對鎘具有阻隔效應(yīng)的芽孢桿菌及用途
【專利摘要】本發(fā)明為對鎘具有阻隔效應(yīng)的芽孢桿菌，解決鎘進(jìn)入食物鏈的問題。其拉丁文名 Bacillussp ，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏編號：CGMCCNO.9541。本發(fā)明菌株對鎘的活性效應(yīng)可以阻止重金屬鎘進(jìn)入植株體內(nèi)，從而減少鎘污染進(jìn)入食物鏈，特別適合在已污染土壤上邊種植邊修復(fù)的我國實際種植國情。
CGMCCNO9541
20140825
【專利說明】對鎘具有阻隔效應(yīng)的芽孢桿菌及用途
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】： 本發(fā)明涉及對土壤重金屬鎘污染具有阻隔效應(yīng)，可減少鎘進(jìn)入食物鏈的細(xì)菌微生物。
[0002] 技術(shù)背景： 鎘（Cd)是生物毒性極強的一種重金屬元素，在環(huán)境中的化學(xué)活性強、移動性大、毒性持 久，易通過食物鏈的富集作用危及人類健康，能誘發(fā)肝、腎、骨骼病變，還有致癌作用。我國 鎘污染耕地面積已達(dá)1.3X IO4 hm2,每年約有5. OXlO7 kg的稻米鎘含量超標(biāo)。2003年農(nóng) 業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心對我國各地稻米質(zhì)量安全普查結(jié)果表明，按照我國 稻米Cd含量0. 2 mg 的限量標(biāo)準(zhǔn)（GB15201-1994)，鎘的超標(biāo)率超過10%，一些鎘污染 地區(qū)的稻米CM含量商達(dá)0. 4 - I. 0 mg · kg \遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過我國谷物中鋪的最商許可量標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] 目前，鎘等重金屬污染土壤主要的修復(fù)方法有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)等 方法。物理修復(fù)主要包括客土、土壤淋洗和電動修復(fù)；該法修復(fù)徹底，但修復(fù)成本高，難以大 面積應(yīng)用?；瘜W(xué)修復(fù)主要指化學(xué)固定，即加入改良劑(如石灰、磷礦石、硫化物、有機物等)改 變土壤的理化性質(zhì)，通過重金屬的吸附或（共）沉淀作用來降低其生物有效性達(dá)到固化失 活的目的。但，長期施用石灰等物質(zhì)易造成土壤板結(jié)，磷灰石等礦物質(zhì)本身含有重金屬Cd, 金屬硫化物釋放到環(huán)境中產(chǎn)生硫化氫會造成二次環(huán)境污染。生物修復(fù)主要包括植物提取 和微生物修復(fù)。植物提取是通過超積累植物進(jìn)行富集，通過收集植物達(dá)到去除重金屬的目 的，但效率低，且占用糧食作物種植面積。微生物修復(fù)主要是利用某些微生物對重金屬的吸 收、沉淀、固定、氧化還原等作用降低重金屬毒性、減少重金屬移動和阻止重金屬進(jìn)入植株 體內(nèi)。
[0004]


【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明的目的在于提供一種對鎘具有吸附、固定效應(yīng)和高抗鎘毒性的對鎘具有阻隔效 應(yīng)的芽孢桿菌。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述芽孢桿菌在減少鎘進(jìn)入農(nóng)作物的應(yīng)用。
[0006] 發(fā)明是這樣實現(xiàn)的： 對鎘具有阻隔效應(yīng)的芽孢桿菌，其拉丁文名5/7.，保藏單位：中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏編號：CGMCC NO. 9541。
[0007] 本發(fā)明芽孢桿菌577.，自編號LY152,詳細(xì)分離篩選步驟如下： (1)樣品采集：2012年10月采取四川省什邡市鎘污染土壤0-20cm 土層樣品。
[0008] (2)富集培養(yǎng)：稱取IOg 土樣于滅菌的液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)48h后 吸取IOml培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代5次 (3)菌株芽孢桿菌分離：吸取IOml富集培養(yǎng)液至裝有90ml無菌生理鹽水的三角瓶中， 于28°C搖床振蕩30min，再一次吸取Iml到9ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至不同梯度，分別 取0. Iml涂布在不同梯度含200mg · Γ1的固體培養(yǎng)基平板上，于28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，長 出的菌株為鎘抗性菌株芽孢桿菌。
[0009] (4)劃線分離：將步驟（3)中得到的芽孢桿菌挑取不同的菌落進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)， 并進(jìn)行復(fù)篩驗證直到分離到純菌落為止，將菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，菌長出后放4°C冰箱 中備用，并用甘油冷凍管保存一份于-80°C。
[0010] (5)芽孢桿菌篩選：菌株芽孢桿菌培養(yǎng)至對數(shù)期，按1%接種量接種至鎘濃度為100 mg · I71的液體培養(yǎng)基，置28°C培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)48h后離心，用石墨爐原子吸收分光光度計 測定上清液中Cd2+含量，上清液中Cd2+含量越低，固定效率越高。
[0011] 對鎘具有阻隔效應(yīng)的芽孢桿菌，該菌株具有如下特征： 1) 菌落形態(tài)特征：菌落粗糙、不透明、乳白色 2) 菌體形態(tài)特征：利用電鏡形態(tài)鑒定和革蘭氏染色分析。特征如下：桿狀，直徑 0· 6 μ m?I. 0 μ m，長1. 5 μ m?2. 0 μ m，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽性。
[0012] 3)生理生化特征：過氧化氫酶（ + )、氧化酶（ + )、明膠水解（ + )、淀粉水解（ + )、酪素 水解（+)、酪氨酸水解（-)、卵磷脂水解（-)、V.P反應(yīng)（+)、丙酸鹽利用（-) 4)對鎘的活性效應(yīng)： 本發(fā)明在實驗室條件下驗證結(jié)果表明該芽孢桿菌對重金屬鎘具有顯著的吸附、固定和 高抗鎘毒性的特征，可用于重金屬鎘污染土壤的生物修復(fù)。
[0013] 5)分子生物學(xué)鑒定：利用16S rDNA鑒定，采用通用引物27F和1492R擴增其16S rDNA并測序，再與NCBI GenBank核酸數(shù)據(jù)庫比對，同源性為99%，鑒定為芽孢桿菌 sp. 〇
[0014] 6)將上述分離得到的菌株命名為LY152,經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀察和分子生物學(xué)鑒定，確 認(rèn)該菌為芽孢桿菌5/7.)。該菌株于2014年8月25日送交中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心（CGMCC)登記保藏，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。 其保藏號為CGMCC NO. 9541。分類命名為：芽孢桿菌沙.） 本發(fā)明通過大棚條件下用重金屬鎘污染的土壤接種該菌株進(jìn)行盆栽放大種植試驗，結(jié) 果表明該菌對鎘具有顯著吸附和固定效應(yīng)，能高效阻止鎘進(jìn)入植物體內(nèi)，阻隔效應(yīng)明顯。對 重金屬鎘污染的土壤、水體生物修復(fù)方面有著良好的應(yīng)用前景。
[0015] 以下節(jié)【具體實施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明提供的芽孢桿菌的用途。
[0016]

【具體實施方式】： 實施例1 芽孢桿菌5/7. )LY152的制備方法，具體操作如下： (1)樣品采集：2012年10月采取四川省什邡市鎘污染土壤0-20cm 土層樣品。
[0017] (2)富集培養(yǎng)：稱取IOg 土樣于滅菌的液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)48h后 吸取IOml培養(yǎng)液進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代5次。液體培養(yǎng)基成分為：蔗糖10 g · Γ1，K2HP042 g · ΙΛ (NH4) SO4 I g · ΙΛ MgSO4 · 7H20 0· 5 g · ΙΛ CaCO3 0· 5 g · ΙΛ 酵母膏 0· 5 g · ΙΛ NaCl 0· I g · Γ1，CdCl2 · 2· 5Η20 0· 2 g · Γ1，pH 7· 0。
[0018] (3)鎘抗性菌株分離：吸取IOml富集培養(yǎng)液至裝有90ml無菌生理鹽水的三角瓶 中，于28°C搖床振蕩30min，再一次吸取Iml到9ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至1〇Λ ΚΓ5， 1〇_6,分別取〇. Iml涂布在含200mg · Γ1的固體培養(yǎng)基平板，每個稀釋度涂布3個平板，于 28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d，長出的菌株為鎘抗性菌株。
[0019] (4)劃線分離：將步驟（3)中得到的鎘抗性菌挑取不同的菌落進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)， 并進(jìn)行復(fù)篩驗證直到分離到純菌落為止，將菌株接種到斜面培養(yǎng)基上，菌長出后放4°C冰箱 中備用，并用甘油冷凍管保存一份于_80°C。
[0020] (5)高抗鎘菌株篩選：鎘抗性菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，按1%接種量接種至鎘濃度為100 mg · I71的液體培養(yǎng)基，置28°C培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)48h后離心，用石墨爐原子吸收分光光度計 測定上清液中Cd 2+含量，上清液中Cd2+含量越低，固定效率越高。液體培養(yǎng)基成分為：蔗糖 10 g · Γ1，K2HPO4 2 g · Γ1，（NH4) SO4 I g · Γ1，MgSO4 · 7H20 0· 5 g · Γ1，CaCO3 0· 5 g · Γ1， 酵母膏 0· 5 g · ΙΛ NaCl 0· I g · ΙΛ CdCl2 · 2· 5H20 0· I g · ΙΛ pH 7. 0。
[0021] (6)菌株的形態(tài)學(xué)和生物學(xué)鑒定 形態(tài)學(xué)特征觀察：利用電鏡形態(tài)鑒定和革蘭氏染色分析。特征如下：桿狀，直徑 0· 6 μ m?I. 0 μ m，長1. 5 μ m?2. 0 μ m，產(chǎn)芽孢，革蘭氏陽性。
[0022] 分子生物學(xué)鑒定：利用16S rDNA鑒定，采用通用引物27F和1492R擴增其16S rDNA并測序，再與NCBI GenBank核酸數(shù)據(jù)庫比對，同源性為99%，鑒定為芽孢桿菌 sp. 〇
[0023] (7)將上述分離得到的菌株命名為LY152,經(jīng)形態(tài)學(xué)特征觀察和分子生物學(xué)鑒定， 確認(rèn)該菌為芽孢桿菌沙.）。該菌株于2014年8月25日送交中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)登記保藏，其保藏號為CGMCC NO. 9541。分類命名 為：芽孢桿菌(AaciBw1S 5/7.)。
[0024] 實施例2 芽孢桿菌在減少重金屬鎘進(jìn)入水稻的應(yīng)用，具體操作如下： 1、 材料 菌株：芽孢桿菌5/7. )LY152,中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心（CGMCC)登記保藏號為CGMCC NO. 9541 種植介質(zhì)：重金屬鎘污染土壤，鎘污染濃度I mg · I71和40 mg · I71 種植容器：容積為50升的栽培盆 植物種子：水稻種子，品種分別為：輻優(yōu)838、糯香61 2、 操作方法及步驟 (1) 育苗：將水稻種子在溫室育秧，葉齡約3葉1心即可移栽； (2) 菌液制備：將有效芽孢桿菌(及沙.）LY152為I X IO9個/毫升接種于2升 液體培養(yǎng)基，37°C 150 rpm振蕩培養(yǎng)24h，制成含菌株LY152的菌液，菌液含菌株LY152有效 活菌數(shù)不低于IX IO6個/毫升，備用；所述的液體培養(yǎng)基：牛肉膏3g ·Ι^，蛋白胨IOg ·Ι^， NaCl 5g · Γ1，pH 7. 0 ?7. 2 ; (3) 種植介質(zhì)準(zhǔn)備：以每盆30公斤鎘污染土壤加水至淹過土面2-4cm，備用； (4) 秧苗移栽：將步驟（1)中所育秧苗用步驟（2)所制備的菌液蘸根后按照每盆4株移 栽至步驟（3)所準(zhǔn)備的介質(zhì)中，同時設(shè)置不蘸根處理作對照； (5) 水稻種植日常管理，至收獲期取植株根、莖、葉和稻米測定鎘含量，結(jié)果如下表：

【權(quán)利要求】
1. 對鎘具有阻隔效應(yīng)的芽孢桿菌，其特征在于其拉丁文名5/7.，保藏單位： 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏編號： CGMCC NO. 9541。
2. 如權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌在減少鎘進(jìn)入農(nóng)作物的應(yīng)用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的芽孢桿菌在減少鎘進(jìn)入農(nóng)作物的應(yīng)用，其特征在于所述農(nóng)作 物為水稻、小麥、玉米、油菜、蔬菜、水果，在農(nóng)作物種植過程中施用對鎘具有阻隔效應(yīng)的芽 孢桿菌，可有效減少重金屬鎘進(jìn)入植株體內(nèi)，進(jìn)而阻止鎘通過植株可食器官污染食物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的芽孢桿菌在減少鎘進(jìn)入農(nóng)作物的應(yīng)用，其特征在于農(nóng)作物種 植過程中施用對鎘具有阻隔效應(yīng)的芽孢桿菌采用蘸根或穴施或土壤撒施或根施或溝施。
【文檔編號】C12R1/07GK104371956SQ201410641370
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月14日
【發(fā)明者】侯勇, 王強峰, 張亮, 夏中梅, 朱彭玲, 黃秀輝, 胡蘇 , 王贇, 曾蕓, 黃雙飛, 李紅兵, 王蘭英, 曾顯斌 申請人:四川省蘭月科技有限公司, 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所