兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別引物和鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種兔源豬瘟脾淋苗和牛源豬瘟細胞苗的鑒別引物和鑒別方法，本發(fā)明利用兔和牛線粒體具有種屬特異性的特點，篩選出特異性的4種引物序列，建立相應的PCR方法，鑒別方法如下：提取豬瘟疫苗樣品的DNA；PCR反應體系為25μL，各種成分為Buffer、dNTP、Mg2+、4種引物、Taq、樣品DNA，用雙蒸水補齊到25μL，進行PCR；取PCR反應產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察、照相和記錄，根據電泳結果與提供的標準圖譜對比，進行鑒別。本發(fā)明所述鑒別方法無需依賴深厚的專業(yè)背景，也無需借助昂貴的精密儀器，具有準確快捷、客觀公正、經濟實用的特點。
【專利說明】兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別引物和鑒別方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于獸用生物制品【技術領域】，涉及獸用生物制品【技術領域】鑒別的引物和鑒別方法，具體涉及兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別引物和鑒別方法。

【背景技術】
[0002]豬痕(classicalswine fever, CSF)是由豬痕病毒(classical swine fevervirus，CSFV)引起的一種以稽留高熱、出血和高死亡率為主要特征的高度接觸性傳染病。目前該病主要流行于亞洲、歐洲、南美洲，是影響我國豬群健康的最主要疫病，也是動物防疫的最重要疫病。我國自上世紀60年代發(fā)明和應用豬瘟兔化牛睪丸細胞苗以來，有效地改善了我國豬群的發(fā)病狀態(tài)，特別是近年來豬瘟兔體脾淋苗的應用和推廣，更進一步提高了動物的健康狀況，有效提升了養(yǎng)豬場的經濟效益。我國目前豬瘟疫苗的生產廠家有數十家之多，豬瘟疫苗的總產量可達20億頭份，生產的豬瘟疫苗主要有兩種:豬瘟脾淋苗(兔源)與豬瘟細胞苗(牛源)。前者是將豬瘟疫苗毒株接種家兔，然后將家兔處死，取家兔的脾臟和淋巴結制備成豬瘟脾淋苗(兔源)；后者是將豬瘟疫苗毒株接種牛睪丸傳代細胞，收獲細胞液制備豬瘟細胞苗(牛源)。盡管豬瘟兔體脾淋苗的免疫效果優(yōu)于豬瘟牛睪丸細胞苗，但其成本也相應地高于豬瘟牛睪丸細胞苗，因此有些不法廠家往往在豬瘟兔體脾淋苗中摻入大量牛睪丸細胞苗，導致豬瘟疫苗的有效滴度降低，由此造成臨床免疫效果不佳。
[0003]目前國內外均沒有可以鑒別兩種不同豬瘟疫苗相互摻假的問題，難以對豬瘟脾淋苗中摻入豬瘟細胞苗的情況進行鑒定檢測，這已成為目前影響動物防疫的一大難題，急需解決。


【發(fā)明內容】

[0004]針對上述【技術領域】的現狀，本發(fā)明提供了一種兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別引物和鑒別方法，本發(fā)明的發(fā)明目的之一是從生產疫苗的兔源和牛源出發(fā)，根據動物線粒體基因組具有種屬特異性的原理，通過大量試驗篩選了 2對特異性的能夠區(qū)別兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別引物。本發(fā)明的發(fā)明目的之二是利用上述鑒別引物建立了相應的PCR鑒別方法，依據特異性的PCR擴增結果判斷某種豬瘟疫苗的來源，從而達到鑒別兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗之目的。
[0005]為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明是通過如下技術方案實現的:
豬瘟脾淋苗(兔源)與豬瘟細胞苗(牛源)的鑒別引物，所述引物序列為:
針對牛源豬痕細胞苗的上游引物:BF1:5’ - accataaagaactccatcaacaag -3’ ；
針對牛源豬痕細胞苗的下游引物:BR1:5’ - acccgtaatataagcctcgtc -3’ ；
針對兔源豬痕脾淋苗的上游引物:RF1:5’ - tcagacattcaaattttcgcatca -3’ ；
針對兔源豬痕脾淋苗的下游引物:RR1:5’ - ttaatagaggtaggtttggttgtg _3，。
[0006]本發(fā)明與現有技術相比有許多優(yōu)點和積極效果:本發(fā)明所建立的鑒別方法基于分子生物學技術原理建立的區(qū)別兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的新方法，它根據動物線粒體基因組具有種屬特異性的原理，通過大量試驗篩選了 2對特異性的能夠區(qū)別兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別引物，并建立了相應的PCR鑒別方法。本發(fā)明所述鑒別方法無需依賴深厚的專業(yè)背景，也無需借助昂貴的精密儀器，具有準確快捷、客觀公正、經濟實用的特點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1是本發(fā)明中牛源豬瘟細胞苗用引物對BF1/BR1的PCR擴增結果。
[0008]圖2是本發(fā)明中兔源豬瘟脾淋苗用引物對RF1/RR1的PCR擴增結果。
[0009]圖3是用本發(fā)明中的引物對BF1/BR1對市場上銷售的兔源豬瘟脾淋苗進行PCR擴增的摻假識別鑒定結果。
[0010]圖4是用本發(fā)明中的引物對RF1/RR1對市場上銷售的牛源豬瘟細胞苗進行PCR擴增的摻假識別鑒定結果。

【具體實施方式】
[0011]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步詳細的描述。
[0012]實施例1
本發(fā)明根據動物線粒體基因組具有種屬特異性的原理，通過大量試驗篩選了 2對特異性的能夠區(qū)別兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別引物，所述2對引物序列為:
針對牛源豬痕細胞苗的上游引物:BF1:5’ - accataaagaactccatcaacaag -3’ ；
針對牛源豬痕細胞苗的下游引物:BR1:5’ - acccgtaatataagcctcgtc -3’ ；
針對兔源豬痕脾淋苗的上游引物:RF1:5’ - tcagacattcaaattttcgcatca -3’ ；
針對兔源豬痕脾淋苗的下游引物:RR1:5’ - ttaatagaggtaggtttggttgtg _3，。
[0013]本發(fā)明還提供了利用上述鑒別引物的兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別方法。利用所述引物和鑒別方法鑒別來源于某生物試劑公司制備的純正兔源豬瘟脾淋苗和牛源豬瘟細胞苗(確保不相互摻假)。
[0014]按照常規(guī)方法采用酚/氯仿抽提法(參見黃培堂等譯《分子克隆實驗指南》(第三版)，科學出版社，2002年9月)提取所述兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的DNA，利用本發(fā)明中提供的4種引物，對其基因組進行兩輪PCR擴增。
[0015]PCR反應體系為25yL，各種成分及終濃度為:Buffer 1mM, dNTP 0.2mM, Mg2+1.5mM，加入I對引物BF1/BR1 (或RF1/RR1) 0.2mM，Taq 1U,豬瘟脾淋苗(兔源)或豬瘟細胞苗(牛源)DNA 50ng，用雙蒸水補齊到25yL。PCR反應程序是95 °C 5min, (95 °C30sec — 55°C 30sec — 72°C lmin) X 30 個循環(huán)—72°C 1min0
[0016]兩輪PCR分別用BF1/BR1和RF1/RR1引物對待測樣品進行PCR檢測。除引物外，其PCR反應體系和反應程序均相同。
[0017]PCR反應結束后,取8 μ L擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測,加入Genefinder，然后在紫外透射反射分析儀下觀察、照相和記錄，根據電泳結果與提供的標準圖譜對比。
[0018]實驗結果如圖1和2所示，圖1為牛源豬瘟細胞苗用引物對BF1/BR1的PCR擴增結果，其中，泳道2-5為純正牛源豬瘟細胞苗樣品，泳道6為不含純正牛源豬瘟細胞苗的陰性對照，其他組分與泳道2-5相同；泳道I為DL2000 Marker,自上向下，大小依次為:2000bp，lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp。泳道2_5均出現了 699bp,序列如序列表中序列1所示，此序列為牛源豬瘟細胞苗的線粒體基因組特異性序列，所以說明泳道2-5所對應的疫苗均為純正未摻雜兔源豬瘟脾淋苗的牛源豬瘟細胞苗。
[0019]圖2為兔源豬瘟脾淋苗用引物對RF1/RR1的PCR擴增結果，其中，泳道2_5為純正兔源豬瘟脾淋苗樣品，泳道6為不含純正兔源豬瘟脾淋苗的陰性對照，其他組分與泳道2-5 相同；泳道 1 為 DL2000 Marker,自上向下，大小依次為:2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp,250bp，lOObp。泳道2-5均出現了 345bp，序列如序列表中序列2所示，此序列為兔源豬瘟脾淋苗的線粒體基因組特異性序列，所以說明泳道2-5所對應的疫苗均為純正未摻雜牛源豬瘟細胞苗的兔源豬瘟脾淋苗。
[0020]實施例2
從市場上購買市場上正在銷售的48份豬瘟疫苗，其中，不同批次的兔源豬瘟脾淋苗24份，不同批次的牛源豬瘟細胞苗24份。按照實施例1所述酚/氯仿抽提法提取上述24份豬瘟脾淋苗和24份豬瘟細胞苗的DNA，利用本發(fā)明中提供的4種引物，對其基因組分別利用BF1/BR1和RF1/RR1兩對引物進行兩輪PCR擴增。
[0021]PCR反應體系為25μ L，各種成分及終濃度為Buffer 10mM, dNTP 0.2mM, Mg2+1.5mM，加入1對引物BF1/BR1 (或RF1/RR1) 0.2mM，Taq 1U，提取的所述豬瘟疫苗的DNA 50ng，用雙蒸水補齊到 25μ L。PCR 反應程序是 95°C 5min, (95 °C 30sec — 55 °C30sec — 72°C lmin) X30 個循環(huán)—72°C lOmin。
[0022]PCR反應結束后，取8 μ L擴增產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，加入Genefinder,然后在紫外透射反射分析儀下觀察、照相和記錄，根據電泳結果與提供的標準圖譜對比。
[0023]圖3是用本發(fā)明中的BF1/BR1引物對市場上銷售的兔源豬瘟脾淋苗進行PCR擴增的摻假識別鑒定結果，泳道1-8，10-25為上述豬瘟疫苗中選取的24份兔源豬瘟脾淋苗，其中泳道 9 為 DL2000 Marker,自上向下，大小依次為:2000bp, lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp,100bp，其余泳道為樣品檢測的PCR結果，表明樣品5，6，16，17和19摻入了牛源豬瘟細胞苗。
[0024]圖4是用本發(fā)明中的RF1/RR1引物對市場上銷售的牛源豬瘟細胞苗進行PCR擴增的摻假識別鑒定結果，泳道1-12，14-25為選取的24份牛源豬瘟細胞苗，泳道13為DL2000Marker,自上向下，大小依次為:2000bp，lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, lOObp,其余泳道為樣品檢測的PCR結果，表明除了樣品1，2，22以外，其余樣品均摻入了兔源脾淋苗。
[0025]在使用本發(fā)明所述引物和鑒別方法具體采樣鑒別時，具體分以下情況判斷: 如果待檢測豬瘟疫苗第一輪PCR用引物對BF1/BR1擴增后僅出現一條大小為699bp片段，第二輪PCR用RF1/RR1引物擴增后均未出現一條大小為345bp片段的條帶，表明待測豬瘟疫苗全部為牛源豬瘟細胞苗，沒有摻入兔源豬瘟脾淋苗；
如果待檢測豬瘟疫苗第一輪PCR用引物對BF1/BR1擴增后未出現一條大小為699bp片段，第二輪PCR用RF1/RR1引物擴增后均出現一條大小為345bp片段的條帶，表明待測豬瘟疫苗全部為兔源豬瘟脾淋苗，沒有摻入牛源豬瘟細胞苗；
如果第一輪PCR用引物對BF1/BR1擴增后出現一條大小為699bp片段，同時第二輪PCR用RF1/RR1引物擴增后出現一條大小為345bp片段的條帶，則說明待測豬瘟疫苗中含有牛源豬瘟細胞苗和兔源豬瘟脾淋苗。
[0026]以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
【權利要求】
1.兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別引物，其特征在于所述引物序列為: 針對牛源豬痕細胞苗的上游引物:BF1:5’ - accataaagaactccatcaacaag -3’ ； 針對牛源豬痕細胞苗的下游引物:BR1:5’ - acccgtaatataagcctcgtc -3’ ； 針對兔源豬痕脾淋苗的上游引物:RF1:5’ - tcagacattcaaattttcgcatca -3’ ； 針對兔源豬痕脾淋苗的下游引物:RR1:5’ - ttaatagaggtaggtttggttgtg _3，。
2.利用權利要求1所述鑒別引物的兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別方法，其特征在于所述鑒別方法的步驟如下: 1)提取待測豬瘟疫苗樣品的DNA； 2)PCR擴增反應包括第一輪PCR反應和第二輪PCR反應，所述第一輪PCR反應所用引物對為BF1/BR1和RF1/RR1中的一種，第二輪PCR反應所用引物對為BF1/BR1和RF1/RR1中的另一種； 所述兩輪PCR反應體系均為25 μ L:包括Buffer 1mM, dNTP 0.2mM, Mg2+ 1.5mM,每種引物0.2mM, Taq 1U，待測豬瘟疫苗樣品的DNA 50ng，用雙蒸水補齊到25 μ L ； 3)電泳染色對比圖譜:取PCR擴增反應后的產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，加入Genefinder,然后在紫外透射反射分析儀下觀察、照相和記錄； 如果引物對BF1/BR1擴增的樣品出現一條大小為699bp片段，同時引物對RF1/RR1擴增的樣品未出現一條大小為345bp片段，則表明該樣品為牛源豬瘟細胞苗； 如果引物對BF1/BR1擴增的樣品未出現一條大小為699bp片段，同時引物對RF1/RR1擴增的樣品出現一條大小為345bp片段，則表明該樣品為兔源豬瘟脾淋苗； 如果引物對BF1/BR1擴增的樣品出現一條大小為699bp片段，同時引物對RF1/RR1擴增的樣品出現一條大小為345bp片段，則表明該樣品中含有牛源豬瘟細胞苗和兔源豬瘟脾淋苗。
3.根據權利要求2所述的兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別方法，其特征在于，所述699bp片段序列如序列表中序列I所示。
4.根據權利要求2所述的兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別方法，其特征在于，所述345bp片段序列如序列表中序列2所示。
5.根據權利要求2所述的兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別方法，其特征在于，所述第一輪PCR反應和第二輪PCR反應的程序是95°C 5min ；95°C 30sec — 55°C30sec — 72°C lmin，30 個循環(huán)；之后 72°C 1min0
6.根據權利要求2所述的兔源豬瘟脾淋苗與牛源豬瘟細胞苗的鑒別方法，其特征在于，采用酚氯仿提取法提取待測豬瘟疫苗的DNA。
【文檔編號】C12Q1/70GK104388596SQ201410754897
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年12月11日 優(yōu)先權日:2014年12月11日
【發(fā)明者】李曉成, 張志 , 吳發(fā)興, 劉爽, 董雅琴, 邵衛(wèi)星 申請人:中國動物衛(wèi)生與流行病學中心