快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡，包括樣品墊，納米材料墊，硝酸纖維素膜和吸收墊，硝酸纖維素膜即為檢測(cè)卡基體，檢測(cè)卡基體上分布有進(jìn)樣區(qū)、空白對(duì)照區(qū)及樣本檢測(cè)區(qū)，進(jìn)樣區(qū)與樣本檢測(cè)區(qū)連通，空白對(duì)照區(qū)及樣本檢測(cè)區(qū)均修飾有具有與待測(cè)miRNA互補(bǔ)的miRNA序列的探針，探針一端與檢測(cè)卡基體連接，探針另一端攜帶有熒光基團(tuán)。本發(fā)明還公開檢測(cè)卡的制備方法。本發(fā)明還公開一種快速檢測(cè)微小核糖核酸的試劑盒。本發(fā)明還公開檢測(cè)卡和檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)肺癌相關(guān)miRNA具有較高的檢測(cè)靈敏度，無需PCR可同時(shí)檢測(cè)多種miRNA，提高了臨床診斷特異性，滿足篩選、診斷肺癌及判斷治療效果與隨訪應(yīng)用需求。
【專利說明】快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微小核糖核酸（miRNA)的檢測(cè)方法，特別涉及快速檢測(cè)微小核糖 核酸的檢測(cè)卡及其制備方法和應(yīng)用，屬于檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌在我國(guó)慢性腫瘤中發(fā)病和死亡率均處第一位，影像學(xué)和形態(tài)發(fā)現(xiàn)時(shí)已進(jìn)入晚 期，目前無特異性標(biāo)志物可用，如何開發(fā)出一種快速診斷且適用于臨床發(fā)病早期的肺癌檢 測(cè)技術(shù)，一直都是本領(lǐng)域的技術(shù)難點(diǎn)。
[0003] 近年來，隨著人們對(duì)人類基因組研究的不斷深入，逐漸揭示了 MicroRNA(miRNA) 在肺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及細(xì)胞凋亡等之間存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。miRNA是一種高保守，長(zhǎng)度大概 21-23個(gè)核苷酸，非蛋白編碼RNA，起著調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。目前已經(jīng)報(bào)告一批miRNA可能 成為診斷肺癌的標(biāo)志物，這些miRNA在肺癌的不同階段高度和特異表達(dá)，進(jìn)入循環(huán)血中后 穩(wěn)定持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，是極其早期診斷的潛在標(biāo)志物。然而，當(dāng)前檢測(cè)miRNA必須依靠 PCR擴(kuò)增 放大，耗時(shí)長(zhǎng)，重復(fù)性差，不能滿足臨床需求。因此，開發(fā)出一種快速、無需PCR擴(kuò)增的miRNA 檢測(cè)技術(shù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種快速檢測(cè) 微小核糖核酸的檢測(cè)卡，可以實(shí)現(xiàn)肺癌相關(guān)標(biāo)記物的高靈敏檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)單，成本低廉， 無需PCR擴(kuò)增技術(shù)。
[0005] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述檢測(cè)卡的制備方法。
[0006] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供了一種快速檢測(cè)微小核糖核酸的試劑盒。
[0007] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供了上述檢測(cè)卡和試劑盒的應(yīng)用。
[0008] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種快速檢測(cè)微 小核糖核酸的檢測(cè)卡，包括依次相連的樣品墊，納米材料墊，硝酸纖維素膜和吸收墊，所述 硝酸纖維素膜即為檢測(cè)卡基體，所述檢測(cè)卡基體上分布有進(jìn)樣區(qū)、空白對(duì)照區(qū)及樣本檢測(cè) 區(qū)，所述進(jìn)樣區(qū)與樣本檢測(cè)區(qū)連通，所述空白對(duì)照區(qū)及樣本檢測(cè)區(qū)均修飾有具有與待測(cè) miRNA互補(bǔ)的miRNA序列的探針，所述探針一端與檢測(cè)卡基體連接，所述探針另一端攜帶有 熒光基團(tuán)。上述的納米材料墊為金納米顆粒結(jié)合區(qū)域。
[0009] 進(jìn)一步的，所述待測(cè) miRNA 的序列包括 miR-21、miR-24、miR-25、miR_30a、 miR-100、miR-126、miR-143、miR-145、miR-152、miR-155、miR-183、miR-188、miR-189、 miR-200b、miR-320、miR-331中的任一種或兩種以上的組合。
[0010] 進(jìn)一步地，所述檢測(cè)卡有1組?10組空白對(duì)照區(qū)和樣本檢測(cè)區(qū)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)單一種 類miRNA或多種minRNA的檢測(cè)，提升檢測(cè)卡的檢測(cè)通量。
[0011] 進(jìn)一步地，所述熒光基團(tuán)為Cy3或Cy5。
[0012] 快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡的制備方法，包括以下步驟：
[0013] 1)合成含有miRNA的探針，首先在miRNA -端修飾由5至20個(gè)碳原子組成的碳 鏈，在另一端修飾熒光基團(tuán)，然后合成得到探針；
[0014] 2)在硝酸纖維素膜表面即檢測(cè)卡基體上限定一組空白對(duì)照區(qū)以及樣本檢測(cè)區(qū)，將 含有濃度為l〇ng/L?lmg/L的步驟1)所述探針的溶液噴涂至空白對(duì)照區(qū)及樣本檢測(cè)區(qū)， 并于溫度為37°C的條件下保持Ih以上；其中噴涂溶液體積可以依據(jù)實(shí)際需求而定，例如， 可以為100μ L至2mL。
[0015] 3)將步驟2)修飾完成的硝酸纖維素膜切割成合適尺寸，然后與樣品墊、納米材料 墊和吸收墊組裝成檢測(cè)卡。
[0016] 一種快速檢測(cè)微小核糖核酸的試劑盒，包含上述的檢測(cè)卡和金納米顆粒標(biāo)記的 miRNA,所述金納米顆粒標(biāo)記的miRNA具有與待測(cè)miRNA相同的序列。
[0017] 進(jìn)一步地，所述金納米顆粒標(biāo)記的miRNA中，miRNA共價(jià)連接于金納米顆粒表面， 所述金納米顆粒的粒徑為5nm?50nm，其在與前述熒光基團(tuán)接近時(shí)，將產(chǎn)生較高的熒光淬 滅效率。為促進(jìn)前述miRNA與金納米顆粒的連接，可對(duì)所述金納米顆粒的進(jìn)行表面修飾，例 如，在金納米顆粒表面包裹朽 1橡酸二納等物質(zhì)，以及，在miRNA末端修飾疏基等，利用疏基 與金的共價(jià)結(jié)合，將前述miRNA較為穩(wěn)定的連接于金納米顆粒表面。
[0018] 上述的檢測(cè)卡、試劑盒在檢測(cè)微小核糖核酸中的應(yīng)用。
[0019] 上述的應(yīng)用，將包含有待測(cè)miRNA的樣本與金納米顆粒標(biāo)記miRNA的混合溶液共 同滴加至檢測(cè)卡的進(jìn)樣區(qū)，并使所述混合溶液定向流動(dòng)至樣本檢測(cè)區(qū)，與固定在樣本檢測(cè) 區(qū)的探針結(jié)合；檢測(cè)樣本檢測(cè)區(qū)及空白對(duì)照區(qū)的熒光強(qiáng)度，并將樣本檢測(cè)區(qū)的熒光強(qiáng)度與 空白對(duì)照區(qū)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比對(duì)，從而獲知樣本中的待測(cè)miRNA濃度。
[0020] 將樣本加入檢測(cè)卡后，保持15min?60min再進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)量，檢測(cè)溫度為 20°C?50°C。
[0021] 在測(cè)得空白對(duì)照區(qū)以及樣本檢測(cè)區(qū)的熒光強(qiáng)度后，將樣本檢測(cè)區(qū)的熒光強(qiáng)度除以 空白對(duì)照區(qū)的熒光強(qiáng)度，結(jié)合標(biāo)定曲線而判斷出樣本中待測(cè)miRNA的濃度。
[0022] 其中，前述標(biāo)定曲線的建立方式是業(yè)界悉知的，S卩，可依據(jù)前述檢測(cè)方法，加待測(cè) miRNA的一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品分別與金納米顆粒標(biāo)記miRNA分別混合后加入所述檢 測(cè)卡，并記錄各標(biāo)準(zhǔn)樣品相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，繼而建立能反應(yīng)出標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與檢測(cè)熒光強(qiáng) 度之關(guān)系的標(biāo)定曲線。
[0023] 利用本發(fā)明的檢測(cè)方法，可以在短至十幾分鐘的時(shí)間內(nèi)完成測(cè)試，無需復(fù)雜設(shè)備， 且檢測(cè)濃度可低至fmol/L水平。
[0024] 進(jìn)一步地，本發(fā)明中，前述的樣本可直接來源于血清、血液等體液。
[0025] 檢測(cè)原理為競(jìng)爭(zhēng)法：將包含有待測(cè)miRNA的樣本與金納米顆粒標(biāo)記miRNA的混合 溶液共同滴加至檢測(cè)卡的進(jìn)樣區(qū)，并使所述混合溶液定向流動(dòng)至樣本檢測(cè)區(qū)，與固定在樣 本檢測(cè)區(qū)的探針miRNA結(jié)合，探針miRNA表面攜帶有熒光基團(tuán)。上述兩種miRNA會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地 與探針miRNA相結(jié)合，當(dāng)金納米顆粒標(biāo)記的miRNA結(jié)合后，會(huì)淬滅掉原miRNA探針的突光， 淬滅程度與待測(cè)miRNA的濃度相關(guān)。檢測(cè)樣本檢測(cè)區(qū)及空白對(duì)照區(qū)的熒光強(qiáng)度，空白對(duì)照 區(qū)系作為質(zhì)控線，其熒光強(qiáng)度用于質(zhì)控；并將樣本檢測(cè)區(qū)的熒光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對(duì)， 從而獲知樣本中的待測(cè)miRNA濃度。
[0026] 檢測(cè)卡中分布有多組空白對(duì)照區(qū)以及樣本檢測(cè)區(qū)，通過檢測(cè)每組空白對(duì)照區(qū)以及 樣本檢測(cè)區(qū)的熒光信號(hào)，可以判斷待測(cè)樣本中的目標(biāo)miRNA含量。
[0027] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括：
[0028] (1)本發(fā)明通過使用miRNA作為肺癌檢測(cè)的標(biāo)志物，多組miRNA并行檢測(cè)，可以涵 蓋足篩選、診斷肺癌及判斷治療效果與隨訪應(yīng)用需求；
[0029] (2)提供了一種快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡，利用該檢測(cè)卡，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)與肺 癌相關(guān)的miRNA分子的快速、高靈敏檢測(cè)，無需復(fù)雜操作，效率高，成本低廉，并可根據(jù)實(shí)際 需要檢測(cè)特定單種或多種miRNA分子，而通過評(píng)價(jià)不同miRNA的含量水平，還可輔助篩選和 診斷肺癌，評(píng)估療效和預(yù)后；
[0030] (3)進(jìn)一步的，通過引入金納米顆粒進(jìn)行miRNA的檢測(cè)，采用競(jìng)爭(zhēng)法的策略，可以 通過判斷熒光淬滅的形式實(shí)現(xiàn)miRNA的檢測(cè)，進(jìn)一步提升檢測(cè)靈敏度，無需復(fù)雜耗時(shí)的PCR 擴(kuò)增技術(shù)，并可以臨床血清或組織等作為檢測(cè)樣本，實(shí)現(xiàn)早期肺癌篩選，克服了影像學(xué)等當(dāng) 前主流檢測(cè)技術(shù)的缺陷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1本發(fā)明一典型實(shí)施方案中一種快速檢測(cè)微小核糖核酸的方法的原理圖；1-檢 測(cè)卡基體；2-預(yù)先固定于空白對(duì)照區(qū)以及樣本檢測(cè)區(qū)、具有與待測(cè)miRNA互補(bǔ)miRNA序列 的探針，其一端修飾有碳鏈，另一端修飾有熒光基團(tuán)；3-熒光基團(tuán)；4-金納米顆粒；5-與待 測(cè) miRNA 互補(bǔ)的 miRNA ;6_ 待測(cè) miRNA ;
[0032] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1示意圖，可實(shí)現(xiàn)單種miRNA的檢測(cè)；
[0033] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例2示意圖，可實(shí)現(xiàn)五種miRNA的檢測(cè)；7-樣品墊；8-納米材料 墊；9-硝酸纖維膜；10-吸收墊；11-樣本檢測(cè)區(qū)；12-空白對(duì)照區(qū)；13-17-五種miRNA對(duì)應(yīng) 的樣本檢測(cè)區(qū)以及空白對(duì)照區(qū)。
[0034] 圖4為實(shí)施例一中的標(biāo)定曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案 為前提下進(jìn)行實(shí)施，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0036] 實(shí)施例1與肺癌發(fā)病相關(guān)的miR-21的檢測(cè)：
[0037] 首先合成與miR-21互補(bǔ)的miRNA序列，在其一端修飾5個(gè)碳原子組成的碳鏈，另 一端標(biāo)記Cy3突光基團(tuán)；
[0038] 在硝酸纖維素膜表面限定一組空白對(duì)照區(qū)以及樣本檢測(cè)區(qū)。利用點(diǎn)噴技術(shù)將中 100 μ L、1 μ mol/L miR-21互補(bǔ)miRNA溶液噴涂于空白對(duì)照區(qū)以及樣本檢測(cè)區(qū)表面，置于 37°C下保持1小時(shí)。進(jìn)一步利用試紙條切刀機(jī)將修飾完成的硝酸纖維素膜切割成合適尺 寸，然后與樣品墊、納米材料墊和吸收墊組裝成檢測(cè)卡。
[0039] 將miR-21溶液與直徑5nm、表面包裹為檸檬酸三鈉的金納米顆?；旌?，制備金納 米顆粒標(biāo)記的miR-21溶液。
[0040] 在肺癌檢測(cè)過程中，首先將金納米顆粒標(biāo)記的miRNA與血清樣本混合，通過進(jìn)樣 區(qū)滴加進(jìn)檢測(cè)試劑盒，反應(yīng)15分鐘后利用熒光檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。使用晶芯LuxScan IOK微 陣列芯片掃描儀分別檢測(cè)空白對(duì)照區(qū)以及樣本檢測(cè)區(qū)的熒光強(qiáng)度，PMT增益設(shè)置為700,采 集得到空白對(duì)照區(qū)熒光強(qiáng)度達(dá)到約4萬計(jì)數(shù)，則可表明檢測(cè)卡可以正常工作；將采集到的 樣本檢測(cè)區(qū)熒光強(qiáng)度，對(duì)比作出標(biāo)定曲線，如圖4所示，可以判斷出樣本中的目標(biāo)miRNA濃 度。采用該方法可以檢測(cè)miR-21的濃度低至6pmol/L。檢測(cè)溫度為35°C。
[0041] 標(biāo)定曲線原始數(shù)據(jù)：
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡，包括依次相連的樣品墊，納米材料墊，硝酸纖 維素膜和吸收墊，其特征在于，所述硝酸纖維素膜即為檢測(cè)卡基體，所述檢測(cè)卡基體上分布 有進(jìn)樣區(qū)、空白對(duì)照區(qū)及樣本檢測(cè)區(qū)，所述進(jìn)樣區(qū)與樣本檢測(cè)區(qū)連通，所述空白對(duì)照區(qū)及樣 本檢測(cè)區(qū)均修飾有具有與待測(cè)miRNA互補(bǔ)的miRNA序列的探針，所述探針一端與檢測(cè)卡基 體連接，所述探針另一端攜帶有熒光基團(tuán)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡，其特征在于，所述待測(cè) miRNA 的序列包括 miR-21、miR-24、miR-25、miR-30a、miR-100、miR-126、miR-143、miR-145、 miR-152、miR-155、miR-183、miR-188、miR-189、miR-200b、miR-320、miR-331 中的任一種或 兩種以上的組合。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡，其特征在于，所述檢測(cè)卡 有1組?10組空白對(duì)照區(qū)和樣本檢測(cè)區(qū)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡，其特征在于，所述熒光基 團(tuán)為Cy3或Cy5。
5. 權(quán)利要求1?4任一項(xiàng)所述的快速檢測(cè)微小核糖核酸的檢測(cè)卡的制備方法，其特征 在于，包括以下步驟： 1) 合成含有miRNA的探針，首先在miRNA -端修飾由5至20個(gè)碳原子組成的碳鏈，在 另一端修飾熒光基團(tuán)，然后合成得到探針； 2) 在硝酸纖維素膜表面即檢測(cè)卡基體上限定一組空白對(duì)照區(qū)以及樣本檢測(cè)區(qū)，將含有 濃度為l〇ng/L?lmg/L的步驟1)所述探針的溶液噴涂至空白對(duì)照區(qū)及樣本檢測(cè)區(qū)，并于 溫度為37°C的條件下保持lh以上； 3) 將步驟2)修飾完成的硝酸纖維素膜切割成合適尺寸，然后與樣品墊、納米材料墊和 吸收墊組裝成檢測(cè)卡。
6. -種快速檢測(cè)微小核糖核酸的試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所 述的檢測(cè)卡和金納米顆粒標(biāo)記的miRNA,所述金納米顆粒標(biāo)記的miRNA具有與待測(cè)miRNA相 同的序列。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速檢測(cè)微小核糖核酸的試劑盒，其特征在于，所述金納米 顆粒標(biāo)記的miRNA中，miRNA共價(jià)連接于金納米顆粒表面，所述金納米顆粒的粒徑為5nm? 50nm〇
8. 權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)卡、權(quán)利要求6?7任一項(xiàng)所述的試劑盒在檢 測(cè)微小核糖核酸中的應(yīng)用。
9. 權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，將包含有待測(cè)miRNA的樣本與金納米顆粒標(biāo)記 miRNA的混合溶液共同滴加至檢測(cè)卡的進(jìn)樣區(qū)，并使所述混合溶液定向流動(dòng)至樣本檢測(cè)區(qū)， 與固定在樣本檢測(cè)區(qū)的探針結(jié)合；檢測(cè)樣本檢測(cè)區(qū)及空白對(duì)照區(qū)的熒光強(qiáng)度；空白對(duì)照區(qū) 作為質(zhì)控，根據(jù)樣本檢測(cè)區(qū)的熒光強(qiáng)度從而獲知樣本中的待測(cè)miRNA濃度。
10. 權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，將樣本加入檢測(cè)卡后，保持15min?60min再 進(jìn)行熒光強(qiáng)度測(cè)量，檢測(cè)溫度為20°C?50°C。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104372089SQ201410633033
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月11日
【發(fā)明者】孔濤, 張寄南, 王煒, 張雷, 程國(guó)勝 申請(qǐng)人:南京博納天元生物科技有限公司