一種菌核側耳新菌種及其栽培方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種菌核側耳新菌種及其栽培方法和應用。所述菌核側耳新菌種為菌核側耳(Lentinus tuber-regium)GIM-L-001，保藏編號為CCTCC NO.M2014392。菌核側耳CCTCC M2014392的栽培方法包括將菌種菌核側耳CCTCC NO.M2014392的栽培種接入栽培袋中，栽培培養(yǎng)并管理采收。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供一種菌核側耳新菌種，該菌種來自于廣州帽峰山闊葉林中腐木上，并且還提供了相應的人工栽培方法及相應的應用。該菌核側耳新菌種具有抑菌活性，豐富了菌種品種，具有很好的社會效益。CCTCC NO:M201439220140826
【專利說明】-種菌核側耳新菌種及其栽培方法和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種菌核側耳新菌種及其栽培方法和應用。

【背景技術】
[0002] 菌核側耳，又稱虎奶菇，核耳菇，茯苓側耳，日本人稱南洋茯苓，為藥食 兼用菇，典型的高溫型食藥用菌，按照最新的分類系統(tǒng)，其拉丁學名為Lentinus tuber_regium(Fr· )Fr.，隸屬于 Basidiomycota(擔子菌門），Agaricomycotina(傘菌亞 門），Agaricomycetes (傘菌綱），Polyporales (多孔菌目），Polyporaceae (多孔菌科）， Lentinus(香菇屬），為具菌核真菌，與茯苓（子實體不可食）、豬苓（菌核不可食）不同，其 子實體與菌核都可食用。菌核側耳為熱帶真菌，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，云南，海南， 廣東等地,生長于倒木或腐木樁或樹根處。
[0003] 據相關記載，民間多使用菌核側耳的菌核治療胃病、便秘、發(fā)燒、感冒、水腫、胸痛、 痔瘡、神經系統(tǒng)疾病、天花、哮喘、糖尿病、冠心病、高血壓、腫瘤等疾病,及用于營養(yǎng)失調的 嬰孩。目前，關于菌核側耳菌種方面的研究多為虎奶菇菌核，而關于菌核側耳專利申請主要 是關于以菌核側耳為材料或添加劑制成的保健品及藥品，或者已有菌核側耳菌種（如虎奶 菇）的栽培方法。本申請是在廣州帽峰山闊葉林中腐木上發(fā)現并分離的新菌種，經研究，未 見關于該菌種的研究報道。


【發(fā)明內容】

[0004] 針對以上不足，本發(fā)明提供一種新的菌核側耳菌種。
[0005] 本發(fā)明的菌核側耳新菌種分離自廣州帽峰山闊葉林中腐木上，經形態(tài)學和分子生 物學鑒定為菌核側耳新菌種，并通過對子實體部分進行組織分離獲得原始菌株，命名為菌 核側耳（Lentinus tuber-regium)GIM_L-〇01，已于2014年8月26日保藏于中國典型培 養(yǎng)物保藏中心（簡稱CCTCC，地址為：武漢市洪山區(qū)八一路武漢大學），保藏編號為CCTCC NO. M2014392。
[0006] 本發(fā)明還提供了上述的菌核側耳CCTCC M2014392的栽培方法，包括將菌種菌核側 耳CCTCC NO. M2014392的栽培種接入栽培袋中，栽培培養(yǎng)并管理采收。
[0007] 進一步的，上述菌核側耳新菌種的栽培方法具體包括：
[0008] -種菌核側耳新菌種的栽培方法，將栽培料裝入聚乙烯折角袋中得到栽培袋，套 上塑料頸圈和蓋子，滅菌，待栽培料溫度下降至30°C以時下接入栽培種，轉移至28°C -30°C 室內培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌絲長滿栽培袋時（此過程約50天左右），去掉塑料頸圈和蓋子，調節(jié) 濕度至88% -85%，光照100-2001ux，通氣，至長出子實體（此過程約需要30天左右），所 述栽培料的原料組成按質量百分比計為木屑78-80%、麩皮18-20%、CaC0 3l-2%，含水量 70-75%。
[0009] 進一步的，上述菌核側耳菌種CCTCC NO. M2014392的栽培種的制備步驟包括：組 織分離菌種后制作母種，制作原種，制作栽培種。
[0010] 進一步的，上述菌核側耳菌種CCTCC NO. M2014392的栽培種的制備步驟具體包 括：
[0011] (1)制作母種：采集組織分離的菌種菌核側耳CCTCC NO. M2014392,將菌種無菌接 至改良PDA斜面，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，直至菌絲長滿斜面即得母種，其中所述改良 PDA斜面的配方按質量百分比計為馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0. 15%、 硫酸鎂0.05%、維生素 Bl微量、酸水解酪蛋白1%，其余為水；
[0012] (2)制作原種：將母種無菌接入原種瓶中，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，至菌絲吃 滿料后即得原種，其中原種料的原料組成按質量百分比計為高粱98%、CaC0 32%、含水量 60 %，將所述原種料裝入玻璃瓶中，制得原種瓶；
[0013] (3)制作栽培種：將原種無菌接入栽培種袋中，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，至 菌絲吃滿料后即得栽培種，其中栽培種料的原料組成按質量百分比計為棉籽殼73%、麩皮 25 %、CaC032 %，含水量65 %，將所述栽培種料裝入折角袋中，蓋上食用菌套環(huán)，制得栽培種 袋。
[0014] 該菌核側耳CCTCC M2014392的子實體具有以下的形態(tài)特征：
[0015] 子實體群生于腐木上，革質，干后易碎，菌蓋漏斗狀，直徑7-13cm，表面黃褐色， 被有密生短絨毛，中部顏色稍淡，老熟后蓋緣成波浪狀，部分裂開，菌肉白色，堅硬，極薄， l-2mm，菌褶茶褐色，延生，極密，褶幅窄，菌柄中生，長8-15cm，下粗上細，上部1-1. 5cm，下 部l-2cm，黃褐色，密生短絨毛。孢子印白色，孢子在光學顯微鏡下無色，透明，孢子橢圓形， 3. 1-5. 83 X 6. 57-8. 93 μ m〇
[0016] 經分子生物學測定其ITS分子序列（Genbank登記號：KM405793)的分析結果為 Lentinustuber-regium(Fr.)Fr.。結合ITS分子序列比對結果和形態(tài)學觀察，與現有的菌 核側耳菌種相似度最高達到99%，但是仍存在差異，且該菌種野外分離子實體和人工馴化 得到的子實體都與已有文獻記載的子實體存在差異，此菌種的野外子實體老熟后蓋緣波浪 狀，有裂紋，且擔孢子稍大，出菇子實體菌柄和菌蓋有部分顆粒狀鱗片，與現有文獻記載的 所有菌核側耳的子實體性狀都不同，因而為菌核側耳新菌種。
[0017] 本發(fā)明還提供上述菌核側耳新菌種（菌核側耳CCTCC M2014392)在制備抑菌藥物 中的應用。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供一種菌核側耳新菌種，該菌種來自于廣州帽峰 山闊葉林中腐木上，并且還提供了相應的人工栽培方法及相應的應用。該菌核側耳新菌種 具有抑菌活性，豐富了菌種品種，具有很好的社會效益。

【具體實施方式】
[0019] 以下結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明。
[0020] 實施例1 :
[0021] 菌核側耳新菌種，分離自廣州帽峰山闊葉林中腐木上，經形態(tài)學和分子生物學鑒 定為菌核側耳新菌種，通過對子實體部分進行組織分離獲得原始菌株，命名為菌核側耳 (Lentinus tuber-regium)GM-L-001，已于2014年8月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中 心（簡稱CCTCC，地址為：武漢市洪山區(qū)八一路武漢大學），保藏編號為CCTCC N0.M2014392。
[0022] 該菌核側耳菌種CCTCC M2014392的特點是：生長速度快，12天左右菌絲即可覆滿 試管（18\180臟)，菌絲生長溫度15-401：，最適生長溫度28-301：，菌絲生長？!15.5-7，最 適 pH 6· 5。
[0023] 實施例2
[0024] 菌核側耳菌種CCTCC Μ2014392的栽培種的制備方法：
[0025] (1)制作母種：采集組織分離的菌種菌核側耳CCTCC NO. Μ2014392,將菌種無菌接 至改良PDA斜面，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，直至菌絲長滿斜面即得母種，這一過程大約 12天左右，菌絲生長情況為：菌絲白色，濃密，不形成棒狀結構及子實體；
[0026] 其中所述改良PDA斜面的配方按質量百分比計為馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂 2%、磷酸二氫鉀0. 15%、硫酸鎂0.05%、維生素 Bl微量、酸水解酪蛋白1 %，其余為水；
[0027] (2)制作原種：將母種無菌接入原種瓶中，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，至菌絲吃 滿料后即得原種，生長周期約為25-30天；
[0028] 其中原種料的原料組成按質量百分比計為高粱98 %、CaC032 %、含水量60 %，將所 述原種料裝入玻璃瓶中，制得原種瓶；121°C高壓滅菌25min，冷卻后使用；
[0029] (3)制作栽培種：將原種無菌接入栽培種袋中，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，至菌 絲吃滿料后即得栽培種，這一過程約需30-40天；
[0030] 其中栽培種料的原料組成按質量百分比計為棉籽殼73%、麩皮25%、CaC032%， 含水量65%，將所述栽培種料裝入折角袋（15*35cm)中，蓋上食用菌套環(huán)，制得栽培種袋，， 128°C條件下滅菌120min，冷卻后使用。
[0031] 實施例3
[0032] 菌核側耳菌種CCTCC M2014392的栽培方法：
[0033] 將栽培料按照比例混勻后裝入17*35cm聚乙烯折角袋中，得到栽培袋，使用打孔 器打孔10cm，套上塑料頸圈和蓋子，使用高壓蒸汽滅菌鍋，I. 5kg/cm2滅菌2小時，滅菌結束 后待栽培料冷卻到30°C以下接入栽培種，轉移至28°C _30°C室內培養(yǎng)，大約培養(yǎng)50天左右， 菌絲長滿栽培袋，去掉塑料頸圈和蓋子，調節(jié)濕度至88 % -85 %，光照100-2001uX，及時通 氣，約30天左右即可形成子實體，采摘。
[0034] 栽培料的原料組成按質量百分比計為木屑78-80%、麩皮18-20%、CaC03l_2%，含 水量 70-75%。
[0035] 實施例4
[0036] 1、菌核側耳菌種CCTCC M2014392的保藏
[0037] 試驗證實，菌核側耳菌種CCTCC M2014392適合于在改良PDA培養(yǎng)基（添加了酸水 解酪蛋白的PDA培養(yǎng)基）中保存，8-10°C冰箱中避光保存，改良PDA培養(yǎng)基的配方為按質量 百分比計為馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0. 15%、硫酸鎂0. 05%、維生素 Bl微量、酸水解酪蛋白1%，其余為水。
[0038] 2、菌核側耳菌種CCTCC M2014392的保藏的培養(yǎng)基的比較：
[0039] 通過采用四種培養(yǎng)基進行試驗，發(fā)現改良PDA培養(yǎng)基最適合于菌核側耳菌種 CCTCC M2014392的保藏，按質量百分比計為，四種培養(yǎng)基配方分別為：
[0040] 改良PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0. 15%、硫酸鎂 0.05%、維生素 Bl微量、酸水解酪蛋白1%，其余為水；
[0041] 普通PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20 %、葡萄糖2%、瓊脂2 %、磷酸二氫鉀0. 15 %、硫酸鎂 0.05%、維生素 BI微量，其余為水；
[0042] 加富PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0. 15%、硫酸鎂 0. 05%、蛋白胨1. 2%、維生素 Bl微量，其余為水；
[0043] MMN培養(yǎng)基：氯化鈉0. 0025 %，葡萄糖1 %，磷酸二氫鉀0. 05 %，麥芽浸粉0. 3 %， 維生素 B10. 00001 %，氯化鈣0. 005%，磷酸氫二銨0. 025%，氯化鐵0. 0012%，七水硫酸鎂 0. 015%，其余為水，pH5. 8。
[0044] 試驗結果：改良PDA培養(yǎng)基不利于菌核及子實體的形成，但菌絲生長濃密，而且能 較深地生長到培養(yǎng)基內部，因此，最適合試管種的保藏；而普通PDA和加富PDA都形成了菌 核或子實體，而且菌絲生長較稀疏，MMN培養(yǎng)基生長速度慢且形成菌核，均不利于試管種的 保藏。
[0045] 實施例5
[0046] 菌核側耳菌種CCTCC M2014392的抑菌活性
[0047] 本實施例的所有實驗器具均在121°C條件下滅菌30min或紫外滅菌30min。
[0048] 1、制備發(fā)酵液培養(yǎng)基：發(fā)酵液培養(yǎng)基的配方按質量百分比計為黃豆粉2.0%、甘 露醇2. 5 %、酵母粉0. 1 %、磷酸二氫鉀0. 1 %、其余為水，按上述配方配制發(fā)酵液培養(yǎng)基，并 調節(jié)pH到7.0,分裝倒入三角瓶，于121 °C高壓滅菌30min后冷卻備用；
[0049] 2、接種及培養(yǎng)：取菌核側耳菌種CCTCC M2014392(試管斜面菌種）0. 5*0. 5cm大小 的菌絲塊4-5塊，無菌接入步驟1準備好的發(fā)酵液培養(yǎng)基中，于30°C，160rpm條件下避光振 蕩培養(yǎng)6d，培養(yǎng)完成。
[0050] 3、發(fā)酵液濃縮：
[0051] 將培養(yǎng)完成的發(fā)酵液經過抽濾,將菌絲體等固體物質過濾除去,得到濾液,然后使 用旋轉蒸發(fā)儀在60°C，75rpm條件下濃縮至無液體凝出，濃縮液按照1 :4的比例加入無水 乙醇，于4°C條件下靜置24h后取出，再次抽濾，得到的濾液再次使用旋轉蒸發(fā)儀在60°C， 75rpm條件下濃縮至無液體凝出，按照I :4的比例加入無水乙醇，于4°C條件下靜置24h后 取出，再次抽濾，得到的濾液使用旋轉蒸發(fā)儀在60°C，75rpm條件下濃縮至無液體凝出，得 到濃縮后的發(fā)酵液，冷卻后放4°C冰箱暫存?zhèn)溆?，該濃縮后的發(fā)酵液作為樣品1，然后取部 分該濃縮后的發(fā)酵液，經〇. 22微米濾膜過濾，得到過濾后的濃縮后的發(fā)酵液，作為樣品2。
[0052] 4、指示菌的制備：
[0053] 購買金黃色葡萄球菌（菌種編號ATCC6538,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），按照 使用說明進行培養(yǎng)，得到斜面菌種后再劃線轉接平板營養(yǎng)培養(yǎng)基（配方：蛋白胨1 %，牛肉 膏粉0. 3%，氯化鈉0. 5%，瓊脂粉1. 5%，pH7. 3)上，于37°C避光條件下培養(yǎng)24小時，加入 無菌水制成菌懸液，調節(jié)菌懸液濃度至l〇6cfu/ml即得，儲存至4°C冰箱備用。
[0054] 5、抑菌檢測：
[0055] 配制營養(yǎng)培養(yǎng)基，其配方為按照質量百分比計：牛肉膏粉0.3%、蛋白胨1%、氯化 鈉0. 5%、瓊脂粉1. 5%，其余為水，然后在121°C下高壓滅菌30min，待溫度降至50°C時取出 倒平板（直徑90mm)，待營養(yǎng)培養(yǎng)基凝固后使用加入步驟4準備好的菌懸液（濃度IO 6Cfu/ ml) 10微升，將菌懸液涂布均勻，然后將牛津杯（直徑5_)放置在培養(yǎng)基中間，最后分別加 入步驟2準備好的樣品1和樣品2,以及加入陰性對照樣品無菌水、加入陽性對照樣品青鏈 霉素（濃度：青霉素含量l〇〇U/ml，鏈霉素含量0. lmg/ml)，每個待檢樣品6次重復，于36°C 恒溫培養(yǎng)24小時后測量其抑菌圈。
[0056] 6、抑菌效果：測量抑菌圈直徑，得到結果如表1所示。
[0057] 表1 :各樣品的抑菌圈直徑
[0058]

【權利要求】
1. 一種菌核側耳新菌種，所述菌核側耳新菌種為菌核側耳（Lentinus tuber-regium) 6頂-1^001，保藏編號為0^0：勵.]\12014392。
2. -種如權利要求1所述的菌核側耳新菌種的栽培方法，其特征在于，包括將菌種菌 核側耳CCTCC N0.M2014392的栽培種接入栽培袋中，栽培培養(yǎng)并管理采收。
3. -種如權利要求2所述的菌核側耳新菌種的栽培方法，其特征在于，將栽培料裝入 聚乙烯折角袋中得到栽培袋，套上塑料頸圈和蓋子，滅菌，待栽培料溫度下降至30°C以時 下接入栽培種，轉移至28°C -30°C室內培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌絲長滿栽培袋時，去掉塑料頸圈和蓋 子，調節(jié)濕度至88 % -85 %，光照100-2001ux，通氣，至長出子實體，所述栽培料的原料組成 按質量百分比計為木屑78-80 %、麩皮18-20 %、CaC03l-2 %，含水量70-75 %。
4. 一種如權利要求2所述的菌核側耳新菌種的栽培方法，其特征在于，所述菌核側耳 菌種CCTCC NO. M2014392的栽培種的制備步驟包括：組織分離菌種后制作母種，制作原種， 制作栽培種。
5. -種如權利要求4所述的菌核側耳新菌種的栽培方法，其特征在于，所述菌核側耳 菌種CCTCC NO. M2014392的栽培種的制備步驟包括： (1) 制作母種：采集組織分離的菌種菌核側耳CCTCC NO. M2014392,將菌種無菌接至改 良PDA斜面，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，直至菌絲長滿斜面即得母種，其中所述改良PDA 斜面的配方按質量百分比計為馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%、磷酸二氫鉀0. 15%、硫酸 鎂0.05%、維生素B1微量、酸水解酪蛋白1%，其余為水； (2) 制作原種：將母種無菌接入原種瓶中，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，至菌絲吃滿料 后即得原種，其中原種料的原料組成按質量百分比計為高粱98 %、CaC032 %、含水量60 %， 將所述原種料裝入玻璃瓶中，制得原種瓶； (3) 制作栽培種：將原種無菌接入栽培種袋中，置于28°C培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，至菌絲吃 滿料后即得栽培種，其中栽培種料的原料組成按質量百分比計為棉籽殼73%、麩皮25%、 CaC032%，含水量65%，將所述栽培種料裝入折角袋中，蓋上食用菌套環(huán)，制得栽培種袋。
6. 如權利要求1所述的一種菌核側耳新菌種在制備抑菌藥物中的應用。
【文檔編號】C12N1/14GK104403952SQ201410809652
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月19日 優(yōu)先權日:2014年12月19日
【發(fā)明者】劉遠超, 胡惠萍, 吳麗霞, 曹仁潤, 黃龍花, 譚武平, 馮德龍 申請人:廣東省微生物研究所, 廣東粵微食用菌技術有限公司