本發(fā)明涉及一種固態(tài)發(fā)酵植物性蛋白飼料制備蛋白飼料添加劑的方法，屬于飼料技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前飼料生產(chǎn)主要是在優(yōu)化飼料配方的基礎(chǔ)上，將飼料添加劑、蛋白質(zhì)飼料原料和能量飼料原料按一定比例配混而成的不同料型飼料，其本質(zhì)上是飼料原料的選擇及其優(yōu)化組合，而忽略了飼料原料的處理技術(shù)。與此同時，飼料資源缺乏，人畜共糧的矛盾日趨突出，蛋白源不足，以及隨著歐盟在飼料中全面禁止使用抗生素，為保證畜牧、水產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，世界各地都在研究、開發(fā)的新飼料資源和新的飼料加工技術(shù)。微生物飼料發(fā)酵技術(shù)作為新型飼料資源的開發(fā)和加工方法，可提供生態(tài)健康型飼料。微生物發(fā)酵飼料的原料可以是秸稈類、餅粕類、廢渣及工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的下腳料或飼料原料，拓寬了飼料原料的來源。
微生物發(fā)酵法按基質(zhì)含水量可分為液態(tài)微生物發(fā)酵與固態(tài)微生物發(fā)酵兩種，相對前者，后者培養(yǎng)基含水量低，發(fā)酵過程中幾乎不產(chǎn)生廢水，即固態(tài)發(fā)酵法是微生物在沒有或基本沒有游離水的固態(tài)基質(zhì)上的發(fā)酵方式方法。組合菌種固態(tài)發(fā)酵法是將多種特定有益微生物接種到復(fù)合蛋白飼料中，通過微生物發(fā)酵來調(diào)制、加工、生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)植物源性蛋白飼料的方法。這種飼料加工方法是利用微生物在一定條件下的生長、繁殖與新陳代謝，分解復(fù)合蛋白飼料中的大分子有機(jī)物為易消化吸收的小分子物質(zhì)，特別是將復(fù)合飼料中的蛋白降解為可溶性蛋白和小分子多肽的混合物，起到飼料機(jī)械難以達(dá)到的深度加工生產(chǎn)飼料的作用；同時，在發(fā)酵過程中，微生物還能利用或降解復(fù)合蛋白飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，一定程度上消除復(fù)合蛋白飼料中植物蛋白的抗原性；積累有用的菌體、酶與中間代謝產(chǎn)物，改善飼料品質(zhì)，提高動物攝食率，提高現(xiàn)有常規(guī)飼料的營養(yǎng)價值及其利用率。
目前，微生物發(fā)酵常用的菌種主要是乳酸菌、芽孢桿菌、酵母、黑曲霉等，多為單菌種發(fā)酵，且大都是液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵工藝設(shè)備復(fù)雜，投資大，成本高。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供一種固態(tài)發(fā)酵植物性蛋白飼料制備蛋白飼料添加劑的方法。
所述固態(tài)發(fā)酵是以復(fù)合益生菌劑作為發(fā)酵菌種，所述復(fù)合益生菌劑為菌液，按體積比計含有：枯草芽孢桿菌菌液27.8％、丁酸梭菌菌液49.7％、釀酒酵母菌菌液5％、植物乳桿菌菌液17.5％；其中，枯草芽孢桿菌菌液濃度為1×108cfu/mL，丁酸梭菌菌液濃度為1.2×108cfu/mL， 釀酒酵母菌液濃度為2.5×107cfu/mL，植物乳桿菌菌液濃度為9×107cfu/mL。
所述固態(tài)發(fā)酵是以菜粕、豆粕、棉粕、小麥粉等植物性原料復(fù)配得到的植物性蛋白飼料作為原料。
所述固態(tài)發(fā)酵是將滅菌后的植物性蛋白飼料的含水量調(diào)整為18～21％，按植物性蛋白飼料干重的11.5～13.3％接種復(fù)合益生菌劑，攪拌均勻后，裝入無菌平底鋁箔自封袋，32～34℃條件下發(fā)酵63～67小時。
在本發(fā)明的一種實施方式中，將菜粕、豆粕、棉粕、小麥粉分別曬干，粉碎過60目篩后，按豆粕粉35份、棉粕粉20份、菜粕粉10份、小麥粉35的質(zhì)量比例混合得到植物性蛋白飼料。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述固態(tài)發(fā)酵是將滅菌后的植物性蛋白飼料的含水量調(diào)整為18.45％，按植物性蛋白飼料干重的11.75％接種復(fù)合益生菌劑，攪拌均勻后，裝入無菌平底鋁箔自封袋，34℃條件下發(fā)酵63小時。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌菌液的制備是以營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)枯草芽孢桿菌至濃度為1×108cfu/mL。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述丁酸梭菌菌液的制備是以生孢梭菌培養(yǎng)基培養(yǎng)丁酸梭菌至濃度為1.2×108cfu/mL。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述釀酒酵母菌液的制備是以麥芽汁培養(yǎng)釀酒酵母至濃度為2.5×107cfu/mL。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述植物乳桿菌菌液的制備是以MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)植物乳桿菌至濃度為9×107cfu/mL。
在本發(fā)明的一種實施方式中，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)40℃溫度下烘干12左右小時，控制水份在12-13％，用飼料粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，制得蛋白飼料添加劑。
在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法包括以下步驟：
(1)對枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、丁酸梭菌、釀酒酵母菌進(jìn)行活化、擴(kuò)大培養(yǎng)；
(2)對菜粕、豆粕、棉粕、小麥粉等植物性原料進(jìn)行粉碎、配料、混合，調(diào)質(zhì)，紫外滅菌；
(3)采用復(fù)合益生菌劑進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，制備蛋白飼料添加劑成品。
本發(fā)明的優(yōu)點在于采用益生菌劑對復(fù)合原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵工藝簡單，投資小，成本低，發(fā)酵產(chǎn)品感觀品質(zhì)良好，粗蛋白、可溶性蛋白、氨基酸含量有不同程度提高，含有較高活性的淀粉酶酶和蛋白酶，并含有一定的活體菌數(shù)，達(dá)到生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)酵香飼料效果。發(fā)酵后多肽含量達(dá)到19％以上，粗蛋白增加了10.02％，粗脂肪、粗灰分分別下降了35.36％和27.29％。
附圖說明
圖1四種菌種生長曲線
具體實施方式
枯草芽孢桿菌(發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號為CICC21095；植物乳桿菌，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號為CICC21794；釀酒酵母，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號為CICC1023；丁酸梭菌，購于廣東微生物菌種保藏中心，菌株保藏編號為GIM1.676。
采用微量凱氏定氮法(GB50095-2010)測定粗蛋白含量。
參照國標(biāo)方法(QB/T 2653-2004)測定多肽含量。準(zhǔn)確稱取發(fā)酵后樣品2.000g，加入8mL的0.2mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)，4000r/min離心15min，取上清液，凱氏定氮法測定發(fā)酵產(chǎn)物中酸溶性蛋白質(zhì)的含量；三氯乙酸沉淀蛋白后用茚三酮顯色法測定發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的含量。
多肽/％＝酸溶性蛋白質(zhì)/％-游離氨基酸/％。
蛋白降解率＝多肽含量/粗蛋白含量/％
實施例1菌種的活化培養(yǎng)
(一)活化、種子液培養(yǎng)基
將各菌種接種于各自的斜面培養(yǎng)上，用于菌種復(fù)蘇活化，并將活化后的斜面培養(yǎng)物挑取一環(huán)，無菌條件下接種到各自的種子液體培養(yǎng)基中，用于固態(tài)發(fā)酵復(fù)合蛋白飼料。
1.枯草芽孢桿菌培養(yǎng)基
枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基名稱為營養(yǎng)肉汁瓊脂，種子液體培養(yǎng)基不加瓊脂。
培養(yǎng)基成分：營養(yǎng)培養(yǎng)基，蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g，MnSO4·H2O 5mg，蒸餾水1L，pH7.0，瓊脂15.0g。
2.植物乳桿菌培養(yǎng)基
植物乳桿菌的培養(yǎng)基名稱是MRS培養(yǎng)基，種子液體培養(yǎng)基不加瓊脂。
培養(yǎng)基成分：酪胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖5.0g，硫酸鎂0.02g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二銨2.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸錳0.05g，CaCO32.0g，吐溫801.0g，蒸餾水1L，pH6.8。
3.丁酸梭菌培養(yǎng)基
丁酸梭菌的培養(yǎng)基名稱為生孢梭菌培養(yǎng)基，種子液體培養(yǎng)基不加瓊脂。
培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖5g，NaCl 5.0g，酵母膏3g，乙酸鈉3g，可溶性淀粉1.0g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，MgSO4·H2O 1.0g，(NH4)2SO42.0g，CaCO32.0g， FeSO4·7H2O 0.001g，MnCl2·7H2O 0.001g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000ml，pH6.8。
4.釀酒酵母培養(yǎng)基
釀酒酵母的培養(yǎng)基名稱是麥芽汁瓊脂養(yǎng)基，種子液體培養(yǎng)基不加瓊脂。
培養(yǎng)基成分：5°Bé麥芽汁1.0L，瓊脂15.0g，自然pH。
(二)菌種活化、種子液制備
1.菌種活化及生長規(guī)律曲線繪制
按照菌種凍干管說明書，在無菌環(huán)境下打開安培瓶，取出部分菌粉，用50uL無菌水溶解后，無菌操作接種到相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24小時，活化菌種。用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的30mL液體培養(yǎng)基上(150mL的三角瓶)，在溫度37℃，轉(zhuǎn)速為120rmp，回旋氣浴振蕩器中恒溫培養(yǎng)。采用比濁法，以各自培養(yǎng)基為對照，每隔2小時觀測培養(yǎng)液的吸光度OD值，連續(xù)觀測36小時左右，繪制各菌種生長量與時間關(guān)系的生長曲線(見圖1)，掌握各菌種生長規(guī)律，便于菌種擴(kuò)大培養(yǎng)，制備種子液制備。
從圖1中可以看出，4種菌在36小時的培養(yǎng)時間內(nèi)都經(jīng)歷了典型的微生物生長曲線4個時期中前3個時期，即遲緩期、對數(shù)期和穩(wěn)定期；枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌分別在培養(yǎng)到大約14和28小時后進(jìn)入衰亡期，而釀酒酵母和丁酸梭菌經(jīng)歷對數(shù)生長期后，分別在14和20小時進(jìn)入穩(wěn)定期的緩慢生長階段，在監(jiān)測的36小時內(nèi)并沒有明顯衰亡跡象。釀酒酵母和丁酸梭菌生長的特性有利于較長時間的固態(tài)發(fā)酵。微生物在對數(shù)期具有生長速率最快、代謝旺盛、酶系活躍、活細(xì)菌數(shù)和總細(xì)菌數(shù)大致接近、細(xì)胞的化學(xué)組成等形態(tài)和理化性質(zhì)基本一致的特點。從圖中1可以看出，4種菌進(jìn)入快速生長期的吸光度OD值約為0.2左右，吸光度約為1.4-1.6時快速生長期結(jié)束，但進(jìn)入對數(shù)期所需培養(yǎng)時間不同，且維持快速生長期的時間長短不一。比濁法中，通過測定培養(yǎng)液吸光度OD值來判斷培養(yǎng)中微生物的菌體數(shù)量，用以調(diào)節(jié)固態(tài)發(fā)酵中接菌量。
后續(xù)實施例中選取培養(yǎng)的吸光度OD值為0.8時培養(yǎng)的4種菌液用于固態(tài)發(fā)酵。用平板計數(shù)法測得培養(yǎng)液中活菌數(shù)量，枯草芽孢桿菌為1×108cfu/mL，丁酸梭菌為1.2×108cfu/mL，釀酒酵母為2.5×107cfu/mL，植物乳桿菌為9×107cfu/mL。4菌種的菌液百分比總和為100％。
2.各菌種的種子液制備
將活化好的菌種，用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的100mL液體培養(yǎng)基上，在溫度37℃，轉(zhuǎn)速為120rpm，回旋氣浴振蕩器中恒溫培養(yǎng)，參照各菌種培養(yǎng)時間與吸光度OD值之間的關(guān)系的生長量規(guī)律(圖1)，收集各菌種的吸光度OD值為0.8的處于活躍生長期菌液，冷藏備用。
實施例2復(fù)合蛋白飼料添加劑原料配料、混合、滅菌
復(fù)合飼料蛋白由菜粕、豆粕、棉粕、小麥粉原料構(gòu)成。其中菜粕、豆粕、棉粕購于鹽城天邦飼料科技有限公司，菜粕中粗蛋白含量為37％，豆粕中粗蛋白含量為46％，棉粕中粗蛋白含量為46％，小麥粉購于某農(nóng)貿(mào)市場，測得粗蛋白含量為12％。將飼料原料曬干，粉碎過60目篩。按豆粕粉35份、棉粕粉20份、菜粕粉10份、小麥粉35比例混合，置于單人雙面凈化工作臺(SW-CJ-1F型，紫外燈管功率15w，燈管距離臺面30cm)紫外滅菌30分鐘，做為益生菌劑固態(tài)發(fā)酵的底物，用來發(fā)酵制備復(fù)合蛋白飼料添加劑。
實施例3 4種單菌分別對復(fù)合飼料蛋白進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵
試驗組在無菌條件下，稱取滅菌后的上述復(fù)合原料20克，分別按復(fù)合原料干重的10％接種制備好的4種單菌種菌液，用滅菌自來水來調(diào)節(jié)飼料含水量到18％，每組重復(fù)3次，共12組。對照組為不接任何菌組，其它操作方法同試驗組。在無菌三角瓶中攪拌均勻后，裝入無菌平底鋁箔自封袋(大小為13cm×18cm×22絲)中，pH值為自來水本來的酸堿度，37℃恒溫發(fā)酵48小時，取樣測定，以發(fā)酵復(fù)合飼料蛋白產(chǎn)物中粗蛋白、多肽含量為指標(biāo)，衡量4種菌種對發(fā)酵復(fù)合飼料蛋白添加劑品質(zhì)的影響。
測定結(jié)果列于表1中。
表1.4種菌對發(fā)酵底物中粗蛋白、多肽含量的影響(干物質(zhì))
由表1可知，在粗蛋白方面，與對照相比，經(jīng)丁酸梭菌發(fā)酵后粗蛋白含量提高幅度最大，顯著(P＜0.05)提高了12.24％，植物乳桿菌提高幅度最小，只提高了8.49％，差異不顯著(P＞0.05)。這4種菌在有氧或無氧的發(fā)酵過程中，一方面，微生物主要消耗了復(fù)合飼料中部分糖類或脂類物質(zhì)，維持自身的生長代謝；另一方面，在植物性的原料中，糖類物質(zhì)豐富，微生物在物質(zhì)代謝過程中，可以利用糖代謝過程中的酮酸碳骨架及代謝過程中產(chǎn)生的氨，把糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)換成氨基酸、蛋白類的物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白含量提高的原因可能是這兩方面原因?qū)е碌?。在多肽含量方面?種菌發(fā)酵后，多肽含量顯著提高了4.12-5.31倍(P＜0.05)，說明這4種菌在生長代謝過程中利用自身的酶來降解復(fù)合飼料中蛋白質(zhì)，從而提高發(fā)酵產(chǎn)物中多肽有含量。從表1中，可以看出，枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌多肽含量分別提高了5.31和5.28 倍，兩者沒有明顯差異(P＞0.05)，在發(fā)酵過程中可降解25％以上的蛋白，從而提高了飼料多肽的含量，提高了飼料的品質(zhì)。
實施例4 4菌種混合比例對發(fā)酵結(jié)果的影響
考察4菌種混合起來作為發(fā)酵用菌種時，枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌、釀酒酵母和植物乳桿菌4種菌的混合比例對多肽含量的影響。按復(fù)合蛋白飼料干重的10％接種復(fù)合益生菌菌液，用滅菌自來水來調(diào)節(jié)飼料含水量為18％，在無菌三角瓶中攪拌均勻后，裝入無菌平底鋁箔自封袋(13cm×18cm×22絲)中，在自來水天然pH值條件下，37℃恒溫發(fā)酵48小時后，測定各菌種組合發(fā)酵后的多肽含量(結(jié)果見表2)。
表2混菌中的各菌液體積百分比及固態(tài)發(fā)酵后多肽含量(％)
表2中列出了按枯草芽孢桿菌、丁酸梭菌、釀酒酵母菌和植物乳桿菌不同混和體積比例固態(tài)發(fā)酵多肽含量的結(jié)果。
進(jìn)一步調(diào)整菌種混合菌液中各菌液體積比例為：枯草芽孢桿菌為27.8％、丁酸梭菌為49.7％、釀酒酵母菌為5％、植物乳桿菌17.5％，在這種比例下復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵后多肽含量最高為16.916％。
實施例5 固態(tài)發(fā)酵條件對發(fā)酵結(jié)果的影響
當(dāng)溫度范圍為25-45℃，飼料底物水分含量為16-22％，接菌量為6-16％(按飼料干重)，發(fā)酵時間為40-80小時，復(fù)合飼料蛋白固態(tài)發(fā)酵后多肽含量的結(jié)果見表3。
表3復(fù)合益生菌發(fā)酵條件與固態(tài)發(fā)酵后多肽含量(％)
進(jìn)一步選擇6種方案進(jìn)行試驗，每種方案3次平行試驗，結(jié)果取平均值，發(fā)酵后多肽含量結(jié)果列于表中(表4)。由表4可知，試驗組5發(fā)酵后的多肽含量顯著高于其它組。由此推斷，復(fù)合益生菌最佳發(fā)酵條件為設(shè)置溫度為34℃，水分為18.45％，接菌總量為11.75％(按飼料干重)，發(fā)酵時間為63小時。
表4復(fù)合益生菌不同固態(tài)發(fā)酵條件對多肽含量影響
實施例6 復(fù)合蛋白飼料添加劑的制備
將實施例5復(fù)合益生菌最佳發(fā)酵條件下得到的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)40℃溫度下烘干12左右小時，控制水份在12-13％，用飼料粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，制得復(fù)合蛋白飼料添加劑成品。
1.復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵對復(fù)合蛋白飼料添加劑品質(zhì)的影響
(1)固態(tài)發(fā)酵
取無菌的復(fù)合原料分為2份做為試驗組，按飼料干重的0％、11.75％的兩種接菌量，在無菌條件下接入復(fù)合益生菌，用滅菌自來水來調(diào)節(jié)飼料含水量為18.45％，每組重復(fù)3次。
在無菌物三角瓶中攪拌均勻后，裝入大小為13cm×18cm×22絲的無菌平底鋁箔自封袋中。自來水自然pH值，34℃恒溫發(fā)酵63小時，取樣測定各項指標(biāo)。
(2)取樣測定各項指標(biāo)結(jié)果
復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵對復(fù)合蛋白的常規(guī)營養(yǎng)成分影響結(jié)果見表5。經(jīng)過益生菌劑固態(tài)發(fā)酵，復(fù)合原料中成分發(fā)生了不同程度的變化。期中，粗蛋白增加了10.02％，粗脂肪、粗灰分分別下降了35.36％和27.29％。
表5益生菌劑發(fā)酵對復(fù)合原料常規(guī)組成成分的影響(干物質(zhì))
益生菌劑固態(tài)發(fā)酵對復(fù)合蛋白飼料中的含酶活性影響的結(jié)果見表6。由表6可知，復(fù)合蛋白飼料中淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶都顯著高于不加益生菌劑的對照組，說明在發(fā)酵過程中，益生菌劑分泌并積累大量酶，有利于原料中大分子物質(zhì)的降解，改善飼料品質(zhì)，提高飼料的營養(yǎng)價值。
表6益生菌劑發(fā)酵對復(fù)合蛋白飼料含酶活性的影響(干物質(zhì))
復(fù)合益生菌固態(tài)發(fā)酵對復(fù)合蛋白飼料pH值、活菌數(shù)、干物質(zhì)回收率影響的結(jié)果見表7。從表7中看出，在發(fā)酵過程中益生菌劑消耗飼料中小部分營養(yǎng)成分來維持生長、繁殖，干物質(zhì)回收率降低。從表7還可以看出，益生菌劑固態(tài)發(fā)酵pH值降低，改變了飼料的風(fēng)味，同時，積累了大量的菌體，促進(jìn)動物采食，有效抑制有害微生物的生長，利于飼料的保存。
表7益生菌劑發(fā)酵對飼料pH值、活菌數(shù)、干物質(zhì)回收率的影響
益生菌劑固態(tài)發(fā)酵對復(fù)合蛋白飼料感觀品質(zhì)影響的結(jié)果見表8。由表8可知，固態(tài)發(fā)酵改變了飼料的色澤，從原有的淡黃色到茶褐色，改變了氣味和飼料組織狀態(tài)。改善了飼料的感觀品質(zhì)。
表8益生菌劑接種量對發(fā)酵飼料感觀品質(zhì)的影響
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。