一種快速提取杉木總rna的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種從植物組織中快速提取總RNA的方法，特別涉及一種從富含多酚等次生代謝產(chǎn)物的植物組織中提取總RNA的方法。本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效的快速提取杉木總RNA的方法，為研究人員在實(shí)際工作中提供更多的選擇。所提取的RNA質(zhì)量高，可以滿足RT-PCR、Northern雜交等基因分離和表達(dá)分析等研究的需要，同時(shí)可以大大降低實(shí)驗(yàn)的成本。本發(fā)明通過(guò)將SDS提取液和巰基乙醇混合提取，離心柱純化，可對(duì)杉木組織的RNA進(jìn)行快速提取，大大縮短時(shí)間及降低實(shí)驗(yàn)成本，提取的RNA純度較高，可以滿足分子生物學(xué)研究的需求。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種快速提取杉木總RNA的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從植物組織中快速提取總RNA的方法，特別涉及一種從富含多酚等次生代謝產(chǎn)物的植物組織中提取總RNA的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]衫木iCunninghamia lanceolata (Lamb.)Hook.)是我國(guó)南方重要的用材林樹(shù)種。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外也逐漸開(kāi)始利用分子生物學(xué)手段來(lái)開(kāi)展杉木的相關(guān)研究，而從杉木組織中提取聞質(zhì)量的總RNA是進(jìn)行這些研究的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。
[0003]杉木富含多酚等次生代謝產(chǎn)物，多酚易被氧化成褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，會(huì)使RNA降解，RNase和多酚氧化酶都屬于蛋白質(zhì)，要獲得完整的、高質(zhì)量的總RNA就必須能夠去除蛋白，次生代謝產(chǎn)物則易于RNA結(jié)合，阻礙RNA的分離。因此，要獲得高質(zhì)量的杉木總RNA，就必須要去除多酚和次生代謝產(chǎn)物，抑制多酚的氧化。
[0004]目前，常見(jiàn)植物材料總RNA的提取方法較多，主要有CTAB法、改良CTAB法、Trizol法、異硫氰酸胍法、熱硼酸法等，但尚未有一種能夠快速?gòu)纳寄窘M織中提取總RNA的方法。我們迫切需要一種成本低廉，操作簡(jiǎn)單、方便，高效的提取方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、高效的快速提取杉木總RNA的方法，為研究人員在實(shí)際工作中提供更多的選擇。所提取的RNA質(zhì)量高，可以滿足RT-PCR、Northern雜交等基因分離和表達(dá)分析等研究的需要，同時(shí)可以大大降低實(shí)驗(yàn)的成本。
[0006]本發(fā)明所提供的一種快速提取杉木總RNA的方法，包括以下步驟:
(1)在1.5 ml離心管中混勻如下液體:1 ml SDS提取液和40-60 μ I巰基乙醇，記為提取液A ；
(2)取90-120mg新鮮杉木材料放到2ml離心管中，并加入鋼珠，迅速放到液氮中速凍，用高通量組織研磨儀研磨成粉末；
(3)向研磨后的離心管中迅速加入0.8-1.5 ml提取液A,渦旋混勻，室溫靜置8-15min，4°C，13000g 離心 10-20 min ；
(4)吸取500-700μ I上清至一新的1.5 ml離心管中，加入200-400 μ I 5 mol/L NaCl和 400-600 μ I 氯仿，混勻，4°C，13000g 離心 4-7 min ；
(5)吸取500-700μ I上清，加入等體積的水飽和酚:氯仿ν/ν=1:1的混合液，混勻，4°C，13000g 離心 4-7 min ；
(6)吸取300-500μ I上清于一新的1.5 ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，于室溫下在側(cè)擺搖床上搖勻10 min ；
(7)將上述搖勻后的液體吸入到離心柱中，4°C，13000g離心1-3min ；
(8)加入75%預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，4°C，13000g離心1-3min ；
(9)重復(fù)步驟(8)； (10)棄液，4°C，13000g空離心 1-3 min ；
(11)更換底部的收集管為新的1.5ml無(wú)RNA酶離心管，向上述離心柱中央加入30-50 μ I DEPC 水，靜置 2-5 min，4°C，13000g 離心 1-3 min ；
(12)將離心后離心管底部的液體重新吸入離心柱中，靜置2?5min, 4°C，13000g離心
1-3 min ；
(13)棄離心柱，將新的收集管_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0007]SDS 提取液配置:0.25M NaCl, 0.05M Tris-HCl、ρΗ=7.5，20mM EDTA、ρΗ=8.0，1%SDSο
[0008]更優(yōu)選地，一種快速提取杉木總RNA的方法，包括以下步驟:
(1)在1.5 ml離心管中混勻如下液體:1 mlSDS提取液和50μ I巰基乙醇，記為提取液A ；
(2)取10mg新鮮杉木材料放到2ml離心管中，并加入2個(gè)5 mm鋼珠,迅速放到液氮中速凍，用高通量組織研磨儀研磨成粉末；
(3)向研磨后的離心管中迅速加入Iml提取液A，渦旋混勻，室溫靜置10 min，4°C，13000g 離心 15 min ；
(4)吸取600μ I上清至一新的1.5 ml離心管中，加入300 μ I 5 mol/L NaCl和500 μ I氯仿，混勻，4°C, 13000g離心5 min ；
(5)吸取600μ I上清，加入等體積的水飽和酚:氯仿v/v=l:1的混合液，混勻，4°C，13000g 離心 5 min ；
(6)吸取400μ I上清于一新的1.5 ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，于室溫下在側(cè)擺搖床上搖勻10 min ；
(7)將上述搖勻后的液體吸入到離心柱中，4°C，13000g離心Imin ；
(8)加入500μ I 75%預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，4°C，13000g離心I min ；
(9)重復(fù)步驟(8)；
(10)棄液，4°C，13000g空離心 I min ；
(11)更換底部的收集管為新的1.5ml無(wú)RNA酶離心管，向上述離心柱中央加入50 μ IDEPC 水，靜置 2 min，4°C，13000g 離心 I min ；
(12)將離心后離心管底部的液體重新吸入離心柱中，靜置2min，4°C，13000g離心I
min ；
(13)棄離心柱，將新的收集管_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0009]本的發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于，可對(duì)杉木組織的RNA進(jìn)行快速提取，大大縮短時(shí)間及降低實(shí)驗(yàn)成本。例如，Iml提取液A可有效提取10mg杉木葉片和根的總RNA (附圖1)，0D26(I/28Q在1.9-2.1之間，提取的RNA純度較高，可以滿足分子生物學(xué)研究的需求；用傳統(tǒng)的CTAB法或改良CTAB法來(lái)提取杉木組織的總RNA，步驟比較繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)(過(guò)夜沉淀);還需要有去除DNA的步驟才能得到質(zhì)量比較高的RNA，也因增加了此步驟，導(dǎo)致最終所得到的RNA的含量比較低。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)杉木組織總RNA，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)拍照所得的效果圖:a為加樣孔，b為28S RNA，c為18S RNA，d為5S RNA ;A、B為杉木葉片，C、D為杉木根。
[0011]圖2為杉木總RNA電泳圖(CTAB法:M為marker，A為杉木葉，B為杉木根)。

【具體實(shí)施方式】
[0012]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0013]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
實(shí)施例1
1、溶液的配制
(1)0.1% (v/v) DEPC水:1000 ml超純水中加入I ml焦炭酸二乙酯(DEPC)，于磁力攪拌器上攪拌4h以上，121°C高壓滅菌20 min，搖勻，冷卻后備用，以下用到的所有溶液都需要用0.1% (v/v) DEPC水配制。
[0015](2) IM Tris-HCl (pH=7.5) 50 ml:稱(chēng)取 12.11 g Tris 堿溶于約 80 ml DEPC 水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.5，定容至100 ml ο
[0016](3)5M NaCl 100 ml:稱(chēng)取29.22 g NaCl 溶于約80 ml DEPC水中，定容至 100 ml。
[0017](4) 0.5M EDTA (ρΗ=8.0) 100 ml:稱(chēng)取 18.61 g Na2EDTA.2H20 溶于 80 ml DEPC水中，加熱溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至8.0。
[0018](5)SDS 提取液:0.25M NaCl,0.05M Tris-HCl (pH=7.5),20mM EDTA, 1%(M/V)SDS。稱(chēng)取 Ig SDS 溶于 20 ml DEPC 水中，再加入 5 ml 5M NaCl，5ml IM Tris-HCl,4 ml 0.5MEDTA，用DEPC水定容至100 ml。由于β -巰基乙醇易降解，使用前現(xiàn)加(提取液A:1ml SDS提取液和40-60 μ I β -巰基乙醇渦旋混勻)。
[0019]2、實(shí)驗(yàn)用品處理
提取過(guò)程中的玻璃器皿在180°C連續(xù)烘烤6h ;塑料離心管及槍頭均121°C高壓滅菌20min，然后80°C烘干。
[0020]3、實(shí)驗(yàn)操作
提取液A法提取杉木葉片和根總RNA的步驟:
(1)在1.5 ml離心管中混勻如下液體:1 ml提取液和50 μ I巰基乙醇，記為提取液A ；(CTAB法需要將提取液在65 °C水浴鍋中預(yù)熱Ih)；
(2)取10mg新鮮杉木葉片及根分別放到2ml離心管中，并各加入2個(gè)5 mm鋼珠，迅速放到液氮中速凍，用高通量組織研磨儀研磨成粉末；
(3)向研磨后的離心管中迅速加入Iml提取液A，渦旋混勻，室溫靜置10 min，4°C，13000g離心15 min ; (CTAB法需要于65°C水浴放置20 min，期間需要每隔5 min顛倒混勻I次。)
(4)取步驟(3)獲得的上清600μ I于一新的1.5 ml離心管中，加入300 μ I 5 mol/LNaCl 和 500 μ I 氯仿，混勻，4°C，13000g 離心 5 min ；
(5)取步驟(4)獲得的上清600μI于一新的1.5 ml離心管中，加入等體積的水飽和酹:氯仿(1:1，v/v)，混勻，4°C, 13000g 離心 5 min ； (6)取步驟(5)獲得的上清400 μ I于一新的1.5 ml離心管中,加入等體積預(yù)冷的異丙醇，于側(cè)擺搖床上搖勻10 min (室溫進(jìn)行)；(CTAB法用LiCl沉淀需要4°C沉淀至少6h，甚至過(guò)夜)。
[0021](7)將步驟(6)所述液體吸入到離心柱中，4°C, 13000g離心I min,棄液；
(8)向步驟(7)所述的離心柱中加入500μI 75%預(yù)冷的乙醇洗沉淀，4°C，13000g離心I min ；
(9)棄液，重復(fù)步驟(8)；
(10)棄液，4°C，13000g空離心 I min ；
(11)更換步驟(10)中底部的收集管為新的1.5 ml無(wú)RNA酶離心管，向上述離心柱中央加入 50 μ I DEPC 水，靜置 2 min, 4°C，13000g 離心 I min ；
(12)將離心后離心管底部的液體重新吸入離心柱中，靜置2min，4°C，13000g離心I
min ；
(13)棄離心柱，并做好標(biāo)記_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0022]4、RNA完整性檢測(cè)
取上述本發(fā)明的方法制備的5 μ I RNA溶液與I μ I 6 X loading buffer混勻，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。通過(guò)凝膠成像可以觀測(cè)到比較完整的RNA，其中28S RNA的亮度大約是18S RNA的兩倍，加樣孔正常，無(wú)發(fā)亮拖尾現(xiàn)象(圖1)。CTAB法提取的杉木葉和根的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，可以看到明顯的DNA污染，無(wú)5S RNA。
[0023]5、RNA質(zhì)量檢測(cè)
取上述方法制備的2 μ I RNA溶液，加入到TECAE酶標(biāo)儀中測(cè)量RNA濃度和0D26(I/28(I的比值，分析RNA質(zhì)量。結(jié)果表明本方法在含酚類(lèi)較高的杉木葉片和根中提取的RNA具有較高的質(zhì)量和產(chǎn)量，其中OD2607280值分別為2.06,2.04,2.06、1.97 (從左到右)，產(chǎn)量為67.3、61.26,58.58,63.62 μ g/g (從左到右)。
[0024]注:CTAB法提取杉木葉片和根總RNA的步驟:
(1)將600ul的2%CTAB加入至1.5ml離心管中，并加入50uL的β -巰基乙醇，振蕩混勻，65 °C水浴預(yù)熱；
(2)取100mg新鮮杉木葉片及根分別放到2 ml離心管中，并各加入2個(gè)5 mm鋼珠，迅速放到液氮中速凍，用高通量組織研磨儀研磨成粉末；
(3)將材料粉末轉(zhuǎn)移至于65°C水浴預(yù)熱的2%CTAB離心管中，混勻，并于65°C水浴20min,期間每隔5 min溫柔顛倒一次；
(4)加入600ul的苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，振蕩均勻，4°C，12000 g離心10
min ；
(5)轉(zhuǎn)移上清到另一1.5 ml離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)后顛倒混勻，4。。，12000 g 離心 10 min ；
(6)將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5 ml離心管中，加入1/4體積的10 M LiCl，使其終濃度為2mol/L，溫柔顛倒混勻后，4°C沉淀過(guò)夜；
(7)4°C，12000g 離心 20 min，棄上清；
(8)加入500μ I SSTE溶解沉淀，加入500 μ I氯仿抽提；
(9)4°C,12000 g 離心 10 min ； (10)取上清，加入無(wú)水乙醇使其終濃度為70%，-20°c放置Ih ；
(11)4°C, 12000 g 離心 20 min ；
(12)棄上清，加入75%乙醇洗滌沉淀，4°C，12000g離心10 min ；
(13)棄上清，用移液器吸走多余乙醇，干燥5?10min，加入50μ1 DEPC水溶解沉淀。
[0025]CTAB法提取的杉木葉和根的0D26Q/28Q值分別為2.10,2.12，產(chǎn)量為45.3,39.9 μ g/
g°
【權(quán)利要求】
1.一種快速提取杉木總RNA的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)在1.5 ml離心管中混勻如下液體:1 ml SDS提取液和40-60 μ I巰基乙醇，記為提取液A ； (2)取90-120mg新鮮杉木材料放到2ml離心管中，并加入鋼珠，迅速放到液氮中速凍，用高通量組織研磨儀研磨成粉末； (3)向研磨后的離心管中迅速加入0.8-1.5 ml提取液A,渦旋混勻，室溫靜置8-15min，4°C，13000g 離心 10-20 min ； (4)吸取500-700μ I上清至一新的1.5 ml離心管中，加入200-400 μ I 5 mol/L NaCl和 400-600 μ I 氯仿，混勻，4°C，13000g 離心 4-7 min ； (5)吸取500-700μ I上清，加入等體積的水飽和酚:氯仿ν/ν=1:1的混合液，混勻，4°C，13000g 離心 4-7 min ； (6)吸取300-500μ I上清于一新的1.5 ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，于室溫下在側(cè)擺搖床上搖勻10 min ； (7)將上述搖勻后的液體吸入到離心柱中，4°C，13000g離心1-3min ； (8)加入75%預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，4°C，13000g離心1-3min ； (9)重復(fù)步驟(8)； (10)棄液，4°C，13000g空離心 1-3 min ； (11)更換底部的收集管為新的1.5ml無(wú)RNA酶離心管，向上述離心柱中央加入30-50 μ I DEPC 水，靜置 2-5 min，4°C，13000g 離心 1-3 min ； (12)將離心后離心管底部的液體重新吸入離心柱中，靜置2-5min，4°C，13000g離心1-3 min ； (13)棄離心柱，將新的收集管_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的快速提取杉木總RNA的方法，其特征在于:步驟(I)所述SDS 提取液的配置:0.25M NaCl, 0.05M Tris-HCl、pH=7.5,20mM EDTA、pH=8.0,1%SDS。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的所述的快速提取杉木總RNA的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)在1.5 ml離心管中混勻如下液體:1 mlSDS提取液和50μ I巰基乙醇，記為提取液A ； (2)取10mg新鮮杉木材料放到2ml離心管中，并加入2個(gè)5 mm鋼珠,迅速放到液氮中速凍，用高通量組織研磨儀研磨成粉末； (3)向研磨后的離心管中迅速加入Iml提取液A，渦旋混勻，室溫靜置10 min，4°C，13000g 離心 15 min ； (4)吸取600μ I上清至一新的1.5 ml離心管中，加入300 μ I 5 mol/L NaCl和500 μ I氯仿，混勻，4°C, 13000g離心5 min ； (5)吸取600μI上清，加入等體積的水飽和酚:氯仿ν/ν=1:1的混合液，混勻，4°C，13000g 離心 5 min ； (6)吸取400μ I上清于一新的1.5 ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，于室溫下在側(cè)擺搖床上搖勻10 min ； (7)將上述搖勻后的液體吸入到離心柱中，4°C，13000g離心Imin ； (8)加入500μ I 75%預(yù)冷的乙醇洗滌沉淀，4°C，13000g離心I min ； (9)重復(fù)步驟(8)； (10)棄液，4°C，13000g空離心 I min ； (11)更換底部的收集管為新的1.5ml無(wú)RNA酶離心管，向上述離心柱中央加入50 μ IDEPC 水，靜置 2 min，4°C，13000g 離心 I min ；(12)將離心后離心管底部的液體重新吸入離心柱中，靜置2min，4°C，13000g離心Imin ； (13)棄離心柱，將新的收集管_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104313014SQ201410523493
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月8日
【發(fā)明者】馬志慧, 林思祖, 陳宇, 許珊珊, 曹光球, 李樹(shù)斌, 丁國(guó)昌 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)