乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀dna檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA，包括盒體(1)、位于盒體(1)內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊(2)包括第一層襯墊，所述第一層襯墊上設(shè)有至少有8個容器孔(3)，所述容器孔(3)分別設(shè)置有：PSAD反應(yīng)試劑1管、特異性擴增HBV cccDNA引物5管、BstDNA聚合酶1管、LAMP反應(yīng)緩沖液1管。本試劑盒試劑盒使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，無需PCR儀器或?qū)ｉT的儀器設(shè)備，所采用的引物及試劑用于擴增HBV cccDNA特異性高、敏感性強，擴增后易于判斷，且操作簡便靈活，易于掌握；該試劑盒設(shè)計合理、操作方便，易于推廣。
【專利說明】乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA檢測試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型涉及HBV DNA【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種乙型肝炎病毒檢測試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]HBV cccDNA是乙型肝炎共價閉合環(huán)狀DNA，檢測HBV cccDNA用途主要用來作為評價抗HBV療效的或臨床治療終點，以及評價HBV感染狀態(tài)及傳染性參考依據(jù)。
[0003]目前臨床應(yīng)用最多的檢測乙肝病毒的指標是血清中HBVDNA的檢測，但是許多臨床和實驗研究表明，一些乙肝病人應(yīng)用抗病毒藥物治療后血液檢查HBV DNA雖然已經(jīng)呈陰性，但是肝組織炎癥活動度并未緩解，還有部分患者出現(xiàn)耐藥而導(dǎo)致反跳現(xiàn)象，這是因為患者病毒復(fù)制的“老巢(HBV cccDNA池)”并未被清除，因此檢測HBV cccDNA是評價抗HBV療效的或臨床治療終點的一項重要標準，也是評價HBV感染狀態(tài)及傳染性的客觀指標。目前還沒有國家批準的穩(wěn)定可靠的的敏感的HBV cccDNA檢測試劑盒用于臨床，用于研究用的HBVcccDNA定量檢測試劑盒有熒光定量PCR試劑盒、滾環(huán)擴增聯(lián)合熒光定量試劑盒，用于定性檢測的試劑盒有DNA印記雜交(southern)試劑盒?，F(xiàn)有技術(shù)中檢測HBV cccDNA的試劑盒操作起來較為繁瑣，使用起來很不方便，而且這些試劑盒內(nèi)的試劑儲存的時間較短，長時間儲存后試劑盒內(nèi)的熒光會減弱，從而會導(dǎo)致檢測結(jié)果的不準確。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本實用新型提供一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA檢測試劑盒，使檢測HBV cccDNA的過程更為便捷，并可直觀的判斷出檢測的結(jié)果，不需要設(shè)備輔助，同時該試劑盒內(nèi)的試劑不會因長時間的儲存而使檢測結(jié)果不準確。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本實用新型提供一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA檢測試劑盒，包括盒體、位于盒體內(nèi)的襯墊，所述襯墊包括第一層襯墊，所述第一層襯墊上至少設(shè)有8個容器孔，所述容器孔中分別放置有:PSAD反應(yīng)試劑I管、特異性擴增HBV cccDNA引物5管、BstDNA聚合酶I管、LAMP反應(yīng)緩沖液I管。
[0006]在該技術(shù)方案中，通過上述PSAD反應(yīng)(質(zhì)粒安全的ATP依賴性DNA酶)試劑的設(shè)置，可以快速地除去樣本DNA中部分非HBV cccDNA的影響，從而相對地保證樣本DNA中模板DNA的純度，能夠提高檢測的特異性。
[0007]進一步，所述襯墊還包括第二層襯墊，所述第二層襯墊設(shè)置有至少24個樣本孔，所述樣本孔對應(yīng)設(shè)置有樣本反應(yīng)管。
[0008]在該技術(shù)方案中，通過第二層襯墊的設(shè)置，可以使HBV cccDNA檢測過程更加便捷。
[0009]進一步，所述容器孔中還設(shè)置有去離子水I管。
[0010]在該技術(shù)方案中，通過設(shè)有去離子水，可以方便去相應(yīng)試劑進行稀釋，從而方便了檢測操作過程。
[0011]進一步，所述襯墊還包括第三層襯墊，所述第一層襯墊上的容器孔為沿其厚度方向的非貫穿孔，所述第二層襯墊上的樣本孔為沿其厚度方向的貫穿孔，所述第二層襯墊設(shè)置在第一層襯墊的下方，所述第三層襯墊設(shè)置在第二層襯墊下方、且具有與第二層襯墊上樣本孔的位置及數(shù)量相匹配的凹槽。
[0012]在該技術(shù)方案中，通過第三層襯墊的設(shè)置，可以方便將第二層襯墊上的樣本反應(yīng)管底部放入凹槽內(nèi)，從而能使便于對樣本反應(yīng)管進行固定，使樣本反應(yīng)管不會傾斜，尤甚是在試劑盒移動時能對樣本反應(yīng)管起到很好的保護作用；另外該第三層襯墊可以作為樣本反應(yīng)管的架子使用，這樣在操作時不需要另外尋找放置樣本反應(yīng)管的架子，也不需要逐一地將樣本反應(yīng)管取出，可以直接將第二層襯墊、第三層襯墊連同上面的樣本反應(yīng)管一起取出，即方便了操作、又能有效防止樣本發(fā)生污染；還可使第一層襯墊上的試劑管和第二層上的樣本反應(yīng)管處于兩個獨立的空間內(nèi)，使其不相接觸；使第一層襯墊放在最上層，這樣可以使冷凍儲存的試劑盒在使用時，其中的試劑可以在室溫下進行快速的溶解。
[0013]進一步，所述樣本孔的孔距和所述凹槽的的槽距均與金屬浴孔距一致。
[0014]在該技術(shù)方案中，通過使樣本孔的孔距和凹槽的的槽距均與金屬浴上的孔距一致，這樣當樣本反應(yīng)管中加完樣本和試劑后，可以直接將放有樣本反應(yīng)管的第二塊襯墊放入金屬浴或水浴鍋中進行反應(yīng)，從而方便了操作過程。
[0015]進一步，所述特異性擴增HBV cccDNA弓丨物包括一對內(nèi)引物FIP和BIP、一對外弓I物B3和F3、一條環(huán)狀引物L(fēng)oopB。
[0016]在該技術(shù)方案中，通過使用上述5種特異性擴增HBV cccDNA引物進行檢測，可以使HBVcccDNA檢測結(jié)果直觀的顯現(xiàn)出來，使檢測人員通過目測就可以判斷出HBV cccDNA檢測結(jié)果，而且上述5種特異性擴增HBV cccDNA引物容易保存，在長期保存后也不會降低檢測結(jié)果的準確性。
[0017]本試劑盒將試劑管、樣本反應(yīng)管、樣本反應(yīng)管管架(由第二層襯墊與第三層襯墊組成)放置同一試劑盒內(nèi)，使檢測的操作很簡便，同時又能防止樣本發(fā)生污染而引起的檢測特異性下降，在操作結(jié)束可以直接將樣本反應(yīng)管連同第二層襯墊一起銷毀，進而避免了環(huán)境的污染，第三塊襯墊所示設(shè)有凹槽既可以固定樣本反應(yīng)管，又可以與第二層襯墊一起構(gòu)成樣本反應(yīng)管架，還可以拆卸，第二層襯墊的作用不但可以用作樣本架，還可以直接將第二層襯墊與樣本反應(yīng)管一起放入金屬浴或水浴鍋中進行擴增反應(yīng)，不用將反應(yīng)管逐一取出放入金屬浴或水浴鍋中，省卻了操作步驟，節(jié)約了操作時間，而且檢測的樣本的數(shù)量可根據(jù)需要靈活地進行選擇。
[0018]本試劑盒使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，無需PCR儀器或?qū)ｉT的儀器設(shè)備，所采用的引物及試劑用于擴增HBV cccDNA特異性高、敏感性強，擴增后易于判斷，且操作簡便靈活，易于掌握；該試劑盒設(shè)計合理、操作方便，易于推廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為本實用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020]圖中:1、盒體，2、襯墊，3、容器孔，4、樣本孔，5、凹槽，6、樣本反應(yīng)管。

【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合附圖對本實用新型作進一步說明。
[0022]文中提到的PSAD反應(yīng)試劑、特異性擴增HBV cccDNA引物、BstDNA聚合酶、LAMP反應(yīng)緩沖液在儲存時均單獨地裝在試劑管中。
[0023]如圖1所示，一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA(HBV cccDNALAMP)檢測試劑盒，包括盒體1、位于盒體I內(nèi)的襯墊2，所述襯墊2包括第一層襯墊，所述第一層襯墊上至少設(shè)有8個容器孔3，所述容器孔3中分別放置有:PSAD反應(yīng)試劑I管、特異性擴增HBV cccDNA引物5管、BstDNA聚合酶I管、LAMP反應(yīng)緩沖液I管。
[0024]在該實施方式中，通過上述PSAD反應(yīng)(質(zhì)粒安全的ATP依賴性DNA酶)試劑的設(shè)置，可以快速地除去樣本DNA中部分非HBV cccDNA的影響，從而相對地保證樣本DNA中模板DNA的純度，能夠提高檢測的特異性。
[0025]所述襯墊2還包括第二層襯墊，所述第二層襯墊設(shè)置有至少24個樣本孔4，所述樣本孔4對應(yīng)設(shè)置有樣本反應(yīng)管6。
[0026]在該實施方式中，通過第二層襯墊的設(shè)置，可以使HBV cccDNA檢測過程更加便捷。
[0027]所述容器孔3中還設(shè)置有去離子水I管。
[0028]在該實施方式中，通過設(shè)有去離子水，可以方便去相應(yīng)試劑進行稀釋，從而方便了檢測操作過程。
[0029]所述襯墊2還包括第三層襯墊，所述第一層襯墊上的容器孔3為沿其厚度方向的非貫穿孔，所述第二層襯墊上的樣本孔4為沿其厚度方向的貫穿孔，所述第二層襯墊設(shè)置在第一層襯墊的下方，所述第三層襯墊設(shè)置在第二層襯墊下方、且具有與第二層襯墊上樣本孔4的位置及數(shù)量相匹配的凹槽5。
[0030]在該實施方式中，通過第三層襯墊的設(shè)置，可以方便將第二層襯墊上的樣本反應(yīng)管6底部放入凹槽5內(nèi)，從而能便于對樣本反應(yīng)管6進行固定，使樣本反應(yīng)管6不會傾斜，尤甚是在試劑盒移動時能對樣本反應(yīng)管6起到很好的保護作用；另外該第三層襯墊可以作為樣本反應(yīng)管6的架子使用，這樣在操作時不需要另外尋找放置樣本反應(yīng)管6的架子，也不需要逐一地將樣本反應(yīng)管6取出，可以直接將第二層襯墊、第三層襯墊連同上面的樣本反應(yīng)管6 —起取出，即方便了操作、又能有效防止樣本發(fā)生污染；還可使第一層襯墊上的試劑管和第二層上的樣本反應(yīng)管6處于兩個獨立的空間內(nèi)，使其不相接觸；使第一層襯墊放在最上層，這樣可以使冷藏儲存的試劑盒在使用時，其中的試劑可以在室溫下進行快速的溶解。
[0031]所述樣本孔4的孔距和所述凹槽5的的槽距均與金屬浴孔距一致。
[0032]在該實施方式中，通過使樣本孔的孔距和凹槽5的的槽距均與金屬浴孔距一致，這樣當樣本反應(yīng)管6中加完樣本和試劑后，可以直接將放有樣本反應(yīng)管6的第二塊襯墊放入金屬浴或水浴鍋中進行反應(yīng)，從而方便了操作過程。
[0033]所述特異性擴增HBV cccDNA引物包括一對內(nèi)引物FIP和BIP、一對外引物B3和F3、一條環(huán)狀引物L(fēng)oopB。
[0034]在該實施方式中，通過使用上述5種特異性擴增HBV cccDNA引物進行檢測，可以使HBVcccDNA檢測結(jié)果直觀的顯現(xiàn)出來，使檢測人員通過目測就可以判斷出HBV cccDNA檢測結(jié)果，而且上述5種特異性擴增HBV cccDNA引物容易保存，在長期保存后也不會降低檢測結(jié)果的準確性。
[0035]試劑盒使用時，將第一層襯墊上的PSAD反應(yīng)(質(zhì)粒安全的ATP依賴性DNA酶)試劑取出，該PSAD反應(yīng)試劑是一種混合液(含有10Xbuffer、ATP、PSAD酶)，將PSAD反應(yīng)試劑在室溫下溶解后混勻，取3.2ulPSAD反應(yīng)試劑和6.8ul樣本DNA計1ul體積，分別加入第二層襯墊中選定的樣本反應(yīng)管6中，吹打混勻后,將第二層襯墊連同選定的樣本反應(yīng)管6一起放在金屬浴或恒溫水浴鍋進行反應(yīng)，設(shè)定溫度為37°C的條件下反應(yīng)30分鐘后，再將溫度設(shè)定為70°C再使其反應(yīng)10分鐘，這樣就完成了 PSAD酶的消化反應(yīng)，從而就能去除了非HBV cccDNA的影響，從而相對地保證樣本DNA中模板DNA的純度，提高檢測的特異性。
[0036]然后直接向選定的樣本反應(yīng)管6中加入20U1LAMP反應(yīng)緩沖液(環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)混合液)，該LAMP反應(yīng)緩沖液是一種混合液、其包括2 Xbuffer1ul (含dNTP、Tris-HCL、KCL、MgS04、(NH4) 2S04、Tween20、Betaine 混合液)，然后再加入稀釋后的 5 條引物(一對內(nèi)引物FIP和BIP、一對外引物B3和F3、一條環(huán)狀引物L(fēng)oopB)各lul、BstDNA聚合酶lul、去離子水4ul，使總計體積為30ul，吹打混勻后彈去氣泡直接將第二層襯墊連同樣本反應(yīng)管6放入金屬浴或恒溫水浴鍋(最好是金屬浴，其加熱速度快，操作相對方便，且在擴增結(jié)束反應(yīng)過程中樣本反應(yīng)管6外壁無水潰，便于觀察)63°C恒溫反應(yīng)30-60分鐘，再在80°C條件下反應(yīng)5分鐘，陽性者反應(yīng)管會呈現(xiàn)混濁不透明狀態(tài)，陰性則為透明狀態(tài)，從而能通過目測判斷出檢測結(jié)果。
[0037]本試劑盒將試劑管、樣本反應(yīng)管6、樣本反應(yīng)管6管架(由第二層襯墊與第三層襯墊組成)放置同一試劑盒內(nèi)，使檢測的操作很簡便，同時又能防止樣本發(fā)生污染而引起的檢測特異性下降，在操作結(jié)束可以直接將樣本反應(yīng)管6連同第二層襯墊一起銷毀，進而避免了環(huán)境的污染，第三塊襯墊所示設(shè)有凹槽5既可以固定樣本反應(yīng)管6，又可以與第二層襯墊一起構(gòu)成樣本反應(yīng)管6架，還可以拆卸，第二層襯墊的作用不但可以用作樣本架，還可以直接將第二層襯墊與樣本反應(yīng)管6 —起放入金屬浴或水浴鍋中進行擴增反應(yīng)，不用將反應(yīng)管逐一取出放入金屬浴或水浴鍋中，省卻了操作步驟，節(jié)約了操作時間，而且檢測的樣本的數(shù)量可根據(jù)需要靈活地進行選擇。
[0038]本試劑盒中的引物是針對HBV cccDNA與HBV DNA結(jié)構(gòu)的差別，使用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增引物設(shè)計軟件設(shè)計的特異性擴增HBV cccDNA引物，針對HBV cccDNA基因6個區(qū)段設(shè)計引物共5條，分5管分裝，分別是一對內(nèi)引物FIP和BIP，一對外引物B3和F3，以及一條環(huán)狀引物L(fēng)oopB。
[0039]本試劑盒進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增HBV cccDNA,使用的是環(huán)介導(dǎo)擴增專用的BstDNA聚合酶和LAMP (環(huán)介導(dǎo)擴增)反應(yīng)緩沖液環(huán)介導(dǎo)擴增反應(yīng)緩沖液，本試劑盒配備BstDNA聚合酶I管、LAMP(環(huán)介導(dǎo)擴增)反應(yīng)緩沖液I管，使用本試劑盒中的引物進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增能相對特異性地擴增HBV cccDNA片段，無需PCR儀器或?qū)ｉT的儀器設(shè)備，所采用的引物及試劑用于擴增HBV cccDNA特異性高、敏感性強，擴增后易于判斷，且操作簡便靈活，易于掌握；在DNA擴增的同時會出現(xiàn)衍生物焦磷酸鎂呈白色混濁物，根據(jù)有無焦磷酸鎂的產(chǎn)生，即可判斷出有無HBV cccDNA的擴增，是否為陽性，該試劑盒設(shè)計合理、操作方便，尤其方便那些缺少PCR儀器的基層醫(yī)院使用，易于推廣。
【權(quán)利要求】
1.一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA檢測試劑盒，包括盒體(I)、位于盒體(I)內(nèi)的襯墊(2)，其特征在于，所述襯墊(2)包括第一層襯墊，所述第一層襯墊上至少設(shè)有8個容器孔(3)，所述容器孔(3)中分別放置有:PSAD反應(yīng)試劑I管、特異性擴增HBV cccDNA引物5管、BstDNA聚合酶I管、LAMP反應(yīng)緩沖液I管。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA檢測試劑盒，其特征在于，所述襯墊(2)還包括第二層襯墊，所述第二層襯墊設(shè)置有至少24個樣本孔(4)，所述樣本孔(4)對應(yīng)設(shè)置有樣本反應(yīng)管(6)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA檢測試劑盒，其特征在于，所述容器孔(3)中還設(shè)置有去離子水I管。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA檢測試劑盒，其特征在于，所述襯墊(2)還包括第三層襯墊，所述第一層襯墊上的容器孔(3)為沿其厚度方向的非貫穿孔，所述第二層襯墊上的樣本孔(4)為沿其厚度方向的貫穿孔，所述第二層襯墊設(shè)置在第一層襯墊的下方，所述第三層襯墊設(shè)置在第二層襯墊下方、且具有與第二層襯墊上樣本孔(4)的位置及數(shù)量相匹配的凹槽(5)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA檢測試劑盒，其特征在于，所述樣本孔(4)的孔距和所述凹槽(5)的的槽距均與金屬浴上的孔距一致。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種乙型肝炎病毒共價閉合環(huán)狀DNA檢測試劑盒，其特征在于，所述特異性擴增HBV cccDNA弓丨物包括一對內(nèi)引物FIP和BIP、一對外引物B3和F3、一條環(huán)狀引物L(fēng)oopB。
【文檔編號】C12M1/00GK204079960SQ201420514086
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月5日
【發(fā)明者】周冬青, 張克球, 劉加彬, 王春穎, 王驥, 楊友國, 李 瑞, 劉成永, 黃海濱, 成松, 季洪斌, 季昊坤 申請人:徐州市傳染病醫(yī)院