一種簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法，所述方法包括：獲得一條鏈的5'端磷酸化的雙鏈線性DNA，然后以該雙鏈線性DNA為底物在堿性磷酸酶存在下在反應(yīng)體系中反應(yīng)，將反應(yīng)獲得的具有5'端去磷酸化的雙鏈線性DNA的反應(yīng)物在足量λ核酸外切酶存在下在反應(yīng)體系中反應(yīng)，反應(yīng)完成后測定反應(yīng)體系中單鏈DNA或雙鏈DNA的相對量，并由該檢測結(jié)果推導(dǎo)出堿性磷酸酶的活性程度。該方法與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，操作簡單快速，可實現(xiàn)高通量、自動化的活性測定，并且靈敏度高，可檢測到10mU的堿性磷酸酶。
【專利說明】一種簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說涉及一種簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP)是一類水解酶，可在核苷酸、蛋白質(zhì)、 生物堿等分子上去除磷酸基，進行去磷酸化作用，在堿性環(huán)境下最為有效，故得名堿性磷酸 酶。堿性磷酸酶是基因工程技術(shù)以及分子生物學(xué)研究中一類非常重要的工具酶，其非特異 性催化DNA和RNA的5'和3'末端磷酸單酯去磷酸化，但不降解磷酸二酯和三酯鍵。此外， 堿性磷酸酶可水解核糖和脫氧核糖核苷三磷酸（rNTPs和dNTPs)。在分子生物學(xué)研究中可 用于去除DNA和RNA的磷酸化末端，以便后續(xù)的克隆和末端標(biāo)記?？寺≈芯€性質(zhì)粒DNA去 磷酸化后可防止自連。該酶作用于5'末端，無論其為凸端、凹端或平端。堿性磷酸酶還可 降解PCR反應(yīng)中多余的dNTPs，此PCR產(chǎn)物可直接用于DNA測序和SNP分析。
[0003] 標(biāo)準(zhǔn)的測活方法采用對硝基苯磷酸鈉（pNPP)法，其反應(yīng)方程式如下： -^pNPP (無色）+H2O pNP (黃色）+ΗΡ042- 通過分光光度法測定產(chǎn)物PNP的含量，進而計算出堿性磷酸酶的活性。這種基于顯色 的方法步驟較多，反應(yīng)時間要求控制精確，難以實現(xiàn)高通量、自動化。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是建立一種簡便、快速的堿性磷酸酶測活方法。本發(fā)明原理如圖1 所示。
[0005] 具體來說，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案： 一種簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：獲得 一條鏈的5'端磷酸化的雙鏈線性DNA，然后以該雙鏈線性DNA為底物在堿性磷酸酶存在下 在反應(yīng)體系中反應(yīng)，將反應(yīng)獲得的具有5'端去磷酸化的雙鏈線性DNA的反應(yīng)物在足量λ 核酸外切酶存在下在反應(yīng)體系中反應(yīng)，反應(yīng)完成后測定反應(yīng)體系中單鏈DNA或雙鏈DNA的 相對量，并由該檢測結(jié)果推導(dǎo)出堿性磷酸酶的活性程度。
[0006] 優(yōu)選地，雙鏈DNA或單鏈DNA的相對量是利用熒光染料，通過熒光法測得的，并且 雙鏈DNA或單鏈DNA的相對量是以熒光強度表示的。更優(yōu)選，所采用的熒光染料是雙鏈DNA 特異性熒光染料。
[0007] 在一個實施方案中，所采用的染料是成熟的商用雙鏈DNA特異性熒光染料，例如 picogreen 染料。
[0008] 優(yōu)選地，所采用的雙鏈線性DNA模板是以λ DNA為底物，在正向和反向引物的 存在下通過PCR擴增獲得的線性雙鏈DNA，以便于建立標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，其中所用的正 向和反向引物中的一者的5'端具有磷酸化基團。在一個實施方案中，所用正向引物為 5，-aataacgtcggcaactttgg-3，，反向弓I物為 5，-gttacgccaccagtcatcct-3，。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)點： 1.操作步驟簡單快速，可實現(xiàn)高通量、自動化的活性測定。
[0010] 2.靈敏度高，可檢測到10 mU的堿性磷酸酶。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明的測定原理圖。
[0012] 圖2是利用本發(fā)明測定方法獲得熒光活性曲線圖。

【具體實施方式】
[0013] 本發(fā)明的目的是建立一種簡便、快速的堿性磷酸酶測活方法。本發(fā)明原理如圖1 所示。
[0014] 如圖所示，堿性磷酸酶可以一端磷酸化的雙鏈DNA轉(zhuǎn)化為非磷酸化的雙鏈DNA。 λ核酸外切酶可以特異性的將磷酸化雙鏈DNA降解為單鏈DNA，而不降解非磷酸化的雙鏈 DNA。picogreen染料特異性的結(jié)合雙鏈DNA，產(chǎn)生熒光，而不能結(jié)合單鏈DNA，從而不能產(chǎn)生 熒光。堿性磷酸酶的活性在一定范圍內(nèi)同去磷酸化雙鏈DNA的量成正比，因此其活性就可 以用Picogreen熒光強度來進行測定。
[0015] 實施例1.熒光法測定堿性磷酸酶活性方法的建立 1.磷酸化雙鏈DNA的制備 引物 F (5' 磷酸化修飾）：5' -aataacgtcggcaactttgg-3' ； 弓I物 R :5' -gttacgccaccagtcatcct-3' ； PCR 模板：λ DNA PCR反應(yīng)：

【權(quán)利要求】
1. 一種簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 獲得一條鏈的5'端磷酸化的雙鏈線性DNA，然后以該雙鏈線性DNA為底物在堿性磷酸酶存 在下在反應(yīng)體系中反應(yīng)，將反應(yīng)獲得的具有5'端去磷酸化的雙鏈線性DNA的反應(yīng)物在足量 λ核酸外切酶存在下在反應(yīng)體系中反應(yīng)，反應(yīng)完成后測定反應(yīng)體系中單鏈DNA或雙鏈DNA 的相對量，并由該檢測結(jié)果推導(dǎo)出堿性磷酸酶的活性程度。
2. 如權(quán)利要求1所述的簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法，其特征在于，雙鏈DNA或 單鏈DNA的相對量是利用熒光染料，通過熒光法測得的，并且雙鏈DNA或單鏈DNA的相對量 是以突光強度表不的。
3. 如權(quán)利要求2所述的簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法，其特征在于，所采用的 熒光染料是雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權(quán)利要求3所述的簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法，其特征在于，所采用的 染料是pi cogreen染料。
5. 如權(quán)利要求1所述的簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法，其特征在于，所采用的 雙鏈線性DNA模板是以λ DNA為底物，在正向和反向引物的存在下通過PCR擴增獲得的線 性雙鏈DNA，其中所用的正向和反向引物中的一者的5'端具有磷酸化基團。
6. 如權(quán)利要求5所述的簡便快速的堿性磷酸酶活性測定方法，其特征在于，所用正向 引物為 5' -aataacgtcggcaactttgg-3'，反向引物為 5' -gttacgccaccagtcatcct-3'。
【文檔編號】C12Q1/42GK104263831SQ201410502155
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】徐曉昱 申請人:南京諾唯贊生物科技有限公司