一種磁性載體固定化脂肪酶的制備及其催化制備生物柴油的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種固定化脂肪酶催化制備生物柴油方法，尤其涉及一種葡萄糖酸改性的磁性載體固定化脂肪酶的制備及其催化大豆油制備生物柴油方法，屬于生物能源【技術領域】。該工藝采用化學共沉淀法合成出粒徑分布均勻、穩(wěn)定的磁性Fe3O4納米顆粒，用葡萄糖酸對磁性顆粒表面進行了修飾，再將游離南極假絲酵母脂肪酶化學共價結合至磁性載體表面，得到一種具有磁性的固定化脂肪酶，該固定化脂肪酶催化大豆油合成生物柴油，甲醇采用分批加入法，反應轉化率可達90%以上，反應后酶回收方便，重復使用7次后，酶活性仍能維持在90%以上。
【專利說明】一種磁性載體固定化脂肪酶的制備及其催化制備生物柴油

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種固定化脂肪酶催化制備生物柴油方法，尤其涉及一種葡萄糖酸改性的磁性載體固定化脂肪酶的制備及其催化大豆油制備生物柴油方法，屬于生物能源【技術領域】。

【背景技術】
[0002]生物柴油主要是以動植物油為原料，通過酯交換反應制備的長鏈脂肪酸酯類物質(zhì)。其具有生物可降解、可再生資源、無毒、廢氣排放量小等優(yōu)點，是環(huán)境友好型燃料，作為可再生的替代能源已引起了世界范圍的廣泛關注。目前生物柴油的生產(chǎn)工藝主要有化學法和生物酶法。化學法一般以無機酸或堿作為催化劑，存在工藝復雜、能耗高、醇消耗量大、環(huán)境污染等缺點；生物酶法則具有反應條件溫和、產(chǎn)物易分離、環(huán)保等優(yōu)點，被認為是有望取代化學法生產(chǎn)生物柴油的綠色工藝。若采用游離脂肪酶作為催化劑，反應結束后，酶的分離、再生、循環(huán)使用很困難。若采用固定化脂肪酶，可克服上述游離酶的缺陷，使酶分子在有效地發(fā)揮催化作用的同時被保護起來，不易受環(huán)境影響，易于從底物和產(chǎn)物中分離，可多次循環(huán)使用，從而降低成本，顯示良好的應用前景。
[0003]CN102260719A公布了一種固定化脂肪酶催化黃連木油制備生物柴油的方法，以苧麻為載體固定化豬胰脂肪酶，該固定化酶催化黃連木油制備生物柴油，反應后回收重復使用13次，其活性保持率大于80%。CN101717801A公開了一種利用玉米芯固定化脂肪酶制備生物柴油的方法，使用的玉米芯固定化脂肪酶制備生物柴油轉化率為63.8%?97.5%。CN101280210A，一種固定化包衣酶制備生物柴油的方法，在催化劑固定化包衣酶的作用下和一定溫度下，將低碳醇與動植物油脂混合，加入有機溶劑正己烷和水，攪拌使酯交換反應進行。CN101255348A公開了一種利用固定化脂肪酶一透醇膜生物反應器制備生物柴油的方法，將脂肪酶通過物理吸附固定于中空纖維透醇膜的表面，制備固定化脂肪酶的膜組件，然后組裝為酶一膜生物反應器；油脂走膜組件的殼程，低碳醇則走膜組件的管程，在固定化脂肪酶的催化作用下油酯化為生物柴油；利用低碳醇選擇性透過中空纖維膜來提供生物柴油制備過程中所需的低碳醇，從而有效避免了由底物引起的酶活抑制作用，能夠高效制備生物柴油。CN1818026A，本發(fā)明涉及一種固定化脂肪酶法在非水相體系催化醇解動植物油脂生產(chǎn)生物柴油的方法，該生產(chǎn)方法包括海藻酸鈉、高嶺土、戊二醛、明膠、乳糖組成的共固定劑對脂肪酶的固定化，球形固定化酶以自然狀態(tài)堆積在填充床酶柱反應器中，在生物柴油作為溶劑的條件下醇解動植物油脂，生產(chǎn)生物柴油。
[0004]可以看出，固定化酶提高了酶的活性，重復利用方便。相關專利采用了多種載體實現(xiàn)酶的負載，并取得了一定效果。負載酶的一個重要指標是表面積大，這樣催化效率才高。高的表面積要求催化劑顆粒要小，使用、分離和回收就會有困難。一般酶的負載利用沉積原理，是物理作用，利用的是分子間作用力，這種力相對于化學鍵小得多，因此容易造成酶從載體脫落。
[0005]發(fā)明目的為了提高酶的催化效率和重復利用率，本發(fā)明使用葡萄糖酸改性的磁性顆粒作為酶載體，利用磁性可方便地使用、固定、回收催化劑；使用特定的化學反應方法對脂肪酶進行固定化，結合牢固，保持了酶活性，大大提高了酶的催化效率；采用該固定化脂肪酶以植物油和甲醇為底物合成生物柴油，甲醇采用分批加入法，反應轉化率高，反應后酶回收方便，重復利用效果好，大大降低生產(chǎn)成本。
[0006]技術方案
本發(fā)明采用了如下技術方案。
[0007]I 一種磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:取適當比例亞鐵和鐵無機鹽混和物水溶液，氮氣保護下滴加無機堿控制合適PH值，攪拌反應30分鐘，水浴條件下晶化2小時，磁場分離出大表面積、穩(wěn)定的Fe3O4納米顆粒；水浴攪拌條件下將葡萄糖酸弱堿性水溶液滴加到磁性Fe3O4顆粒膠體中，劇烈攪拌反應數(shù)小時，磁場分離出葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性顆粒，真空干燥；取葡萄糖酸改性的磁性Fe3O4顆粒載體與1_乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液超聲分散后加入脂肪酶溶液，超聲分散，振蕩反應數(shù)小時，過濾，磷酸緩沖液洗滌，真空干燥得磁性載體固定化脂肪酶；取適量大豆油、甲醇、溶劑和制備的固定化脂肪酶于恒溫振蕩器中反應，反應過程中分批加入甲醇。
[0008]2根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:亞鐵和鐵無機鹽為氯化物或硫酸鹽，亞鐵和鐵無機鹽摩爾比為1:1.5?3。
[0009]3根據(jù)權利要求1和2所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:鐵和亞鐵無機鹽混和物水溶液反應時，滴加的無機堿為氨水或氫氧化鈉水溶液，所控PH值為l(Tll。
[0010]4根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:大表面積、穩(wěn)定的Fe3O4納米顆粒的制備通過反應溫度控制，攪拌下反應溫度為30^600C，水浴晶化溫度為7(T90°C。
[0011]5根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:葡萄糖酸弱堿性水溶液中氫氧化鈉濃度為1.25mol/L，葡萄糖酸弱堿性水溶液濃度為25mg/mL，葡萄糖酸改性磁性Fe3O4顆粒反應的水浴溫度為25?40°C，真空干燥溫度為80。。。
[0012]6根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性顆粒載體與1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液超聲分散前均用pH=8.0的NaH2PO4-Na2HPO4磷酸緩沖液配制，碳化二亞胺溶液濃度為12.5 mg/mL0
[0013]7根據(jù)權利要求1和6所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:所加入脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶，酶用量:載體量=1:1 (質(zhì)量比)。
[0014]8根據(jù)權利要求1、6和7所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:脂肪酶固定化反應的水浴溫度為2(T30°C，反應時間為2(Γ30小時。
[0015]9根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:溶劑為正己烷與水的混合物，醇油質(zhì)量比為3:1，固定化脂肪酶占油的質(zhì)量分數(shù)為20%，水體積為反應介質(zhì)體積的15?25%。
[0016]10根據(jù)權利要求1和9所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:催化制備生物柴油的反應溫度為40°C，反應時間為1(Γ15小時。
[0017]本發(fā)明的有益效果。
[0018]I制得的固定化酶在熱穩(wěn)定性，耐酸堿能力、重復利用率及貯藏穩(wěn)定性等方面比游離酶有了很大程度提高，尤其是反應鍵合，酶與載體結合牢固。當溫度升高至55°C時，固定化酶活性保持在75%左右，而游離酶活性僅保留10% ;使用葡萄糖酸改性的磁性顆粒作載體固定化酶反復使用7次后，活性仍然能維持90%以上；在儲存30天后，以葡萄糖酸改性的磁性顆粒作載體的固定化酶活性與游離酶對比有明顯優(yōu)勢，分別為85%和20%。
[0019]2使用葡萄糖酸改性的磁性顆粒固定化酶催化生產(chǎn)生物柴油，甲醇用量少，后處理簡單，轉化率高。甲醇對酶蛋白具有抑制作用，其分批加入減小了甲醇在反應體系中的濃度，酶蛋白可以更好地發(fā)揮催化作用，同時有利于反應平衡向正反應方向進行；溶劑的加入增大了催化劑和底物間的傳質(zhì)速度，提高了催化效率；反應后固定化酶易于分離，重復使用7次后，轉化率仍達90%以上，大大降低了生產(chǎn)成本。

【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0021]I化學共沉淀法合成四氧化三鐵納米顆粒
將摩爾比為1:2的硫酸亞鐵和氯化鐵固體溶解在適量的的稀鹽酸中。待鐵離子溶液呈透明狀后將其轉入四頸圓底燒瓶中，在氮氣保護、劇烈攪拌下，連續(xù)滴加1.5 mo I/L NaOH溶液至pH=10，室溫下反應30分鐘后，水浴溫度升至80°C水浴晶化2小時。磁鐵分離磁性顆粒，去離子水反復洗滌至中性后，得到Fe3O4納米顆粒。
[0022]2磁性四氧化三鐵納米顆粒的表面改性
磁性Fe3O4納米顆粒通過超聲，均勻分散到20.0 mL去離子水中，將10.0 mL由0.5 g氫氧化鈉和0.5 g葡萄糖酸配制的水溶液逐滴加入磁性顆粒膠體中，在30°C水浴鍋中，劇烈攪拌反應4小時。用磁鐵分離改性的Fe3O4納米顆粒。去離子水反復洗滌，80°C真空干燥，密封保存?zhèn)溆谩?br> [0023]3葡萄糖酸改性的磁性顆粒作載體制備固定化脂肪酶
取5.0 mg載體，加入到2.0mL pH=8.0磷酸緩沖溶液，加入1.0mL 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺溶液(12.5 mg/mL磷酸緩沖液)，超聲10分鐘，再加入2.0 mL
2.5mg/mL南極假絲酵母脂肪酶溶液，超聲30分鐘，25°C，水浴搖床振蕩24小時，過濾，磷酸緩沖液洗滌三次，40°C真空干燥24小時，得到固定化脂肪酶。
[0024]4固定化脂肪酶催化制備生物柴油
具塞錐形瓶中加入2.0g大豆油、2.0g甲醇、2.0mL正己燒、0.5mL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴搖床振蕩反應12小時，反應過程中分兩次分別加入2.0g甲醇，轉化率為92%。
[0025]5固定化脂肪酶催化制備生物柴油
具塞錐形瓶中加入2.0g大豆油、2.0g甲醇、3.0mL正己燒、0.5mL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴搖床振蕩反應15小時，反應過程中分兩次分別加入2.0g甲醇，轉化率為89%。
[0026]6固定化脂肪酶催化制備生物柴油
具塞錐形瓶中加入2.0g大豆油、3.0g甲醇、3.0mL正己燒、ImL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴搖床振蕩反應12小時，反應過程中加入3.0g甲醇，轉化率為77%。
[0027]7固定化脂肪酶催化制備生物柴油具塞錐形瓶中加入2.0g大豆油、1.0g甲醇、2.0mL正己燒、0.5mL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴搖床振蕩反應12小時，反應過程中分兩次分別加入2.5g甲醇，轉化率為85%。
[0028]8固定化脂肪酶催化制備生物柴油具塞錐形瓶中加入2.0g大豆油、1.5g甲醇、4.0mL正己燒、1.5mL水和0.4g固定化脂肪酶，40°C水浴搖床振蕩反應12小時，反應過程中分三次分別加入1.5g甲醇，轉化率為73%。
【權利要求】
1.一種磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:取適當比例亞鐵和鐵無機鹽混和物水溶液，氮氣保護下滴加無機堿控制合適PH值，攪拌反應30分鐘，水浴條件下晶化2小時，磁場分離出大表面積、穩(wěn)定的Fe3O4納米顆粒；水浴攪拌條件下將葡萄糖酸弱堿性水溶液滴加到磁性Fe3O4顆粒膠體中，劇烈攪拌反應數(shù)小時，磁場分離出葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性顆粒，真空干燥；取葡萄糖酸改性的磁性Fe3O4顆粒載體與1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液超聲分散后加入脂肪酶溶液，超聲分散，振蕩反應數(shù)小時，過濾，磷酸緩沖液洗滌，真空干燥得磁性載體固定化脂肪酶；取適量大豆油、甲醇、溶劑和制備的固定化脂肪酶于恒溫振蕩器中反應，反應過程中分批加入甲醇。
2.根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:亞鐵和鐵無機鹽為氯化物或硫酸鹽，亞鐵和鐵無機鹽摩爾比為1:1.5?3。
3.根據(jù)權利要求1和2所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:鐵和亞鐵無機鹽混和物水溶液反應時，滴加的無機堿為氨水或氫氧化鈉水溶液，所控pH值為10?11。
4.根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:大表面積、穩(wěn)定的Fe3O4納米顆粒的制備通過反應溫度控制，攪拌下反應溫度為3(T60°C，水浴晶化溫度為7(T90°C。
5.根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:葡萄糖酸弱堿性水溶液中氫氧化鈉濃度為1.25mol/L，葡萄糖酸弱堿性水溶液濃度為25mg/mL,葡萄糖酸改性磁性Fe3O4顆粒反應的水浴溫度為25?40°C，真空干燥溫度為80°C。
6.根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:葡萄糖酸改性的Fe3O4磁性顆粒載體與1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺溶液超聲分散前均用PH=8.0的NaH2PO4-Na2HPO4磷酸緩沖液配制，碳化二亞胺溶液濃度為12.5mg/mL。
7.根據(jù)權利要求1和6所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:所加入脂肪酶為南極假絲酵母脂肪酶，酶用量:載體量=1:1 (質(zhì)量比)。
8.根據(jù)權利要求1、6和7所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:脂肪酶固定化反應的水浴溫度為2(T30°C，反應時間為2(Γ30小時。
9.根據(jù)權利要求1所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:溶劑為正己烷與水的混合物，醇油質(zhì)量比為3:1，固定化脂肪酶占油的質(zhì)量分數(shù)為20%，水體積為反應介質(zhì)體積的15?25%。
10.根據(jù)權利要求1和9所述的磁性載體固定化脂肪酶的制備及催化制備生物柴油，其特征是:催化制備生物柴油的反應溫度為40°C，反應時間為1(Γ15小時。
【文檔編號】C12N11/14GK104404023SQ201410614900
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年11月5日 優(yōu)先權日:2014年11月5日
【發(fā)明者】崔玉, 隋穎, 孫國新 申請人:濟南大學