一種天然皮革的dna鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于熒光定量PCR檢測(cè)豬皮革的特異性引物對(duì)和特異性探針及其檢測(cè)方法，所述特異性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，所述特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本發(fā)明的方法可簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)和鑒定豬皮革樣品，設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)和特異性探針的特異性好，靈敏度佳，可檢測(cè)到含量為1ng的豬皮革DNA。
【專利說明】-種天然皮革的DNA鑒別方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說，是關(guān)于一種天然皮革的DNA鑒別方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 皮革制品的材質(zhì)屬性既是產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素，又與市場(chǎng)價(jià)格直接掛鉤，因而關(guān) 系到消費(fèi)者的切身利益。按其來源可分為羊皮革、牛皮革、豬皮革、馬皮革等，因其種類不同 價(jià)格差異懸殊。市場(chǎng)上充斥著人造皮革假冒天然皮革，以次等的動(dòng)物皮革冒充質(zhì)優(yōu)的動(dòng)物 皮革等現(xiàn)象，擾亂了市場(chǎng)的秩序，也損害了消費(fèi)者的權(quán)益。目前天然皮革的主要還要是外觀 和嗅覺檢測(cè)為主，有經(jīng)驗(yàn)的操作人員根據(jù)天然皮革特有的氣味，皮質(zhì)的厚度，以前表面毛孔 的排布確定皮革的種類。
[0003] 隨著皮革加工技術(shù)的不斷發(fā)展，貼膜革、移膜革、壓花革等新產(chǎn)品不斷涌現(xiàn)，給不 法分子以次充好創(chuàng)造了條件。豬皮革是最為常見、廉價(jià)的一種皮革，常被用來制成皮包、皮 鞋、皮衣、沙發(fā)等家具，具有堅(jiān)固耐用的特點(diǎn)。豬皮革也常加工修飾，用于冒充牛皮等價(jià)格較 高的皮革制品，令人防不勝防。因此，有必要提供一種能夠快速、準(zhǔn)確地鑒別豬皮革的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明是一種基于DNA檢測(cè)技術(shù)的豬皮革的定性鑒別方法，克服了現(xiàn)有的感官法 和顯微鏡法準(zhǔn)確性差的不足。
[0005] 本發(fā)明的目的在于，提供一種用于熒光定量PCR檢測(cè)豬皮革的特異性引物對(duì)和特 異性探針。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于，提供一種采用熒光定量PCR檢測(cè)豬皮革的方法。
[0007] 本發(fā)明的再一目的在于，提供一種豬皮革的檢測(cè)試劑盒。
[0008] 本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：
[0009] 作為本發(fā)明的第一方面，一種用于熒光定量PCR檢測(cè)豬皮革的特異性引物對(duì)和特 異性探針，其中，所述特異性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDN0 :1和SEQIDN0 :2所示，所 述特異性探針的核苷酸序列如SEQIDN0 :3所示。
[0010] 作為本發(fā)明的第二方面，一種采用熒光定量PCR檢測(cè)豬皮革的方法，包括以下步 驟：
[0011] 步驟一、以豬皮革的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0012] 步驟二、檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)；
[0013] 其中，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有特異性引物對(duì)和特異性探針，所述特異性 引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDN0 :1和SEQIDN0 :2所示，所述特異性探針的核苷酸序列 如SEQIDN0 :3所示。
[0014] 其中，所述PCR擴(kuò)增的條件如下：
[0015]反應(yīng)體系：2XTaqmanUniversalMasterMixlOu1，DNA模板2u1，特異性引物終 濃度為600nM，特異性探針終濃度為400nM，用水補(bǔ)足至20iU;
[0016]反應(yīng)條件：95°C，10min;95°〇，158,601：，458,40個(gè)循環(huán)。
[0017] 作為本發(fā)明的第三方面，一種豬皮革的檢測(cè)試劑盒，含有以下試劑：
[0018] (a)特異性引物對(duì)，所述特異性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQIDN0 :1和SEQIDN0: 2所示；
[0019] (b)特異性探針，所述特異性探針的核苷酸序列如SEQIDN0 :3所示。
[0020] 其中，所述試劑盒還包括：
[0021] (c)標(biāo)準(zhǔn)參照物。
[0022] 其中，所述標(biāo)準(zhǔn)參照物為豬皮革DNA，或含有豬皮革擴(kuò)增目的片段的質(zhì)粒DNA，或 豬皮革。
[0023] 作為本發(fā)明的第四方面，所述豬皮革的檢測(cè)試劑盒可用于鑒定豬皮革。
[0024] 本發(fā)明的有益效果：
[0025] 1、可簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)和鑒定豬皮革樣品；
[0026] 2、本發(fā)明基于豬線粒體12SrRNA基因的序列，設(shè)計(jì)的特異性引物和特異性探針的 特異性好；
[0027] 3、檢測(cè)方法靈敏度高，可檢測(cè)到模板含量為lngDNA的樣品。
[0028] 本發(fā)明提供的針對(duì)豬皮革樣品檢測(cè)的特異性引物對(duì)和特異性探針具有高度的特 異性和靈敏度，能夠適用于不同工藝處理的豬皮革樣品的鑒別，具有廣泛的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為不同種屬的皮革標(biāo)準(zhǔn)樣品的熒光定量檢測(cè)結(jié)果。
[0030] 圖2為內(nèi)參基因的熒光定量檢測(cè)結(jié)果。
[0031] 圖3為不同濃度的豬皮革來源的DNA模板的熒光定量檢測(cè)結(jié)果。
[0032] 圖4為不同種屬和不同工藝處理的皮革樣品的顯微鏡觀察結(jié)果，其中，（a)為鹿皮 革；(b)為豬皮革；（c)為綿羊皮革；（d)為山羊皮革；（e)為牛皮革；(f)為豬皮革。
[0033] 圖5為不同種屬和不同工藝處理的皮革樣品的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實(shí)施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0035] 下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩?shí) 驗(yàn)室手冊(cè)》（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件或廠 商提供的條件進(jìn)行。
[0036]實(shí)施例1、皮革樣品的DNA提取方法
[0037]1. 1、樣品前處理
[0038] 首先用砂皮將皮革的表層或是表面涂層先除去，然后用剪刀剪碎或者冷凍研磨機(jī) 粉碎后，用〇. 〇3mol/L的Na2HP04溶液浸泡樣品，于50°C空氣浴不間斷震蕩6小時(shí)，用蒸餾 水浸泡皮革樣品至無色，每半小時(shí)換一次水，烘干待用。
[0039] 1. 2、裂解
[0040] 將烘干的樣品細(xì)細(xì)剪碎，取40mg至于2mlEP管內(nèi)，加入500i!L裂解緩沖液，上下 顛倒混勻，于60°C水浴20分鐘，每過5分鐘取出劇烈震蕩，冷卻至室溫，加入20個(gè)單位的 膠原蛋白酶，于37°C空氣浴，以500rmp的速度振蕩1小時(shí)，加入20個(gè)單位的蛋白酶K，于 50°C空氣浴，以500rmp的速度振蕩過夜，加入0. 5mL10mol/LNaOH溶液，于50°C空氣浴，以 150rmp的速度振蕩1小時(shí)，加入0. 2mL2mol/LTris-HCl(pH8. 0)，再加入0. 4mL濃HC1中和 該溶液。
[0041]其中，所述裂解緩沖液組成如下：lmol/LTris-HCl(pH8. 0) 5mL，500mmol/ LEDTA(pH8. 0)2mL，十二烷基硫酸鈉 0? 2g，蔗糖 1. 2g，NaC1170mg，二硫蘇糖醇（DIT)920mg， 補(bǔ)水至10mL。
[0042] 1.3、去除蛋白
[0043] 將裂解的樣品于lOOOOrpm離心3分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管內(nèi)，加入等體積的 苯酚氯仿溶液（1 :1)劇烈震蕩，4°C，12000rpm離心10分鐘，轉(zhuǎn)移水相至新的EP管，加入等 體積的氯仿，4°C，12000rpm離心10分鐘，去除殘留苯酚，轉(zhuǎn)移水相至新的EP管。
[0044] 1.4、沉淀DNA
[0045] 將去除蛋白的樣品加入0? 7V的異丙醇沉淀，4°C，12000rpm離心15分鐘，用70% 乙醇洗去殘留異丙醇，晾干，用適量水溶解DNA。
[0046] 1.5、純化0嫩
[0047] 將獲得的DNA樣品用磁珠（購(gòu)自Promega公司）純化，最終溶解體積為40iiL。
[0048] 實(shí)施例2、豬皮革熒光定量PCR檢測(cè)方法
[0049] 2. 1、豬皮革熒光定量PCR擴(kuò)增的引物和探針設(shè)計(jì)
[0050] 比較豬、牛、山羊、綿羊、馬、鹿線粒體DNA的序列，在12SrRNA基因中選擇種內(nèi)保 守、種間高變的區(qū)域設(shè)計(jì)引物對(duì)和探針。特異性引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為61bp。
[0051] 特異性引物對(duì)和特異性探針的序列如下：
[0052]PigF:5, -GCGCCCCGGTGAGAA-3'（SEQIDN0 :1)
[0053]PigR:5' -TGTGCTTGATACCTGCTCCTTTT-3'（SEQIDNO:2)
[0054]Ppig：FAM-CCCTCCAGATCCTAAAG-MGB(SEQIDNO：3)
[0055] 同時(shí)設(shè)計(jì)了豬、牛、山羊、綿羊、馬、鹿共有的通用引物，通用引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小 為171bp，通用引物對(duì)和通用探針的序列如下：
[0056]UniF:5' -AAAGGACTTGGCGGTGCTT-3'（SEQIDN0 :4)
[0057]UniR:5' -GGGTTTGCTGAAGATGGCG-3'（SEQIDNO:5)
[0058]Puni：FAM-TAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCG-TAMARA(SEQIDNO：6)
[0059] 其中，F(xiàn)AM表示熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB和TAMARA表示淬滅基團(tuán)。本發(fā)明采用熒光探針 法，其檢測(cè)原理是利用熒光標(biāo)記特異性探針來識(shí)別模板。與現(xiàn)有技術(shù)中SYBR染料法相比， 本發(fā)明熒光標(biāo)記特異性探針的特異性更強(qiáng)。
[0060] 2. 2、熒光定量PCR的反應(yīng)條件
[0061]反應(yīng)體系如下：AB公司的 2XTaqmanUniversalMasterMix(Part No. 4440040) 10ill，DNA模板2ill，引物和探針，用水補(bǔ)足至20ill。其中，特異性引物的 終濃度分別為600nM，特異性探針的終濃度為400nM，通用引物和通用探針的終濃度分別為 300nM〇
[0062]反應(yīng)條件如下：95°C，10min;951：，158,601：，458,40個(gè)循環(huán)。
[0063] 2. 3、特異性檢測(cè)
[0064] 將豬、馬、山羊、綿羊、牛、鹿皮革標(biāo)準(zhǔn)樣品提取DNA，以其中濃度最低的DNA為準(zhǔn)， 將其余樣品均稀釋至SOng/yL左右，然后使用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)和探針進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果如表1、圖1和圖2所示。
[0065] 表1、不同種屬的皮革標(biāo)準(zhǔn)樣品的特異性檢測(cè)結(jié)果
[0066]
[0067]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于熒光定量PCR檢測(cè)豬皮革的特異性引物對(duì)和特異性探針，其特征在于，所 述特異性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示，所述特異性探針的核 苷酸序列如SEQ ID NO : 3所示。
2. -種采用熒光定量PCR檢測(cè)豬皮革的方法，包括以下步驟： 步驟一、以豬皮革的DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 步驟二、檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)； 其特征在于，用于PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中含有特異性引物對(duì)和特異性探針，所述特異 性引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2所示，所述特異性探針的核苷酸序 列如SEQ ID NO :3所示。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件如下： 反應(yīng)體系：2XTaqman Universal Master Mix 10lil，DNA 模板 2ul，特異性引物終濃 度為600nM，特異性探針終濃度為400nM，用水補(bǔ)足至20iU ; 反應(yīng)條件：95°C，10min ;951：，158,601：，458,40個(gè)循環(huán)。
4. 一種豬皮革的檢測(cè)試劑盒，含有以下試劑： (a) 用于熒光定量PCR檢測(cè)豬皮革的特異性引物對(duì)，所述特異性引物對(duì)的核苷酸序列 如 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2 所示； (b) 用于熒光定量PCR檢測(cè)豬皮革的特異性探針，所述特異性探針的核苷酸序列如SEQ ID NO :3 所示。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括： (c) 標(biāo)準(zhǔn)參照物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述標(biāo)準(zhǔn)參照物為豬皮革DNA，或含有 豬皮革擴(kuò)增目的片段的質(zhì)粒DNA，或豬皮革。
7. 如權(quán)利要求4?6中任一項(xiàng)所述的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于，用于鑒定豬皮革。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328186SQ201410614016
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月4日
【發(fā)明者】孫美蓉, 費(fèi)靜, 陳青, 周之平, 王濤, 張昌盛 申請(qǐng)人:上海出入境檢驗(yàn)檢疫局工業(yè)品與原材料檢測(cè)技術(shù)中心, 北京自然博物館