一種診斷先天性脊柱側(cè)凸的產(chǎn)品及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種診斷先天性脊柱側(cè)凸的產(chǎn)品，該產(chǎn)品通過檢測染色體16p11.2微缺失或TBX6基因移碼突變存在與否，以及另一條同源染色體上的TBX6基因中rs3809624-rs3809627兩個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型來做出判斷。本發(fā)明的診斷試劑盒靈敏，可用于早期先天性脊柱側(cè)凸的診斷。
【專利說明】一種診斷先天性脊柱側(cè)凸的產(chǎn)品及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，涉及一種診斷疾病的產(chǎn)品及其應(yīng)用，具體涉及一種先 天性脊柱側(cè)凸的產(chǎn)品及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 微陣列比較基因組雜交（array-comparativegenomichybridization, Array-CGH)是在傳統(tǒng)的CGH基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項(xiàng)高通量分析技術(shù)。該技術(shù)將BAC克隆 DNA或寡聚核苷酸做成微陣列，代替?zhèn)鹘y(tǒng)CGH檢測中將中期染色體作為雜交靶進(jìn)行檢測，不 僅使分辨率提高，而且還可以提供精確定位。同時(shí)可經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件識別每條染色體，克服了 需要經(jīng)驗(yàn)豐富的人員識別染色體的限制，為快速全面的分析DNA拷貝數(shù)的變化，以及染色 體不穩(wěn)定性檢測提供了較為理想的方法。該技術(shù)從組織細(xì)胞中提出基因組DNA后將等量不 同熒光標(biāo)記的待測樣本與參照DNA經(jīng)人Cot-IDNA封閉非特異性重復(fù)序列后，同時(shí)雜交到由 DNA或寡聚核苷酸組成的微陣列上。用微陣列每個(gè)靶點(diǎn)上兩種信號的熒光比例反映待測基 因組DNA在相應(yīng)序列或基因上的拷貝數(shù)變化。自1995年斯坦福大學(xué)Schena等在科學(xué)雜志 上發(fā)表第一篇利用基因芯片技術(shù)研究基因水平的文章以來，這一技術(shù)已應(yīng)用于多種先天缺 陷、腫瘤性疾病發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)基因及診斷指標(biāo)的篩選，特別是用于多種惡性腫瘤分子分 型及對治療反應(yīng)、腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和預(yù)后的預(yù)測等研究，并取得了很多成果。其研究內(nèi)容主要 包括腫瘤基因拷貝數(shù)的改變、特定基因區(qū)域分析以及一系列臨床應(yīng)用相關(guān)研究，如：協(xié)助病 理分型診斷、篩選腫瘤預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物等等。
[0003] 先天性脊柱側(cè)凸（Congenitalscoliosis,CS)是一種常見的脊椎疾病，新生兒患 病幾率為0. 5-1%。。CS的臨床表現(xiàn)為脊柱側(cè)彎超過10度，這是由于胚胎的發(fā)育過程中脊柱 畸形（半椎體畸形、分節(jié)障礙、蝴蝶椎、并肋等）引起的脊柱縱向生長不平衡導(dǎo)致的。CS可 以影響生理和心理的健康，已經(jīng)成為青少年殘疾的一個(gè)主要的因素。
[0004] 以往認(rèn)為，大多數(shù)先天性脊柱側(cè)凸是非遺傳性的，是胚胎在發(fā)育過程中由環(huán)境因 素引起的。近年來，已有研究表明遺傳因素參與了CS的發(fā)病機(jī)制。以前在動物模型中的基 因操作實(shí)驗(yàn)表明遺傳缺陷導(dǎo)致了脊椎異常。有趣地是，已表明人類基因（例如，DLL3，HES7， MESP2和T)的一些突變參與了CS的過程；然而，這些突變可從表型正常的家族成員那遺傳 而來。家族內(nèi)部相同突變導(dǎo)致的不同表型的差異說明了人類CS遺傳變異的復(fù)雜性?；?與環(huán)境的相互作用已被提出用于解釋上述現(xiàn)象。
[0005] 已有多項(xiàng)研究報(bào)道，人類染色體16pll. 2的微缺失患者有CS的表型，故我們假設(shè) 遺傳修飾因子和輔助因子可能是CS遺傳變異的另一機(jī)制。人類染色體16pll. 2大約0. 6Mb 的缺失是人類的罕見突變，其突變頻率大約是〇. 02%。該缺失能夠引起神經(jīng)發(fā)育相關(guān)疾病 (例如，孤獨(dú)癥和肥胖）。有趣的是，近來在一小部分16pll. 2微缺失的病人中發(fā)現(xiàn)了CS的 表型，表明16pll. 2微缺失可能參與了CS的發(fā)病機(jī)制。另外，CS的16pll. 2微缺失的低外 顯率也強(qiáng)調(diào)了人類CS遺傳機(jī)制的復(fù)雜性。
[0006] 雖然CS往往是在嬰兒或幼兒時(shí)期發(fā)現(xiàn)，但也有許多患兒直到他們的青少年時(shí)期 才表現(xiàn)出來。由于診斷常識和診斷手段缺乏等原因，病變常為家長和醫(yī)生忽視，直至畸形發(fā) 展明顯后才被發(fā)現(xiàn)。現(xiàn)在診斷先天性脊柱側(cè)凸常用的方法包括X線、MRI等，但這些方法只 適用于病變明顯的患者使用，對于那些潛在的還未有明顯表型的患者并不適用，因此開發(fā) 一種靈敏的能夠早期診斷先天性脊柱側(cè)凸的方法是亟待解決的問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種診斷先天性脊柱側(cè)凸的產(chǎn)品，使用該產(chǎn)品的檢測相比 傳統(tǒng)的使用醫(yī)療器械的檢測更為靈敏，適合先天性脊柱側(cè)凸的早期診斷。本發(fā)明還提供了 用于診斷先天性脊柱側(cè)凸的方法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0009] -方面，本發(fā)明提供了一種診斷先天性脊柱側(cè)凸的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠檢測染色 體16pll. 2區(qū)域是否存在突變。
[0010] 本發(fā)明提供的診斷先天性脊柱側(cè)凸的產(chǎn)品可以是診斷試劑盒，該診斷試劑盒包括 能夠檢測染色體16pll. 2區(qū)域是否存在突變的試劑。
[0011] 染色體16pll. 2區(qū)域的突變包括核苷酸缺失、核苷酸插入、核苷酸突變。染色 體16pll. 2區(qū)域的核苷酸微缺失是指染色體16pll. 2區(qū)域長度為0.6Mb的核苷酸序 列的缺失，簡稱16pll. 2微缺失。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的診斷先天性脊 柱側(cè)凸的試劑盒中的試劑包括能夠檢測16pll. 2微缺失存在與否的試劑，該試劑包括 擴(kuò)增染色體16pll. 2區(qū)域29. 5Mb到30. 1Mb間長度為0.6Mb的核苷酸序列的引物，所 述引物序列如下：P1位點(diǎn)正向引物5 ' -GGGGAAGGAACTTACATGAC-3 '、P1位點(diǎn)反向引物 5 ' -TCGTGITTCCCTGITGTACC-3'、PA位點(diǎn)正向引物 5 ' -GGTCTAAGCCACACACTAAC-3'、PA位點(diǎn)反 向引物 5' -TGAGTTTAGGGACCAATCTA-3'、PB位點(diǎn)正向引物 5' -GCTGCCAGTATGTGACCGAGA-3'、 PB位點(diǎn)反向引物 5 ' -GGGTGGAGGAGAGGATAGGG-3 '。
[0012] 作為一種可替代的實(shí)施方案，本發(fā)明提供的診斷先天性脊柱側(cè)凸的試劑盒中 的試劑包括能夠檢測染色體16pl1. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因rs3809624和/或rs3809627 位點(diǎn)的基因型的試劑。能夠檢測所述染色體16pll.2區(qū)域內(nèi)TBX6基因rs3809624 和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的試劑包括構(gòu)建含有TBX6基因的重組載體的引物， 所述引物序列如下：T7反向引物5' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3'、SP6反向引 物 5' -GTAITCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、CS正向引物 5'-GACTCACTATAGGGCGAGGGGAA GGGAGCGGGAGGTTTGTG-3'、CS反向引物5'-GGTGACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCCGGGAA GTGTAGT-3'。優(yōu)選地，所述能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因rs3809624 和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物， 所述引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、5' -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3'、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
[0013] 作為一種可替代的實(shí)施方案，本發(fā)明提供的診斷先天性脊柱側(cè)凸的試劑盒 中的試劑包括能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因核苷酸移碼突變存 在與否的試劑，上述試劑包括擴(kuò)增TBX6基因的引物，所述引物序列如下：正向引物 5 ' -TAGGGAGAGGGCTCTGITCTCATGG-3 '、反向引物 5 ' -GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3 '。優(yōu)選地， 所述能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑還包 括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物，所述引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、 -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、5, -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、 -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、5, -AATGGCTTCCTAACAGATGAd、 5' _GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3'5' -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3'。
[0014] 作為一種可替代的實(shí)施方案，本發(fā)明提供的診斷先天性脊柱側(cè)凸的試劑盒中的試 劑包括能夠檢測16pll. 2微缺失存在與否的試劑、能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi) TBX6基因rs3809624和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的試劑。所述能夠檢測16pll. 2微 缺失存在與否的試劑包括擴(kuò)增染色體16pll. 2區(qū)域長度為0. 6Mb的核苷酸序列的引物， 所述引物序列如下：P1位點(diǎn)正向引物5 ' -GGGGAAGGAACTTACATGAC-3 '、P1位點(diǎn)反向引物 5 ' -TCGTGITTCCCTGITGTACC-3'、PA位點(diǎn)正向引物 5 ' -GGTCTAAGCCACACACTAAC-3'、PA位點(diǎn)反 向引物 5' -TGAGTTTAGGGACCAATCTA-3'、PB位點(diǎn)正向引物 5' -GCTGCCAGTATGTGACCGAGA-3'、 PB位點(diǎn)反向引物5' -GGGTGGAGGAGAGGATAGGG-3'。所述能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域 內(nèi)TBX6基因rs3809624和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的試劑包括構(gòu)建含有TBX6基因 的重組載體的引物，所述引物序列如下：!7反向引物5' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3'、 SP6 反向引物 5' -GTAITCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、CS正向引物 5'-GACTCACTATAGGG CGAGGGGAAGGGAGCGGGAGGTTTGTG-3'、CS反向引物5'-GGTGACACTATAGAATACGCGCTGAGC CTGCCGGGAAGTGTAGT-3 '。優(yōu)選地，所述能夠檢測所述染色體16p11. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因 rs3809624和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的 引物，所述引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、5' -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3'、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
[0015] 作為一種可替代的實(shí)施方案，本發(fā)明提供的診斷先天性脊柱側(cè)凸的試劑盒中的試 劑包括能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑、能 夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因rs3809624和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的 試劑。所述能夠檢測染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑包括 擴(kuò)增TBX6基因的引物，所述引物序列如下：正向引物5'-TAGGGAGAGGGCTCTGTTCTCATGG-3'、 反向引物5' -GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3'。優(yōu)選地，所述能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū) 域內(nèi)TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引 物，所述引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、5' -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3'、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5 ' -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3 '。所述能夠檢測所述染色體16p11. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因 rs3809624和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的試劑包括構(gòu)建含有TBX6基因的重組載體 的引物，所述引物序列如下反向引物5' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3'、SP6反 向引物 5' -GTAITCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、CS正向引物 5'-GACTCACTATAGGGCGAGGGG AAGGGAGCGGGAGGTTTGTG-3'、CS反向引物 5'-GGTGACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCCGGGA AGTGTAGT-3'。優(yōu)選地，所述能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因rs3809624 和/或rS3809627位點(diǎn)的基因型的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物， 所述引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、5' -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3'、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3,、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
[0016]作為一種可替代的實(shí)施方案，本發(fā)明提供的診斷先天性脊柱側(cè)凸的試劑盒中 的試劑包括能夠檢測16pll. 2微缺失存在與否的試劑、能夠檢測所述染色體16pll. 2 區(qū)域內(nèi)TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑。所述能夠檢測16pll. 2微缺失存 在與否的試劑包括擴(kuò)增染色體16pll. 2區(qū)域長度為0.6Mb的核苷酸序列的引物，所 述引物序列如下：P1位點(diǎn)正向引物5 ' -GGGGAAGGAACTTACATGAC-3 '、P1位點(diǎn)反向引物 5 ' -TCGTGITTCCCTGITGTACC-3'、PA位點(diǎn)正向引物 5 ' -GGTCTAAGCCACACACTAAC-3'、PA位點(diǎn)反 向引物 5' -TGAGTTTAGGGACCAATCTA-3'、PB位點(diǎn)正向引物 5' -GCTGCCAGTATGTGACCGAGA-3'、 PB位點(diǎn)反向引物5' -GGGTGGAGGAGAGGATAGGG-3'。所述能夠檢測染色體16pll. 2 區(qū)域內(nèi)TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑包括擴(kuò)增TBX6基因的引物， 所述引物序列如下：正向引物5' -TAGGGAGAGGGCTCTGTTCTCATGG-3'、反向引物 5 ' -GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3 '。優(yōu)選地，所述能夠檢測所述染色體16p11. 2區(qū)域內(nèi) TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引 物，所述引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、5' -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3'、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3,、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
[0017]作為一種可替代的實(shí)施方案，本發(fā)明提供的診斷先天性脊柱側(cè)凸的試劑盒中的 試劑包括能夠檢測16pll. 2微缺失存在與否的試劑、能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域 內(nèi)TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑、能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi)TBX6 基因rs3809624和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的試劑。所述能夠檢測16pll. 2微缺 失存在與否的試劑包括擴(kuò)增染色體16pll. 2區(qū)域長度為0.6Mb的核苷酸序列的引物， 所述引物序列如下：P1位點(diǎn)正向引物5 ' -GGGGAAGGAACTTACATGAC-3 '、P1位點(diǎn)反向引物 5 ' -TCGTGITTCCCTGITGTACC-3'、PA位點(diǎn)正向引物 5 ' -GGTCTAAGCCACACACTAAC-3'、PA位點(diǎn)反 向引物 5' -TGAGTTTAGGGACCAATCTA-3'、PB位點(diǎn)正向引物 5' -GCTGCCAGTATGTGACCGAGA-3'、 PB位點(diǎn)反向引物5' -GGGTGGAGGAGAGGATAGGG-3'。所述能夠檢測染色體16pll. 2 區(qū)域內(nèi)TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑包括擴(kuò)增TBX6基因的引物， 所述引物序列如下：正向引物5 ' -TAGGGAGAGGGCTCTGTTCTCATGG-3 '、反向引物 5 ' -GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3 '。優(yōu)選地，所述能夠檢測所述染色體16p11. 2區(qū)域內(nèi) TBX6基因核苷酸移碼突變存在與否的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引 物，所述引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、5' -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3'、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3,、 5 ' -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3 '。所述能夠檢測所述染色體16p11. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因 rs3809624和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的試劑包括構(gòu)建含有TBX6基因的重組載體 的引物，所述引物序列如下：17反向引物5 ' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3 '、SP6反 向引物 5' -GTAITCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、CS正向引物 5'-GACTCACTATAGGGCGAGGGG AAGGGAGCGGGAGGTTTGTG-3'、CS反向引物 5'-GGTGACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCCGGGA AGTGTAGT-3'。優(yōu)選地，所述能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域內(nèi)TBX6基因rs3809624 和/或rS3809627位點(diǎn)的基因型的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物， 所述引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、5' -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3'、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
[0018]優(yōu)選地，本發(fā)明的診斷試劑盒還包括基因組DNA的提取試劑。更優(yōu)選地，DNA提取 試劑包括苯酚、氯仿、異丙醇、乙醇。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供了上述診斷產(chǎn)品在制備診斷先天性脊柱側(cè)凸產(chǎn)品和/或治 療先天性脊柱側(cè)凸產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0020] 又一方面，本發(fā)明提供了一種檢測染色體16pll. 2區(qū)域突變的方法，所述方法包 括檢測染色體16pll. 2微缺失的方法。優(yōu)選地，所述檢測染色體16pll. 2微缺失的方法包 括使用高密度寡核苷酸比較基因組雜交微陣列。更優(yōu)選地，所述檢測染色體16pll. 2微缺 失的方法包括使用QPCR初篩和高密度寡核苷酸比較基因組雜交微陣列驗(yàn)證。
[0021] 所述QPCR的具體操作方案為：在16pll. 2微缺失區(qū)域選擇兩個(gè)檢測位點(diǎn)PA 和PB、在16pll. 2微缺失區(qū)域外選擇一個(gè)參照位點(diǎn)P1，使用P1和PA或P1和PB組合 設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增不同的片段，常規(guī)QPCR方法檢測片段的存在量。在具體的實(shí)施方案中， 上述引物序列如下：P1位點(diǎn)正向引物5 ' -GGGGAAGGAACTTACATGAC-3 '、P1位點(diǎn)反向引物 5 ' -TCGTGITTCCCTGITGTACC-3'、PA位點(diǎn)正向引物 5 ' -GGTCTAAGCCACACACTAAC-3'、PA位點(diǎn)反 向引物 5 ' -TGAGTTTAGGGACCAATCTA-3'、PB位點(diǎn)正向引物 5 ' -GCTGCCAGTATGTGACCGAGA-3 '、 PB位點(diǎn)反向引物 5 ' -GGGTGGAGGAGAGGATAGGG-3 '。
[0022] 作為一種可替代的實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測染色體16pll. 2區(qū)域突變的方 法包括檢測TBX6基因移碼突變方法和/或檢測TBX6基因中rs3809624位點(diǎn)和/或 rs3809627位點(diǎn)基因型的方法。所述檢測TBX6基因移碼突變的方法包括：（1)設(shè)計(jì) 合理的引物，將TBX6基因編碼區(qū)和將近lkb的上游調(diào)控區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；（2)利用測序 引物對步驟（1)中的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增引物序列如下：正向引物 5'-TAGGGAGAGGGCTCTGITCTCATGG-3'；反向引物5'-GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3'。所 述測序引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、5' -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3'、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3,、 5' -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3'。所述檢測TBX6 基因中rs3809624 位點(diǎn)和 / 或rs3809627 位點(diǎn)基因型的方法包括：（1)擴(kuò)增載體和插入的DNA片段，連接，構(gòu)建TBX6基因的重組 載體；（2)將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中；（3)挑選克隆，設(shè)計(jì)測序用引物使 用sanger測序進(jìn)行序列的檢測。優(yōu)選地，所述載體是pGEM-T。所述構(gòu)建TBX6基因的 重組載體中所需的引物序列如下：T7反向引物5 ' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3 '、 SP6 反向引物 5' -GTAITCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、CS正向引物 5'-GACTCACTATAGGGCG AGGGGAAGGGAGCGGGAGGTTTGTG-3'、CS反向引物 5'-GGTGACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCC GGGAAGTGTAGT-3 '。優(yōu)選地，所述測序用的引物序列如下：5 ' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3 '、 -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、5, -GTTGCATACTGATCCCGAAT-S、 -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、5, -AATGGCTTCCTAACAGATGAd、 5' -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3'5' -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3'。
[0023] 作為一種可替代的實(shí)施方案，本發(fā)明的檢測染色體16pll. 2區(qū)域突變的方法包 括檢測染色體16pll. 2微缺失的方法和檢測TBX6基因移碼突變方法和/或檢測TBX6 基因中rs3809624位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的方法。優(yōu)選地，所述檢測染色體 16pll. 2微缺失的方法包括使用高密度寡核苷酸比較基因組雜交微陣列。更優(yōu)選地，所 述檢測染色體16pll. 2微缺失的方法包括使用QPCR初篩和高密度寡核苷酸比較基因組 雜交微陣列驗(yàn)證。所述QPCR的具體操作方案為：在16pll. 2微缺失區(qū)域選擇兩個(gè)檢測位 點(diǎn)PA和PB、在16pll. 2微缺失區(qū)域外選擇一個(gè)參照位點(diǎn)P1，使用P1和PA或P1和PB組 合設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增不同的片段，常規(guī)QPCR方法檢測片段的存在量。在具體的實(shí)施方案中， 上述引物序列如下：P1位點(diǎn)正向引物5 ' -GGGGAAGGAACTTACATGAC-3 '、P1位點(diǎn)反向引物 5 ' -TCGTGITTCCCTGITGTACC-3'、PA位點(diǎn)正向引物 5 ' -GGTCTAAGCCACACACTAAC-3'、PA位點(diǎn)反 向引物 5 ' -TGAGTTTAGGGACCAATCTA-3'、PB位點(diǎn)正向引物 5 ' -GCTGCCAGTATGTGACCGAGA-3 '、 PB位點(diǎn)反向引物5 ' -GGGTGGAGGAGAGGATAGGG-3 '。所述檢測TBX6基因移碼突變的方法包 括：（1)設(shè)計(jì)合理的引物，將TBX6基因編碼區(qū)和將近lkb的上游調(diào)控區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；（2)利 用測序引物對步驟（1)中的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。優(yōu)選地，所述擴(kuò)增引物序列如下：正向引 物 5' -TAGGGAGAGGGCTCTGITCTCATGG-3' ；反向引物 5' -GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3'。所 述測序引物序列如下：5' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3'、5' -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3'、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5' -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3'。所述檢測TBX6 基因中rs3809624 位點(diǎn)和 / 或rs3809627 位點(diǎn)基因型的方法包括：（1)擴(kuò)增載體和插入的DNA片段，連接，構(gòu)建TBX6基因的重組 載體；(2)將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中；(3)挑選克隆，設(shè)計(jì)測序用引物使 用sanger測序進(jìn)行序列的檢測。優(yōu)選地，所述載體是pGEM-T。所述構(gòu)建TBX6基因的 重組載體中所需的引物序列如下：T7反向引物5 ' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3 '、 SP6 反向引物 5' -GTAITCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、CS正向引物 5'-GACTCACTATAGGGCG AGGGGAAGGGAGCGGGAGGTTTGTG-3'、CS反向引物 5'-GGTGACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCC GGGAAGTGTAGT-3 '。優(yōu)選地，所述測序用的引物序列如下：5 ' -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3 '、 -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、5, -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、 -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、5, -AATGGCTTCCTAACAGATGAd、 5' -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3'5' -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3'。
[0024] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的檢測染色體16pll. 2區(qū)域突變的方法還包括提取基因組 DNA的方法。
[0025] 又一方面，本發(fā)明提供了一種診斷先天性脊柱側(cè)凸的方法，所述方法包括以下步 驟：
[0026] (1)提取檢測個(gè)體的基因組DNA;
[0027] (2)檢測染色體16pll. 2區(qū)域是否存在突變。
[0028] 優(yōu)選地，所述檢測染色體16pll. 2區(qū)域是否存在突變包括檢測所述染色體 16pll. 2區(qū)域是否存在16pll. 2微缺失、檢測無16pll. 2微缺失的同源染色體上TBX6基因 rs3809624-rs3809627兩個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型。當(dāng)所述染色體16pll. 2區(qū)域存在16pll. 2 微缺失，同時(shí)在無16pll. 2微缺失的同源染色體上TBX6基因rs3809624-rs3809627兩個(gè) SNP位點(diǎn)的單倍型為C-A時(shí)，診斷個(gè)體為先天性脊柱側(cè)凸患者。
[0029] 優(yōu)選地，所述檢測染色體16pll. 2區(qū)域是否存在突變包括檢測所述染色體 16pll. 2區(qū)域中TBX6基因是否存在核苷酸移碼突變、檢測無TBX6基因核苷酸移碼突變的 同源染色體上的TBX6基因rs3809624-rs3809627兩個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型。所述染色體 16pll. 2區(qū)域中TBX6基因存在以下單核苷酸插入和雙核苷酸缺失：C1248位插入T、C263插 入C、C697插入G、C1167插入C、C1179位雙缺失AG導(dǎo)致的核苷酸移碼突變中的一種或幾 種，同時(shí)無TBX6基因核苷酸移碼突變的同源染色體上的TBX6基因rs3809624-rs3809627 兩個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型為C-A時(shí)，診斷個(gè)體為先天性脊柱側(cè)凸患者。
[0030] 優(yōu)選地，基因組DNA自外周血白細(xì)胞中提取。提取檢測個(gè)體的基因組DNA按照本 領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)進(jìn)行。
[0031] 檢測染色體16pll. 2微缺失的方法包括使用高密度寡核苷酸比較基因組雜交微 陣列和QPCR。優(yōu)選地，本發(fā)明使用QPCR方法進(jìn)行染色體16pll. 2微缺失的初篩，而后利用 比較基因組雜交微陣列來驗(yàn)證。比較基因組雜交微陣列分為基因組廣泛的基因組雜交微陣 列和客戶設(shè)計(jì)的靶向基因組雜交微陣列，后者是客戶根據(jù)選定的目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)寡核苷酸制 備的。
[0032] 利用QPCR檢測染色體16pll. 2微缺失的原理是：在16pll. 2微缺失區(qū)域選擇兩個(gè) 檢測位點(diǎn)（命名為PA和PB)、在16pll. 2微缺失區(qū)域外選擇一個(gè)參照位點(diǎn)（命名為P1)，使 用P1和PA或P1和PB組合使用擴(kuò)增不同的片段，QPCR檢測片段的存在量。
[0033] 檢測無16pll. 2微缺失的同源染色體上的TBX6基因中rs3809624-rs3809627 兩個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型的具體實(shí)施方案是：使用ClonExpress One Step Cloning Kit (Vazyme)檢測常見TBX6基因變體的單倍型。使用pGEM-T載體作為模板用于擴(kuò)增載體， 分別擴(kuò)增載體和插入的DNA片段，連接；將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中；挑選克 隆，使用sanger測序進(jìn)行序列的檢測。
[0034] 檢測TBX6基因核苷酸移碼突變的方法包括以下步驟：（1)擴(kuò)增全長的TBX6基因； (2)sanger測序。
[0035] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，TBX6基因發(fā)生核苷酸插入導(dǎo)致移碼突變。發(fā)生移碼 突變后，TBX6基因的表達(dá)量降低，當(dāng)然不排除其他影響TBX6基因表達(dá)的移碼突變的存在。
[0036] 本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明rs3809624-rs3809627位點(diǎn)的單倍型為C-A時(shí)，TBX6基因表達(dá)下 調(diào)。證明的具體操作步驟為：（1)擴(kuò)增TBX6基因上游調(diào)控元件的長度為1120bp的DNA片 段，將正常DNA片段、僅rs3809624位點(diǎn)突變成C的DNA片段、僅rs3809627位點(diǎn)突變成A 的DNA片段、rs3809624和rs3809627位點(diǎn)同時(shí)突變的DNA片段分別構(gòu)建到pGL3基本載體 上；（2)將重組載體轉(zhuǎn)染到體外培養(yǎng)的HEK293T、H印G2、Hela細(xì)胞中；（3)轉(zhuǎn)染一定時(shí)間后， 裂解細(xì)胞取上清使用雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)檢測熒光素酶的活性。
[0037] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述人類細(xì)胞為HEK293T、H印G2、Hela。優(yōu)選地，本 發(fā)明使用的帶有熒光素酶報(bào)告基因的載體是PGL3基本載體，對照載體是pRL-TK。
[0038] 本發(fā)明利用QPCR和高密度寡核苷酸比較基因組雜交技術(shù)在161名無親戚關(guān)系的 患有先天性脊柱側(cè)凸的群體中鑒定出12名染色體16pll. 2微缺失的個(gè)體，同時(shí)利用DNA測 序技術(shù)在上述患病群體中鑒定出4名單核苷酸插入導(dǎo)致TBX6基因移碼突變的個(gè)體，單核苷 酸插入的四種情況是：C1248位插入A、C263插入G、C697插入C、C1167插入G。染色體缺 失和移碼突變統(tǒng)稱為無義突變，在161名患病群體中鑒定出16名個(gè)體存在無義突變，無義 突變在CS中的概率為10. 6%。利用同樣的方法，本發(fā)明重新收集了 76名無親戚關(guān)系的患 有先天性脊柱側(cè)凸的群體，鑒定出5名染色體16pll. 2微缺失的個(gè)體，同時(shí)在上述群體中鑒 定出1名雙核苷酸缺失導(dǎo)致TBX6基因移碼突變的個(gè)體，雙核苷酸缺失的情況是：C1179位 雙缺失AG。在76名患病群體中鑒定出6名個(gè)體存在無義突變，無義突變在CS中的概率為 7. 9%。綜合兩次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)無義突變在CS中的概率在7. 9% -10. 6%之間。
[0039] 以存在染色體16pll. 2微缺失的兩個(gè)家系為研究對象，分析各成員的表型，患 有CS的個(gè)體的父親或兄弟姐妹雖然具有16pll. 2微缺失，但是他們并沒有CS表型，推 測其他因素輔助參與了 CS的表型的呈現(xiàn)。分析無16pll. 2微缺失的同源染色體上TBX6 基因的單倍型，發(fā)現(xiàn)rs2289292-rs3809624-rs3809627三個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型為T-C-A 時(shí)，具有染色體16pll. 2微缺失的個(gè)體表現(xiàn)為CS，否則，即使具有染色體16pll. 2微缺 失也不表現(xiàn)為CS。同時(shí)檢測161名患病群體中鑒定出的16名具有無義突變的個(gè)體和 76名患病群體中鑒定出的6名具有無義突變的個(gè)體的另一條正常染色體上TBX6基因 中rs2289292-rs3809624-rs3809627三個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型，發(fā)現(xiàn)三個(gè)SNP位點(diǎn)的單 倍型均為T-C-A。三個(gè)SNP位點(diǎn)中rs2289292的突變并沒有改變TBX6基因的蛋白質(zhì)編 碼，而rs3809624和rs3809627位于TBX6基因的上游調(diào)控序列，利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng) 測定rs3809624和rs3809627位點(diǎn)突變對基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)rs3809624和 rs3809627位點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，基因表達(dá)被抑制。因?yàn)閞s2289292位點(diǎn)的突變不影響TBX6基 因的蛋白質(zhì)編碼，已經(jīng)有報(bào)道稱，rs2289292位點(diǎn)和rs3809624位點(diǎn)同處于連鎖不平衡區(qū)， 當(dāng)確定rs3809624和rs3809627位點(diǎn)的單倍型為C-A時(shí)，rs2289292位點(diǎn)的單倍型即為T。
[0040] 據(jù)此，本發(fā)明揭示了一種判斷先天性脊柱側(cè)凸的標(biāo)準(zhǔn)：
[0041] (1)當(dāng)存在染色體16pll. 2微缺失的同時(shí)，無16pll. 2微缺失的同源染色體上 TBX6基因中rs3809624-rs3809627兩個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型為C-A時(shí)，診斷個(gè)體為先天性脊 柱側(cè)凸患者。
[0042] (2)當(dāng)染色體16pll. 2區(qū)域中TBX6基因存在以下單核苷酸插入和雙核苷酸缺失： C1248位插入T、C263插入C、C697插入G、C1167插入C、C1179位雙缺失AG導(dǎo)致的核苷酸移 碼突變中的一種或幾種時(shí)，無移碼突變的同源染色體上TBX6基因中rs3809624-rs3809627 兩個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型為C-A時(shí)，診斷個(gè)體為先天性脊柱側(cè)凸患者。
[0043] 基于上述理論，本發(fā)明開發(fā)了一種診斷先天性脊柱側(cè)凸的產(chǎn)品，該產(chǎn)品能夠檢測 染色體16pll. 2微缺失與否、能夠檢測TBX6基因移碼突變的存在與否、能夠確定沒有無義 突變的同源染色體上TBX6基因中rs3809624-rs3809627兩個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型。
[0044] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：首次揭示人類先天性脊柱側(cè)凸的遺傳基礎(chǔ)，通過檢測 個(gè)體基因缺失或基因核苷酸移碼突變和基因單核苷酸多態(tài)性來診斷先天性脊柱側(cè)凸是否 發(fā)生，根據(jù)上述原理制備的先天性脊柱側(cè)凸診斷試劑盒靈敏，適用于先天性脊柱側(cè)凸的早 期診斷，能夠?yàn)榛颊郀幦∽詈玫脑缙诟深A(yù)時(shí)間。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0045] 圖1顯示經(jīng)過高密度寡核苷酸比較基因組雜交微陣列分析鑒定的116pll. 2微缺 失；
[0046] 圖2顯示sanger測序鑒定的四種單核苷酸插入和一種雙核苷酸缺失；
[0047] 圖3顯不突光素酶報(bào)告系統(tǒng)構(gòu)建圖不；
[0048] 圖4顯示利用熒光素報(bào)告基因檢測單核苷酸多態(tài)性對基因表達(dá)的影響。
[0049] 具體的實(shí)施方式
[0050] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，或按照制造廠商所建議的條件。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常 規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051] 研究監(jiān)督：本發(fā)明人保證數(shù)據(jù)和分析的完整性和準(zhǔn)確性。本發(fā)明得到了中國醫(yī)學(xué) 科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院倫理委員會、復(fù)旦生命科學(xué)院、首都兒科研究所的認(rèn)可。所有的病人 或其家族成員提供了參與本發(fā)明的手寫知情同意書。
[0052] 研究對象信息：召集了 237名無親戚關(guān)系的患有先天性脊柱側(cè)凸的中國漢族 人。所有的患者是在2010年10月至2014年6月之間從中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院 通過影像學(xué)確認(rèn)的先天性脊柱側(cè)凸病人中募集的?；加幸阎木C合癥，如Alagile綜 合癥（Alagillesyndrome)、戈頓哈爾綜合癥（Goldenhar，ssyndrome)、面肌身材矮小 (hemifacialmicrosomia)，克-費(fèi)二氏綜合征（Klippel-Feilsyndrome)，脊椎肋骨發(fā)育 不全（spondylocostaldysostosis)和VACTERL綜合征（VACTERLsyndrome)的患者除外。 家族內(nèi)部CS表型不一致的16pll. 2微缺失的兩個(gè)家系從首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院中 募集。從所有家族成員那獲得了知情同意書。共計(jì)166名隨機(jī)挑選的健康中國漢族人被用 于實(shí)驗(yàn)對照，他們不患有先天性脊柱側(cè)凸同時(shí)不具有遺傳方面的缺陷。
[0053] 實(shí)施例1檢測染色體16pll. 2微缺失
[0054] 1.血樣抽取和基因組DNA的提取：
[0055] 全部研究對象均用真空EDTA抗凝采血管采集晨起空腹外周靜脈血5ml，3000rpm/ min離心10min，分離血漿、白細(xì)胞層和紅細(xì)胞。如有條件可使用淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)一步將 粒細(xì)胞提取。如無條件，則可直接將白細(xì)胞層分裝于2ml凍存管，置-80°C冷凍貯存?zhèn)溆谩?br> [0056] 采用酚-氯仿法提取基因組DNA，采用紫外分光光度法（260/280比值）確定DNA 純度，〇D26(l測定DNA濃度，統(tǒng)一標(biāo)化后-20°C貯存?zhèn)溆?。具體步驟如下：
[0057] (1)將白細(xì)胞懸液移入5ml離心管，加入溶血試劑，振蕩混勻后4000rpm/min離心 10min，棄上清，重復(fù)此過程一次；
[0058] (2)沉淀中加入1ml抽提液，混勻后加入8ill蛋白酶K，37°C水浴過夜；
[0059] (3)取出后稍冷卻，加入1mlTris-飽和酚，上下顛倒混勻15min，4000rpm/min離 心 10min;
[0060] (4)小心吸取上清，加入3MpH5. 0的醋酸鈉60ill，再加入與上清液等體積的異 戊醇，輕搖后可見白色絮狀沉淀物，l〇〇〇〇rpm/min離心2min;
[0061] (5)沉淀中加入75%乙醇約1ml，8000rpm/min離心2min，棄上清；
[0062] (6)沉淀中加入無水乙醇約lml，8000rpm/min離心2min，棄上清后干燥；
[0063] (7)干燥產(chǎn)物加入TE緩沖液100 ill溶解，通過測定 0〇26〇/280 和〇D26〇//23〇 比值來確 定DNA純度，gDNA平均大小通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行估計(jì)。標(biāo)化后-20°C貯存；
[0064] (8)DNA質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)：條帶清晰，長度> 10kb，無明顯降解；0D26Q/28Q在1. 8?2. 0 之間， 〇〇26〇/230〉1. 5即符合檢測標(biāo)準(zhǔn)。
[0065] 2.小樣本染色體16pll. 2微缺失的檢測
[0066] 從161名無親戚關(guān)系的患有先天性脊柱側(cè)凸的中國漢族人的基因組中選擇20例 進(jìn)行寡核苷酸比較基因組雜交檢測，使用Agilent寡核苷酸比較基因組雜交微陣列，按照 產(chǎn)品說明上的操作步驟進(jìn)行DNA剪切、微陣列處理和數(shù)據(jù)分析。參照DNA從Promega購買。
[0067] 3.大樣本QPCR初篩
[0068] 在16pll. 2微缺失區(qū)域選擇兩個(gè)檢測位點(diǎn)（命名為PA和PB)、在16pll. 2微缺失 區(qū)域外選擇一個(gè)參照位點(diǎn)（命名為P1)，使用P1和PA或P1和PB組合擴(kuò)增不同的片段，常 規(guī)的QPCR方法檢測片段的存在量。QPCR實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列如表1所示：
[0069] 表1 16pll. 2微缺失檢測中使用的引物序列
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種診斷先天性脊柱側(cè)凸的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品能夠檢測染色體16pll. 2 區(qū)域是否存在突變。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品是診斷試劑盒，所述診斷試劑盒 包括能夠檢測染色體16pll. 2區(qū)域是否存在突變的試劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑包括能夠檢測所述染色體 16pll. 2區(qū)域是否存在長度為0. 6Mb的核苷酸序列微缺失的試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測所述染色體16pll. 2區(qū)域是 否存在長度為0. 6Mb的核苷酸微缺失的試劑包括能夠擴(kuò)增所述0. 6Mb核苷酸序列的引物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如下：P1位點(diǎn)正向引物 5' -GGGGAAGGAACTTACATGAC-3'、P1 位點(diǎn)反向引物 5' -TCGTGITTCCCTGITGTACC-3'、PA 位點(diǎn) 正向引物 5 ' -GGTCTAAGCCACACACTAAC-3 '、PA 位點(diǎn)反向引物 5 ' -TGAGITTAGGGACCAATCTA-3 '、 PB位點(diǎn)正向引物5'-GCTGCCAGTATGTGACCGAGA-3'、PB位點(diǎn)反向引物 5, -GGGTGGAGGAGAGGATAGGG-3，。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑包括能夠檢測TBX6基因中 rs3809624位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因中rs3809624位 點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑包括構(gòu)建含有TBX6基因的重組載體的引物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如下：T7反向引物 5' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3'、SP6 反向引物 5' -GTATTCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、 CS 正向引物 5' -GACTCACTATAGGGCGAGGGGAAGGGAGCGGGAGGITTGTG-3'、CS 反向引物 5' -GGT GACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCCGGGAAGTGTAGT-3 '。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因中rs3809624位 點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如 下 Y -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3,、5, -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
11. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑還包括能夠檢測TBX6基因中 rs3809624位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因中rs3809624 位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑包括構(gòu)建含有TBX6基因的重組載體的引物。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如下：T7反向引物 5' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3'、SP6 反向引物 5' -GTATTCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、 CS 正向引物 5' -GACTCACTATAGGGCGAGGGGAAGGGAGCGGGAGGITTGTG-3'、CS 反向引物 5' -GGTG ACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCCGGGAAGTGTAGT-3 '。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因中rs3809624 位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如 下 Y -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3,、5, -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
16. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑包括能夠檢測TBX6基因核苷酸 移碼突變存在與否的試劑。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因核苷酸移碼突 變存在與否的試劑包括擴(kuò)增TBX6基因的引物。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如下：正向引物 5 ' -TAGGGAGAGGGCTCTGTTCTCATGG-3'、反向引物 5 ' -GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3 '。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因核苷酸移碼突 變存在與否的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如 下 Y -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3,、5, -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
21. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑還包括能夠檢測TBX6基因中 rs3809624位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑。
22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因中rs3809624 位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑包括構(gòu)建含有TBX6基因的重組載體的引物。
23. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如下：T7反向引物 5' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3'、SP6 反向引物 5' -GTATTCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、 CS 正向引物 5' -GACTCACTATAGGGCGAGGGGAAGGGAGCGGGAGGITTGTG-3'、CS 反向引物 5' -GGTG ACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCCGGGAAGTGTAGT-3 '。
24. 根據(jù)權(quán)利要求22所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因中rs3809624 位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如 下 Y -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3,、5, -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
26. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑還包括能夠檢測TBX6基因核苷 酸移碼突變存在與否的試劑。
27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因核苷酸移碼突 變存在與否的試劑包括擴(kuò)增TBX6基因的引物。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如下：正向引物 5 ' -TAGGGAGAGGGCTCTGTTCTCATGG-3'、反向引物 5 ' -GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3 '。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因核苷酸移碼突 變存在與否的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如 下 Y -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3,、5, -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
31. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述試劑還包括能夠檢測TBX6基因中 rs3809624位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑。
32. 根據(jù)權(quán)利要求31所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因rs3809624位 點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)的基因型的試劑包括構(gòu)建含有TBX6基因的重組載體的引物。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如下：T7反向引物 5' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3'、SP6 反向引物 5' -GTATTCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、 CS 正向引物 5' -GACTCACTATAGGGCGAGGGGAAGGGAGCGGGAGGITTGTG-3'、CS 反向引物 5' -GGTG ACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCCGGGAAGTGTAGT-3 '。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述能夠檢測TBX6基因中rs3809624 位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的試劑還包括TBX6基因核苷酸序列測序用的引物。
35. 根據(jù)權(quán)利要求34所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述引物序列如 下 Y -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3,、5, -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
36. 根據(jù)權(quán)利要求2至35中任一項(xiàng)所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述診斷試劑盒還包括基 因組DNA的提取試劑。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述DNA提取試劑包括苯酚、氯仿、異丙 醇、乙醇。
38. -種檢測染色體16pll. 2區(qū)域突變的方法，其特征在于，所述方法包括檢測染色體 16pll. 2微缺失的方法。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述檢測染色體16pll. 2微缺失的方法 包括使用高密度寡核苷酸比較基因組雜交微陣列。
40. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述檢測染色體16pll. 2微缺失的方法 包括使用QPCR初篩和高密度寡核苷酸比較基因組雜交微陣列驗(yàn)證。
41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述QPCR的具體操作方案為：在 16pll. 2微缺失區(qū)域選擇兩個(gè)檢測位點(diǎn)PA和PB、在16pll. 2微缺失區(qū)域外選擇一個(gè)參照位 點(diǎn)P1，使用P1和PA或P1和PB組合設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增不同的片段，常規(guī)QPCR方法檢測片段的 存在量。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述引物序列如下：P1位點(diǎn)正向引物 5' -GGGGAAGGAACTTACATGAC-3'、P1 位點(diǎn)反向引物 5' -TCGTGITTCCCTGITGTACC-3'、PA 位點(diǎn) 正向引物 5 ' -GGTCTAAGCCACACACTAAC-3 '、PA 位點(diǎn)反向引物 5 ' -TGAGITTAGGGACCAATCTA-3 '、 PB位點(diǎn)正向引物5'-GCTGCCAGTATGTGACCGAGA-3'、PB位點(diǎn)反向引物 5, -GGGTGGAGGAGAGGATAGGG-3，。
43. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述檢測染色體16pll. 2區(qū)域突變的 方法還包括檢測TBX6基因移碼突變方法和/或檢測TBX6基因中rs3809624位點(diǎn)和/或 rs3809627位點(diǎn)基因型的方法。
44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述檢測TBX6基因移碼突變的方法包 括：（1)設(shè)計(jì)合理的引物，將TBX6基因編碼區(qū)和將近lkb的上游調(diào)控區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；（2)利用 測序引物對步驟（1)中的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增引物序列如下：正向引物 5' -TAGGGAGAGGGCTCTGTTCTCATGG-3' ；反向引物 5' -GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3'。
46. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于，所述測序引物序列 如下 V -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3,、5> -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
47. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述檢測TBX6基因中rs3809624位點(diǎn) 和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的方法包括：（1)擴(kuò)增載體和插入的DNA片段，連接，構(gòu)建TBX6 基因重組載體；(2)將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中；（3)挑選克隆，設(shè)計(jì)測序用 引物使用sanger測序進(jìn)行序列的檢測。
48. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述載體是pGEM-T。
49. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建TBX6基因的重組載體中 所需的引物序列如下反向引物5 ' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3 '、SP6反向引物 5' -GTATTCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、CS 正向引物 5' -GACTCACTATAGGGCGAGGGGAAGGGAGCGG GAGGTTTGTG-3'、CS 反向引物 5' -GGTGACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCCGGGAAGTGTAGT-3'。
50. 根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其特征在于，所述測序用的引物序 列如 T ：5, -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3, ,5, -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3?, -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
51. -種檢測染色體16pll. 2區(qū)域突變的方法，其特征在于，所述方法包括檢測TBX6基 因移碼突變方法和/或檢測TBX6基因中rs3809624位點(diǎn)和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的 方法。
52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述檢測TBX6基因移碼突變的方法包 括：（1)設(shè)計(jì)合理的引物，將TBX6基因編碼區(qū)和將近lkb的上游調(diào)控區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；（2)利用 測序引物對步驟（1)中的擴(kuò)增片段進(jìn)行測序。
53. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述擴(kuò)增引物序列如下：正向引物 5' -TAGGGAGAGGGCTCTGTTCTCATGG-3' ；反向引物 5' -GCGTCCCAGGGAGGCAACCG-3'。
54. 根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述測序引物序列 如下 Y -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3,、5> -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3,、 -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3,、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
55. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，所述檢測TBX6基因中rs3809624位點(diǎn) 和/或rs3809627位點(diǎn)基因型的方法包括：（1)擴(kuò)增載體和插入的DNA片段，連接，構(gòu)建 TBX6基因的重組載體；（2)將重組載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中；（3)挑選克隆，設(shè)計(jì) 測序用引物使用sanger測序進(jìn)行序列的檢測。
56. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述載體是pGEM-T。
57. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建TBX6基因的重組載體中 所需的引物序列如下反向引物5 ' -TCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACA-3 '、SP6反向引物 5' -GTATTCTATAGTGTCACCTAAATAG-3'、CS 正向引物 5' -GACTCACTATAGGGCGAGGGGAAGGGAGCGG GAGGTTTGTG-3'、CS 反向引物 5' -GGTGACACTATAGAATACGCGCTGAGCCTGCCGGGAAGTGTAGT-3'。
58. 根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，所述測序用的引物序 列如 T ：5, -CTCGAAGGGGTCCGAGAGG-3, ,5, -CTCCTTCCATAGCTCCCGGT-3?, -GTTGCATACTGATCCCGAAT-3,、5, -CTGCCCGAACTAGGTGTATG-3、 -AATGGCTTCCTAACAGATGAC-3,、5, -GAGCGGGAGGTTTGTGATG-3,、 5, -GGCAGCTGGAAACACAGGT-3，。
59. 根據(jù)權(quán)利要求38至58中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括提取基 因組DNA的方法。
60. 權(quán)利要求1至37中任一項(xiàng)所述的產(chǎn)品在制備診斷先天性脊柱側(cè)凸產(chǎn)品中的應(yīng)用。
61. 權(quán)利要求1至37中任一項(xiàng)所述的產(chǎn)品在制備治療先天性脊柱側(cè)凸產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328169SQ201410572962
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月24日
【發(fā)明者】吳南, 劉嘉琦, 劉森, 吳志宏, 邱貴興 申請人:吳南