干燥30～35?h后，即得凍干粉；

7、凍干粉中再添加活性老陳醋醋醅源植物乳桿菌cgmcc?15731凍干粉，添加量按最終成品中活性植物乳桿菌濃度≥107cfu/g計算；即為富含納豆激酶、γ-氨基丁酸和活性益生菌的雙菌發(fā)酵醋泡黑豆凍干粉。

8、所述植物乳桿菌為cgmcc?15731，所述解淀粉芽孢桿菌為cgmcc?15732；植物乳桿菌cgmcc?15731種子液或解淀粉芽孢桿菌cgmcc?15732種子液的制備方法為：將活化的植物乳桿菌cgmcc?15731或解淀粉芽孢桿菌cgmcc?15732按3%的接種量接入到mrs液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24h，菌體濃度達108cfu/ml，8000r/min，離心10min得菌泥，用0.85%的生理鹽水洗滌菌體兩次后重懸菌體，使?jié)舛冗_到108cfu/ml，即為種子液。

9、所述的活性老陳醋醋醅源的植物乳桿菌cgmcc?15731凍干粉的制備方法為：按照上述的植物乳桿菌cgmcc?15731種子液制備過程，得菌泥后，以保護劑/菌泥(體積/質量)為3：1的比例添加10%的保護劑，進行真空冷凍干燥得活性老陳醋醋醅源的植物乳桿菌cgmcc15731凍干粉（活菌數(shù)濃度達到1010cfu/g），真空冷凍干燥條件同上述的醋泡黑豆凍干粉的凍干條件。保護劑制備方法為：保護劑1：脫脂乳粉10g，水100ml，115℃，15min滅菌；保護劑2：海藻糖1.5g，甘油0.5g，山梨醇2g，麥芽糊精1g，水100ml，115℃，15min滅菌；將高溫滅菌的保護劑1和保護劑2，冷卻至室溫，按1:1體積比混合，即為保護劑。

10、所述的黑豆為山西忻州神池黑豆。所述陳釀8年老陳醋陳漿為：總酸≥6.5?g/100ml、不揮發(fā)性酸≥2.5g/100ml、氨基態(tài)氮≥0.30?g/100ml、總酯≥3.0?g/100ml、還原糖≥2.5?g/100ml、可溶性固形物≥15?g/100ml、黃酮≥200?mg/100g、川芎嗪≥90mg/l。

11、本發(fā)明所述解淀粉芽孢桿菌為：申請?zhí)枮?01910354887.7，發(fā)明名稱為一種由地衣芽孢桿菌、萎縮芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌所產抑菌物復配的鮮切果蔬保鮮劑中所記載的解淀粉芽孢桿菌；所述植物乳桿菌為申請?zhí)?01910136386.1，發(fā)明名稱為一株耐受性強、產酸高的山西老陳醋優(yōu)勢土著風味植物乳桿菌及應用中所記載的植物乳桿菌。

12、本發(fā)明所述的植物乳桿菌cgmcc?15731，為本實驗室從山西老陳醋的醋醅中分離出的具有耐受性強、高產酸、高產γ-氨基丁酸、高產β-葡萄糖苷酶、高轉化大豆異黃酮、發(fā)酵風味佳的優(yōu)良菌株。所述的解淀粉芽孢桿菌cgmcc?15732，為本實驗室從山西老陳醋的醋醅中分離出的具有產納豆激酶、蛋白酶能力強、抑制雜菌能力強的優(yōu)良菌株。

13、本發(fā)明還提供了利用所述方法制備而成的富含納豆激酶、γ-氨基丁酸和活性益生菌的雙菌發(fā)酵醋泡黑豆凍干粉。

14、所述富含納豆激酶、γ-氨基丁酸和活性益生菌的雙菌發(fā)酵醋泡黑豆凍干粉為和紫色，納豆激酶≥16000?u/g、γ-氨基丁酸≥200?mg/100?g、異黃酮苷元≥90mg/l、原花青素≥2000?mg/100?g、益生菌≥107cfu/g，色澤為黑紫色，具有老陳醋、桑葚和豆香復合風味及降血脂、增強免疫、抗氧化等功效。

15、與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下創(chuàng)新點和有益效果：

16、（1）本發(fā)明采用的黑豆為山西忻州神池黑豆，是當?shù)貧v史悠久的名優(yōu)特產，是國家農業(yè)地理標志保護產品。神池縣地處黃土丘陵區(qū)，山丘起伏、溝壑縱橫，平均海拔在1500米，屬大陸季風氣候，干旱、高寒、溫差大、無霜期短。神池氣候涼爽、降雨集中、西北風長年不斷、光照充足、晝夜溫差大這樣的氣候條件正好符合黑豆的生產發(fā)育。

17、神池黑豆籽實大而飽滿，呈卵圓形或近于球形，色澤烏黑發(fā)亮，子葉呈黃綠色。蛋白質含量高達38-42g/100g，人體必需的亞油酸含量為4-5g/100g、亞麻酸含量為0.8-1.0g/100g；含有18種氨基酸，特別是人體必需的8種氨基酸，其中賴氨酸含量可達2-3g/100g；大豆異黃酮達79.5-83.2mg/100g、維生素e達20.1-25.9mg/100g、鈣達158-187mg/100g、磷達548-598mg/100g，還含有人體必需的維生素b1、b2、c、煙酸和豐富的鋅、銅、鎂、鉬、硒、氟等微量元素；黑豆皮含有花青素，花青素是很好的抗氧化劑來源，能清除體內自由基。

18、（2）本發(fā)明采用山西老陳醋的醋醅源優(yōu)良植物乳桿菌cgmcc?15731（菌株耐受性強、高產酸、高產r-氨基丁酸、高產β-葡萄糖苷酶、高轉化大豆異黃酮、發(fā)酵風味佳）和醋醅來源解淀粉芽孢桿菌cgmcc?15732（高產納豆激酶、蛋白酶能力強）聯(lián)合進行黑豆發(fā)酵，相比于單菌發(fā)酵，產品中的納豆激酶、異黃酮苷元、r-氨基丁酸的含量顯著提升,增強了其營養(yǎng)健康功能。

19、（3）本發(fā)明采用的醋泡液為8年陳釀山西老陳醋陳漿再添加桑葚干浸泡1個月，醋泡液中不僅富含山西老陳醋典型功效成分川芎嗪，黃酮、有機酸，并且富含桑葚原花青素及桑葚果香風味。

20、（4）本發(fā)明將發(fā)酵浸泡好的黑豆與之前濾出的醋泡桑葚混合，進行粉碎，真空冷凍干燥后，添加活性老陳醋的醋醅源植物乳桿菌，集合了醋泡黑豆、醋泡桑葚、山西老陳醋和益生菌等雜豆、水果和益生菌的原料營養(yǎng)、功能和風味之間的互補協(xié)調優(yōu)勢，并且采用凍干粉的形式，不僅有利于產品中功能成分的活性保持，更加拓展了醋泡黑豆的多元產品形式，最終雙菌發(fā)酵醋泡黑豆凍干粉中益生菌的強化添加，則進一步提高了產品的調節(jié)腸道菌群、降血脂、抗氧化等營養(yǎng)功能價值。