一種快速診斷桑椹縮小型菌核病的方法
【專利摘要】一種快速診斷桑椹縮小型菌核病的方法，通過發(fā)現(xiàn)的病原核地杖菌特異性保守DNA序列，獲得了特異性SCAR-PCR引物，建立了桑椹縮小型菌核病SCAR-PCR診斷檢測方法。該方法的靈敏度高(檢測靈敏度為1 pg/μL)，特異性強，使用方便快捷，檢測結果準確可靠，可用于桑椹縮小型菌核病的田間診斷和桑果帶菌情況檢測檢驗；同時還可用于病害潛伏期(已侵染桑果但未顯癥的時期)診斷，從而對病害做出早期預報，以及時實施必要的控制措施，安全有效地防治病害的發(fā)生和危害，減輕或避免經(jīng)濟損失。根據(jù)此方法可研制開發(fā)桑椹縮小型菌核病“檢測試劑盒”產(chǎn)品，廣泛應用于桑葚相關產(chǎn)業(yè)的科學研究和生產(chǎn)實踐。
【專利說明】-種快速診斷桑植縮小型菌核病的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病害防治【技術領域】，特別是涉及一種用分子生物技術快速診斷桑 植縮小型菌核病的方法。

【背景技術】
[0002] 桑植縮小型菌核病的經(jīng)濟重要性.桑植縮小型菌核病 (S虹unken-fruitsclerotiniose of mu化erry)是H種桑植菌核病之一，其病原菌為核地 |sf {Scleromi trula shiraiana) {Schuamacher T, Holst-Je打se打 /L A sy打opsis of the genus Scleromitrula. 2997,說^分.?仿-化0,是世界上發(fā)生最普遍和危 害最嚴重的桑植菌核病。該病在我國發(fā)生非常普遍，江蘇、浙江、上海、四川、重慶、陜西和臺 灣等主要果桑種植區(qū)均有發(fā)生分布，發(fā)病率常年均可達到30% - 60%，一般減產(chǎn)20% - 50% ; 近幾年來在許多地區(qū)桑菌核病爆發(fā)流行，造成大面積果桑毀產(chǎn)絕收（崩兒^填，桌濕巧.桑 堪菌核病病原及病害防治技術綜述.蠶業(yè)科學，2012，38巧）：1099-1104)。啦化，棄藤 菌核病是危害果桑作物的重要病害，是影響桑樹生長發(fā)育和桑植產(chǎn)量的重要限制因子，研 究該病害的診斷鑒定技術，W準確地預測和有效地防治病害流行，對于桑果生產(chǎn)穩(wěn)定發(fā)展 具有重要意義。
[0003] 桑植縮小型菌核病發(fā)生診斷的重要性.桑菌核病菌W掉落在桑園±壤中的菌核 越冬，次年春季氣溫升高后開始萌發(fā)產(chǎn)生子囊盤（磨茹），形成大量子囊抱子散發(fā)于空氣 中，在桑樹開花期侵染花朵，果實成熟時表現(xiàn)癥狀，將桑植的部分或全部小果粒變?yōu)榫恕?縮小型菌核病植顯著縮小，灰白色，質(zhì)地堅硬，表面有暗褐色細斑，病植內(nèi)形成黑色堅硬菌 核。桑植菌核病從病原菌侵染到桑果大量發(fā)病的時間歷程很短，病害的快速準確診斷和早 期預報是指導生產(chǎn)中病害防治的關鍵。
[0004] 桑植縮小型菌核病快捷準確診斷技術的必要性.目前，桑植菌核病的診斷主要采 用傳統(tǒng)病害診斷方法，即根據(jù)癥狀和病原菌形態(tài)確定病害的種類。但是，傳統(tǒng)的病害診斷需 要病害表現(xiàn)出癥狀之后才能進行，而且需要分離得到病原菌的純培養(yǎng)和對病原菌進行顯微 特征觀察。一方面，病原菌的分離純化過程相當復雜，實驗條件和技術要求都較高，診斷的 準確性和可靠性難W保證；且在人工培養(yǎng)條件下病菌生長緩慢，一般需要15 - 20天之后才 能觀察鑒定，獲得診斷鑒定結果；另一方面，病害一旦開始顯癥，就會迅速發(fā)展，此時做出診 斷為時已晚，根據(jù)診斷結果采取防治措施已不能獲得有效的病害防治效果。因此急需一種 快速診斷桑植縮小型菌核病的方法。
[0005] 桑植縮小型菌核病分子診斷技術尚未建立.傳統(tǒng)的真菌分類和鑒定主要基于形 態(tài)學特征、致病性測定等，該種方法耗時長、靈敏度低W及經(jīng)驗性強，從發(fā)病的植株中分離 和鑒定病原菌需要很長時間，難W適應現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病害預測和綜合防控實踐的需要。 隨著分子生物學的發(fā)展，各種分子技術應用到植物病原物的檢測，唐建輝等（2006)利用 RAPD技術轉(zhuǎn)化為SCAR標記，設計引物RB/RC對西瓜炭痘病菌仿or如'cu7are 進行特異性檢測。Qin et al(2010)應用巢式PCR技術，根據(jù)ITS序列，設計出引物XJJ21/ XJJ222對引起油菜菌核病的況'yerWinia s<;?7erWia/Y邸進行特異性檢測。化ang et al (2014)建立了水稻黑條欽縮病毒病的實時PCR定量檢測技術?？傊壳胺肿由锛夹g在 植物病害診斷鑒定領域已經(jīng)廣泛應用，不少重要的植物病害的分子檢測技術都已建立。但 迄今為止，國內(nèi)外還未見有關核地杖菌DNA特異保守序列（或基因）的發(fā)現(xiàn)及桑植縮小型 菌核病分子快捷診斷鑒定方法的研究報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速診斷桑植縮小型菌核病的方法。 申請人:通過研 究桑植菌核病病原核地杖菌DNA，篩選出適合的基因CS23進行RATO擴增，獲得了 590bp的 核地杖菌特異性保守序列（SCAR序列，見序列表及實施例），由此設計和篩選出一對能有效 擴增該保守序列的特異性SCAR引物（SSF/SSR)，再通過幾個重要PCR因子的優(yōu)化，建立了核 地杖菌的SCAR-PCR體系和技術，測試明確技術的靈敏度，并通過桑園采集的田間樣品測試 檢驗技術的實用性和可靠性。
[0007] 本發(fā)明所述的一種用分子生物技術快速診斷桑植縮小型菌核病的方法，通過W下 步驟實現(xiàn)： (1) 取待測樣品，采用CTAB方法從樣品中提取總DNA ; (2) 利用5Wbp的核地杖菌特異性保守序列設計并篩選得到核地杖菌的一對特異 性 SCAR-PCR 引物，引物正向序列 SS-F 為 5' - AGTAAAGAGAACATCAAACTTCG -3'，位于特異 序列的8 bp-30 bp;反向序列SS-R為5'- ACTTCCACCGACCA ATCT -3'，位于特異序列的 580bp-596bp ； (3) 進行 PCR 擴增，擴增體系為；2.5yL lOXPCRBuffer; 2.25yLMg2+(25mmol/ 1);2.5111(1饑？3(2.5111111〇1/1);0.625111引物55斗/55-尺（1011111〇1/1);川1模板（10叫/ y L) ;0. 2U rTaq酶；dd&O補足至25 y L ;反應程序為；94°C預變性5min ;94°C變性30s ; 5(TC退火30s ;72°C延伸45s，循環(huán)35次；72°C補充延伸5min ;根據(jù)擴增條帶診斷桑植縮小 型菌核病。
[0008] 步驟（1)待測樣品為桑果、桑葉、桑莖、桑根及±壤樣品等。
[0009] 靈敏度測試表明，在25UL體系中，特異性引物SS-F / SS-R能從質(zhì)量濃度為 1 pg/uL及其W上的核地杖菌DNA模板中擴增出590 bp的特異性條帶，由此確定該 SCAR-PCR的檢測靈敏度為1 pg/yL。
[0010] 在田間樣測試試驗中，使用該SCAR-PCR技術檢測24個桑園田間樣品，只有從縮小 型病桑果提取的總DNA中擴增出了 SCAR-條帶序列，從健康桑果、桑葉、桑莖、桑根及±壤樣 品（注：其中含有不同的微生物或動植物殘體）總DNA中均未擴增到SCAR條帶，說明除了 縮小型桑果外，其它樣品均不帶核地杖菌。
[0011] 本發(fā)明的重要意義和價值.桑植縮小型菌核病是危害桑樹的重要植物病害，是限 制桑果產(chǎn)業(yè)穩(wěn)定發(fā)展的關鍵限制因子。本發(fā)明通過發(fā)現(xiàn)的病原核地杖菌特異性保守DNA序 列，獲得了特異性SCAR-PCR引物，建立了桑植縮小型菌核病SCAR-PCR診斷檢測技術。該技 術的靈敏度高，檢測靈敏度為1 異性強，使用方便快捷，檢測結果準確可靠，可用 于桑植縮小型菌核病的田間診斷和桑果帶菌情況檢測檢驗；同時還可用于病害潛伏期（已 侵染桑果但未顯癥）診斷，從而對病害做出早期預報，W及時實施必要的控制措施，安全有 效地防治病害的發(fā)生和危害，減輕或避免經(jīng)濟損失。同時，可用本發(fā)明技術研制開發(fā)桑植縮 小型菌核病診斷的商品試劑盒，具有一定的商業(yè)應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 本發(fā)明包含6幅顯示發(fā)明結果的圖，分別為： 圖1.隨機引物CS23對不同供試菌株DNA的隨機擴增結果指紋圖.注：圖中M;DL2 000 DM marker;泳道1-5;核地杖菌不同菌株DM片斷的隨機擴增指紋；泳道6-14分別 是；桑實杯盤菌、肉阜狀杯盤菌、擬康寧木霉、蓋姆斯木霉、綠木霉、蟲毛狀木霉、鉤狀木霉、 油菜菌核病菌、灰霉DNA片斷隨機擴增指紋；白色線框內(nèi)為核地杖菌的特異性條帶。
[001引 圖2.核地杖菌SCAR-PCR檢測體系優(yōu)化電泳圖.注;M ;DL2 000 DNA marker; A 為退火溫度，泳道 1一7 分別為 60. 0、59. 4、58. 3、56. 3、53. 9、52、50. 7 和 50. 0°C ; B 為 Mg" 濃度，泳道 1-7 分別為 2. 5、2. 25、2、1. 75、1. 5、1. 25 和 1 mmol/L ;C 為 dNTPs 濃度，泳道 1- 7 分別為 025、0. 225、0. 2、0. 175、0. 15、0. 125 和 0. 1 mmol/L ;D 為引物濃度；泳道 1一7 分別 為 0. 35、0. 3、0. 25、0. 2、0. 15、0. 1 和 0. 05 y mol/L ;E 為 rTaq 酶用量，泳道 1-7 分別為 2、 1. 75、1. 5、1. 25、1、0. 75 和 0.抓。
[0014] 圖3.用SCA巧I物SS-F/SS-R PCR擴增核地杖菌及相關真菌DNA電泳圖.注： M ;DL2 000 DNA marker ;泳道1-5 ;核地杖菌擴增結果；泳道6-14分別是；桑實杯盤菌、 肉阜狀杯盤菌、擬康寧木霉、蓋姆斯木霉、綠木霉、蟲毛狀木霉、鉤狀木霉、油菜菌核病菌、灰 霉；泳道15 ;陰性對照。
[0015] 圖4.引物檢測核地杖菌DNA靈敏度檢測電泳圖.注;M ;DL2 000 DNA marker ;泳 道 1-8 ;分別是在 25 Ml 的體系中含有 10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、l^DNA 量的擴增結果。
[001引 圖5.桑田樣本的SCAR-PCR檢測結果電泳圖.注;M;DL2 000 DNA marker ;泳道 1 ;陽性對照；泳道2 ;陰性對照；泳道3-4 ;花期桑植；泳道5 ;服大的病果；泳道6 ;縮小的 病果；泳道7 ;服大的病果；泳道8 ;桑樹根；泳道9-10 ;桑樹莖；泳道11-12 ;桑樹葉；泳 道13 - 24 ;隨機采集的±樣；泳道25- 26:核地杖菌接種2天后未顯癥的桑果。
[0017] 圖6.用SCAR-PCR檢測桑田樣本核地杖菌的結果電泳圖.注；M ;DL2 000 DNA marker ;泳道1 ;陽性對照；泳道2 ;陰性對照；泳道3 -10 ;縮小的病果；泳道11 一 18 ;服大 的病果

【具體實施方式】 供試菌株.用于尋找核地杖菌DNA中SCAR序列的供試菌株共17株，其中核地杖菌5 株，其它桑植菌核病病原菌2株，桑植菌核病菌核寄生菌5株，其它相關植物致病菌2株（表 1)。該些菌株分別從不同類型的菌核病病桑果分離純化而獲得。
[0018] 表1分離桑園系統(tǒng)并用于特異性引物篩選的供試真菌菌株

【權利要求】
1. 一種快速診斷桑椹縮小型菌核病的方法，其特征在于通過以下步驟實現(xiàn)： (1) 取待測樣品，采用CTAB方法從樣品中提取總DNA; (2) 利用590bp的核地杖菌特異性保守序列設計并篩選得到核地杖菌的一對特異 性SCAR-PCR引物，引物正向序列SS-F為 5' -AGTAAAGAGAACATCAAACTTCG-3'，位于特異 序列的8bp-30bp;反向序列SS-R為5'-ACTTCCACCGACCAATCT-3'，位于特異序列的 580bp-596bp； (3) 進行PCR擴增，擴增體系為：2. 5iiL10XPCRBuffer; 2. 25iiLMg2+，濃度為 25mmol/L; 2. 5iiLdNTPs，濃度為 2. 5mmol/L;0? 625iiL引物SS-F/SS-R，濃度為 10iimol/ L;luL模板，濃度為10ng/iiL;0. 2UrTaq酶；ddH20補足至25iiL;反應程序為：94°C預變 性5min;94°C變性30s; 50°C退火30s;72°C延伸45s，循環(huán)35次；72°C補充延伸5min;根 據(jù)擴增條帶診斷桑椹縮小型菌核病。
【文檔編號】C12R1/645GK104513860SQ201510012942
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2015年1月12日 優(yōu)先權日:2015年1月12日
【發(fā)明者】譚萬忠, 吳舒劼, 蘇正川, 余洋, 畢朝位, 楊宇衡 申請人:西南大學